Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Alpukat (Persea americana Mill). Terhadap Beberapa Mikroba Patogen Secara In Vitro

  

LAMPIRAN

LAMPIRAN 1. Alur Kerja Ekstraksi Biji Alpukat (Persea Americana Mill.)

Menggunakan Pelarut Metanol, n-heksana dan Etil Asetat

  Biji Alpukat

• Dicuci dibersihkan dari kotoran
• Di potong menjadi ukuran yang lebih kecil

  o

• Dimasukkan ke dalam oven pada suhu 30-40 C sampai kering
• Dihaluskan - Dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer 500 ml
• Ditambahkan ± 150 ml pelarut metanol
• Dimaserasi selama 3 hari
• Disaring dan disimpan dalam tabung Erlenmeyer lain
• Dimaserasi kembali dengan volume yang sama

  Maserat

• Supernatan - Dipekatkan dengan menggunakan rotary
• Evaporator pada suhu tidak lebih dari 50°C
• Hal yang sama dilakukan terhadap jenis pelarut n-heksana dan etil asetat

Disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit

  Ekstrak Biji Alpukat

  8 LAMPIRAN 2 . Alur Kerja Pembuatan Larutan Standar McFarland 10 CFU/ml

  0,048 M 0,18 M

• Diambil sebanyak 0,5 ml - Diambil sebanyak 99,5 ml
• Dihomogenkan kedua larutan

  Hasil

• Diukur densitas suspensi dengan menggunakan spektrofotometer (nilai O.D. 625nm ± 0,13)

  Larutan standar 0,5 McFarland 1x 108 CFU/ml

  LAMPIRAN 3. Skrining Fitokimia Pemeriksaan Alkaloida

  0,5 g serbuk biji alpukat Ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N

• Ditambahkan 9 ml akuadest
• Dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit
• Didinginkan -
• Filtrat - Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer - Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat - Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf Hasil

  Disaring

  Pemeriksaan Flavonoida

  0,5 g serbuk biji alpukat Dilarutkan dengan 10 ml metanol

• Direfluks selama 10 menit
• Disaring panas-panas melalui kertas saring
• Diencerkan dengan 10 ml akuadest
• Ditambah 5 ml n-heksan
• Dikocok -

  Didiamkan

• Filtrat Diambil lapisan metanol
• C Diuapkan pada temperature 40
• Sisa dilarutkan dalam 5 etil asetat
• Disaring -

  Larutan

• Diuapkan 1 ml larutan hingga kering - Diuapkan 1 ml larutan hingga kering
• Dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96% - Dilarutkan dalam 1 ml etanol 96%
• Ditambahkan 0,5 g serbuk seng - Ditambahkan 0,1 g magnesium
• Ditambahkan 2 ml asam klorida 2N - 10 tetes asam klorida pekat
• Didiamkan selama satu menit
• Ditambahkan 10 ml asam klorida pekat

  Larutan berwarna Larutan berwarna merah merah jingga/ungu

  Pemeriksaan Tanin

  0,5 g serbuk biji alpukat

• Dilarutkan dengan 10 ml akuadest
• Disaring - Filtratnya diencerkan dengan akuadest sampai tidak berwarna
• Diambil 2 ml larutan
• Ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida

  Berwarna biru/hijau kehitaman

  Pemeriksaan Glikosida

  3 g serbuk biji alpukat

• Dilarutkan dengan 30 ml campuran etanol 96% akuadest
• Ditambahkan 10 ml HCl 2 N - Direfluks selama 10 menit
• didinginkan
• Disaring 20 ml filtrat
• Ditambahkan 25 ml akuadest
• Ditambahkan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M - Dikocok - Didiamkan selama 5 menit
• Disaring - Dilarutkan dengan 20 ml campuran kloroform:isopropanol (3:2)
• Ditambahkan natrium sulfat anhidrat secukupnya
• Disaring - Diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 500C
• Dilarutkan sisanya dengan 2 ml metanol
• Diambil 0,1 ml larutan percobaan di masukkan kedalam tabung reaksi
• Diuapkan - Ditambahkan 2 ml air
• Ditambahkan 2 tetes pereaksi molish
• Ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat

  Cincin warna ungu

  Pemeriksaan Saponin

  0,5 g serbuk

• Dimasukkan kedalam tabung reaksi
• Ditambahkan 10 ml akuadest
• Didinginkan - Dikocok kuat-kuat selama 10 detik
• Timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm
• Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N Busa

  Pemeriksaan Steroida/triterpenoida

  1 g serbuk

• Dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam
• Filtrat diuapkan dalam cawan penguap
• Ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat
• Ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat

  Warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi biru hijau air laut konsentrasi menjadi 100 ppm

  

LAMPIRAN 4. Uji Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

  0,5 ml @ 0,5 mL ke dalam 3 vial

  0,5 ml Larutan induk konsentrasi 10000 ppm

  Sampel 20 mg Dilarutkan dalam 2 ml metanol

  Ditambahkan 5 ml metanol Larutan dengan konsentrasi 1000 ppm

  Ketika ditambahkan air laut konsentrasi menjadi Ditambahkan 5 ml metanol

  Larutan dengan konsentrasi 100 ppm @ 0,5 mL ke dalam 3 vial

  @ 0,5 mL ke dalam 3

• Dibiarkan pelarutnya menguap
• Ditambahkan 50 µL dimetilsulfoksida (DMSO)
• Ditambahkan air laut hingga hampir mencapai batas kalibrasi
• 10 ekor larva udang dimasukkan ke dalam masing-masing vial uji
• Kemudian tambahkan air laut hingga batas kalibrasi
• Biarkan selama 24 jam dan hitung larva yang mati

  Hitung nilai LC

  

