Skripsi Berjudul OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA
SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:
Maria Yolanda NIM : 068114001
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA
SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:
Maria Yolanda NIM : 068114001
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
Skripsi Berjudul
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA
SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
Yang diajukan oleh: Maria Yolanda
NIM : 068114001 telah disetujui oleh: Pembimbing Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. tanggal………….. Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA
SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
Oleh: Maria Yolanda
NIM : 068114001
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal : 29 Mei 2010
Mengetahui Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Dekan Rita Suhadi, M.Si., Apt.
Pembimbing Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt.
Panitia Penguji : 1. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. ………………….
2. Christine Patramurti, M.Si., Apt. ………………….
Jalan-Nya bagimu Lewat jalan berliku yang kau lal Le lalui Lewat at tebing dan jurang yang menak nakutkan
Serta lewat wat jalan yang berputar-putar yang ang tak tentu arah tujuannya Bahkan an yang membuatmu kehilangan y n yang kau sayangi
Itu bukan karena Dia tak pedul peduli Tapi Dia m mendidik dan membentukmu jadi di saksi-Nya yang ang membawa berkat bagi sesam ama…
Tuhan me membuat segala sesuatu in indah pada waktunya,
Let go and Let God
Kupersembahkan ka karya ini untuk Bapak dan ibuku yan ang luar biasa, Hugo dan Ndayu yun tersayang, Para sahabat dan almamat ater tercinta….
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Maria Yolanda Nomor Mahasiswa : 068114001
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM
DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA SECARA KROMATOGRAFI
CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIKBeserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal: 15 April 2010 Yang menyatakan
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Bapa Yang Maha Kuasa atas segala limpahan berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Optimasi Dan Validasi Metode Penetapan Kadar Aspartam Dalam Minuman Serbuk Beraroma Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang dengan sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.
3. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing akademik dan dosen penguji, atas bimbingan, saran, kritik, nasehat dan semangat yang telah diberikan selama ini.
4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji atas saran, masukan dan diskusi yang telah diberikan.
5. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma: Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Otok, dan Pak Timbul yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium.
6. Ibu Ani Fatima atas bantuan dalam pengadaan baku aspartam sehingga penelitian dapat berjalan lancar.
7. Keluarga keduaku Kak Ivonne, Kak Nora, Tere, Cici, Esti. Terima kasih sudah menemani dan mendukung di masa-masa penuh perjuangan ini. Kalian begitu berarti.
8. Adhitya Eka Prasetya, teman seperjuangan dan tempat berbagi keluh kesah selama penelitian dan penyusunan skripsi. Terima kasih partner.
9. Gregorius Adhi dan Yudhi Pradana atas suka, duka, dan semangat yang kita bagi bersama.
10. Sahabat mungilku: Uut, Dewi, Sinta, atas kebersamaan, dukungan dan persahabatan kita.
11. Robertus V. Mahartantyo, atas kasih, senyum, air mata dan pengalaman berharga yang membuatku belajar sangat banyak.
12. Keluarga besar Ceria: mami, Kak Ivonne, Mikha, Mery, Oktin, Okvi, Putri, Tyas, Sherly, Tere, Esti, Cici, Lia, atas bantuan dan dukungan selama di Yogyakarta.
13. Pecinta KCKT, Heny, Octav, Jimmy, Bayu, Micell, Ange, Pungky, Aya, Roby. Terima kasih atas masukan, saran, ide dan diskusi yang sangat membantu penulis.
14. Teman bermain dan belajar, Dani, Nika, Adit, Uut, Phita dan Aya. Mari kita bermain (dan belajar).
15. Teman-teman FST angkatan 2006, atas tawa, canda, kebersamaan dan kekompakan yang begitu indah dan tak terlupakan. One for the FST.
16. Keluarga besar Paduan Suara Mahasiswa Cantus Firmus. Suatu kebanggaan bisa eksis bersama kalian. Nyayian kita akan selalu tersimpan di hati.
17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini. Tidak tertulis di sini bukan berarti tidak tertulis di hati. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan.
Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada khususnya dan ilmu pengetahuan pada umumnya.
Yogyakarta, 15 April 2010 Penulis
Pernyataan Keaslian Karya
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 15 April 2010 Penulis,
Maria Yolanda
INTISARI
Aspartam merupakan salah satu bahan tambahan makanan yang digunakan sebagai pemanis pengganti gula. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa penggunaan aspartam dapat memicu timbulnya berbagai macam penyakit sehingga penggunaannya pada berbagai jenis makanan dan minuman perlu dimonitor. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang digunakan dalam penetapan kadar aspartam.
