Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba [Azardirachta indica A. Juss] FP30, FP40, dan FP60 terhadap kultur sel myeloma - USD Repository

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP

30 , FP

40 , FP 50 , dan FP

  60 TERHADAP

KULTUR SEL MYELOMA

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Anastasia Yuli Ekasaptawati NIM : 038114016

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP

30 , FP

40 , FP 50 , dan FP

  60 TERHADAP

KULTUR SEL MYELOMA

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Anastasia Yuli Ekasaptawati NIM : 038114016

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

“Hal-hal yang benar-benar kau yakini, pasti akan selalu terjadi;

dan keyakinan akan suatu hal, akan menyebabkannya terjadi” -

Frank Lloyd Wright

“You don't have to be afraid of change. You dont have to worry

about what's been taken away. Just look to see what's been added”

• - Jackie Greer

  

Ia membuat segala sesuatu indah pada waktunya, bahkan Ia

memberikan kekekalan dalam hati mereka. Tetapi manusia tidak

dapat menyelami pekerjaan yang dilakukan Allah dari awal sampai

akhir - Pengkhotbah 3:11

  Dedicated with love to: My King who died for me, JESUS

  My heroes who fight for me, Mum and Dad My sisters who cheer up my life, Tia and Tyas My beloved who always there for me….

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

PRAKATA

  Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa sehingga atas berkat rahmat dan anugerahnya penulis bisa menyelesaikan skripsinya yang berjudul “Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 ,

  FP

  40 , FP 50 ,dan FP 60 terhadap Kultur Sel Myeloma”.

  Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak untuk itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  2. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik, saran dan waktunya.

  4. dr. Luciana Kuswibawati, M.Kes., selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik, saran dan waktunya.

  5. Mbak Yuli, Pak Rajiman dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan dengan baik.

  6. Bapak, ibu dan adik-adikku tercinta atas kasih sayang, doa dan dukungannya selama ini.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  7. Robertus Bangun Antoro yang senantiasa memberi dorongan motivasi, doa, serta berbagi suka dan duka.

  8. Sari, Melon, Vita, Lusi, Jeny, Ndari, Lea, buat kebersaman dan kerjasamanya selama penelitian.

  9. Uti, Neti, Lina, Sinta, Opunk, Meta, Agung, Widi, Win, Tanti buat persahabatan yang indah. Aku tak merasa sendiri karena kalian......

  10. D’ Sindens (Angger-Tata- Rosa ’sapi’-Vera ’sundes’- Sari ’Sri’- Dita-Dita ’Bu Man’-Moncee) dan teman-teman kelas A angkatan 2003 buat kebersamaan yang indah selama ini.

  11. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

  Tidak dapat dipungkiri tulisan ini masih jauh dari sempurna. Maka dari itu penulis tidak menutup diri untuk koreksi dan saran yang membangun dari pembaca. Harapan penulis karya ini bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa angkatan berikutnya untuk berkarya lebih baik bagi kemajuan dunia farmasi di Indonesia.

  Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

INTISARI

  Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang sangat mematikan di dunia. Banyak penelitian menggunakan sumber bahan obat dari alam nabati yang digunakan untuk mengobati penyakit tersebut, salah satunya yaitu daun mimba (Azadirachta indica A. Juss). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 ,

  FP

  40 , FP 50 , dan FP 60 berpotensi sebagai antikanker.

  Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan pada sel Myeloma dan sel Vero dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel yang kemudian diolah dengan menggunakan analisis probit dan uji T sampel independen.

  Dari hasil penelitian harga LC

  50 yang diperoleh dari fraksi protein daun

  mimba FP

  30 , FP 40 , FP 50 , dan FP 60 terhadap sel myeloma berturut-turut adalah

  sebesar 0,71

  50 untuk FP 30 ,

  μg/ml; 2,04 μg/ml; 1,88 μg/ml; 1,48 μg/ml. Harga LC FP

  40 , FP 50 , dan FP

60 terhadap sel vero berturut-turut adalah 0,01

  μg/ml; > 1 g/ml; 0,03 berefek paling sitotoksik.

