Perubahan Kadar TNF-α, Interleukin-1, Interleukin-6 Serum Setelah Pemberian Amitriptilin atau Deksketoprofen dan Korelasinya dengan Tingkat Intensitas Nyeri pada Penderita Tension-Type Headache Kronik

  LAMPIRAN 1 :

  LAMPIRAN 2

  LAMPIRAN 4 :

  LAMPIRAN 5 :

  LAMPIRAN 6 :

LAMPIRAN 7 : Prosedur pemeriksaan kadar TNF- α serum. Prinsip Pengujian

  Uji ini bekerja dengan teknik penyisipan enzim immunoassay secara kuantitatif. Antibodi monoklonal yang spesifik untuk TNF- α telah dilapisi atas microplate. Standar dan sampel dimasukkan kedalam dan TNF-

  α yang muncul terikat dengan antibodi yang

  immobile. Setelah membuang substansi yang tidak terikat, enzyme- linked polyclonal antibody yang spesifik untuk TNF α ditambahkan.

  Kemudian, ditambahkan larutan substrat dan dilakukan pewarnaan. Pewarnaan dihentikan dengan mempertimbangkan intensitasnya.

  Batasan pemeriksaan :

  Hanya untuk penelitian, tidak digunakan untuk prosedur diagnostik. Kit tidak boleh digunakan bila telah melewati tanggal kadaluarsa yang tertera pada label. Jangan mencampur reagen dengan bahan dari sumber yang lain. Penting untuk menggunakan alat kalibrasi pengencer sebagai kurva standar, agar konsisten terhadap sampel yang akan diuji. Jika nilai sampel secara umum lebih tinggi dari standar, lakukan pengenceran dengan alat kalibrasi yang sesuai dan ulangi pengujian. Standar pengencer, operator, pipetting technique, teknik pencucian, masa inkubasi/temperatur dan umur kit dapat mempengaruhi variasi pengikatan. Pemeriksaan ini diciptakan untuk mengeliminir percampuran dengan reseptor yang larut, ikatan protein dan faktor lain yang terdapat pada sampel biologis. Sebelum semua faktor diatas diuji dengan Quantikine Immunoassay, kemungkinan dari percampuran belum bisa dieksklusikan. Reagen : TNF α microplate

  TNF α Conjugate

  TNF α Standard

  Assay diluent RD1F Calibrator Diluent RD6-35 Wash Buffer Concentrate Color Reagent A Color Reagent B Stop Solution Plate Covers

  Penyimpanan

  KIT yang belum terbuka Simpan dalam suhu 2-8

  ͦC, jangan gunakan melebihi tanggal kadaluarsa KIT yang sudah terbuka

  Diluted wash buffer Bisa disimpan

  sampai 1 bulan dalam suhu 2-

  8 C ͦ

  Stop solution Calbrator diluent RD6-35 Assay diluent RD 1F Conjugate Unmixed Color reagent A Unmixed Color reagent B Standard Microplate wells Kembalikan

  tabung yang tidak terpakai kedalam kantung foil. Bisa disimpan sampai 1 bulan dalam suhu 2- 8C

  Perlengkapan Lain Yang Dibutuhkan Microplate reader

  Pipet Air suling

  

Squirt bottle, manifold dispenser atau automated microplate

washer

  100 ml dan 500 ml graduated cylinders

  Human TNF α controls Tindakan Pencegahan

Calibrator diluent RD 6-35 terdiri atas sodium azide yang akan

  bereaksi dengan timah dan tembaga, dapat membentuk azides metalik yang bersifat eksplosif. Siram dengan air bervolume banyak selama pembuangan.

  

Stop solution pada Kit ini berasal dari cairan asam. Gunakan

  pelindung mata, tangan wajah & baju pelindung saat menggunakan material tersebut.

  Pengumpulan Dan Penyimpanan Sampel

Cell Culture Supernates : hilangkan partikulat dengan sentrifugasi

  dan uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu ≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles.

  Serum : gunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel membeku selama 30 menit sebelum sentrifugasi selama 10 menit sekitar 10000 x g. Angkat serum dan uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu

  ≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles. Plasma : kumpulkan plasma menggunakan EDTA, Heparin atau citrate sebagai antikoagulan. Sentrifugasi pada 1000 x g selama 30 menit pengumpulan. Uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu ≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles. Peringatan : jika menggunakan citrate atau tabung heparin, pastikan bebas pyrogen untuk menghindari produksi TNF α yang endogenus.

  Persiapan Reagen Simpan semua reagen dalam suhu kamar sebelum digunakan.

