Efek Ekstrak Daun Kare Murraya koenigii
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Research Report
Efek Ekstrak Daun Kare (Murraya koenigii) Terhadap Pertumbuhan
Candida Albicans dan Aktivitas Fagositosis Makrofag
(The effects of curry leaves (Murraya koenigii) extract on the growth of
Candida Albicans and phagocytosis activation of macrophage)
Tengku Natasha Eleena Tengku Ahmad Noor, Retno Pudji Rahayu, Bambang Sumaryono
BagianPatologi Anatomi Oral dan Maksilofasial
Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga
Surabaya - Indonesia
Korespondensi (correspondence): Tengku Natasha Eleena Tengku Ahmad Noor, Mahasiswa Kedokteran Gigi
Universitas Airlangga BHMN, Surabaya, Indonesia. Email : natasha-eleena@hotmail.com
ABSTRACT
Background: Candida Albicans (C. albicans) is the commonest being of Candida species colonizes the mucosal
surfaces of all humans and have the risk of endogenous infection. Candidiasis of the oral mucosa is a disease,
as an infection frequently seen in AIDS patients and in other conditions. Nowadays, herbal therapy is often used
as an antifungal agent to inhibit the growth of fungus. Thus, this study is using curry leaves (Murraya koenigii)
extract because it is known that curry leaves contain some active agents which are potential as an antifungal
such as carbazole alkaloid, caumarin, flavanoid, tannin and polyphenol. Besides, curry leaves can induce the
phagocytosis activation of macrophage which can help to reduce the growth of C. albicans. Purpose: The aim
of the study is to find out the MIC and MFC of the curry leaves extract towards the growth of C. albicans and
phagocytosis activation of macrophage. Method: Method used in this study for the effects of curry leaves extract
towards C. albicans is dilution with the concentration of 12.5%, 9,375%, 8,75%, 6,25%, 5%, and 3,125%.
Phagocytosis activation of macrophage with the method of phagocytosis index is used by counting the total of
macrophage in the isolated peritoneal and number of C. albicans colonies before and after contacted with
macrophage using the MIC and MFC of curryleaves. Result: The concentration of 3,125%, 5% and 6,25%
showed the presence of C. albicans growth while there is no growth of C. albicans in the concentration of
8,75%, 9,375%, and 12,5%. Thus, 6,25% of curry leaves extract has the minimum ability to inhibit the growth of
the C. albicans and 8,75% has the minimum fungicidal property. These two concentrations of curry leaves
extract are observed for the phagocytosis activation of macrophage and 8,75% showed highest ability in
inducing phagocytosis activation of macrophage compared to 6,25%. Conclusion: The MIC and MFC of the
curry leaves towards the growth of C. albicans is approximately at 6,25% and 8,75%. The highest ability in
inducing phagocytosis activation of macrophage towards C. albicans growth is 8,75% curry leaves extract.
Keywords: curry leaves (Murraya koenigii) extract, Candida albicans, minimum inhibitory concentration,
minimum fungicidal concentration, phagocytosis activation of macrophage.
1
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
C. albicans bertanggungjawab pada
kebanyakan infeksi Candida seperti oral
candidiasis yang terdapat di dalam rongga
mulut.1 Pada perawatan infeksi oleh C. albicans
di rongga mulut digunakan obat-obatan anti
jamur seperti nistatin, ketokonazol, amfoterin,
namun pada saat ini obat-obatan tersebut mulai
resisten terhadap infeksi C. albicans.2
Berdasarkan hal tersebut maka perlu suatu
terobosan baru untuk terapi infeksi C. albicans
dengan penggunaan bahan alam. Bahan alam
dilaporkan relatif aman sebagai obat alternatif
sehingga, penggunaan daun kare dapat sebagai
solusi dalam penanganan infeksi C. albicans.
Daun kare atau bahasa latinnya, Murraya
koenigii adalah tanaman yang kaya sumber
karbazol alkaloid, bioaktif kumarin, alkaloid
dan alkaloid akridin karbazol dari keluarga
Rutaceae.3 Kelebihan daun kare termasuk
sebagai anti-diabetik4-7 antioksidan5,8, anti
mikroba5,9,10 dan anti inflamasi.11
Hasil dari penelitian Abishek et al. 10
dilaporkan bahwa, komposisi kimia daun kare
yaitu 9,12 octadecadienoic acid dapat
menghambat pertumbuhan C. albicans dan
mikroorganisme lainnya seperti E. coli,
Salmonella Typhimurium, Staphylococcus
Aureus dan Proteus Vulgaris dengan MIC daun
kare yaitu 0,05 µg/ml.
Dari berbagai kandungan pada daun
kare yang belum diteliti adalah fungsinya selain
sebagai anti jamur khususnya pada infeksi C.
albicans serta fungsinya dalam mengaktivasi
fagositosis makrofag. Ekstrak metanol daun
kare dievaluasi pada respon imun oral dan cell
mediated immune response untuk ovalbumin,
serta ujifagositosis dengan metode uji bersihan
karbon. Sifat fagositosis makrofag meningkat
oleh karena peningkatan produksi nitrit.12
Dengan demikian maka, penelitian
terhadap daun kare dapat menjadi solusi
alternatif dalam terapi berbahan dasar herbal
terhadap penyakit infeksi jamur, sehingga dapat
meminimalkan efek samping obat anti jamur
serta lebih ekonomis dan aman.