  30

  μg/ml; 0,05 μg/ml. Dapat disimpulkan bahwa FP Berdasarkan harga LC

  50 ; FP 30 , FP 50 dan FP 60 tidak berpotensi untuk

  dikembangkan sebagai antikanker. Sedangkan FP

  40 tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker berdasarkan uji T sampel independen.

  Kata kunci: daun mimba, sitotoksisitas, kanker, sel myeloma, sel vero, LC

  50

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

ABSTRACT

  Cancer is one of deadly diseases in the world. Many researchs use natural medicine plant for curing the disease. One of them is neem leaves (Azadirachta

  indica

  A. Juss). The purpose of this research was to determine which protein fraction of neem leaves have cytotoxic effect against myeloma cells..

  The research is a pure experimental with the complete random- design, one way pattern. Cytotoxicity test was done at Myeloma cell and Vero cell by using MTT method (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Data in percentage of the death cells were analysed by probit and independent-samples T test.

  The result show that on myeloma cell, the LC

  50 value of protein fraction

  PF 30, PF

  40 , PF 50 , PF 60 are 0,71

  50

  μg/ml; 2,04 μg/ml; 1,88 μg/ml; 1,48 μg/ml. LC value of protein fraction PF 30, PF

  40 , PF 50 , PF 60 to vero cells are 0,01

  μg/ml; > 1 g/ml; 0,03 have the highest cytotoxic

  30

  μg/ml; 0,05 μg/ml. In conclusion, PF effect.The LC

  50 value, indicate that PF 30, PF 50 , and PF 60 doesn’t have anticancer

  potency. Independent-samples T test, indicate that PF

  40 doesn’t have anticancer potency.

  Keyword: neem leaves, cytotoxicity, cancer, myeloma cell, vero cell, LC .

  50

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................... .. ii

  HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iii HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iv

  HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v PRAKATA.................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... viii

  INTISARI...................................................................................................... ix

  

ABSTRACT .................................................................................................... x

  DAFTAR ISI................................................................................................. xi DAFTAR TABEL......................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvii

  DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xviii ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH PENTING..………………………….. xix

  BAB I PENGANTAR .................................................................................. 1 A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

  1. Permasalahan .............................................................................. 3

  2. Keaslian penelitian ...................................................................... 3

  3. Manfaat penelitian....................................................................... 4

  B. Tujuan Penelitian… ............................................................................. 4

  1. Tujuan umum…… ...................................................................... 4

  2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA........................................................... 6 A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)........................................ 6

  G. Landasan Teori..................................................................................... 15

  C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 17

  5. Definisi operasional .................................................................... 17

  4. Variabel pengacau tak terkendali ................................................ 16

  3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 16

  2. Variabel tergantung..................................................................... 16

  1. Variabel bebas............................................................................. 16

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 16 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 16 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................... 16

  H. Hipotesis............................................................................................... 15

  F. Uji Sitotoksisitas .................................................................................. 14

  1. Keterangan botani ....................................................................... 6

  E. Sel Vero................................................................................................ 13

  D. Sel Myeloma……… ............................................................................ 12

  C. Protein……………. ............................................................................. 9

  B. Kanker .................................................................................................. 7

  5. Penelitian mengenai tanaman mimba…………………………... 7

  4. Khasiat dan penggunaan ............................................................. 7

  3. Kandungan kimia ........................................................................ 6

  2. Deskripsi ..................................................................................... 6

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  1. Alat ............................................................................................ 17