  

Wash-buffer : Jika terjadi pembentukan kristal, hangatkan pada

suhu kamar dan aduk perlahan hingga kristal larut.

Diluted Calibrator Diluent RD6-35 : tambahkan 20 ml Calibrator

Diluted RD6-35 dengan 80 ml air suling hingga menghasilkan 100

  ml Diluted Calibrator Diluent RD6-35.

  

Substrate Solution : Color reagent A & B harus dicampur dengan

  volume yang berimbang selama 15 menit. Hindari dari cahaya, 200 uL campuran hasil reaksi wajib per tabung. TNF

  α Standard : Susun kembali TNF α Standard dengan 1.0 ml air suling. Prosedur penyusunan kembali ini menghasilkan 10.000 pg/ml persediaan solution. Biarkan standard tersebut selama 15 menit agar membentuk pengenceran. Ambil 900 uL calibrator Diluent RD6-35 atau encerkan calibrator

  

Diluent RD6-35 menjadi 1000 pg/ml. Ambil 500 ml dari Calibrator

diluent yang sesuai ke tabung yang tersisa. Gunakan larutan

  persediaan untuk menghasilkan serial pengencer. Aduk setiap tabung sebelum dipindahkan ketabung berikutnya. 1000 pg/ml standard merupakan standard tertinggi. Calibrator diluent yang sesuai merupakan standard nol (0 pg/ml).

  Prosedur Pengujian

  Simpan semua reagen dan sampel dalam suhu kamar sebelum digunakan. Direkomendasikan untuk membuat duplikat pada semua sampel, standar dan kontrol yang akan diuji. Persiapkan semua reagen dan standar seperti yang diarahkan pada sesi sebelumnya.

  Buka microplate strips dari plate frame, masukkan kedalam foil yang berisi paket pengering. Tambahkan 50 ml Assay Diluent RD1F pada setiap tabung. Assay

  

diluent RD1F dapat menyebabkan pengendapan. Aduk tabung

sebelum dan selama penggunaan.

  Tambahkan 200 uL Standard, sampel atau control pada setiap tabung. Bungkus dengan adhesive strips yang tersedia. Lakukan inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. Plate layout disediakan untuk merekam standard dan sampel yang sudah diuji. Aspirasi setiap tabung dan cuci, ulangi proses sebanyak tiga kali dengan total empat kali pencucian. Cuci dengan menambahkan

  

Wash Buffer (400 uL) pada setiap tabung dengan menggunakan

squirt bottle, manifold dispenser atau autowasher. Setelah

  pencucian yang terakhir, bersihkan semua sisa wash buffer dengan aspirasi atau decanting ?. Balikkan plate dan keringkan dengan kertas handuk yang bersih. Tambahkan 200 uL TNF

  α Conjugate pada setiap tabung. Bungkus

  dengan adhesive strip yang baru. Untuk serum plasma sampel : inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dan untuk cell culture

  supernate sampel : inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.

  Ulangi aspirasi/pencucian seperti pada langkah di atas. Tambahkan 200 uL substrate solution pada setiap tabung. Inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Hindari dari cahaya.

  Tambahkan 50 uL stop solution pada setiap tabung. Warna harus berubah dari biru menjadi kuning. Jika warnanya hijau atau tidak terjadi perubahan warna, ketuk perlahan plate nya untuk memastikan percampuran sepenuhnya. Pastikan densitas optikal pada setiap tabung dengan menggunakan

  

microplate reader yang diatur pada 45 nm. Jika koreksi panjang

  gelombang tersedia, ubah menjadi 540 nm atau 570 nm. Jika koreksi panjang gelombang tidak tersedia, kurangi pembacaan pada 540 nm atau 570 nm pada 450 nm. Pengurangan ini akan dikoreksi dengan optical imperfection pada plate. Pembacaan secara langsung pada 450 nm tanpa melakukan koreksi, akan menghasilkan akurasi yang lebih tinggi atau lebih rendah.

  Kesimpulan Prosedur Pengujian

  Persiapkan semua reagen dan sampel seperti yang sudah dijelaskan Tambahkan 50 uL assay diluent RD 1F pada setiap tabung Tambahkan 200uL standar, kontrol atau sampel pada setiap tabung, inkubasi selama 2 jam Aspirasi dan bilas sebanyak 4 kali Tambahkan 200 uL conjugate pada setiap tabung Aspirasi dan bilas sebanyak 4 kali Tambahkan 200 uL substrate solution pada setiap tabung. Hindari dari cahaya Tambahkan 50 uL stop solution pada setiap tabung. Baca pada 450 nm selama 30 menit.