Penelitian ini merupakan jenis
penelitian eksperimental dengan pendekatan
the post-test only control group design yang
menggunakan binatang coba sebagai objek
penelitian.
1. Sterilisasi Alat dan Bahan yang
digunakan
Semua alat yang akan digunakan
dalam penelitian ini sebelumnya akan disteril
terlebih dahulu dalam autoklaf dengan suhu
121ºC selama 15 menit.
2. Persiapan kultur C. albicans
Stok kultur C.albicans isolat Surabaya
diambil dari Laboratorium Biologi Oral FKG
Universitas Airlangga (diambil dari pasien
HIV yang telah dikarekterisasi) dan dilakukan
kultur ulang pada media padat Sabouraud
Dextrose Broth (Difco) lalu di inkubasi pada
suhu 37ºC selama 18 - 20 jam dalam
inkubator.
3. Persiapan Ekstrak Daun Kare
Pembuatan ekstrak daun kare dibuat
dari daun kare yang telah dikeringkan. Daun
kare yang telah dikeringkan seterusnya
dimaserasi dengan etanol 99% [rasio 1:3
(W/V)] dalam bejana tertutup selama 3x24
jam, setelah itu disaring dengan corong
Buchner. Hasil saringan didapatkan ekstrak
cair yang diuapkan sampai bebas dari pelarut
etanol dengan menggunakan Rotary Vacuum
Evaporator pada suhu 40ºC dan kemudian
disterilkan dengan UV selama 30 menit.13
Ektrak daun kare dibuat dengan
konsentrasi 12,5%, 9,375%, 8,75%, 6,25%,
5%, dan 3,125% untuk mendapatkan
konsentrasi MIC dan MFC daun kare terhadap
pertumbuhan C. albicans.
4. Uji Kepekaan Jamur Terhadap Ekstrak
Daun Kare dengan Teknik Dilusi
Uji aktivitas antifungi ekstrak daun
kare ini dilakukan dengan metode dilusi cair.
Uji diawali dengan memasukkan suspensi
jamur 1.5x108 CFU/ml C. albicans sebanyak
0,5 ml ke dalam tiap-tiap tabung uji yang
berisi 0,5 ml larutan uji dalam berbagai
2
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
konsentrasi. Campuran suspensi jamur dan
larutan uji tersebut diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24 jam. Kekeruhan larutan hasil
inkubasi diamati. Selanjutnya, cairan kultur
hasil inkubasi digoreskan pada media agar
SDA menggunakan ose lalu diinnkubasi pada
suhu 37ºC selama 18-24 jam. Pertumbuhan
koloni jamur pada media agar Sabouraud
Dextrose Agar diamati dan dibandingkan
dengan kontrol untuk menentukan MIC dan
MFC ekstrak daun kare terhadap pertumbuhan
C. albicans.14
5. Persiapan Tikus (Rattus norvegicus)
dengan Pemberian Ekstrak Daun Kare
Tikus diberikan ekstrak daun kare
setiap hari selama 2 minggu dengan dosis
tunggal yang mempunyai konsentrasi MFC
dan MIC ekstrak daun kare serta konsentrasi
lebih rendah pada C. albicans secara sonde
sebanyak 0.2 ml. 3 ekor tikus dijadikan
sebagai subjek diberikan 3 konsentrasi daun
kare yang berbeda dengan 1 ekor tikus setiap
konsentrasi dan 1 ekor dijadikan sebagai
subjek kontrol tanpa diberikan ekstrak daun
kare.
6. Persiapan Makrofag dari Cairan
Peritoneal Tikus
Tikus diinjeksi Thioglycolate 7 hari
sebelum diambil cairan peritoneal ke dalam
rongga peritoneum menggunakan spuit 25G
agar didapatkan makrofag aktif.
Setelah 7 hari, tikus diletakkan dalam
posisi terlentang, kulit abdomen dibuka
sehingga tampak peritoneum kemudian
dibersihkan dengan etanol 70%, dan diinjeksi
dengan 10cc larutan DMEM dingin ke dalam
rongga peritoneum menggunakan spuit 19G.
Peritoneum dipijat pelan untuk mendapatkan
makrofag yang cukup banyak.Setelah 30
menit, cairan disedot kembali sampai habis
dan dimasukkan dalam tabung falkon yang
steril.
Cairan peritoneal yang terdapat di
dalam tabung falkon dilakukan sentrifus
dengan kecepatan1000 rpm pada suhu
4oC.Seterusnya, supernatan yang terbentuk
dibuang dan resuspen pelet sel dengan
mengetuk bagian bawah botol pelan-pelan
sehingga mendapatkan konsentrasi yang
cukup.
7. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag
terhadap C. albicans dan Perhitungan
Makrofag
Perhitungan sel makrofag dilakukan
dengan pengambilan 20µl sampel cairan
peritoneal ke dalam microtube dan dilakukan
sentrifus selama 6 menit dengan kecepatan
600 rpm. Seterusnya sel makrofag dilakukan
pewarnaan dengan Diff Quick dan dihitung
menggunakan hemositometer.