  2. Bahan .......................................................................................... 17

  D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 18

  1. Determinasi tanaman................................................................... 18

  2. Pengumpulan daun mimba........................................................... 19

  3. Sterilisasi alat dan bahan............................................................. 19

  4. Preparasi fraksi protein daun mimba .......................................... 19

  5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV ............ 20

  6. Propagasi dan panen sel Myeloma.............................................. 21

  7. Propagasi dan panen sel Vero…………………………………... 22

  8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma 23

  9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero......... 24

  E. Analisis Hasil....................................................................................... 25

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 27 A. Determinasi Tanaman .......................................................................... 27 B. Pengumpulan Daun Mimba ................................................................. 27 C. Sterilisasi Alat dan Bahan .................................................................... 28 D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba .................................... 28 E. Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Spektrofotometri UV ...... 30 H. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba...................................... 31 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 39 A. Kesimpulan .......................................................................................... 39 B. Saran..................................................................................................... 39 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 40 LAMPIRAN.................................................................................................. 43 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 89

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm .............................. 30

  Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Myeloma ………………….……………………………. 33 Tabel III. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero.......………………….…………………………….. 35 Tabel IV. Harga LC fraksi protein daun mimba terhadap

  50

  sel Myeloma………………….…………………………….. 36 Tabel V. Hasil LC

  50 fraksi protein daun mimba terhadap

  sel Vero………………….…………………………………. 36 Tabel VI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  30

  terhadap kultur sel Myeloma................................................... 45 Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  40

  terhadap kultur sel Myeloma................................................... 45 Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  50

  terhadap kultur sel Myeloma................................................... 46 Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  60

  terhadap kultur sel Myeloma................................................... 46 Tabel X. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  30

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  40

  terhadap kultur sel Vero........................................................... 48 Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  50

  terhadap kultur sel Vero........................................................... 48 Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP

  60

  terhadap kultur sel Vero........................................................... 49 Tabel XIV. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan

  260 nm ................................................................................ 50

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Sel Myeloma dan Sel Vero tanpa perlakuan …………..…... 32 Gambar 2 Kultur sel Myeloma dan sel Vero yang diberi

  Perlakuan fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 32 Gambar 3 Persen kematian sel Myeloma vs konsentrasi fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 34 Gambar 4 Persen kematian sel Vero vs konsentrasi fraksi protein daun mimba ……………………...………………………… 35 Gambar 5. Foto tanaman mimba …………............................................. 84 Gambar 6. Foto daun mimba …………................................................... 85 Gambar 7. Foto ELISA reader SLT 340ATC…………........................... 86 Gambar 8. Foto Spektrofotometer UV ………….................................... 86 Gambar 9. Foto Sentrifuse KPLC Series …………................................. 87

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat................................. .. 43 Lampiran 2. Absorbansi Sel dengan Metode MTT .................................... 45 Lampiran 3. Cara Perhitungan Konsentrasi Protein ................................... 50 Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba

  (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel myeloma dengan metode MTT…………………………………....…… 52 Lampiran 5. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba

  (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel vero dengan metode MTT…………………………………....…… 64 Lampiran 6. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel myeloma ………….………………………………. 76 Lampiran 7. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel vero ………….……………………………………. 77 Lampiran 8. Perhitungan nilai kolerasi LC Sel Myeloma dan Sel Vero

  50

  pada Taraf Kepercayaan 95%…………….……………….. 79 Lampiran 9. Hasil Uji Signifikansi LC antara Sel Myeloma

  50

  dan Sel Vero dengan Analisis Statistik …………………… 80 Lampiran 10. Foto tanaman dan daun mimba.............................................. 84 Lampiran 11. Foto ELISA reader, Spektrofotometer UV, dan Sentrifuge... 86 Lampiran 12. Surat Determinasi Tanaman ………………………………... 88

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

  FBS : Fetal Bovine Serum FP : Fraksi Protein LC

  50 : Lethal Concentration 50%

  MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid) reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N RPMI : Rosswell Park Memorial Institute SDS : Sodium Dodesil Sulfat

  tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan

  leher bengkok 96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB I PENGANTAR Latar Belakang Kanker adalah jenis tumor yang ganas. Penderita kanker semakin

  meningkat hampir tiap tahunnya. Di negara yang telah berhasil membasmi penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab utama kematian pada wanita antara 3-14 tahun (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Di Indonesia kanker masuk urutan ke-6 sebagai penyebab kematian. Penyakit kanker diperkirakan diidap oleh 15 orang per 100.000 penduduk di dunia (Kuswibawati, 2000).