Penelitian ini bersifat eksperimental deskriptif, menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan kolom Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 μm, fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (80 : 20), flow rate 1,4 mL/menit, dan detektor UV 214 nm.
Parameter validasi yang diteliti meliputi presisi, akurasi, linearitas, Limit of
Detection
(LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ). Hasil penelitian menunjukkan metode memiliki linearitas yang baik pada konsentrasi 2,0 – 6,0 mg/100 mL (r = 0,999). Nilai recovery dan CV berturut-turut untuk level kadar rendah, sedang dan tinggi adalah 99,0% dan 0,46%; 101,1% dan 1,13%; 100,1% dan 1,12%. Nilai LOD untuk aspartam adalah 0,11 mg/100 mL sedangkan nilai LOQ 0,38 mg/100 mL. Berdasarkan hasil tersebut maka metode ini valid untuk penetapan kadar aspartam.
Kata kunci : aspartam, KCKT fase terbalik, validasi metode
ABSTRACT
Aspartame is one of food additional substances which is used as a sweetener instead of sugar. Several researches conclude that the usage of aspartame can touch off the emergence of some diseases and that is why its users need monitoring. This research is aimed to discover validity of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method of reversed phase which is employed in aspartame determination.
This is a non experimental descriptive research using HPLC method with reversed phase by using Kromasil column-100 C18 250x4.6 mm, 5 μm, phosphate buffer mobile phase pH 4 : acetonitrile (80 : 20), flow rate 1.4 mL/minute, and detector UV 214 nm.
Validity parameter is observed included precision, accuracy, linearity, Limit of
Detection (LOD), and Limit of Quantitation (LOQ). Result of the research shows that
the method holds a decent linearity on concentration 2.0 – 6.0 mg/100 mL (r = 0.999). Recovery point and successive CV to low level, medium, and high are 99.0% and 0.46%; 101.1% and 1.13%; 100.1% and 1.12%. LOD point to aspartame is 0.11 mg/100 mL while LOQ is 0.38 mg/100mL. Based on the result, it can be summed up that this particular method is valid to aspartame determination.
Keywords : Aspartame, reversed phase HPLC, method validation.
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ................................................................................................i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI..................................................................iii HALAMAN PERSEMBAHAN ..............................................................................iv HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................................................... v KATA PENGANTAR .............................................................................................vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................................ix
INTISARI ................................................................................................................ x
ABSTRACT
...............................................................................................................xi DAFTAR ISI........................................................................................................... xii DAFTAR TABEL...................................................................................................xvi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xvii DAFTAR LAMPIRAN...........................................................................................xix
BAB I PENGANTAR .............................................................................................. 1 A. Latar Belakang ........................................................................................... 1
1. Permasalahan.......................................................................................... 3
2. Keaslian Penelitian................................................................................. 4
3. Manfaat Penelitian ................................................................................. 4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA....................................................................... 5 A. Bahan Tambahan Makanan ........................................................................ 5 B. Pemanis Buatan .......................................................................................... 6 C. Aspartam .................................................................................................... 7
1. Deskripsi Aspartam ................................................................................ 7
2. Penggunaan Aspartam ............................................................................ 8
3. Kajian Keamanan ................................................................................... 9
4. Metode Analisis Aspartam .................................................................... 10
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi............................................................. 11
1. Kromatografi Partisi Fase Terbalik........................................................ 12
2. Fase Diam .............................................................................................. 13
3. Fase Gerak ............................................................................................. 13
4. Kolom dan Kinerjanya........................................................................... 15
5. Pengekoran Puncak Kromatogram ........................................................ 19
6. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif ......................................................... 21
E. Parameter Validasi Metode Analisis ......................................................... 22
1. Akurasi................................................................................................... 22
2. Presisi..................................................................................................... 23
3. Selektivitas............................................................................................. 24
4. Linearitas dan Rentang .......................................................................... 24
5. Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitation (LOQ) ............... 24
G. Hipotesis.................................................................................................... 26
BAB III METODE PENELITIAN.......................................................................... 27 A. Jenis Penelitian.......................................................................................... 27 B. Variabel Penelitian .................................................................................... 27
1. Variabel bebas ....................................................................................... 27
2. Variabel tergantung ............................................................................... 27
3. Variabel terkendali ................................................................................ 27
C. Bahan-bahan Penelitian ............................................................................. 28
D. Alat-alat Penelitian .................................................................................... 28
E. Tata Cara Penelitian................................................................................... 29
1. Optimasi Metode KCKT ....................................................................... 29