Uji aktivitas fagositosis makrofag
diteruskan dengan makrofag yang telah
dipanen, dicuci dengan cara sentrifugasi 250G
pada suhu 4ºC selama 2 menit, kemudian
dihitung jumlah selnya. Kultur makrofag
disiapkan dengan kepadatan sel 2,5.107 sel/ml
dandiambil 0,1 ml ke microplate kultur.
Cairan
media
DMEM
dan
FBS5%
ditambahkan sebanyak 0,9 ml kedalam setiap
microplate dan dirotasi dengan kelajuan 8 rpm
selama 20-30 menit dengan suhu 37ºC. Setelah
itu, diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 30
menit untuk proses adaptasi.
Makrofag yang sudah diinkubasi 30
menit kemudian dimasukkan kedalam kultur
C. albicans sudah disiapkan dengan kepadatan
sel akhir 2,5x107 sel dan sudah ditambahkan
dengan 50 µl normal serum inaktivasi,
selanjutnya diinkubasi dengan internal waktu
selama 1 jam.
Kultur makrofag diamati dibawah
mikroskop inverted untuk melihat aktivitas
fagositosis makrofag terhadap C. albicans.
Setelah dilakukan pengamatan dan kultur
dengan cara panen sel dan dicuci dengan PBS
dan FBS5%, hasil kontak makrofag dan C.
albicans disentrifugasi sebanyak 3 kali
250G/1000rpm pada suhu 4˚C serta dibuang
supernatant.
0,1 ml kultur diambil untuk
pembuatan hapusan pada objek glass, dan
fiksasi dengan methanol serta dilanjutkan
dengan pengecatan Diff Quick (protokol
mengikuti supplier). Perhitungan jumlah C.
albicans sebelum dan setelah diberikan
makrofag dilakukan dengan pengambilan 50µl
3
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
kultur dan diinkubasi di inkubator oksigen
dengan suhu 37ºC pada media TSA selama 24
jam untuk melihat aktivitas fagositosis
makrofag.
8. Pengukuran Penelitian
Uji MIC ekstrak bahan penelitian
dilakukan dengan menggunakan permukaan
medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada
permukaan medium dan kertas saring yang
berbentuk cakram yang telah mengandung
ekstrak penelitian. Setelah inkubasi overnight
jumlah koloni mikroba yang tumbuh dihitung
dan dibandingkan dengan jumlah koloni
mikroba pada konsentrasi yang lain. Dengan itu
maka, pengukuran MIC secara tidak langsung
dari daya hambat antibiotika terhadap
mikroba.15
MFC adalah konsentrasi ekstrak yang
dapat menghambat hamper 99 - 99,5% jamur.
Penapisan dilakukan diantara konsentrasi
ekstrak paling tinggi yang dapat menghambat
pertumbuhan jamur dan konsentrasi MIC
ekstrak sehingga mendapatkan konsentrasi
MFC yang optimum dengan perhitungan
hambatan jumlah koloni jamur.16
Perhitungan sel makrofag dilakukan
dengan pengambilan 20µl sampel dan dihitung
menggunakan
hemositometer.
Aktivitas
fagositosis makrofag diuji dengan diamati 200
sel dan dihitung makrofag yang mengandung
C. albicans dengan menggunakan rumus indeks
fagositosis.17
9. Analisa Data
Data hasil penelitian diperoleh dengan
cara mengamati MIC dan MFC ekstrak daun
kare. Konsentrasi ekstrak yang mulai jernih
pada konsentrasi terkecil sebagai MIC dan
konsentrasi minimal dalam penghambatan
pertumbuhan jamur sebagai MFC.
Pengukuran
aktivitas
fagositosis
makrofag dengan indeks fagositosis dilihat dari
data yang diperoleh dari hasil hitungan
makrofag dengan alat hemositometer dan
hitungan C. albicans. Indeks fagositosis
dianalisa dengan uji One-Sample KolmogorovSmirnov dan apabila didapatkan sebaran
distribusi yang normal, sehingga data di analisa
dengan uji One-Way ANOVA untuk melihat
perbedaan pada keempat kelompok dilanjutkan
dengan uji Post Hoc Test dan TUKEY HSD
untuk melihat perbedaan masing-masing
kelompok pada derajat kemaknaan 0,05.
HASIL
Ekstrak daun kare dapat menghambat
pertumbuhan C. albicans pada konsentasi
12,5%, 9,375% dan 8,75% yang dilihat dari
tidak didapatkan zona pertumbuhan C.
albicans. Disisi lain, pada konsentrasi 6,25%
didapatkan zona hambat dengan jumlah C.
albicans rata-rata adalah 2,15x104 CPU/ml.