  Obat antikanker yang ideal seharusnya dapat membunuh sel kanker tanpa membahayakan jaringan sehat. Sampai sekarang belum ditemukan obat-obatan yang memenuhi kriteria demikian (Katzung, 1989). Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal yang berproliferasi (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).

  Kesadaran akan bahaya bahan-bahan kimiawi yang terkandung dalam obat-obatan modern menyebabkan obat-obatan tradisional yang diwariskan secara

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  2 turun-temurun menjadi lebih penting dan bernilai. Bahan-bahan untuk itupun telah disediakan secara melimpah oleh alam Indonesia (Soedibyo, 1998).

  Kenyataan menunjukkan bahwa penggunaan obat tradisional dan obat dari alam akhir-akhir ini mengalami peningkatan, misalnya mimba (Azadirachta

  indica

  A. Juss). Tumbuhan ini bisa digunakan mulai dari kulit batang sampai daun segarnya. Berdasarkan penelitian sebelumnya beberapa khasiat daun mimba diantaranya, sebagai obat anti diabetes, antibakteri, analgesik, antiinflamasi, ekspektoran, karminatif, hepatitis, alergi, dan malaria (Keating, 1999). Dewasa ini, kepopulerannya semakin melambung karena dipercaya dapat digunakan sebagai antikanker (Kardinan dan Taryono, 2003).

  Suatu senyawa dinyatakan memiliki potensi sebagai antikanker jika memiliki nilai LC

  50 lebih kecil dari 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991).

  Penelitian sebelumnya menggunakan fraksi protein daun mimba hasil pengendapan ammonium sulfat 30%, 40%, dan 100% jenuh dengan konsentrasi 6,25

  μg/ml; 12,5 μg/ml; 25 μg/ml; 50 μg/ml; 100 μg/ml; dan 200 μg/ml (Hariadi, 2006), terbukti memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel myeloma. Dari hasil penelitian tersebut, pengendapan dengan ammonium sulfat 30% dan 60% dengan nilai LC sebesar 0,5 µg/ml dan 2,6 µg/ml berpotensi untuk dikembangkan

  50

  sebagai antikanker. Pada penelitian tersebut, diperoleh persen kematian melebihi 50% yang kemungkinan disebabkan oleh terlalu besarnya fraksi protein yang digunakan. Didasari oleh penelitian tersebut, maka dilakukan penelitian menggunakan proses fraksinasi untuk mencari fraksi protein yang memiliki efek

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  3 sitotoksik dengan menggunakan parameter LC

  50 dan yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker.

  1. Permasalahan

  Permasalahan yang timbul dalam penelitian ini adalah :

  a. fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan

  FP

  60 , manakah yang mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel

  myeloma?

  b. dari fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica seberapa besar nilai LC

  50 A. Juss) FP 30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 terhadap sel myeloma?

  c. apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 ,

  FP

  50 ,dan FP 60 , juga memiliki daya sitotoksisitas terhadap sel vero?

  d. apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 ,

  FP ,dan FP berpotensi dikembangkan sebagai antikanker jika dilihat dari

  50

  60

  daya sitotoksisitasnya terhadap sel myeloma dan sel vero?

  2. Keaslian penelitian

  Sebelumnya telah dilakukan penelitian mengenai “Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, dan 100% Jenuh terhadap Kultur Sel Myeloma (Hariadi, 2006)”. Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi potein daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 terhadap kultur sel myeloma.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, penggunaan dan efek sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap kultur sel myeloma dan sel vero.

