Efek Pemberian The Hijau Terhadap Gambaran Histoogis Paru Tikus Sprague Dawey Yang Diberi Paparan Asap Rokok

izyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
B A B III
M E T O D E PENELITIAN

1.

R a n c a n g a n Penelitian

Penelitian
jnggunakan

ini

analisis

merupakan
kemaknaan

penelitian

eksperimental

Mann-Whitney

dengan

murni

yang

memanfaatkan

}gram S P S S 11.5 for v/indows.

!.

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dengan hewan c o b a dilaksanakan di r u m a h h e w a n
use)

{animal

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. P e r i a k u a n teriiadap hewan

3a dimulai sejak tangga! 22 Juli 2 0 0 6 s a m p a i dengan 2 2 S e p t e m b e r 2006.
mbuatan preparat jaringan dilakukan di laboratorium Histologi dan Patologi
atomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Preparat d i b a c a dan diambii
Dnya

di

Bagian

iversitas Indonesia.

Histologi

dan

Patologi

Anatomi

Fakultas

Kedokteran

Sampel

mzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Subjek penelitian a d a l a h tikus S p r a g u e D a w l e y jantan

dengan

berat

badan 150-160 g r a m s e b a n y a k 4 5 ekor, y a n g ditentukan berdasarkan m m u s
^ n e l i t i a n eksperimental (Frederer).
^

t(n-1)>15
y
t = jumlah periakuan

n = jumlah subjek d a l a m satu kelompok zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIH
f

9(n-1)>15

-

9n-9>15
9 n > 15 + 9

It
1^

I f * '

11 • <

-9n>24'

I

n > 24/9

it:-

n > 2,67

p.

ekor.

diputuskan jumlah tikus perieri
Deriakuan.apa-apa.

Tikus y a n g diberi pajanan a s a p rokok dipindahkan dalam

i i a n g a n terpisah. P e n g a s a p a n dilakukan s e l a m a 90 menit setiap hari. Setelah
neiakukan

pengasapan,

tikus-tikus

;andangnya . m a s i n g - m a s i n g .

coba

Pemberian

dikembalikan
antioksidan

lagi

ke

dilakukan

dalam
dengan

nenggunakan s o n d e s e s u a i d e n g a n d o s i s yang s u d a h ditentukan.
/lakanan dan minuman diberikan ad libitum.
S e m u a kelompok yang mendapatkan d u a periakuan (pajanan a s a p rokok
Ian larutan teh hijau, a q u a destilata, atau a s a m askortaat), diberikan
sriebih dahulu baru dilakukan p e n g a s a p a n .

41

larutan

Isabel 3.3 Pembagian kelompok hewan c o b a berdasarkan periakuan
Jumlah
(ekor)

'Ke'.ompok

Keterangan

Periakuan

1
II
III
IV

Kontrol 1
Kontrol 2
Kontrol 3
Periakuan 1

V

Periakuan 2

VI

Periakuan 3

Vll

Periakuan 4

VIII

Periakuan 5

IX

Periakuan 6

Tidak dilakukan periakuan
Asap rokok selama 20 hari
Aqua destilata 20 hari, asap rokok sejak 10 hari kedua
Larutan teh hijau 2 ml/ hari selama 20 hari, asap
rokok sejak 10 hari kedua

Larutan teh hijau 2,5 ml/ hari selama 20 hari, asap
rokok sejak 10 hari kedua
Larutan asam askorbat selama 20 hari, asap rokok
sejak 10 hari kedua
Asap rokok selama 20 hari, larutan teh hijau 2 ml/ hari
sejak 10 hari kedua
Asap rokok selama 20 hari, larutan teh hijau 2,5 ml/
hari sejak 10 hari kedua
Asap rokok selama 20 hari. larutan asam askorbat
sejak 10 hari kedua

5
5
5
5
5
5
5
5
5

P e n g a s a p a n dilakukan d e n g a n 3 batang rokok setiap kelompok s e l a m a
90 menit setiap tiari, 10 hari atau 2 0 hari berturut-turut, tergantung jenis
periakuan kelompoknya. Rata-rata 1 batang rokok a k a n h a b i s d a l a m waktu 30
menit, m a k a pengasapan pertama dilakukan d e n g a n m e m b a k a r 1 batang lebih
dulu untuk satu kelompok (3 kali 30 menit). Metode ini merujuk p a d a cara yang
dilakukan Cavan-a et. al (2001).
I

Pada

hari

ke-21

semua

tikus

coba

dianestesi d e n g a n

eter

kemudian

F
dilakukan pembedahan untuk m e n g a n g k a t jaringan paru. J a r i n g a n yang diambii
Jifiksasi dalam lamtan fonnal salin s e b e l u m diproses lebih lanjut.