Pada konsentrasi 5% dan 3,125% tidak terdapat
zona hambat sehingga tidak bisa dihitung
karena terlalu banyak jumlah koloni C.
albicans. Hasil dapat dilihat pada Tabel 1 dan
Gambar 1.
a
b
c
d
e
Gambar 1 Jumlah koloni C. albicans setelah
paparan dengan daun kare. (a) Konsentrasi12,5%,
(b) 9,375%, (c) 8,75%, (d) 6,25%, (e) 3,125%
4
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Tabel 1 Ekstrak daun kare terhadap hitung total jamur dalam berbagai konsentrasi
Konsentrasi
Hitung Total Jamur (CPU/ml)
Rata-rata
(%)
1
2
3
4
12,5
0
0
0
0
0
9,375
0
0
0
0
0
8,75
0
0
0
0
0
6,25
1,8x103
2,06x103
8x104
2,2x103
2,15x104
5
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
3,125
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
K. negatif
0
K. positif
8,2X102
Keterangan : 0 = steril, tidak ada pertumbuhan jamur; TBUD = tidak bisa dihitung. CFU/ml = colony forming uniter per
millilitre
Hasil pengamatan tabel 2 didapatkan
daun kare pada konsentrasi 6,25% dan 8,75%
dapat meningkatkan jumlah makrofag dengan
rata-rata 16867 mm3dan 23750 mm³ dibanding
kelompok
kontrol.
Sedangkan
pada
konsentrasi 3,75% terjadi penurunan jumlah
makrofag apabila dibanding kelompok kontrol
dan jumlah makrofag paling sedikit diantara
konsentrasi daun kare yang lain.
Tabel 2 Konsentrasi daun kare terhadap peningkatan jumlah makrofag
Hitung Makrofag (mm3)
Konsentrasi (%)
8,75
6,25
3,75
Kontrol negatif
Kontrol positif
1
21350
17600
8150
0
15500
Rata-rata
2
16150
14500
3800
3
33750
18500
15950
23750
16867
9300
10150
16850
14167
Tabel 3 menunjukkan jumlah C.
albicans setelah pemberian makrofag yang
diinduksi ekstrak daun kare dengan
konsentrasi 8,75% didapatkan sebanyak 680
CFU/ml. Sedangkan pada konsentrasi 6,25%
diperoleh jumlah C. albicans sebanyak 951,67
CFU/ml. Hasil ini menunjukkan terdapat
penurunan jumlah C. albicans dengan
makrofag yang diinduksi konsentrasi MIC dan
MFC ekstrak daun kare apabila dibandingkan
dengan jumlah C. albicans pada kelompok
kontrol positif dan hitung awal jumlah C.
albicans.
5
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Tabel 3 Jumlah C. albicans setelah diinduksi makrofag yang telah diberikan konsentrasi MIC (6,25%), MFC
(8,75%) dan 3,75% daun kare.
hitung total awal jamur
(CFU/ml)
Konsentrasi
8,75
6,25
3,75
Kontrol Positif
3780
760
820
4400
7100
3520
740
1040
5400
5800
4040
620
1280
8200
7100
3480
740
1110
5400
5800
4560
660
840
5400
7100
4150
560
620
7600
5400
Rata-rata
680
951,67
6066,67
6383,33
daun kare (%)
Gambar 3 Hasil uji fagositosis makrofag
Dari data yang diperoleh hasil indeks
fagositosis, dilakukan uji One-Way ANOVA
setelah dilakukan uji normalitas pada masing masing kelompok dengan menggunakan uji
One-Sample Kolmogorov-Smirnov dan uji
homogenitas.Hasil dapat dilihat pada tabel 4
dan 5. Pada tabel 4, keempat kelompok
penelitian mempunyai nilai Asymp. Sig. (2-
tailed) lebih besar dari 0,05 (p>0,05) yang
berarti data pada kelompok tersebut
berdistribusi normal. Seterusnya dilanjutkan
uji homogenitas (Tabel 5) dengan signifikansi
diatas 0,05 (p=0,051; p>0,05). Analisa data
memenuhi syarat untuk dilanjutkan dengan uji
one-way ANOVA.
Tabel 4 Nilai Asymp. Sig. (2-Tailed) Uji Normalitas Kolmogorov-Smirnov
Asymp. Sig. (2
tailed)
Kontrol positif
Konsentrasi MIC
daun kare (6,25%)
Konsentrasi MFC
daun kare (8,75%)
Konsentrasi daun
kare (3,75%)
.590
.989
.761
.492
6
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Tabel 5 Uji Analisis Homogenitas Data
Levene Statistic
2.280
df1
4
df2
25
Sig.
.051
Tabel 6 Uji One-Way ANOVA masing-masing kelompok penelitian
Sum
Squares
of
df
Mean Square
F
Sig.
71.940
.000
Between
Groups
176849553.333
4
44212388.333
Within
Groups
15364233.333
25
614569.333
Total
192213786.667
29
Pada tabel 6, dengan uji One-Way
ANOVA didapatkan hasil yang bermakna
p=0,000 (p 0,05) dari hasil uji analisa homogenitas
data. Selanjutnya dilakukan uji One-Way
ANOVA karena data penelitian ini bersifat
kuantitatif dan digunakan untuk menguji
hipotesis dengan dua variabel atau lebih.