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 , juga memiliki daya sitotoksisitas terhadap sel vero.

  A. Juss) FP

  Untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

  c.

  30 , FP 40 , FP

50 ,dan FP

60 terhadap sel myeloma.

  A. Juss) FP

  indica

  dari fraksi protein daun mimba (Azadirachta

  50

  4

3. Manfaat penelitian

  b.

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 yang mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel myeloma.

  Untuk mengetahui fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  2. Tujuan Khusus a.

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 berpotensi sebagai antikanker.

  Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  1. Tujuan Umum Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah fraksi protein daun

  

Tujuan Penelitian

  Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif untuk pengobatan kanker dengan menggunakan bahan dari alam.

  b.

  Untuk mengetahui nilai LC

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  5 d.

  Untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

  A. Juss) FP

  30 , FP 40 , FP 50 ,dan FP 60 berpotensi dikembangkan sebagai

  antikanker jika dilihat dari daya sitotoksisitasnya terhadap sel myeloma dan sel vero.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Azadirachta indica A. juss Keterangan Botani Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) berasal dari genus Azadirachta, famili Meliaceae, dan ordo Archiclamydae dengan sinonim Melia azadirachta Linn. Tanaman ini dalam bahasa Inggris dikenal dengan neem.

  (Backer dan Backuizen van den Brink, 1965; Hutapea, 1993).

  Deskripsi

  Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak, berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, dan berwarna coklat.

  Daun berwarna hijau, majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, dan tangkai daun panjang 8-20 cm. Bunga berwarna putih, majemuk, berkelamin dua, terletak di ujung cabang, bertangkai silindris, panjang 8-15 cm, kelopak hijau, mahkota halus, benang sari silindris berwarna putih kekuningan, putih lonjong, dan coklat muda. Buah berwarna hijau, berbentuk bulat telur, dan buni. Biji berbentuk bulat, berwarna putih, dan mempunyai diameter 1 cm. Tanaman mimba mempunyai akar tunggang yang berwarna coklat (Hutapea, 1993).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Kandungan Kimia

  Tumbuhan mimba mengandung azadirachtin, aspargin, margosin, asam glutamat, isolesin, karbohidrat, protein, lemak, kalsium, dan treonin (Anonim, 2004; Anonim, 1985).

  Khasiat dan Penggunaan

  Mimba banyak digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain digunakan sebagai penurun panas, pembunuh serangga, pencahar, pemacu enzim pencernaan, antiinflamasi, antirematik, antipiretik, penurun gula darah, antitukak lambung, hepatoprotektor, antifertilitas, antivirus, dan antikanker (Anonim, 1985; Anonim, 2004; Sukrasno, 2003).

  Penelitian Mengenai Tanaman Mimba

  Penelitian mengenai tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) telah banyak dilakukan antara lain sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) hasil pengendapan dengan ammonium sulfat 30%, 60%, dan 100% jenuh terhadap kultur sel Myeloma (Hariadi, 2006) dengan LC

  50

  sebesar 0,5µg/ml, 2,6µg/ml,dan 25,0 µg/ml; terhadap kultur sel Hela (Suwanto, 2006) dengan LC

  50 sebesar 1,0µg/ml, 4,1µg/ml, dan 407,7µg/ml; terhadap kultur

  sel SiHa (Candra, 2006) dengan LC sebesar 1,72µg/ml, 0,04µg/ml, dan 32,56

  50

  µg/ml; sedangkan terhadap kultur sel Raji (Robbyono, 2006) dengan LC

  50 sebesar 15,3µg/ml, 24,0µg/ml.

B. Kanker

  Kanker adalah suatu proliferasi sel-sel yang tidak dapat diatur. Kanker menunjukkan suatu kegagalan morfogenesis normal dan kegagalan diferensiasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  normal (Kimball, 1988). Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannya (Macdonald and Ford, 1997).