  Λ correction pada 540 atau 570 nm

  Kalkulasi Hasil

  Rata-ratakan pembacaan hasil duplikasi pada setiap standar, kontrol dan sampel dan kurangi dengan rata-rata standar nol dari

  optical density.

  Buat kurva standar dengan mengurangi data menggunakan

  

software komputer yang mampu menghasilkan four parameter

logistic (4-PL) curve fit. Sebagai alternatif, buat kurva standar

  dengan membuat plot pada rata-rata absorbansi pada setiap standar di aksis y dengan konsentrasi pada aksis x dan buat garis antar titik pada grafik tersebut. Data mungkin akan membentuk garis dengan plotting log konsentrasi TNF

  α vs log OD dan garis yang sesuai dapat ditentukan dengan analisis regresi. Prosedur ini akan menghasilkan hasil yang adekuat tetapi ketepatan yang kurang cocok dengan data. Jika sampel sudah dilakukan pengenceran, konsentrasinya pembacaan dari kurva standar harus dikalikan dengan faktor pengencer.

  Petunjuk Teknik

  Saat mencampur protein solution, hindari pembentukan busa

  

Substrate solution harus tetap tanpa warna sebelum dimasukkan

  kedalam plate. Jauhkan substrate solution dari cahaya. Substrate solution harus berubah warna menjadi biru.

  

Stop solution harus dimasukkan kedalam plate berurutan dengan

substrate solution. Warna akan berubah dari biru menjadi kuning

  saat dicampur dengan stop solution. Warna hijau merupakan indikasi jika stop solution tidak tercampur sepenuhnya dengan

  substrate solution.

  Untuk menghindari kontaminasi, ganti pipet saat menambahkan setiap level standard, penambahan sampel dan saat memasukkan reagen. Gunakan reservoir yang berbeda setiap reagen. Untuk memastikan hasil yang akurat, kelayakan adhesion plate selama tahap inkubasi adalah penting.

  Ketelitian Intra-assay Precision

  Tiga sampel yang konsentrasinya sudah diketahui diuji sebanyak 20 kali pada satu plate untuk menilai ketelitian intra-assay.

  Inter-assay Precision

  Tiga sampel yang konsentrasinya sudah diketahui diuji sebanyak 20 kali secara terpisah untuk menilai ketelitian inter-assay.

  Linearitas

  Untuk menilai linearitas dari uji ini, lima sampel dibubuhi dengan TNF- α konsentrasi tinggi, dengan berbagai matriks dan diencerkan dengan calibrator diluent yang sesuai untuk menghasilkan sampel dengan nilai dalam range yang dinamis.

  Kalibrasi

  Immunoasaay ini dikalibrasi terhadap highly purifired E coli-

  

expressed recombinant human TNF α yang dihasilkan pada sistem

R&D.

  Standar internasional pertama NIBSC/WHO 87/650 dievaluasi pada kit ini. Kurva respon dosis dari standar internasional pertama ini sejajar dengan kurva standard dari Quantikine. Untuk merubah nilai sampel diperoleh dari Quantikine TNF

  α yang setara dengan NIBSC 87/650 internasional unit. Nilai equivalent NIBSC (IU/mL) = 0.026 X nilai Quantikine TNF α (pg/mL)

  Nilai Sampel

  Serum/Plasma : empatpuluh serum dan plasma sampel telah dievaluasi dalam uji ini. Semua sampel terukur dengan hasil dibawah nilai standard 15.6 pg/mL

  

Cell Cultured Supernates : mononuklear sel dikultur di RPMI,

  ditambahkan dengan 10% fetal calf serum, 50uL β- mercaptoethanol, 2mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin dan 100 ug/mL streptomycin sulfate. Sel tersebut distimulasi pada hari ke 1, 3 dan 5. Alikuot dari culture supernate dipisahkan pada hari ke 1, 3 dan 5dan diuji untuk natural TNF- α.

  Sensitifitas

  Duapuluh lima uji yang telah dievaluasi dan range minimum

  detectable dose (MDD) dari TNF-

  α dari 0,5-5,5 pg/mL. Rata-rata MDDnya adalah 1,6 pg/mL.

  MDD ditentukan dengan menambahkan dua standar deviasi ke rata-rata 20 standar nol dari optikal densitas dan menghitung semua konsentrasi yang sesuai.

  Spesifisitas

  Uji ini mengenal kedua natural dan rekombinan TNF α. Faktor-faktor yang terdapat dibawah disiapkan sebanyak 50uL/ml di Calibrator

  

Diluent RD6-35 dan diuji reaktifitasnya. Tidak ada reaktifitas yang

signifikan maupun ditemukannya gangguan.