Analisa hasil uji One-Way ANOVA p=0,000
(p
Research Report
Efek Ekstrak Daun Kare (Murraya koenigii) Terhadap Pertumbuhan
Candida Albicans dan Aktivitas Fagositosis Makrofag
(The effects of curry leaves (Murraya koenigii) extract on the growth of
Candida Albicans and phagocytosis activation of macrophage)
Tengku Natasha Eleena Tengku Ahmad Noor, Retno Pudji Rahayu, Bambang Sumaryono
BagianPatologi Anatomi Oral dan Maksilofasial
Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga
Surabaya - Indonesia
Korespondensi (correspondence): Tengku Natasha Eleena Tengku Ahmad Noor, Mahasiswa Kedokteran Gigi
Universitas Airlangga BHMN, Surabaya, Indonesia. Email : natasha-eleena@hotmail.com
ABSTRACT
Background: Candida Albicans (C. albicans) is the commonest being of Candida species colonizes the mucosal
surfaces of all humans and have the risk of endogenous infection. Candidiasis of the oral mucosa is a disease,
as an infection frequently seen in AIDS patients and in other conditions. Nowadays, herbal therapy is often used
as an antifungal agent to inhibit the growth of fungus. Thus, this study is using curry leaves (Murraya koenigii)
extract because it is known that curry leaves contain some active agents which are potential as an antifungal
such as carbazole alkaloid, caumarin, flavanoid, tannin and polyphenol. Besides, curry leaves can induce the
phagocytosis activation of macrophage which can help to reduce the growth of C. albicans. Purpose: The aim
of the study is to find out the MIC and MFC of the curry leaves extract towards the growth of C. albicans and
phagocytosis activation of macrophage. Method: Method used in this study for the effects of curry leaves extract
towards C. albicans is dilution with the concentration of 12.5%, 9,375%, 8,75%, 6,25%, 5%, and 3,125%.
Phagocytosis activation of macrophage with the method of phagocytosis index is used by counting the total of
macrophage in the isolated peritoneal and number of C. albicans colonies before and after contacted with
macrophage using the MIC and MFC of curryleaves. Result: The concentration of 3,125%, 5% and 6,25%
showed the presence of C. albicans growth while there is no growth of C. albicans in the concentration of
8,75%, 9,375%, and 12,5%. Thus, 6,25% of curry leaves extract has the minimum ability to inhibit the growth of
the C. albicans and 8,75% has the minimum fungicidal property. These two concentrations of curry leaves
extract are observed for the phagocytosis activation of macrophage and 8,75% showed highest ability in
inducing phagocytosis activation of macrophage compared to 6,25%. Conclusion: The MIC and MFC of the
curry leaves towards the growth of C. albicans is approximately at 6,25% and 8,75%. The highest ability in
inducing phagocytosis activation of macrophage towards C. albicans growth is 8,75% curry leaves extract.
Keywords: curry leaves (Murraya koenigii) extract, Candida albicans, minimum inhibitory concentration,
minimum fungicidal concentration, phagocytosis activation of macrophage.
1
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
C. albicans bertanggungjawab pada
kebanyakan infeksi Candida seperti oral
candidiasis yang terdapat di dalam rongga
mulut.1 Pada perawatan infeksi oleh C. albicans
di rongga mulut digunakan obat-obatan anti
jamur seperti nistatin, ketokonazol, amfoterin,
namun pada saat ini obat-obatan tersebut mulai
resisten terhadap infeksi C. albicans.2
Berdasarkan hal tersebut maka perlu suatu
terobosan baru untuk terapi infeksi C. albicans
dengan penggunaan bahan alam. Bahan alam
dilaporkan relatif aman sebagai obat alternatif
sehingga, penggunaan daun kare dapat sebagai
solusi dalam penanganan infeksi C. albicans.
Daun kare atau bahasa latinnya, Murraya
koenigii adalah tanaman yang kaya sumber
karbazol alkaloid, bioaktif kumarin, alkaloid
dan alkaloid akridin karbazol dari keluarga
Rutaceae.3 Kelebihan daun kare termasuk
sebagai anti-diabetik4-7 antioksidan5,8, anti
mikroba5,9,10 dan anti inflamasi.11
Hasil dari penelitian Abishek et al. 10
dilaporkan bahwa, komposisi kimia daun kare
yaitu 9,12 octadecadienoic acid dapat
menghambat pertumbuhan C. albicans dan
mikroorganisme lainnya seperti E. coli,
Salmonella Typhimurium, Staphylococcus
Aureus dan Proteus Vulgaris dengan MIC daun
kare yaitu 0,05 µg/ml.
Dari berbagai kandungan pada daun
kare yang belum diteliti adalah fungsinya selain
sebagai anti jamur khususnya pada infeksi C.
albicans serta fungsinya dalam mengaktivasi
fagositosis makrofag. Ekstrak metanol daun
kare dievaluasi pada respon imun oral dan cell
mediated immune response untuk ovalbumin,
serta ujifagositosis dengan metode uji bersihan
karbon. Sifat fagositosis makrofag meningkat
oleh karena peningkatan produksi nitrit.12
Dengan demikian maka, penelitian
terhadap daun kare dapat menjadi solusi
alternatif dalam terapi berbahan dasar herbal
terhadap penyakit infeksi jamur, sehingga dapat
meminimalkan efek samping obat anti jamur
serta lebih ekonomis dan aman.