  Agen yang menyebabkan terjadinya kanker disebut karsinogen. Karsinogen mungkin dapat berupa zat kimia maupun fisika, seperti sinar radiasi ultraviolet, zat-zat kimia seperti hidrokarbon dan tar. Karsinogen berupa biologis misalnya virus (Franks and Teich, 1997).

  Kanker dapat menyerang berbagai sel pada seluruh organ di dalam tubuh, dari kepala sampai ujung kaki. Dalam keadaan normal sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkan, misalnya ada sel yang mau diganti karena mati atau rusak. Sedangkan sel kanker akan membelah meskipun tidak diperlukan, sehingga terjadi sel-sel baru yang berlebihan. Sel-sel baru mempunyai sifat seperti induknya yang sakit yaitu sel-sel yang tidak mempunyai daya atur (Kuswibawati, 2000).

  Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu kanker jinak (benigna) dan kanker ganas (maligna) (Macdonald and Ford, 1997). Disebut kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan di sekitarnya danmasuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas (Albert et al, 1994).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut: 1. hiperplasi adalah pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan.

  2. metaplasi yaitu pertumbuhan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga dewasa.

  3. displasi yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar dan orientasinya yang masih bersifat reversibel.

  4. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang bersifat ireversibel.

  5. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif.

  6. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan (Kuswibawati, 2000).

C. Protein

  Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta (Poedjiadi, 1994).

  Protein dalam tanaman terbagi menjadi dua yaitu protein biji dan protein daun. Beberapa protein biji memiliki sifat sebagai protein racun. Sebagian diantaranya mungkin berperan dalam melindungi tumbuhan dari serangan mikroba. Protein beracun lain memberikan harapan sebagai antikanker dan penyakit lain yang disebabkan oleh virus (Robinson, 1991).

  Cara untuk memisahkan protein dari suatu larutan adalah dengan mengendapkannya. Proses ini dilakukan dalam beberapa langkah yang kemudian

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  dikenal dengan istilah fraksinasi. Maksud dari langkah-langkah fraksinasi adalah untuk memisahkan campuran protein ke dalam suatu seri fraksi protein. Fraksinasi protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan dengan garam, misalnya dengan kalium atau amonium sulfat (Scopes cit Robbyono, 1994).

  Keuntungan fraksinasi menggunakan amonium sulfat adalah keefektifannya yang melebihi garam kation yang lain, selain itu harganya lebih murah dan ada manfaat yang lebih besar lagi yaitu dapat menstabilkan protein yang dimurnikan. Pada konsentrasi garam yang tinggi dapat mencegah terjadinya proteolisis dan juga mencegah pertumbuhan bakteri. Selain itu, amonium sulfat bersifat inert, tidak bereaksi dengan protein yang dipisahkan. Namun kelemahannya, amonium sulfat biasanya terkontaminasi oleh logam berat seperti besi, sehingga dapat mengganggu proses pengendapan. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan yang diinginkan dapat ditentukan dengan rumus yang mudah (Scopes cit Candra, 1994).

  Beberapa metode tersedia untuk determinasi protein, antara lain: 1) metode spektrofotometri

  Sebagian besar protein memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 280 nm karena adanya residu asam amino tirosin dan triptofan.

  Keuntungan metode ini yaitu sensitifitasnya tinggi dan tidak membutuhkan reagen. Komponen yang mengandung cincin purin dan pirimidin akan menyerap UV pada panjang gelombang 260 nm. Dengan demikian keberadaan beberapa komponen tersebut akan mengganggu pengukuran absorbansi protein pada panjang gelombang 280 nm. Oleh karena itu untuk pengukuran protein dilakukan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  pada panjang gelombang 260 nm dan 280 untuk mengoreksi adanya komponen- komponen tersebut (Kerese, 1984).

