Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba [Azadirachta indica A. Juss] FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap kultur sel myeloma - USD Repository

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) FP 10 , FP 20 , FP 30 , dan FP

  40 TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA

  SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Alfonsia Purnamasari

  NIM : 038114044 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) FP 10 , FP 20 , FP 30 , dan FP

  40 TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA

  SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Alfonsia Purnamasari

  NIM : 038114044 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Karya yang terbaik adalah karya hasil dari pengorbanan diri Karya ini walau bukan yang terbaik bagi orang lain, tetapi terbaik bagi diriku

  (Shary)

  

Kupersembahkan karya ini untuk

Jesus Christ yang selalu menyertaiku dalam segala hal

Papa, Mama, Bude, my brothers n’ sister Ius, Adit, Onna

Yang selalu memberi doa, semangat dan dukungan

  

Untuk teman-teman terbaikku dan Almamaterku tercinta

Tengkyu for all

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Puji Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena penulis bisa menyelesaikan skripsi yang berjudul Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP

  10 , FP 20 , FP 30 , dan FP 40 terhadap kultur sel Myeloma.

  Sebagai salah satu tugas akhir di jenjang pendidikan S1, kiranya penelitian ini dapat memberikan sumbangan informasi yang berharga bagi pengembangan obat antikanker dari tanaman Azadirachta indica A. Juss di masa mendatang.

  Dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak lepas dari bantuan dan dorongan dari berbagai pihak yang senantiasa meluangkan waktu dan pikirannya. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

  1. Drs. A. Yuswanto, Ph.D., S.U., Apt, yang telah memberikan bimbingan selama penyusunan skripsi.

  2. dr. Luciana Kuswibawati,MKes yang memberikan saran sebagai dosen penguji skripsi.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., yang memberikan saran sebagai dosen penguji skripsi.

  4. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan.

  5. Segenap Dosen dan karyawan yang telah banyak memberikan bimbingan dan bantuan selama ini.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  6. Mbak Yuli, Pak Rajiman, Mas Dwi dan segenap karyawan Laboratorium Hayati UGM yang telah banyak membantu, membimbing dan menemani dalam jalannya penelitian skripsi ini.

  7. Arry, Candra, Robby dan Nadia yang telah memberi masukan-masukan dan diskusi dalam terselesainya skripsi ini.

  8. Mama, Papa, Bude Sur, Ius dan segenap keluarga yang bersedia mendengarkan keluh kesahku dan atas doa dan dorongan semangat yang telah diberikan kepadaku.

  9. Vita, Jenny, Lucy, Melon, Anna, Ndari, Leea, Agnes, Wati, Mila, dan Ratih atas kerjasama, diskusi, canda tawa dan keluh kesahnya hingga skripsi ini bisa terselesaikan.

  10. Angger, Rosa, Tata, Vera, Dita atas kesabaran mendengar keluh kesahku, masukan dan dorongan semangat juga atas persahabatan yang indah ini.

  11. Teman-teman kelas A, khususnya kelompok praktikum B atas kebersamaan dan kerjasamanya, canda tawa dan persahabatannya yang indah.

  12. Teman-teman angkatan 2003 Fakultas Farmasi Univesitas Sanata Dharma, yang telah bersama-sama berjuang.

  13. Semua pihak yang telah memberikan dukungan baik moral maupun material yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dan kesalahan. Oleh karena itu penulis tidak menutup diri atas koreksi, kritik dan saran dari tulisan ini.

  Penulis berharap, karya ini dapat bermanfaat dan mendorong mahasiswa angkatan berikutnya untuk berkarya lebih baik lagi demi majunya dunia kefarmasian di Indonesia.

  Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

INTISARI

  Kanker merupakan jenis tumor ganas yang menjadi penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Telah banyak dikembangkan pengobatan antikanker menggunakan obat tradisional, salah satunya adalah daun mimba. Berdasarkan penelitian yang sebelumnya, diketahui bahwa daun mimba pada fraksi 30% memiliki sitotoksisitas yang paling tinggi dibandingkan fraksi 60% dan fraksi 100% terhadap sel Myeloma dan paling berpotensi sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan melakukan fraksinasi lebih lanjut untuk mengetahui keberadaan protein yang mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel Myeloma.

  Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro terhadap sel Myeloma dan sel Vero menggunakan metode MTT (3-4(4,5-dimetil-diazol-2-il)-2,5-diphenil tetrazolium bromid). Fraksi protein diperoleh dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat dengan konsentrasi 10%, 20%, 30%, dan 40%. Hasil uji dinyatakan dalam persentase kematian dan nilai LC

  50 dan selanjutnya dihitung menggunakan uji T.

  Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa FP

  10 memiliki sitotoksisitas

  paling besar terhadap sel Myeloma dan sel Vero. Harga LC untuk FP , FP , FP ,

  50

  10

  20

  30

  dan FP berturut-turut untuk sel Myeloma adalah 0,01 ng/ml; 0,57µg/ml; 0,73µg/ml;

  40

  dan 2.07µg/ml. Sedangkan untuk sel Vero adalah 0,24 ng/ml; >1g/ml; 0,01 μg/ml; dan >1g/ml . FP

  30 menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0.05) tetapi dilihat dari

  nilai LC

  50 -nya untuk sel Vero, FP 30 memiliki nilai LC 50 yang lebih kecil

  dibandingkan sel Myeloma. Berarti FP lebih bersifat toksik terhadap sel Vero

  30

  dibandingkan dengan sel Myeloma, sehingga kurang baik untuk diterapkan dalam pengobatan kanker. Kata kunci : daun mimba, sitotoksisitas, fraksi protein, sel Myeloma

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

ABSTRACT

Cancer is a disease to cause death only exceeded by cardiovaskular disease.

  Alternative therapy and traditional medicine had been developed to treat cancer, one of them is neem leaves. Previously research showed that protein fraction 30% had highest cytotoxic activity compare to that of protein fraction 60% and 100% against

  

Myeloma cells and consider to be the most potential fraction as anticancer. This

  research aim to carried out a further fractination of protein fraction of neem leaves to investigate the existence protein having cytotoxic activity against Myeloma cells.

  This research was an experimental research with complete random design one way pattern. The cytotoxic activity assay was conduted against Myeloma and Vero cells in vitro using MTT (3-4(4,5-dimetil-diazol-2-il)-2,5-diphenil tetrazolium bromid) method. Protein fractions were obtained by precipitating with ammonium sulphate with the concentration of 10%, 20%, 30% and 40%. Data expressed by percentage of death and LC value and were calculate by T test.

  50 The result showed that FP 10 had the highest cytotoxic activity against Myeloma and Vero cells. LC 50 value of FP 10 , FP 20 , FP 30 , and FP 40 for Myeloma cells

  are 0,01ng/ml; 0,56 μg/ml; 0,71 μg/ml; dan 2,04 μg/ml. While for Vero cells are

  0,24ng/ml; >1g/ml; 0,01 differ manifestly with cytotoxicity

  30

  μg/ml; dan >1g/ml. FP

  

Vero cells (p<0.05) but LC of FP for Vero cells is smaller than Myeloma cells, so

  50

  30 it’s less good to be use as medication of cancer.

  Key word: neem leaves, cytotoxicity, protein fraction, Myeloma cell

  

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................... .. ii

  HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iii HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iv

  HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v KATA PENGANTAR .................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix

  INTISARI...................................................................................................... x

  

ABSTRACT .................................................................................................... xi

  DAFTAR ISI................................................................................................. xii DAFTAR TABEL......................................................................................... xvi

  DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xviii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xix ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING.............................................. xxi

  BAB I PENGANTAR .................................................................................. 1 A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

  1. Rumusan masalah ....................................................................... 2

  2. Keaslian penelitian ...................................................................... 3

  3. Manfaat penelitian....................................................................... 3

  B. Tujuan .................................................................................................. 4

  1. Tujuan umum…… ...................................................................... 4

  2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4

  BAB II PENELAAH PUSTAKA ................................................................ 5 A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)........................................ 5

  G. Landasan Teori..................................................................................... 10

  C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 13

  5. Definisi operasional .................................................................... 13

  4. Variabel pengacau tak terkendali ................................................ 12

  3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 12

  2. Variabel tergantung..................................................................... 12

  1. Variabel bebas............................................................................. 12

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 12 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 12 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................... 12