Penelitian ini merupakan jenis
penelitian eksperimental dengan pendekatan
the post-test only control group design yang
menggunakan binatang coba sebagai objek
penelitian.
1. Sterilisasi Alat dan Bahan yang
digunakan
Semua alat yang akan digunakan
dalam penelitian ini sebelumnya akan disteril
terlebih dahulu dalam autoklaf dengan suhu
121ºC selama 15 menit.
2. Persiapan kultur C. albicans
Stok kultur C.albicans isolat Surabaya
diambil dari Laboratorium Biologi Oral FKG
Universitas Airlangga (diambil dari pasien
HIV yang telah dikarekterisasi) dan dilakukan
kultur ulang pada media padat Sabouraud
Dextrose Broth (Difco) lalu di inkubasi pada
suhu 37ºC selama 18 - 20 jam dalam
inkubator.
3. Persiapan Ekstrak Daun Kare
Pembuatan ekstrak daun kare dibuat
dari daun kare yang telah dikeringkan. Daun
kare yang telah dikeringkan seterusnya
dimaserasi dengan etanol 99% [rasio 1:3
(W/V)] dalam bejana tertutup selama 3x24
jam, setelah itu disaring dengan corong
Buchner. Hasil saringan didapatkan ekstrak
cair yang diuapkan sampai bebas dari pelarut
etanol dengan menggunakan Rotary Vacuum
Evaporator pada suhu 40ºC dan kemudian
disterilkan dengan UV selama 30 menit.13
Ektrak daun kare dibuat dengan
konsentrasi 12,5%, 9,375%, 8,75%, 6,25%,
5%, dan 3,125% untuk mendapatkan
konsentrasi MIC dan MFC daun kare terhadap
pertumbuhan C. albicans.
4. Uji Kepekaan Jamur Terhadap Ekstrak
Daun Kare dengan Teknik Dilusi
Uji aktivitas antifungi ekstrak daun
kare ini dilakukan dengan metode dilusi cair.
Uji diawali dengan memasukkan suspensi
jamur 1.5x108 CFU/ml C. albicans sebanyak
0,5 ml ke dalam tiap-tiap tabung uji yang
berisi 0,5 ml larutan uji dalam berbagai
2
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
konsentrasi. Campuran suspensi jamur dan
larutan uji tersebut diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24 jam. Kekeruhan larutan hasil
inkubasi diamati. Selanjutnya, cairan kultur
hasil inkubasi digoreskan pada media agar
SDA menggunakan ose lalu diinnkubasi pada
suhu 37ºC selama 18-24 jam. Pertumbuhan
koloni jamur pada media agar Sabouraud
Dextrose Agar diamati dan dibandingkan
dengan kontrol untuk menentukan MIC dan
MFC ekstrak daun kare terhadap pertumbuhan
C. albicans.14
5. Persiapan Tikus (Rattus norvegicus)
dengan Pemberian Ekstrak Daun Kare
Tikus diberikan ekstrak daun kare
setiap hari selama 2 minggu dengan dosis
tunggal yang mempunyai konsentrasi MFC
dan MIC ekstrak daun kare serta konsentrasi
lebih rendah pada C. albicans secara sonde
sebanyak 0.2 ml. 3 ekor tikus dijadikan
sebagai subjek diberikan 3 konsentrasi daun
kare yang berbeda dengan 1 ekor tikus setiap
konsentrasi dan 1 ekor dijadikan sebagai
subjek kontrol tanpa diberikan ekstrak daun
kare.
6. Persiapan Makrofag dari Cairan
Peritoneal Tikus
Tikus diinjeksi Thioglycolate 7 hari
sebelum diambil cairan peritoneal ke dalam
rongga peritoneum menggunakan spuit 25G
agar didapatkan makrofag aktif.
Setelah 7 hari, tikus diletakkan dalam
posisi terlentang, kulit abdomen dibuka
sehingga tampak peritoneum kemudian
dibersihkan dengan etanol 70%, dan diinjeksi
dengan 10cc larutan DMEM dingin ke dalam
rongga peritoneum menggunakan spuit 19G.
Peritoneum dipijat pelan untuk mendapatkan
makrofag yang cukup banyak.Setelah 30
menit, cairan disedot kembali sampai habis
dan dimasukkan dalam tabung falkon yang
steril.
Cairan peritoneal yang terdapat di
dalam tabung falkon dilakukan sentrifus
dengan kecepatan1000 rpm pada suhu
4oC.Seterusnya, supernatan yang terbentuk
dibuang dan resuspen pelet sel dengan
mengetuk bagian bawah botol pelan-pelan
sehingga mendapatkan konsentrasi yang
cukup.
7. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag
terhadap C. albicans dan Perhitungan
Makrofag
Perhitungan sel makrofag dilakukan
dengan pengambilan 20µl sampel cairan
peritoneal ke dalam microtube dan dilakukan
sentrifus selama 6 menit dengan kecepatan
600 rpm. Seterusnya sel makrofag dilakukan
pewarnaan dengan Diff Quick dan dihitung
menggunakan hemositometer.