  2) metode biuret Prinsip dari metode biuret adalah mencampur larutan yang mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan

  CuSO

  4 yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai

  biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan

  2+

  karena reaksi antara Cu dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain

  2+

  berikatan dengan Cu sehingga membentuk kompleks warna biru violet, dimana semakin lama warna yang terbentuk akan semakin pekat (tua). Reaksi ini tidak dapat terjadi pada dipeptida dan asam amino bebas (kecuali serin dan Treonin). Range protein yang dapat dianalisis menggunakan merode biuret yaitu 0,2 sampai 2 mg (Alexander, 1985).

  3) metode lowry Prinsip dari metode Lowry adalah mencampur larutan yang mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan

  CuSO yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai

  4

  biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan

  2+

  karena reaksi antara Cu dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain

  2+ berikatan dengan Cu sehingga membentuk kompleks warna biru violet.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Kemudian terjadi reduksi reagen fosfomolibdat-fosfotungstat (reagen Folin- Ciocalteau) oleh tirosin, triptofan, dan sistein (Alexander,1985).

  4) metode “dye-binding” Interaksi antara reagen Coomassie Brilliant Blue G250 dengan protein memberikan perubahan warna yang teramati, sehingga kadar protein dapat ditetapkan dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm (Alexander, 1985).

D. Sel Myeloma

  Myeloma adalah tumor yang terdiri dari jenis sel yang biasa ditemukan dalam sumsum tulang (Katzung, 1989). Multiple myeloma (yang dikenal sebagai myeloma) merupakan penyakit hematologik progresif. Myeloma merupakan kanker pada sel plasma, bagian penting dari sistem imun yang menghasilkan immunoglobulin (antibodi) untuk membantu melawan infeksi dan penyakit.

  

Multiple myeloma ditandai dengan jumlah yang berlebihan dari sel plasma

  abnormal pada sumsum tulang dan produksi berlebihan dari immunoglobulin monoklonal (IgG, IgA, IgD, atau IgE). Hypercalcemia, anemia, kerusakan ginjal, meningkatnya kerentanan terhadap infeksi bakteri dan terganggunya produksi immunoglobulin adalah manifestasi klinis yang umum pada multiple myeloma (Anonim, 2005).

  Myeloma cell line pertama kali diambil pada tahun 1967 oleh R. Laskov dan MD Scharff dari Merwin Plasma Sel Tumor-11 (MPC-11) yang diisolasi dari mencit Balb/c yang diperoleh dari J. Fahey. Sel tumor ini diadaptasikan ke dalam kultur secara terus-menerus sampai 6 kali dan dipelihara dalam flask yang berisi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  media Dulbecco’s-Eagle’s dengan asam amino non essensial dan 20% serum kuda yang inaktif (Anonim cit Rahmawati, 1983).

  Sel myeloma dapat menimbulkan efek pada tulang, akan tetapi sel myeloma bukan termasuk ke dalam kanker tulang melainkan sel myeloma merupakan sel kanker darah atau sel kanker plasma. Pengobatan sel myeloma tergantung pada stadium yang diderita. Penyakit ini jarang terjadi, akan tetapi merupakan suatu penyakit yang mematikan (Anonim cit Hariadi, 2003).

E. Sel Vero

  Untuk pertama kalinya cell line diambil dari ginjal African Green Monkey dewasa pada tanggal 27 Maret 1967 oleh Y. Yasamura dan Y. Kawakita dari Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media yang berisi 0,5 % laktalbumin hidrosilat, 0,1 % ekstrak yeast dan 0,1 % polivinilpirolidan dalam 98 % Earle’s BBS dan 2 % calf serum. Konsentrasi calf serum akhirnya ditingkatkan menjadi 5 %. Kemudian sel di bawa ke laboratorium Virologi Tropis, Institut Alergi dan Infeksi Nasional Amerika, Institut Kesehatan Nasional Amerika setelah mencapai keturunan ke-93 dari Universitas Chiba oleh Dr. B. Simizu pada 15 Juni 1964. Mulai keturunan ke-97 sel vero ditumbuhkan dalam 95 % FBS (Fetal Bovine Serum), media Morgan, Morton dan Parker dan 95 % MEM (Minimum Essensial Medium) dengan asam amino non essensial dan Earl’s BSS dan 5% FBS. Sel vero digunakan secara luas pada studi replikasi virus dan uji penyakit pes. Selain itu juga digunakan untuk uji berbagai penyakit yang diakibatkan oleh virus. Akhirnya virus cell line diserahkan ke American Type Cultur Collection pada keturunan ke-113 (Anonim, 1983).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