  H. Hipotesis............................................................................................... 11

  F. Uji Sitotoksisitas .................................................................................. 9

  1. Keterangan Botani....................................................................... 5

  E. Sel Vero................................................................................................ 9

  D. Sel Myeloma………............................................................................. 8

  C. Kanker……………. ............................................................................. 7

  B. Protein .................................................................................................. 7

  5. Kegunaan .................................................................................... 6

  4. Kandungan kimia ........................................................................ 6

  3. Deskripsi ..................................................................................... 5

  2. Nama Daerah............................................................................... 5

  

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  1. Alat ............................................................................................ 13

  2. Bahan .......................................................................................... 13

  D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 14

  1. Determinasi tanaman................................................................... 14

  2. Pengumpulan daun mimba........................................................... 15

  3. Sterilisasi alat dan bahan............................................................. 15

  4. Preparasi fraksi protein daun mimba .......................................... 15

  5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV ............ 16

  6. Propagasi dan panen sel Myeloma .............................................. 17

  a. Propagasi sel Myeloma............................................................ 17

  b. Panen sel Myeloma.................................................................. 17

  7. Propagasi dan panen sel Vero ..................................................... 18

  a. Propagasi sel Vero ................................................................... 18

  b. Panen sel Vero......................................................................... 18

  8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma. 19

  9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero........ 20

  E. Analisis Hasil....................................................................................... 20

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22 A. Sterilisasi Alat dan Bahan .................................................................... 22 B. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba .................................... 22 C. Pengukuran Konsentrasi Fraksi Protein Secara Spektrofotometer UV.. 25 D. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba terhadap sel Myeloma dan sel Vero.......................................................................................... 26

  

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 35 A. Kesimpulan .......................................................................................... 35 B. Saran..................................................................................................... 35 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 36 LAMPIRAN.................................................................................................. 38 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 78

  DAFTAR TABEL

  Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  terhadap kultur sel Vero ............................................ 43

  20

  Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta indica A Juss. FP

  indica A Juss. FP 10 terhadap kultur sel Vero.................................. 43

  Tabel X. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  indica A Juss. FP 40 terhadap kultur sel Myeloma .......................... 42

  Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  indica A Juss. FP 30 terhadap kultur sel Myeloma .......................... 42

  indica A Juss. FP 20 terhadap kultur sel Myeloma .......................... 41

  Halaman Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan konsentrasi protein masing- masing fraksi protein daun mimba.............................................. 26

  terhadap kultur sel Myeloma .......................... 41 Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  10

  A Juss. FP

  indica

  Tabel VI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  hasil analisis probit pada sel Myeloma dan sel Vero 32 Tabel V. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometri UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280nm dan 260nm .................................................... 40

  50

  Tabel II. Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein terhadap sel Myeloma .... 29 Tabel III. Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein terhadap sel Vero...... 31 Tabel IV. Harga LC

  PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  indica A Juss. FP 30 terhadap kultur sel Vero.................................. 44

  Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

  indica A Juss. FP 40 terhadap kultur sel Vero.................................. 44

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Foto Sel Myeloma ....................................................................... 27 Gambar 2. Foto Sel Vero.............................................................................. 27 Gambar 3. Grafik Konsentrasi fraksi protein daun mimba VS persen kematian sel Myeloma ................................................... 30 Gambar 4. Grafik Konsentrasi fraksi protein daun mimba VS persen kematian sel Vero .......................................................... 31

  

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat kejenuhan tertentu ................................................................. 38 Lampiran 2. Cara Perhitungan Konsentrasi Protein ................................. 40 Lampiran 3. Absorbansi Sel Myeloma dengan Metode MTT ................... 41 Lampiran 4. Absorbansi Sel Vero dengan Metode MTT .......................... 43 Lampiran 5. Hasil analisis probit fraksi protein Azadirachta indica A.Juss terhadap kultur sel Myeloma dengan metode MTT .............. 45 Lampiran 6. Hasil analisis probit fraksi protein Azadirachta indica A.Juss terhadap kultur sel Vero dengan metode MTT ..................... 57 Lampiran 7. Uji distribusi data sel Myeloma dengan