Uji aktivitas fagositosis makrofag
diteruskan dengan makrofag yang telah
dipanen, dicuci dengan cara sentrifugasi 250G
pada suhu 4ºC selama 2 menit, kemudian
dihitung jumlah selnya. Kultur makrofag
disiapkan dengan kepadatan sel 2,5.107 sel/ml
dandiambil 0,1 ml ke microplate kultur.
Cairan
media
DMEM
dan
FBS5%
ditambahkan sebanyak 0,9 ml kedalam setiap
microplate dan dirotasi dengan kelajuan 8 rpm
selama 20-30 menit dengan suhu 37ºC. Setelah
itu, diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 30
menit untuk proses adaptasi.
Makrofag yang sudah diinkubasi 30
menit kemudian dimasukkan kedalam kultur
C. albicans sudah disiapkan dengan kepadatan
sel akhir 2,5x107 sel dan sudah ditambahkan
dengan 50 µl normal serum inaktivasi,
selanjutnya diinkubasi dengan internal waktu
selama 1 jam.
Kultur makrofag diamati dibawah
mikroskop inverted untuk melihat aktivitas
fagositosis makrofag terhadap C. albicans.
Setelah dilakukan pengamatan dan kultur
dengan cara panen sel dan dicuci dengan PBS
dan FBS5%, hasil kontak makrofag dan C.
albicans disentrifugasi sebanyak 3 kali
250G/1000rpm pada suhu 4˚C serta dibuang
supernatant.
0,1 ml kultur diambil untuk
pembuatan hapusan pada objek glass, dan
fiksasi dengan methanol serta dilanjutkan
dengan pengecatan Diff Quick (protokol
mengikuti supplier). Perhitungan jumlah C.
albicans sebelum dan setelah diberikan
makrofag dilakukan dengan pengambilan 50µl
3
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
kultur dan diinkubasi di inkubator oksigen
dengan suhu 37ºC pada media TSA selama 24
jam untuk melihat aktivitas fagositosis
makrofag.
8. Pengukuran Penelitian
Uji MIC ekstrak bahan penelitian
dilakukan dengan menggunakan permukaan
medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada
permukaan medium dan kertas saring yang
berbentuk cakram yang telah mengandung
ekstrak penelitian. Setelah inkubasi overnight
jumlah koloni mikroba yang tumbuh dihitung
dan dibandingkan dengan jumlah koloni
mikroba pada konsentrasi yang lain. Dengan itu
maka, pengukuran MIC secara tidak langsung
dari daya hambat antibiotika terhadap
mikroba.15
MFC adalah konsentrasi ekstrak yang
dapat menghambat hamper 99 - 99,5% jamur.
Penapisan dilakukan diantara konsentrasi
ekstrak paling tinggi yang dapat menghambat
pertumbuhan jamur dan konsentrasi MIC
ekstrak sehingga mendapatkan konsentrasi
MFC yang optimum dengan perhitungan
hambatan jumlah koloni jamur.16
Perhitungan sel makrofag dilakukan
dengan pengambilan 20µl sampel dan dihitung
menggunakan
hemositometer.
Aktivitas
fagositosis makrofag diuji dengan diamati 200
sel dan dihitung makrofag yang mengandung
C. albicans dengan menggunakan rumus indeks
fagositosis.17
9. Analisa Data
Data hasil penelitian diperoleh dengan
cara mengamati MIC dan MFC ekstrak daun
kare. Konsentrasi ekstrak yang mulai jernih
pada konsentrasi terkecil sebagai MIC dan
konsentrasi minimal dalam penghambatan
pertumbuhan jamur sebagai MFC.
Pengukuran
aktivitas
fagositosis
makrofag dengan indeks fagositosis dilihat dari
data yang diperoleh dari hasil hitungan
makrofag dengan alat hemositometer dan
hitungan C. albicans. Indeks fagositosis
dianalisa dengan uji One-Sample KolmogorovSmirnov dan apabila didapatkan sebaran
distribusi yang normal, sehingga data di analisa
dengan uji One-Way ANOVA untuk melihat
perbedaan pada keempat kelompok dilanjutkan
dengan uji Post Hoc Test dan TUKEY HSD
untuk melihat perbedaan masing-masing
kelompok pada derajat kemaknaan 0,05.
HASIL
Ekstrak daun kare dapat menghambat
pertumbuhan C. albicans pada konsentasi
12,5%, 9,375% dan 8,75% yang dilihat dari
tidak didapatkan zona pertumbuhan C.
albicans. Disisi lain, pada konsentrasi 6,25%
didapatkan zona hambat dengan jumlah C.
albicans rata-rata adalah 2,15x104 CPU/ml.