2. Verifikasi Sistem ................................................................................... 31
3. Validasi Metode..................................................................................... 32
F. Analisis Hasil ............................................................................................. 33
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 36 A. Optimasi Metode ...................................................................................... 36
1. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan ........................................ 36
2. Optimasi Fase Gerak ............................................................................. 37
3. Pengamatan Waktu Retensi Aspartam .................................................. 46
B. Verifikasi Sistem KCKT ........................................................................... 50
1. Verifikasi akurasi pompa....................................................................... 50
C. Pembuatan Kurva Baku............................................................................. 52
D. Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Aspartam .................................. 54
1. Selektivitas............................................................................................. 55
2. Linearitas ............................................................................................... 55
3. Akurasi................................................................................................... 56
4. Presisi..................................................................................................... 57
5. LOD dan LOQ ....................................................................................... 57
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................. 60 A. Kesimpulan ............................................................................................... 60 B. Saran .......................................................................................................... 61 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 62 LAMPIRAN ............................................................................................................ 65
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Nilai indeks polaritas dan eluen strength pelarut ............................... 15 Tabel II. Kriteria % recovery yang diijinkan .................................................... 22 Tabel III. Kriteria presisi yang diijinkan untuk konsentrasi analit yang berbeda ...................................................................................... 23 Tabel IV. Hasil optimasi flow rate fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (80 : 20) .................................................................. 44 Tabel V. Data penyimpangan flow rate pada uji akurasi pompa....................... 51 Tabel VI. Hasil uji presisi sistem injeksi ............................................................ 52 Tabel VII. Data kurva baku aspartam................................................................... 53 Tabel VIII. Hasil penetapan recovery aspartam .................................................... 56 Tabel IX. Hasil penetapan CV aspartam............................................................. 57
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Struktur kimia aspartam ...................................................................... 7 Gambar 2. Peralatan KCKT ................................................................................. 12 Gambar 3. Difusi Eddy ........................................................................................ 17 Gambar 4. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor ....................... 20 Gambar 5. Distribusi dalam fase diam dan fase gerak......................................... 21 Gambar 6. Gugus kromofor aspartam .................................................................. 36 Gambar 7. Spektrum panjang gelombang aspartam ............................................ 37 Gambar 8. Reaksi ionisasi aspartam .................................................................... 39 Gambar 9. Degradasi aspartam ............................................................................ 40 Gambar 10. Kromatogram optimasi fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (95 : 5) ................................................................... 41 Gambar 11. Kromatogram optimasi fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (90 : 10) .................................................................. 41 Gambar 12. Kromatogram optimasi fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (85 : 15) .................................................................. 42 Gambar 13. Kromatogram optimasi fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (80 : 20) .................................................................. 42 Gambar 14. Kromatogram pemisahan aspartam pada sampel dengan fase gerak bufer
Gambar 15. Kurva flow rate vs HETP fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (80 : 20) ................................................................... 45 Gambar 16. Kromatogram waktu retensi baku aspartam....................................... 46 Gambar 17. Kromatogram waktu retensi sampel.................................................... 47 Gambar 18. Kromatogram waktu retensi aspartam + baku aspartam ..................... 48 Gambar 19. Ikatan aspartam dengan fase gerak...................................................... 49 Gambar 20. Ikatan aspartam dengan fase diam ...................................................... 50 Gambar 21. Kurva hubungan antara konsentrasi aspartam (mg/100 ml) dengan AUC/100000 ........................................................................... 54
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Sertifikat analisis aspartam............................................................. 66 Lampiran 2. Contoh perhitungan N dan HETP ................................................... 67 Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate fase gerak bufer fosfat pH 4 : asetonitril (80 : 20) ........................................... 68 Lampiran 4. Tabel hasil penetapan presisi injeksi .............................................. 73 Lampiran 5. Kromatogram penetapan presisi injeksi.......................................... 74 Lampiran 6. Kromatogram kurva baku aspartam replikasi I............................... 81 Lampiran 7. Kromatogram kurva baku aspartam replikasi II ............................ 86 Lampiran 8. Kromatogram kurva baku aspartam replikasi III ............................ 91 Lampiran 9. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku ................ 96 Lampiran 10. Kromatogram hasil validasi metode replikasi I .............................. 97 Lampiran 11. Kromatogram hasil validasi metode replikasi II............................ 100 Lampiran 12. Kromatogram hasil validasi metode replikasi III .......................... 103 Lampiran 13. Data penimbangan dan perhitungan recovery ............................... 106 Lampiran 14. Perhitungan LOD dan LOQ .......................................................... 109
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Zat-zat pemanis makanan dan minuman pengganti gula saat ini banyak
digunakan dalam aneka jenis makanan dan minuman. Zat tersebut ditambahkan untuk memberikan persepsi rasa manis namun tidak memiliki nilai gizi.