  Kolmogorov-Smirnov ………….………………………….. 69 Lampiran 8. Uji distribusi data sel Vero dengan

  Kolmogorov-Smirnov …………….……………………….. 70 Lampiran 9. Hasil uji signifikansi LC50 antara sel Myeloma dan sel Vero dengan analisis statistic uji T-independent sampel.........................................…………………………… 72

  Lampiran 10. Foto Tanaman Azadirachta indica A. Juss ........................... 73 Lampiran 11. Foto Daun Azadirachta indica A. Juss.……………………... 73 Lampiran 12. Foto ELISA reader SLT 340ATC ........................................ 74 Lampiran 13. Foto Mikroskop Olympus....................……………………... 74

  

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Lampiran 15. Foto 96 Well Plate................................................................. 75 Lampiran 16. Foto Spektrofotometer UV..................……………….……... 76 Lampiran 17. Foto Sentrifuge K PLC Series ............................................... 76 Lampiran 18. Nilai r tabel dan r hitung pada sel Myeloma dan sel Vero .... 77

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  FP : Fraksi Protein FP (PF ) : Fraksi protein (protein fraction) daun Azadirachta indica A.

  10

  10 Juss. hasil pengendapan amonium sulfat 10% jenuh FP (PF ) : Fraksi protein (protein fraction) daun Azadirachta indica A.

  20

  20 Juss. hasil pengendapan amonium sulfat 20% jenuh

  FP

  30 (PF 30 ) : Fraksi protein (protein fraction) daun Azadirachta indica A.

  Juss. hasil pengendapan amonium sulfat 30% jenuh FP

  40 (PF 40 ) : Fraksi protein (protein fraction) daun Azadirachta indica A.

  Juss. hasil pengendapan amonium sulfat 40% jenuh

  continous cell linse : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus

  menerus FBS : Fetal Bovine Serum MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid ) reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

  round single cell : sel tunggal yang berbentuk bulat

  SDS : Sodium Dodesil Sulfat

  

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan leher

  bengkok 96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker adalah jenis tumor yang ganas. Kanker disinyalir merupakan

  penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler. Baik dinegara maju maupun di negara berkembang penderita kanker dari tahun ke tahun cenderung makin bertambah. Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, WHO, setiap tahun jumlah penderita kanker didunia bertambah 6,25 juta orang. Dalam 10 tahun mendatang diperkirakan 9 juta orang akan meninggal setiap tahun akibat kanker. Kanker dapat menimpa semua orang pada semua bagian tubuh dan pada semua golongan umur (Anonim, 2003). Jika kanker ditemukan pada stadium dini kemungkinan penyembuhannya cukup besar, tetapi jika telah terjadi penyebaran luas kemungkinan penyembuhannya menjadi semakin kecil.

  Penyakit kanker hingga kini termasuk salah satu penyakit yang sulit ditemukan obatnya, terkecuali dengan operasi atau terapi kimia dan radiasi dengan sinar

  γ. Di rumah sakitpun pengobatan kanker masih sangat terbatas sehingga pelayanan pengobatan kanker ini juga terbatas. Biasanya pengobatan kanker bersifat umum yaitu bisa digunakan untuk semua jenis kanker. Selain kerja obat yang tidak selektif, obat-obat kanker juga merusak sel-sel tubuh yang normal. Karena itu sangat diharapkan suatu antikanker yang memiliki toksisitas selektif menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel normal.

  Perlu dikembangkan obat anti kanker dari bahan alam yang memiliki efek samping kecil, mudah diperoleh serta memiliki nilai ekonomis yang relatif murah.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  Salah satu tanaman yang dipercaya dapat menyembuhkan kanker adalah tanaman mimba. Daun mimba telah digunakan untuk antiinflamasi, antirematik, antipiretik, penurunan gula darah, antitukak lambung, hepatoprotektor, imunopotensiasi, antifertilitas, antivirus dan antikanker (Sukrasno, 2003).