Pada konsentrasi 5% dan 3,125% tidak terdapat
zona hambat sehingga tidak bisa dihitung
karena terlalu banyak jumlah koloni C.
albicans. Hasil dapat dilihat pada Tabel 1 dan
Gambar 1.
a
b
c
d
e
Gambar 1 Jumlah koloni C. albicans setelah
paparan dengan daun kare. (a) Konsentrasi12,5%,
(b) 9,375%, (c) 8,75%, (d) 6,25%, (e) 3,125%
4
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Tabel 1 Ekstrak daun kare terhadap hitung total jamur dalam berbagai konsentrasi
Konsentrasi
Hitung Total Jamur (CPU/ml)
Rata-rata
(%)
1
2
3
4
12,5
0
0
0
0
0
9,375
0
0
0
0
0
8,75
0
0
0
0
0
6,25
1,8x103
2,06x103
8x104
2,2x103
2,15x104
5
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
3,125
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
K. negatif
0
K. positif
8,2X102
Keterangan : 0 = steril, tidak ada pertumbuhan jamur; TBUD = tidak bisa dihitung. CFU/ml = colony forming uniter per
millilitre
Hasil pengamatan tabel 2 didapatkan
daun kare pada konsentrasi 6,25% dan 8,75%
dapat meningkatkan jumlah makrofag dengan
rata-rata 16867 mm3dan 23750 mm³ dibanding
kelompok
kontrol.
Sedangkan
pada
konsentrasi 3,75% terjadi penurunan jumlah
makrofag apabila dibanding kelompok kontrol
dan jumlah makrofag paling sedikit diantara
konsentrasi daun kare yang lain.
Tabel 2 Konsentrasi daun kare terhadap peningkatan jumlah makrofag
Hitung Makrofag (mm3)
Konsentrasi (%)
8,75
6,25
3,75
Kontrol negatif
Kontrol positif
1
21350
17600
8150
0
15500
Rata-rata
2
16150
14500
3800
3
33750
18500
15950
23750
16867
9300
10150
16850
14167
Tabel 3 menunjukkan jumlah C.
albicans setelah pemberian makrofag yang
diinduksi ekstrak daun kare dengan
konsentrasi 8,75% didapatkan sebanyak 680
CFU/ml. Sedangkan pada konsentrasi 6,25%
diperoleh jumlah C. albicans sebanyak 951,67
CFU/ml. Hasil ini menunjukkan terdapat
penurunan jumlah C. albicans dengan
makrofag yang diinduksi konsentrasi MIC dan
MFC ekstrak daun kare apabila dibandingkan
dengan jumlah C. albicans pada kelompok
kontrol positif dan hitung awal jumlah C.
albicans.
5
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Tabel 3 Jumlah C. albicans setelah diinduksi makrofag yang telah diberikan konsentrasi MIC (6,25%), MFC
(8,75%) dan 3,75% daun kare.
hitung total awal jamur
(CFU/ml)
Konsentrasi
8,75
6,25
3,75
Kontrol Positif
3780
760
820
4400
7100
3520
740
1040
5400
5800
4040
620
1280
8200
7100
3480
740
1110
5400
5800
4560
660
840
5400
7100
4150
560
620
7600
5400
Rata-rata
680
951,67
6066,67
6383,33
daun kare (%)
Gambar 3 Hasil uji fagositosis makrofag
Dari data yang diperoleh hasil indeks
fagositosis, dilakukan uji One-Way ANOVA
setelah dilakukan uji normalitas pada masing masing kelompok dengan menggunakan uji
One-Sample Kolmogorov-Smirnov dan uji
homogenitas.Hasil dapat dilihat pada tabel 4
dan 5. Pada tabel 4, keempat kelompok
penelitian mempunyai nilai Asymp. Sig. (2-
tailed) lebih besar dari 0,05 (p>0,05) yang
berarti data pada kelompok tersebut
berdistribusi normal. Seterusnya dilanjutkan
uji homogenitas (Tabel 5) dengan signifikansi
diatas 0,05 (p=0,051; p>0,05). Analisa data
memenuhi syarat untuk dilanjutkan dengan uji
one-way ANOVA.
Tabel 4 Nilai Asymp. Sig. (2-Tailed) Uji Normalitas Kolmogorov-Smirnov
Asymp. Sig. (2
tailed)
Kontrol positif
Konsentrasi MIC
daun kare (6,25%)
Konsentrasi MFC
daun kare (8,75%)
Konsentrasi daun
kare (3,75%)
.590
.989
.761
.492
6
Pathology of Oral and Maxillofacial Journal Vol. 1 No. 1
Tabel 5 Uji Analisis Homogenitas Data
Levene Statistic
2.280
df1
4
df2
25
Sig.
.051
Tabel 6 Uji One-Way ANOVA masing-masing kelompok penelitian
Sum
Squares
of
df
Mean Square
F
Sig.
71.940
.000
Between
Groups
176849553.333
4
44212388.333
Within
Groups
15364233.333
25
614569.333
Total
192213786.667
29
Pada tabel 6, dengan uji One-Way
ANOVA didapatkan hasil yang bermakna
p=0,000 (p 0,05) dari hasil uji analisa homogenitas
data. Selanjutnya dilakukan uji One-Way
ANOVA karena data penelitian ini bersifat
kuantitatif dan digunakan untuk menguji
hipotesis dengan dua variabel atau lebih.
Analisa hasil uji One-Way ANOVA p=0,000
(p