Salah satu jenis makanan atau minuman yang menggunakan pemanis pengganti gula adalah minuman serbuk beraroma. Minuman minuman serbuk beraroma adalah minuman ringan yang dikonsumsi dengan cara melarutkan serbuk tersebut kedalam air sesuai dengan saran penyajian yang biasanya dicantukan pada kemasan. Untuk meningkatkan minat konsumen akan produknya, produsen biasanya menambahkan bahan tambahan seperti pemanis buatan untuk meningkatkan cita rasa pada produk minuman serbuk beraroma tersebut.
Aspartam adalah salah satu pemanis buatan yang paling laris digunakan saat ini. Aspartam merupakan pemanis buatan dari golongan gula non-sakarida yang banyak dipakai untuk produk-produk diet atau produk rendah kalori. Dibuat dengan menggabungkan 2 buah asam amino, yaitu fenilalanin dan asam aspartat dengan derajat kemanisan sekitar 160 sampai 200 kali gula pasir dan hampir tidak mengandung kalori.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa penggunaan aspartam sebagai seperti penyakit Alzheimer, epilepsi, tumor otak, stroke dan penyakit jantung. Walaupun demikian, pemakaian aspartam sebagai pemanis buatan masih diijinkan oleh FDA (Food and Drug Administration) namun dengan batas-batas pemakaian yang dianjurkan agar penggunaannya aman (Maisons and Alfort, 2002).
Di Indonesia, Berdasarkan Peraturan Kepala POM No. HK 00.05.5.1.4547/2004 pasal 6 ayat 3, produk pangan yang mengandung aspartam wajib mencantumkan peringatan untuk pasien fenilketonuria yang tertulis jelas pada kemasan produk. Berdasarkan Peraturan Kepala POM No. HK 00.05.5.1.4547/ 2004 batas maksimum penggunaan aspartam adalah 50 mg/kg berat badan per hari.
Penetapan kadar aspartam dan beberapa pemanis buatan lainnya dalam minuman ringan pernah dilakukan Hayun, dkk. (2004) dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan detektor UV. Fase diam yang digunakan adalah C-18 Latek (15 cm x 4,0 mm) dan fase gerak asetonitril : bufer asetat (5 : 95).
Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian Hayun dkk. terletak pada komposisi fase gerak, fase diam dan sampel yang digunakan. Pada penelitian ini digunakan fase diam C-18 merek Kromasil (25 cm x 4,6 mm) dan fase gerak buffer fosfat : asetonitril (80 : 20), sedangkan sampel yang digunakan adalah minuman serbuk beraroma. Dengan adanya perbedaan tersebut maka perlu dilakukan kembali optimasi dan validasi untuk penetapan kadar aspartam dalam minuman serbuk beraroma karena sistem KCKT dalam penelitian Hayun dkk. belum tentu memberikan hasil optimal jika digunakan dalam penelitian ini.
Aspartam bersifat polar dengan gugus yang mudah terionisasi mudah terionisasi yaitu COOH dan NH
2 karena adanya pasangan elektron bebas (Anonim,
2005). Oleh karena itu dipilih sistem KCKT fase terbalik dimana fase diamnya bersifat non polar dan fase geraknya polar sehingga aspartam memiliki afinitas yang lebih besar pada fase gerak dan pemisahan menjadi lebih efisien.
Metode Kromatografi Kinerja Tinggi Fase Terbalik adalah metode terpilih yang digunakan dalam analisis aspartam dalam minuman serbuk beraroma.
Berdasarkan hasil penelitian ini diharapkan dapat diperoleh metode penetapan kadar aspartam menggunakan metode KCKT yang memiliki akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas yang baik. Penelitian ini merupakan penelitian pendahulu dari penelitian lain mengenai penetapan kadar aspartam dalam minuman serbuk beraroma secara KCKT fase terbalik.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: Apakah metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik dengan fase diam C- 18 dan fase gerak asetonitril : bufer fosfat pH 4 (20 : 80 v/v) yang digunakan dalam penetapan kadar aspartam dalam minuman serbuk beraroma memiliki validitas yang baik?
2. Keaslian Penelitian
Berdasarkan sumber informasi yang diperoleh penulis, validasi penetapan kadar aspartam dalam minuman serbuk beraroma secara KCKT fase terbalik belum pernah dilakukan. Namun penelitian mengenai kadar aspartam dan beberapa jenis pemanis buatan lainnya pernah dilakukan oleh Hayun, dkk. (2004) pada sampel minuman ringan bersoda secara KCKT menggunakan kolom C-18 Latex (15 cm x 4,0 mm) dan fase gerak campuran asetonitril : buffer asetat pH 5 (5 : 95) dengan detektor UV pada panjang gelombang 254 nm.