42

j3,5. Isolasi Jaringan Paru

Kelompok tikus y a n g a k a n diambii jaringan parunya d i m a s u k k a n ke dalam
fsungkup tertutup.
Iter.

K e d a l a m sungkup d i m a s u k k a n k a p a s y a n g sudah dibasahi

Setelah s e m u a tikus l e m a s dan s u d a h terbius, satu persatu diambii secara

bergantian dan diletakkan di atas p a p a n untuk dilakukan p e m b e d a h a n .

Tikus
dianestesi
inhalasi

X

/

Pembedahan
PC
ikus ->
Jaringan paru
diambii

Fiksasi
jaringan
dengan
formol salin

J aringan^tfiproses
secara histoteknik
(dehidrasi
pembeningan.impregnansi,
blok parafin, pengirisan,
pewamaan)

Pemeriksaan
histologi
jaringan
.Gambar 3.2. Skema isolasi jaringan paru

Pembedahan

dilakukan

dengan

menggunting

dinding

perut

teriebih

;dahulu, dilanjutkan d e n g a n menggunting tulang rawan iga kiri-kanan. Setelah itu
;sternum disingkap, s a l u r a n nafas dipotong
'abdominalis digunting.

s a m p a i batas trakea dan

aorta

S e m u a isi mediastinum dikeluarkan dan dicuci d e n g a n

larutan garam fisiologis, k e m u d i a n paru dipisahkan dari jaringan Iainnya.

Paru

dimasukkan ke d a l a m pot y a n g berisi larutan formol salin d a n diberi kode n a m a

Icelompok.
S e b e l u m dilanjutkan

d e n g a n p e m b u a t a n preparat, jaringan

direndam

'dalam larutan ini s e l a m a minimal 24 j a m .

3.5.1.

Fiksasi

(Fixating)^

Jaringan p a m tikus difiksasi d a l a m larutan formol salin d e n g a n cara fiksasi
rendamzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
(immersed fixation). F o n n u l a pembuatan larutan ini a d a l a h :
Lamtan formalin (formaldehida 4 0 % )

3.5.2.

100 ml

Natrium klorida

9 gram

Aquadestilata

9 0 0 ml

Dehidrasi (DehidratJng)

34

Dehidrasi dikerjakan d e n g a n m e m i n d a h k a n jaringan dari larutan formol
salin ke d a l a m alkohol serial d e n g a n gradasi m e n i n g k a t

Dari larutan formalin,

[jaringan dipindahkan ke d a l a m larutan alkohol 7 0 % s e l a m a 3 hari (setiap hari di
ganti), kemudian ke d a l a m alkohol 9 5 % s e l a m a 3 hari (setiap hari diganti), d a n
ke d a l a m alkohol absolut s e l a m a 3 hari juga (setiap hari di ganti).

44

3.5.3.

Pembeningan

Pembeningan

(Clearing)^

dilakukan

dengan

menggunakan

lamtan

xylol,

jaringan

direndam s e l a m a kurang lebihi 1 j a m .

3.5.4.

Pembenaman

(Embedding)

34

J a r i n g a n diangkat dari xylol d a n d i b e n a m k a n ke d a l a m parafin cair s e l a m a
5 j a m d a l a m o v e n d e n g a n s u h u 56°C.

I 3.5.5.

r

Pembuatan Blok Parafin

Pembuatan

blok

(Blocking)

menggunakan

II

34

tiistoplate

plastik

parafin. ; J a r i n g a n diletakkan d l tengah-tengah histoplate.
I
1
r membeku.-

I

I

3.5.6.

yang

diisi

dengan

K e m u d i a n dibiari^an

Pengirisan Jaringan (Cutting)

Blok yang dipilih untuk m e m b u a t preparat adalah blok yang m e n g a n d u n g

i

lobus tengah paru.

H a l ini dilakukan agar mendapatkan hasil p e r c o b a a n y a n g

[

paling nyata karena lobus tengah paru yang paling dekat d e n g a n hilus, s e h i n g g a
paling banyak terpapar a s a p rokok.