50

Ketika ditambahkan

  

LAMPIRAN 5. Alur Kerja Daya Hambat Ekstrak Biji Alpukat (Persea Americana

Mill.) Terhadap Bakteri Patogen

  Bakteri Ekstrak Biji

• Disubkultur selama ± 24 jam pada media N - Diencerkan dengan DMSO sesuai konsentrasi yaitu 5, 10, 15, dan 20%
• Diambil dengan jarum ose - Ditetesi sebanyak 10μl pada cakram kertas steril
• Dilarutkan dalam larutan fisiologis (NaCl 0.9%) - Kontrol (-) digunakan cakram kertas yang berisi 10μl DMSO
• Dihomogenkan dan disesuaikan kekeruhannya - Kontrol (+) digunakan cakram kertas dengan standar McFarland kloramfenikol 30μg dan nistatin 10µg

  Suspensi Bakteri

• Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media MHA
• Diletakkan cakram kertas yang sudah berisi ekstrak meatbolit sekunder isolat potensial

  Hasil _o

• Diinkubasi pada T: 37 C selama 24-48 jam
• Diukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka sorong

  Diameter Zona y = 1.011x - 0.626

  0.5

  10

  10

  3

  10

  1

  1

  1

  1 10 3,178

  5

  2

  3 Rata-rata

  2 1 1,7 17 4,046 PerhitunganLC

  50

  : Persamaanregresi : y =ax+b Maka y = 1,0115x -0,6265 a = 1,0115 b = -0,6265

  Untuk LC

  50 responadalah 50% sehingganilaiprobit (y) adalah 5,00

  5 = 1,0115x -0,6265 1,0115 x = 5 +0,6265

  1,0115x = 5,6265 x = 5,6 LC

  50

  = x = 5,6 µg/mL (ppm)

  1

  2

  1

  2

  1.5

  2

  2.5

  3

  3.5

  4

  4.5

  5

  1

  

3

  1

  4

  5

  6 N ila i P ro b it

  

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva Uji Toksisitas Ekstrak Metanol LAMPIRAN 6. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Biji Alpukat

  1. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Metanol Dengan Metode BSLT

  Konsentrasi (μg/mL)

  Jumlah larva Artemia tiap uji

  Jumlah larva Artemia yang mati Persen kematian

  (%) Nilai probit

  2. Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Etil Asetat Dengan Metode BSLT y = 1.647x + 0.721

  2

  10

  1

  1 10 3,178

  3

  10

  3 2 1,7 17 4,046

  5

  10

  10

  10

  10 10 100 9,768 PerhitunganLC

  50 :

  Persamaanregresi : y = ax+b Maka y = 1,6475x + 0,7215 a = 1,6475 b = 0,7215

  Untuk LC

  50

  responadalah 50% sehingganilaiprobit (y) adalah 5,00 5 = 1,6475x + 0,7215 1,6475 x = 5 – 0,7215 1,6475 x = 4,2785 x = 2,6

  LC

  50 = x

  2

  1

  4

  4

  6

  8

  10

  12

  1

  2

  

3

  5

  3 Rata-rata

  6 N ila i P ro b it

  

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva Uji Toksisitas Ekstrak Etil Asetat

  Konsentrasi (µg/mL)

  Jumlah larva Artemia tiap uji

  Jumlah larva Artemia yang mati Persen kematian

  (%) Nilai probit

  1

  2

  = 2,6μg/mL(ppm) y = 0.648x + 2.620

  1

  LC

  1

  4 40 4,747

  5

  10

  10

  8 5 7,7 77 5,772 PerhitunganLC

  50

  : Persamaanregresi : y = ax+b Maka y = 0,6485x + 2,6202 a = 0,6485 b = 2,6202

  Untuk LC

  50 responadalah 50% sehingganilaiprobit (y) adalah 5,00

  5 = 0,6485x + 2,6202 0,6485 x = 5 – 2,6202 0,6485 x =2,3798 x =3,7

  50

  6

  = x = 3,7μg/mL (ppm)

  Tabel Nilai Probit

  %

  1

  2

  3

  4

  5

  6

  7

  8

  5

  10

  2

  Konsentrasi (μg/mL)

  3

  4

  5

  6

  7

  1

  2

  

3

  4

  5

  6 N ila i P ro b it Konsentrasi ( μg/mL) Kurva Uji Toksisitas Ekstrak n-Heksan

  Jumlah larva Artemia tiap uji

  3

  Jumlah larva Artemia yang mati Persen kematian

  (%) Nilai probit

  1

  2

  3 Rata-rata

  1

  10

  1

  1

  1

  1 10 3,178

  9 …. 2,674 2,946 3,119 3,249 3,355 3,445 3,524 3,595 3,659

  10 3,178 3,773 3,825 3,874 3,920 3,964 4,006 4,046 4,085 4,122 20 4,158 4,194 4,228 4,261 4,294 4,326 4,357 4,387 4,417 4,447 30 4,476 4,504 4,532 4,560 4,597 4,615 4,642 4,668 4,695 4,721 40 4,747 4,733 4,798 4,824 4,849 4,900 4,925 4,950 4,950 4,975 50 5,000 5,030 5,050 5,075 5,100 5,126 5,151 5,182 5,202 5,277 60 5,253 5,279 5,305 5,332 5,358 5,385 5,413 5,468 5,468 5,496 70 5,524 5,553 5,583 5,613 5,643 5,674 5,706 5,772 5,722 5,806 80 5,842 5,878 5,519 5,854 5,994 6,036 6,080 6,125 6,175 6,227 90 6,282 6,341 6,405 6,476 6,576 6,645 6,751 6,881 7,054 7,326 100 9,768