3. Manfaat Penelitian
Manfaat teroritis penelitian ini adalah memberikan informasi tentang validasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi untuk penetapan kadar aspartam.
Manfaat metodologis penelitian ini adalah memberikan informasi tentang pengembangan metode analisis untuk penetapan kadar aspartam agar nantinya dapat digunakan sebagai metode analisis alternatif untuk penetapan kadar aspartam.
B. Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui apakah metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik dengan fase diam C-18 dan fase gerak asetonitril : bufer fosfat pH 4 (20 : 80 v/v) yang digunakan pada penetapan kadar aspartam dalam minuman serbuk beraroma memiliki validitas yang baik.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Bahan Tambahan Makanan Berdasarkan Peraturan Menteri Kesehatan RI No. 722/Menkes/Per/IX/1988 Bahan Tambahan Makanan (BTM) adalah bahan yang ditambahkan ke dalam
makanan untuk mempengaruhi sifat atau bentuk pangan baik yang mempunyai atau tidak mempunyai nilai gizi, antara lain pemanis buatan, bahan pengawet, pewarna, penyedap rasa dan aroma, anti gumpal dan pengental. Ketentuan lain yang mengatur penggunaan bahan tambahan makanan adalah larangan bagi setiap orang yang memproduksi pangan untuk diedarkan menggunakan bahan tambahan makanan yang dinyatakan terlarang atau melampaui ambang batas maksimal yang telah ditetapkan.
Penambahan BTM secara umum bertujuan untuk meningkatkan nilai gizi makanan, memperbaiki nilai sensori makanan, dan memperpanjang umur simpan makanan. Selain tujuan-tujuan di atas, BTM sering digunakan untuk meproduksi makanan untuk kelompok khusus seperti penderita diabetes, pasien yang baru mengalami operasi, orang-orang yang menjalankan diet rendah kalori atau rendah lemak, dan sebagainya. Berbagai BTM yang digunakan untuk maksud tersebut di antaranya pemanis buatan, pengganti lemak (fat replacer), dan pengental (Siagian, 2002).
B. Pemanis Buatan
Pemanis merupakan senyawa kimia yang sering ditambahkan dan digunakan untuk keperluan produk olahan pangan, industri, dan minuman serta makanan kesehatan. Pemanis berfungsi untuk meningkatkan cita rasa dan aroma, memperbaiki sifat fisik, sebagai pengawet, memperbaiki sifat-sifat kimia, mengembangkan jenis minuman dan makanan dengan jumlah kalori terkontrol, dan sebagai bahan substitusi pemanis utama (Sakidja, 1989).
Berdasarkan Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor : HK.00.05.5.1.4547, pemanis buatan adalah bahan tambahan pangan yang dapat menyebabkan rasa manis pada produk pangan yang tidak atau sedikit mempunyai nilai gizi atau kalori, hanya boleh ditambahkan ke dalam produk pangan dalam jumlah tertentu.
Pemanis buatan adalah bahan tambahan yang dapat menyebabkan rasa manis pada pangan, tetapi tidak memiliki nilai gizi. Beberapa pemanis buatan yang telah dikenal dan banyak digunakan adalah sakarin, siklamat, aspartam, dulsin, sorbitol sintetis, nitro-propoksi-anilin (Sakidja, 1989).
Pemanis buatan diperoleh secara sintetis melalui reaksi-reaksi kimia di laboratorium ataupun skala industri. Karena diperoleh melalui proses sintetis dapat dipastikan bahan tersebut mengandung senyawa-senyawa sintetis. Penggunaan pemanis buatan perlu diwaspadai karena dalam takaran yang berlebih dapat menimbulkan efek samping yang merugikan kesehatan manusia. Hasil penelitian dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu Organisasi Kesehatan Dunia (World Health
Organization
/WHO) telah menetapkan batas-batas yang disebut Acceptable Daily
Intake
(ADI) atau kebutuhan per orang per hari, yaitu jumlah yang dapat dikonsumsi tanpa menimbulkan risiko. Sejalan dengan itu, di negara-negara Eropa, Amerika dan juga di Indonesia telah ditetapkan standar penggunaan pemanis buatan pada produk makanan (Ambarsari dkk., 2009).
Menurut peraturan Menteri Kesehatan RI No. 722/Menkes/Per/IX/88, produk pangan yang menggunakan pemanis buatan harus mencantumkan jenis dan jumlah pemanis buatan dalam komposisi bahan atau daftar bahan pada tabel.