A s u m s i ini diambii berdasarkan literatur

45

/yang menyatakan bahwa C a p a m terbanyak a d a l a h akibat rokok dan 9 5 % dari
^eluruh insiden C a paru primer a d a l a h karsinoma bronkogenik.^
Jaringan
fdimasukkan

diiris

ke

dengan

mikrotom

setebal 5

mikron.

Irisan

jaringan

waterbath
(suhu 37°C), k e m u d i a n diambii dengan
d a l a mzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA

fmenggunakan gelas objek yang telah diberi o l e s a n putih telur.
[Gelas objek yang telah ditempeli jaringan diletakkan p a d a hotplate

bersuhu

5v

'40°C, lalu dibiariesaran 400 kali).
4 . A d a tidaknya fibrosis p a d a preparat y a n g dinilai.

Fibrosis tampak p a d a

preparat yang d i w a m a i d e n g a n p e w a m a a n trikrom ini s e b a g a i pulasan
V

berwama bim kehijauan.

1zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
5. Keutuhan silia bronkus.
Penilaian diambii d e n g a n

cara

persentase rerata keutuhan silia dari tiap bronkus y a n g ditemukan.
: 6. J u m l a h skoring dari m a s i n g - m a s i n g poin di atas.
9.1^ Ketentuan skoring a d a l a h s e b a g a i t>erikut:
iC

J u m l a h granuloma/ Ipb

i

^

ti

2

• 3

= 0
=0,2-1
=

> 1

49

menilai

J u m l a h makrofag aktif/ s e l epiteloid/ Ipk
1

= 1 - 3

2

=

3-5

3

=

>5

J u m l a h sel radang/ Ipk
1

=0-20

2

=

20-40

3

=

>40

K e b e r a d a a n fibrosis
1

=

Tidak a d a

3

=

Ada

,D, Keutuhan silia bronkus
1

=

;8.13

7 5 %

Penilaian skoring a d a l a h s e b a g a i berikut:
Hasil penjumlahan skoring 5 s a m p a i 7 dikategorikan d a l a m rusak ringan; skoring
^ s a m p a i 10 masuk d a l a m kategori m s a k s e d a n g ; d a n j u m l a h skoring yang lebih
jdari 10 adalah m s a k berat.
|r

Skoring dibuat berdasarkan hasil penelitianzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHG
pre-eliminary, paru tikus yang

| l i b e r i rokok tampak banyak sekali gejala peradangan d i b a n d i n g k a n d e n g a n paru
• jtikus kontrol.

I

P a d a preparat paru tikus periakuan ini dicari gejala peradangan zyxwvutsrqponmlkjihgf

'^apa saja yang tampak

d a n tanda-tanda tersebut diambii s e b a g a i parameter

50

^nelitian.

i

Gejala yang menonjol adalah peningkatan jumlah s e l radang yang

jj^'embentuk granuloma, ditemukannya s e l datia, a d a n y a fibrosis, d a n kerusakan
j ^ k t u r silia bronkus.
Pada

awalnya

peneliti

ingin

membedakan

leukosit

d a n melakukan

(ji'ferensiasi sel-sel radang. N a m u n d e n g a n keterbatasan alat yang tersedia saat
ini dan diferensiasi sel m e m b u t u h k a n ketelitian y a n g tinggi d a n tingkat kesalahan

prig kecil, sehingga peneliti kesulitan m e l a k u k a n n y a .
P e n e n t u a n nilai skoring dilakukan sendiri oleh peneliti karena belum a d a
S^ndar skoring baku y a n g dipublikasikan untuk menilai tingkat p e r a d a n g a n /
^ m s a k a n jaringan p a m akibat rokok.

3.8. Parameter Penelitian

•3.8.1 Granuloma

G r a n u l o m a m e m p a k a n m a s s a atau nodul jaringan granulasi seperti tumor
^ n g a n fibroblas dan kapiier y a n g tumbuh aktif, terdiri atas kumpulan makrofag
p m o d i f i k a s i yang m e n y e m p a i s e l epitel (sel epiteloid), y a n g dikelilingi oleh
^ngkaran s e l mononuklear teoitama limfosit dan k a d a n g - k a d a n g sekelompok s e l
raksasa berinti banyak (sel datia) yang m e r u p a k a n penyatuan dari beberapa s e l
gpiteloid.

12.1^.15.1*=

( G a m b a r 3.3 dan 3.4)

Menurut beberapa ahli patologi anatomi, suatu nodul iritan sudah dapat
^disebut granuloma walaupun belum terdapat sel datia d a n hanya ditemukan s c l -

51

| l radang mononuklear, multinuklear, dan atau sel-sel epiteloid saja.
^ait

Hal ini

dengan pengertian granuloma itu sendiri yang artinya tumor yang

Jrbentuk dari sel-sel granul (sel-sel radang).