  Suatu penelitian menggunakan total protein daun mimba yang diendapkan dengan ammonium sulfat terbukti memiliki sitotoksisitas terhadap kultur sel myeloma (Rahmawati, 2004) meskipun daya sitotoksiknya kecil. Fraksi protein yang diendapkan dengan amonium sulfat 30% dan 60% berpotensi sebagai antikanker, dan pada fraksi protein 30% jenuh mempunyai efek sitotoksik yang paling tinggi terhadap sel myeloma dan paling berpotensi sebagai antikanker (Hariyadi, 2006).

  Suatu senyawa dinyatakan memiliki potensi sebagai antikanker jika memiliki nilai LC 50 lebih kecil dari 20µg/ml (Suffness and Pezzuto cit Candra, 2006).

  Diharapkan penelitian dengan menggunakan fraksi protein daun mimba yang yang lebih kecil, yaitu fraksi protein 10%, 20%, 30% dan 40% yang diperlakukan terhadap sel Myeloma akan memberikan daya sitotoksik dan berpotensi sebagai antikanker tanpa membunuh sel normal dengan melihat daya sitotoksik terhadap sel Vero.

1. Rumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: a.

  50 fraksi protein daun mimba FP 10 , FP 20 , FP 30 , dan

  seberapa besar nilai LC FP

  40 terhadap sel Myeloma dan sel Vero?

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  c. apakah fraksi protein daun mimba FP

  b. manfaat praktis yang dapat diperoleh ialah dapat membuktikan khasiat daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) sebagai obat antikanker

  Penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein daun mimba diharapkan memiliki beberapa manfaat antara lain: a. manfaat teoritis ialah untuk melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, kegunaan dan efek sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel Myeloma dengan sel Vero sebagai pembanding

  3. Manfaat penelitian

  

10 , FP

20 , FP 30 , dan FP 40 terhadap Kultur Sel Myeloma .

  Sebelumnya pernah dilakukan penelitian mengenai Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba Hasil Pengendapan dengan Ammonium Sulfat 30%, 60% dan 100% jenuh terhadap sel Myeloma (Hariyadi, 2006). Sejauh yang diketahui penulis, bahwa belum pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A.Juss) FP

  2. Keaslian penelitian

  dikembangkan sebagai antikanker jika dilihat daya sitotoksisitasnya terhadap sel Myeloma dan sel Vero?

  10 , FP 20 , FP 30 , dan FP 40 berpotensi untuk

  b. diantara fraksi protein daun mimba FP

  10

  Vero

  , manakah yang mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel Myeloma dan Sel

  40

  , dan FP

  30

  , FP

  20

  , FP

  ?

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

B. Tujuan Penelitian

  Tujuan umum: untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A.

  Juss) FP

  10 , FP 20 , FP 30 dan FP 40 jenuh memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

  Tujuan khusus:

  a. untuk mengetahui nilai LC

  

50 fraksi protein FP

10 , FP 20 , FP 30 , dan FP 40 terhadap

  sel Myeloma dan sel Vero

  b. untuk mengetahui fraksi protein daun mimba FP

  10 , FP 20 , FP 30 , dan FP 40 yang

  mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel Myeloma dan sel

  Vero

  c. untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP

  10 , FP 20 , FP 30 , dan

  FP berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker jika dilihat daya

  40

  sitotoksisitasnya terhadap sel Myeloma dan sel Vero

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB II PENELAAH PUSTAKA A. Mimba (Azarirachta indica A. Juss)

  1. Keterangan Botani Tumbuhan mimba termasuk dalam suku Meliaceae, marga Azadirachta, jenis Azadirachta indica A. Juss. (Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1965).

  2. Nama Daerah Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) dengan sinonim Melia

  

azadirachta Linn memiliki nama daerah Jawa yaitu imba, mamba, membha,

mempheuh sedangkan nama Nusa Tenggara ialah intaran, mimba (Hutapea, 1993).