F. Uji Sitotoksisitas

  Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik dari suatu senyawa (Freshney, 1986).

  Program pengembangan obat baru untuk mengidentifikasi agen kemoterapetik kanker yang baru melibatkan evaluasi preklinik yang luas dari sejumlah besar senyawa kimia. Uji tersebut biasanya dilakukan pada hewan percobaan yang mempunyai kesamaan sifat dengan manusia. Penelitian menggunakan hewan percobaan memegang peranan penting, namun ada beberapa pertimbangan yang menyebabkan kecenderungan untuk menggunakan kultur sel.

  Pertimbangan tersebut antara lain tes in vitro lebih murah dibanding in vivo, ada perbedaan proses fisiologi antara hewan percobaan dan manusia, dan ada pertimbangan moral dalam penggunaan hewan untuk penelitian (Freshney, 1986).

  Uji MTT mengindikasikan integritas dan aktivitas mitokondria, yang diintepretasikan sebagai tolak ukur kelangsungan hidup sel. Pada uji MTT, garam tetrazolium, 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide secara aktif diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi dalam mitokondrial membentuk suatu produk formazan berwarna ungu. Produk tersebut terakumulasi di dalam sel karena tidak bisa menembus membran sel (Barile cit Robbyono, 1997).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

G. Landasan Teori

  Kanker adalah adalah penyakit pertumbuhan tidak normal dari sel-sel jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker dalam perkembangannya, sel-sel kanker ini dapat menyebar ke bagian tubuh sehingga menyebabkan kematian.

  Myeloma adalah tumor yang terdiri dari jenis sel yang biasa ditemukan dalam sumsum tulang dan sel myeloma telah digunakan sebagai model untuk mengetahui daya sitotoksik.

  Banyak penelitian telah dilakukan untuk mencari alternatif obat antikanker yang berasal dari bahan alam. Salah satunya yaitu dengan menggunakan daun mimba. Dari hasil penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30%, 60%, dan 100% jenuh terhadap kultur sel myeloma (Hariadi, 2006), diperoleh harga LC

  50 sebesar 0,5 µg/ml (fraksi 30%)

  dan 2,6 µg/ml (fraksi 60%) yang berarti memikili potensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Hal tersebut mendasari dilakukannya penelitian dengan memfraksinasi protein daun mimba FP

  

30 , FP

40 , FP 50 , dan FP

  60. Diharapkan hasil

  penelitian dapat memberikan informasi tentang fraksi protein yang memiliki efek sitotoksik paling besar dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

H. Hipotesis

  Fraksi protein dari daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  30 , FP 40 ,

  FP

  50 , dan FP 60 memiliki efek sitotoksik sehingga berpotensi sebagai antikanker.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP 30 , FP 40 , FP 50 , dan FP 60 terhadap kultur sel Myeloma ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel bebas Kadar fraksi protein daun mimba yaitu 0,20

  μg/ml; 0,39 μg/ml; 0,78 μg/ml; 1,56

  μg/ml; 3,13 μg/ml; 6,25 μg/ml; 12,5 μg/ml; 25 μg/ml; 50 μg/ml; 100 μg/ml dan 200 μg/ml.

  2. Variabel tergantung Persentase kematian sel myeloma dan sel vero.

  3. Variabel pengacau terkendali a. pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu 4