C. Aspartam
HO H N O 2 O O NH O
C H N O BM: 294,3
14
18
2
5 Gambar 1. Struktur kimia aspartam
1. Deskripsi Aspartam
Aspartam atau Aspartil fenilalanin metil ester (APM) dengan rumus kimia
aspartyl-L-phenylalanine-1-methyl ester
dengan 220 kali tingkat kemanisan sukrosa dengan nilai kalori sebesar 0,4 kkal/ merupakan senyawa yang tidak berbau, berbentuk tepung kristal berwarna putih, sedikit larut dalam air, dan berasa manis. Aspartam memiliki tingkat kemanisan relatif sebesar 60 sampai g atau setara dengan 1,67 kJ/g (Gelardi, 1986).
Aspartam mengandung tak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 102,0% C
14 H
18 N
2 O
5. Kelarutan aspartam dalam air tergantung pada pH dan suhu. Kelarutan
maksimum tercapai pada pH 2,2 (20 mg/mL pada 25 C) (Anonim, 1995).
2. Penggunaan Aspartam
Mengacu pada asam amino pembentuk aspartam, maka aspartam bukanlah termasuk suatu bahan pemanis nonkalori karena seperti protein, aspartam dimetabolisme menjadi asam amino penyusunnya dan memiliki nilai energi 4 kkal/g. Tetapi karena dalam penggunaannya, 100 gram sukrosa dapat diganti dengan 1 gram aspartam maka dapat dikatakan bahwa aspartam merupakan bahan pemanis nonkalori (Sakidja, 1989).
Pemanis buatan aspartam merupakan pemanis buatan yang diijinkan digunakan dalam pembuatan produk makanan sesuai Peraturan Menteri Kesehatan N0.722 tahun 1988. Aspartam banyak digunakan oleh orang yang membatasi jumlah kalori misalnya penderita diabetes, orang yang obesitas atau yang menjaga berat badan. Aspartam juga berfungsi sebagai penegas rasa terutama cita rasa buah
Berdasarkan Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republi k I ndonesia Nomor : HK.00.05.5.1.4547 aspartam tidak diizinkan penggunaannya pada produk pangan olahan tertentu untuk dikonsumsi oleh kelompok tertentu meliputi bayi, balita, ibu hamil, ibu menyusui dalam upaya memelihara dan meningkatkan kualitas kesehatannya.
3. Kajian Keamanan
Aspartam tersusun atas asam amino sehingga dalam tubuh akan mengalami metabolisme seperti halnya asam amino pada umumnya. Aspartam terurai menjadi asam amino L-asam aspartat dan L-fenilalanin yang merupakan asam amino penyusun protein dalam makanan sehari-hari sehingga tidak akan menimbulkan efek berbahaya (Sakidja, 1989).
Aspartam merupakan salah satu bahan tambahan makanan yang telah mengalami uji dan percobaan yang mendalam serta menyeluruh dan telah disetujui oleh US-FDA. Pada tahun 1974, US-FDA telah mengabulkan usulan mengenai penggunaan aspartam sebagai pemanis pada makanan kering. Tetapi karena banyaknya laporan mengenai keamanan aspartam bagi kesehatan, pemasaran aspartam baru diizinkan pada tahun 1981 (Sakidja, 1989). Selain itu tahun 2006 AFC Panel dari Badan Keamanan Pangan Eropa (EFSA) mengevaluasi carcinogenicity aspartam dan berkesimpulan bahwa dari segi keamanan tidak ada alasan untuk melakukan review lagi mengenai keamanan aspartam (Enie, 2006).
Penggunaan aspartam bagi orang yang menderita penyakit turunan yang dikenal sebagai fenilketonuria perlu mendapat perhatian khusus. Orang yang menderita penyakit tersebut tidak mampu memetabolisme fenilalanin. Berlebihnya jumlah fenilalanin dalam tubuh penderita dapat menyebabkan kerusakan otak yang dapat mengakibatkan cacat mental, karena adanya penumpukan fenilalanin di otak (Sakidja, 1989).
Di Indonesia, Berdasarkan Peraturan Kepala POM No. HK 00.05.5.1.4547/2004 pasal 6 ayat 3, produk pangan yang mengandung aspartam wajib mencantumkan peringatan yang tertulis jelas pada kemasan produk bagi pasien fenilketonuria. Berdasarkan Peraturan Kepala POM No. HK 00.05.5.1.4547/ 2004 batas maksimum penggunaan aspartam adalah 50 mg/kg berat badan per hari.