3. Deskripsi

  Perawakan berupa pohon dengan tinggi 8-15m, bunga banci, batang simpodial, kulit batang mengandung gum dan berasa pahit. Daun menyirip gasal berpasangan, anak daun berupa helaian berbentuk memanjang-lanset-bengkok dengan panjang 3-10cm, lebar 0,5-3,5cm, pangkal runcing tidak simetri, ujung runcing sampai mendekati meruncing, gundul tepi daun bergerigi kasar, remasan berasa pahit, warna hijau muda. Bunga berupa susunan malai, terletak diketiak daun paling ujung, 5-30cm, gundul atau berambut halus pada pangkal tangkai karangan, tangkai bunga 1-2mm, kelopak bewarna kekuningan, bersilia dengan panjang 5- 7mm. Benang sari membentuk tabung benang sari, sebelah luar gundul atau berambut pendek halus, sebelah dalam berambut rapat, panjang putik rata-rata 3mm, gundul. Buah berbentuk bulat, hijau kekuningan 1,5-2cm, berbunga pada bulan Maret-Desember (Sudarsono, 2002; Sukrasno, 2003).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  4. Kandungan kimia Metabolit yang ditemukan dari tanaman mimba antara lain disentil vilasinin, nimbandiol, 3-desasentil salanin, salanol, azadirachtin. Biji mengandung azadirachtin, azadiron, azadiradion, epoksiazadiradion, gedunin, 17-epiazadiradion, 17-

  β-hidroksi azadiradion dan alkaloid. Kulit batang dan kulit akar mengandung nimbin, nimbinin, nimbidin, nimbosterol, nimbosterin, sugiol, nimbiol, margosin (suatu senyawa alkaloid). Hasil hidrolisis ekstrak bunga ditemukan kuersetin, kaemferol dan sedikit mirisetin. Dari bagian kayu ditemukan nimaton, C H O ,

  24

  30

  5

  15% zat samak terkondensasi. Buah mengandung alkaloid (azaridin). Daun mengandung Paraisin, suatu alkaloid dan komponen minyak atsiri mengandung senyawa sulfida. Tangkai dan ranting hijau mengandung 2 tetranorterpenoid- hidroksibutenolida yaitu desasetilnimbinolida dan desasetilsonimbinolida yang berhasil diisolasi bersama dengan desasetilnimbin. Disamping itu terdapat pula senyawa 17-epiazadiradion, 17-

  β-hidroksiazadiradion, azadirachtin, azadiron, azadiradion, epoksiazadiradion dan gedunin (Sudarsono,dkk, 2002).

  5. Kegunaan Daun digunakan untuk penambah nafsu makan, untuk menanggulangi disentri, borok, malaria, anti bakteri. Minyak untuk mengatasi eksim, kepala yang kotor, kudis, cacing, menghambat perkembangan dan pertumbuhan kuman. Kulit batang digunakan untuk mengatasi nyeri lambung, penguat, penurun demam. Buah dan getah digunakan sebagai penguat (Sudarsono,dkk, 2002).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

B. Protein

  Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Suatu protein terdiri dari asam amino yang terikat satu dengan yang lain oleh ikatan peptida (Poedjiadi, 1994). Beberapa protein dalam tanaman memiliki sifat sebagai protein racun. Sebagian diantaranya berperan dalam melindungi tumbuhan dari serangan mikroba. Protein beracun lain memberikan harapan sebagai antikanker dan penyakit lain yang disebabkan oleh virus (Robinson, 1991).

  Pemurnian protein dapat dilakukan dengan cara fraksionasi, yaitu memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi.

  Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuh (Poedjiadi, 1994). Hasil pengendapan didialisis untuk menghilangkan amonium sulfat yang sebelumnya digunakan untuk mengendapkan protein. Dialisis ini didasarkan pada perbedaan konsentrasi antara dua permukaan membran dialisis. Molekul kecil, dalam hal ini adalah amonium sulfat, akan keluar dari kantong dialisis dan protein yang mempunyai bobot molekul besar akan tetap tertinggal di dalam kantong dialisis. Proses dialisis akan berhenti setelah tercapai keadaan setimbang atau equilibrium (Kerese, 1984).

C. Kanker

  Kanker adalah penyakit akibat pertumbuhan tidak normal dari sel-sel jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker dalam perkembangannya, sel-sel kanker ini dapat menyebar ke bagian tubuh lainnya sehingga dapat menyebabkan kematian. Kanker sering dikenal masyarakat sebagai tumor, padahal tidak semua

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  tumor adalah kanker (Anonim, 2003). Perbedaan yang utama yaitu kanker merupakan neoplasma yang menyebar dan ganas atau disebut malignant neoplasm dan tumor merupakan neoplasma yang tidak menyebar dan tidak ganas atau disebut benign neoplasm (Bosman, 1996).

  Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut: 1. hiperplasi yaitu pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru yang abnormal karena kehilangan kontrol pertumbuhan.

  2. metaplasi yaitu perubahan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga dewasa.

  3. displasi yaitu eprubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar dan orientasinya, masih bersifat reversibel.

  4. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Bersifat ireversibel.

  5. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif.

  6. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan.

  (Yuswanto&Sinaradi, 2000) D.

   Sel Myeloma Multiple myeloma dikenal juga sebagai Myeloma atau sel plasma Myeloma,

  merupakan kanker sel plasma, bagian penting dari sistem imun yang menghasilkan immunoglobulin (antibodi) untuk melawan infeksi dan penyakit. Karakteristik

  

multiple myeloma ditandai dengan jumlah sel plasma yang abnormal dalam sumsum

  tulang belakang dan produksi yang berlebihan dari monoclonal immunoglobulin

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  (IgG, IgA, IgD, atau IgE) atau protein Bence-Jones. Hiperkalsemia, anemia, kerusakan ginjal, meningkatnya kerentanan terhadap infeksi bakteri dan rusaknya produksi immunoglobulin normal yang merupakan manifestasi umum dari multiple

  

myeloma . Ditandai dengan osteoporosis dalam tulang panggul, tulang punggung,

tulang rusuk dan tulang tengkorak (Anonim, 2006 b).

E. Sel Vero

  Sel vero diambil pertama kali dari ginjal African Green Monkey dewasa oleh Y. Yasamura dan Y. Kawakita dari Universitas Chiba, Jepang. Meskipun secara luas digunakan untuk produksi vaksin dan transinfection, sel vero juga sering digunakan untuk deteksi verotoxin, (Anonim, 2006a). Sel vero mempunyai morfologi fibroblastik dan telah digunakan secara ekstensif untuk propagasi virus dan deteksi mikoplasma. Sel vero umumnya digunakan untuk menyelidiki toksoplasma, trikomonas, tripanosom dan infeksi klamidia. Sel ini sensitif terhadap infeksi yang disebabkan virus dan parasit protozoa yang telah menyebar luas (Doyle, 2002).

F. Uji Sitotoksisitas

  Suatu obat atau senyawa agar dapat dinyatakan sebagai antikanker harus melalui beberapa tahap pengujian. Salah satu dari pengujian yang sering dilakukan adalah uji praklinik. Uji praklinik biasanya dilakukan terhadap hewan percobaan yang mempunyai sifat-sifat tertentu yang mirip dengan manusia. Penelitian dengan menggunakan hewan percobaan pada masa sekarang ini mulai dikurangi. Sekarang yang lebih sering digunakan adalah dengan kultur sel untuk mengidentifikasi agen kemoterapetik kanker yaitu tes invitro. Adapun pertimbangan digunakan kultur sel

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  ini adalah karena lebih ekonomis dibandingkan dengan tes invivo, adanya perbedaan fisiologis antara hewan percobaan dan manusia, dan adanya pertimbangan moral dalam menggunakan hewan untuk penelitian (Freshney, 2000).

  Uji MTT, didasarkan pada kemampuan enzim mitokondria dehidrogenase dari sel sehat untuk merusak cincin tetrazolium pada MTT dan membentuk suatu kristal formazan yang berwarna biru tua yang tidak dapat menembus membran sel, sehingga terakumulasi dalam sel sehat. Jumlah sel yang hidup berbanding lurus terhadap jumlah formazan yang dihasilkan. Warna kemudian dapat diukur menggunakan metode kolorimetri sederhana. Hasil dapat dibaca pada multiwell

  scanning spectrophotometer ( ELISA reader) (Anonim, 2006c).

  Uji sitotoksisitas pada umumnya menggunakan parameter nilai LC . Nilai

  50 LC 50 adalah besaran konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian 50% pada

  subyek uji. Suatu senyawa dikatakan memiliki daya antikanker bila memiliki nilai LC 50 lebih kecil dari 20µg/ml (Suffness and Pezzuto cit Candra, 2006).