Sedangkan pembentukkan sel

'^tia sangat berkaitan dengan faktor waktu, yakni lamanya iritasi terjadi dan
^ o r intensitas iritan.

Granuloma yang telah mengalami proses degenerasi

f ibat hipovaskularisasi di bagian sentralnya akan mengalami degenerasi sentral

I
yan kondisi ini akan digantikan oleh jaringan fibrosis.
Untuk

kepentingan

penelitian,

peneliti

memutuskan

untuk

menilai

ipnuloma yang sudah mengandung sel-sel epiteloid.

V

I

gambar 3.3. Tampak kumpulan sel-sel radang yang disebut granuloma pada irisan jaringan
^nj, di sekitar bronkus yang terdiri dan sel-sel mononuklear di bagian tepi dan sel- sel datia di
^gian tengahnya (ditunjukkan dengan panah merah) (www.lumen.luc. edu)

52

•Gambar 3.4. Granuloma (tanda 'i^)yang ditemukan pada preparat jaringan pam tikus kelompok
fAR20 (yang diberi aqua destilata dan asap rokok) tampak di sekitar bronkus, sel mononuklear
'berada di tepi (panah merah), dan sel datia berkumpul di bagian inti granuloma (panah kuning)

3.8.2

Sel Datia

S e l datia atau giant cell a d a l a h s e l r a k s a s a y a n g b e r a s a l dari penyatuan
beberapa sel epiteloid, tampak s e b a g a i sel y a n g s i t o p l a s m a n y a b e s a r d a n berinti
^anyak.

Sumber

Rermodifikasi y a n g
Benggabungan

lain

mengatakan,

sangat

sel epiteloid

sel

datia

besar, multinuklear,
atau

dari

yang

pembelahan

p t o p l a s m a dari monosit. • '^• • '^-l
e ( G a m b a r 3.5 d a n 3.6)

53

adalah

setiap

dapat

makrofag

terbentuk

inti tanpa

dari

pembelahan

Gambar 3.5. Sel datia dengan pewamaan HE tampak sebagai sel raksasa berinti banyak,
^merupakan penyatuan dari beberapa sol epiteloid sebagai reaksi tertiadap benda asing
'(www.medlib.med.utah.edu)

Gambar 3.6. Sel-sel epiteloid yang mulai menyatu dan akan membentuk sel datia, ditemukan
pada preparat tikus periakuan

54

Gambar 3.7. Panah merah pada gambar A adalah sel datia, tampak sel besar dan sitoplasma
'dominan berisi multinuklear. Panah merah pada gambar B menunjukkan granuloma, panah hijau
frnenunjukkan sel neutrofil, dan panah biru menunjukkan makrofag aktif Gambaran ini
^menunjukkan bahwa granuloma tidak hanya terdiri dari sel radang kronik tetapijuga sel radang
\akut.

3.8.3

Fibrosis

K e r u s a k a n jaringan
jaringan

ikat paru.

tegenerasi

Jika

akibat

radang

perbaikan tidak

kronik

melibatkan

sel epitel

dan

dapat tercapai s e p e n u h n y a

oleti

sel septa (pneumosit tipe II), m a k a p e r g a n t i a n n y a a k a n melibatkan

aringan fibrosis. S a a t itu y a n g teriihat a d a l a h p e n e b a l a n dinding alveoli d a n juga
penebalan dinding p e m b u l u h darah y a n g b e r a d a di d e k a t n y a . ^^• '^'^-''^ ( G a m b a r
^.'O d a n 3.9)
Jaringan fibrosis a d a l a h tahapan terakhir dari s u a t u p r o s e s p e r a d a n g a n ,
^ i m a n a p e n y e m b u h a n tidak bisa terjadi s e m p u r n a . D a l a m penelitian ini fibrosis
^ang

dinilai

dalam

preparat

adalah jaringan

fibrosis

yang

terdapat

dalam

'granuloma, hal ini meningkatkan spesifikasi tingkat k e r u s a k a n akibat partikel zyxwvutsrqponmlk

I
asap rokok.
if

55

•Gambar 3.8. Fibrosis jaringan paru di selesaran y a n g d i g u n a k a n

untuk p e n g a m b i l a n g a m b a r a d a l a h 50 kali d a n 2 0 0 kali.

58

Nikon