4. Metode Analisis Aspartam
Aspartam dapat ditentukan secara kualitatif dengan kromatografi lapis tipis (KLT) didasarkan pada pemisahan dengan KLT karena perbedaan afinitas aspartam terhadap fase diam dan fase geraknya. Fase diam untuk penetapan kadar aspartam ini adalah silika gel 60 GF 254, sedangkan fase geraknya adalah sistem pengembang n- butanol : asam asetat glasial : air (2 : 1 : 1). Untuk menampakkan noda digunakan larutan ninhidrin 0,2% dalam air dan larutan brom 1% dalam karbon tetra klorida . Noda dilihat di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 nm (Sakidja, 1989).
Penentuan aspartam secara kuantitatif dapat dilakukan secara titrasi biru (Anonim, 2000). Penetapan kadar aspartam dalam minuman dan makanan yang paling umum digunakan saat ini adalah dengan metode KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan dua jenis fase gerak yang dapat dipilih yaitu metanol : bufer asetat atau asetonitril : bufer fosfat (Nollet, 2000). Penetapan kadar aspartam dengan metode KCKT pernah dilakukan Hayun dkk. (2004) dengan sampel minuman ringan bersoda menggunakan fase diam C-18 Latek (15 cm x 4,0 mm) dan fase gerak asetonitril : buffer asetat pH 5 (5 : 95). Metode ini memiliki akurasi dan presisi yang cukup baik namun waktu analisisnya sangat lama yaitu lebih dari 30 menit.
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi adalah suatu sistem kromatografi yang fase geraknya dialirkan dengan cepat dengan bantuan pompa dan hasilnya dideteksi dengan detektor (Gritter et al., 1985). Tujuan analisis dengan KCKT yaitu didapatkannya pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat (Mulja dan Suharman, 1995). Peralatan KCKT dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Peralatan KCKT
1. Kromatografi Partisi Fase Terbalik
Prinsip kromatografi partisi didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan fase gerak. Fase diam (polar atau nonpolar) disalutkan pada penyangga dan dikemas ke dalam kolom. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, linarut akan tersebar antara dua fase menurut persamaan:
C s
K
C m
Dengan K adalah koefisien distribusi dan C s dan C m adalah konsentrasi linarut berturut-turut dalam fase diam dan fase gerak (Johnson dan Stevenson, 1991).
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, biasanya digunakan hidrokarbon dan fase geraknya relatif bersifat polar seperti air, metanol
Kolom yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase terbalik adalah kolom dengan kemasan fase terikat, yang bersifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak mudah terbawa oleh fase gerak. Penyangga pada kemasan fase terikat biasanya terbuat dari silika yang sudah diseragamkan, berpori dan umumnya partikel mempunyai diameter 3,5 atau 10 µm (Skoog et al., 1994).
2. Fase Diam
KCKT fase terbalik menggunakan fase diam yang berupa senyawa organik, dimana senyawa organik ini terikat secara kimia dengan gugus silanol pada permukaan silika. Hal ini yang menyebabkan permukaan silika menjadi bersifat non polar. Dalam kromatografi jenis ini, senyawa lebih polar terelusi lebih dahulu, kemudian diikuti senyawa non polar (Munson, 1991).
Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase terbalik adalah oktadesilsilan (ODS). Selain ODS, dikenal pula silika dengan substitusi oktil (C ).
8 Panjang pendeknya rantai karbon mempengaruhi tertambatnya senyawa pada fase
diam. Kolom dengan rantai panjang bersifat retensif, sehingga senyawa yang mempunyai sifat mirip dengan kolom akan tertambat lebih lama (Munson, 1991).
3. Fase Gerak Fase gerak merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi pemisahan. beberapa sifat yang perlu diperhatikan yaitu, fase gerak yang digunakan harus murni tanpa cemaran, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan cuplikan, memiliki viskositas yang rendah dan memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan (Johnson and Stevenson, 1991).
Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut atau kemampuan pelarut untuk mengelusi suatu senyawa. Kandungan utama fase gerak pada kromatografi fase terbalik adalah air. Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dioksan, tetrahidrofuran dan dimetilformamida ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak (Munson, 1991).
Polaritas fase gerak dalam KCKT sangat mempengaruhi kromatogram yang dihasilkan, sehingga perlu diperhitungkan komposisi campuran pelarut yang akan digunakan. Berdasarkan nilai P’(indeks polaritas), maka besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan persamaan berikut :
P campuran = ' =
1 P
1 ’ +2 P 2 ’ + .......+ n P n ’
∑ Nilai P adalah polaritas campuran, P’ menyatakan indeks polaritas,
campuran
merupakan fraksi pelarut dalam campuran dan n adalah jenis pelarut yang digunakan (Skoog, 1985).
Berikut ini adalah daftar pelarut berikut nilai indeks polaritas dan eluen strength dari beberapa pelarut (Skoog et al., 1985).