G. Landasan Teori

  Berbagai macam penelitian tentang daun mimba telah banyak dilakukan untuk menanggulangi penyakit kanker. Dari penelitian-penelitian sebelumnya yang telah berhasil membuktikan adanya senyawa antikanker. Diketahui bahwa senyawa protein yang terkandung dalam tumbuhan dapat beraktivitas untuk menghambat pertumbuhan sel kanker, salah satunya adalah terhadap sel Myeloma. Sel Myeloma digunakan sebagai model untuk mengetahui daya sitotoksisitas.

  Hasil penelitian yang menggunakan fraksi protein dari beberapa tanaman telah diujikan daya sitotoksiknya terhadap sel Myeloma diantaranya fraksi protein

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  daun Mirabilis jalapa L (Aceka, 2003), fraksi protein daun cangkring (Handayani, 2000), fraksi total protein daun Azadirachta indica A.Juss (Rahmawati, 2004). Fraksi protein yang diendapkan dengan amonium sulfat 30% dan 60% berpotensi sebagai antikanker, dan pada fraksi protein 30% jenuh mempunyai efek sitotoksik yang paling tinggi terhadap sel Myeloma dan paling berpotensi sebagai antikanker (Hariyadi, 2006).

  Pernyataan tersebut mendasari dilakukannya penelitian menggunakan fraksi protein daun mimba yang yang lebih kecil, yaitu fraksi protein 10%, 20%, 30% dan 40% yang diperlakukan terhadap sel Myeloma akan memberikan daya sitotoksik dan berpotensi sebagai antikanker tanpa membunuh sel normal dengan melihat daya sitotoksik terhadap sel Vero.

  H. Hipotesis

  Fraksi protein dari daun mimba hasil pengendapan dengan ammonium sulfat 10%, 20%, 30% dan 40% berpotensi sebagai antikanker.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 10 , FP 20 , FP 30 , dan FP 40 terhadap kultur sel Myeloma termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. B. Variabel penelitian dan Definisi operasional

  1. Variabel bebas Kadar fraksi protein daun mimba.

  2. Variabel tergantung Persentase kematian sel Myeloma dan sel Vero.

  3. Variabel pengacau terkendali

  1) pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu

  4

  o C.

  2) medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640- serum (untuk sel Myeloma) dan M199 (untuk sel Vero).

  3) tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

  4. Variabel pengacau tak terkendali

  Kematian alami sel Myeloma dan sel Vero dan kandungan kimia tanaman mimba.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Definisi operasional

  

counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil CE-292), ELISA

reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop (Olympus IMT-2),

haemocytometer (Nebauer), kain monel, tissue, glove, masker.

  b. kultur sel Myeloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  a. daun mimba segar

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah

  2. Bahan

  a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi protein daun mimba terhadap sel Myeloma dan sel vero.

  b. Fraksi protein ialah fraksi protein daun mimba yang diperoleh dari hasil pengendapan dengan garam amonium sulfat pada konsentrasi 10%, 20%, 30% dan 40%, dinyatakan dalam µg/ml.

  

stirrer , tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge (PLC),

  Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic

  1. Alat

  atau menyebabkan kematian sejumlah 50% sel Myeloma atau 50% sel Vero dan dinyatakan dalam µg/ml.

  50 ialah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh

  c. LC

C. Alat dan Bahan

  inkubator (Nuaire), mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin, cell

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  c. kultur sel Vero yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  d. pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein daun mimba 1) larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 (Merck) 2) larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M

  NaCl (Merck) 3) amonium sulfat p.a. (Merck)

  e. Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas 1) media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes 2) media penumbuh: RPMI 1640, M199, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

  3) reagen Stopper : SDS (sodium dodeksil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck)

  4) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma)

  5) bahan untuk isolasi sel Vero : tripsin 0,5%

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

  Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den Brink, 1965).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

  2. Pengumpulan daun mimba

  Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan Juni 2006.

  3. Sterilisasi alat dan bahan

  Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121

  C.

  4 . Preparasi fraksi protein dari daun mimba

  Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin (dengan penambahan es di sekitarnya). Bahan diperas dan disaring dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker gelas dan diukur volumenya.