Tabel I. Nilai indeks polaritas dan eluen strength pelarut
Indeks Polaritas
Eluen strength Pelarut (P’) (SiO 2 )
Fluoroalkana <2 -0,25 Sikloheksana 0,04 -0,2 n-Heksana 0,1 0,01 Karbon tetraklorida 1,6 0,18 i-Propil eter 2,4 0,28 Toluen 2,4 0,29 Dietil eter 2,8 0,38 Tetrahidrofuran 4,0 0,57 Kloroform 4,1 0,40 Etanol 4,3 0,88 Etil asetat 4,4 0,58 Metanol 5,1 0,95 Acetonitril 5,8 0,65 Etilen glikol 6,9 0,64 Air 10,2 tinggi
Eluen strength merupakan ukuran kemampuan fase gerak menarik analit dari
fase diam. Waktu retensi analit akan turun jika digunakan fase gerak dengan eluen
strength
rendah, sebaliknya waktu retensi analit akan meningkat jika digunakan fase
, gerak dengan eluen strength tinggi (Snyder et al. 1997).
4. Kolom dan Kinerjanya
Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa (Johnson dan Stevenson, 1978). Batasan yang paling sering digunakan yaitu bilangan lempeng teoritik dan faktor resolusi (Munson, 1991). a) Teori Lempeng (Plate Theory) Salah satu ukuran kinerja kolom adalah jumlah lempeng teoritik yang dihitung dengan persamaan:
= 16 = 5,54 Nilai w adalah lebar alas, w 1/2 adalah lebar alas puncak pada setengah tinggi puncak, dan t R adalah waktu retensi (Sastrohamidjojo, 2001).
Jumlah pelat teori berbanding lurus dengan panjang kolom. Karena panjang kolom bermacam-macam, maka diperlukan ukuran efisiensi kolom yang tidak bergantung pada panjang kolom. Tinggi atau jarak yang setara dengan pelat, H atau
Height Equivalent to a Theoritical Plate
(HETP), merupakan ukuran efisiensi kolom yang lebih disukai karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya berlainan. H berkaitan dengan jumlah pelat teori menurut persamaan berikut:
L H HETP N
L menunjukkan panjang kolom biasanya dalam mm, dan N menunjukkan jumlah pelat teoritis (Johnson dan Stevenson, 1978).
b) Teori Laju (Rate Theory) Pada waktu migrasi, analit mengalami transfer antara fase diam dan fase gerak berkali-kali. Waktu tinggal pada fase diam maupun fase gerak tidak teratur dan tergantung pada tersedianya energy termal dari lingkungannya yang memungkinkan migrasi di dalam kolom tidak teratur. Hal ini mengakibatkan laju rata-rata analit relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga terjadi pelebaran puncak analit. Faktor- faktor utama penyebab terjadinya pelebaran puncak yaitu:
1) Difusi Eddy merupakan aliran tidak teratur yang menyebabkan terjadinya pencampuran konvektif. Difusi Eddy disebabkan oleh banyak kemungkinan pada kemasan kolom yang kurang baik.
Gambar 3. Difusi Eddy
Gambar 3 menunjukkan proses terjadinya difusi Eddy. Nomor 1 menunjukkan analit yang keluar lebih dahulu karena melewati kolom dengan partikel berukuran besar dan kurang kompak. Nomor 2 menunjukkan analit keluar lebih lambat dari nomor 1 karena ukuran partikel yang lebih kecil dan lebih kompak daripada nomor 1. Nomor 3, analit keluar paling akhir, hal ini terjadi . karena melewati bagian kolom dengan ukuran partikel halus dan kompak
2) Difusi Longitudinal merupakan efek dari gerakan random molekul analit dalam fase gerak karena adanya perbedaan konsentrasi.
3) Transfer massa non-ekuillibrium merupakan efek laju ekuilibrasi analit di antara fase gerak dan fase diam yang terbatas. Hal ini terjadi karena pada umumnya aliran fase gerak terlalu cepat untuk mendapatkan ekuilibrium antara kedua fase (Noegrohati, 1994).
Hubungan antara ketiga faktor dapat digambarkan dengan persamaan Van
Deemter
:
- = + . .
A = difusi Eddy B = difusi longitudinal C = transfer massa non-ekuilibrium
= rata-rata flow rate linear fase gerak H = HETP
(Noegrohati,1994) Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari dua puncak. Daya pisah (Rs) dapat diukur dengan persamaan:
( t t ) R 2 R 1 2 t
Rs
( 1 / 2 )( w w ) w w 1 2 1 2 Nilai t dan t adalah waktu retensi senyawa, diukur pada titik maksimum puncak