Teknik imunositokimia protein aquaporin3 pada fibroblas dan keratinosit

  Artikel Asli

EKSPRESI PROTEIN AQUAPORIN3 PADA FIBROBLAS DAN

KERATINOSIT KULIT MANUSIA YANG DIINDUKSIOLEH

EKSTRAK ETANOL CENTELLA ASIATICA DALAM

NANOPARTIKEL KITOSAN

  

Linda Yulianti *, Kusmarinah Bramono **, Etik Mardliyati ***, Hans Joachim Freisleben *

• *Program Pendidikan Doktor Ilmu Biomedik FK Universitas Indonesia

  ***Pusat Teknologi Farmasi dan Medis Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi

  **Departemen Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin FK Universitas Indonesia

  ABSTRAK Hidrasi dan elastisitas kulit menurun seiringprosespenuaan. Aquaporin3 (AQP3) adalahprotein tamayang terlibatpada hidrasi kulit danjumlahnya menurun seiring penuaan kulit, sehingga merupakan protein kunci pada pengembangan kosmetik antipenuaan kulit kulit. Ekspresi protein AQP3 tampakpada sitoplasma

  Centella selfibroblas dermis dan keratinosit epidermis kulit manusia, namun menurun seiring penuaan kulit. asiatica (pegagan) dan kitosan adalah produk alami yang telah digunakan sebagai bahan aktif kosmetik antipenuaan kulit, Tujuan penelitian ini mengevaluasi pengaruh ekstrak etanol Centella asiatica dalam nanopartikel kitosan (EECA + NPK) terhadap ekspresi AQP3 pada fibroblas dan keratinosit kulit manusia dibandingkan dengan asam retinoat (AR) sebagai baku emas.

  Selfibroblas dermis dan keratinosit epidermis kulit manusia diinkubasi selama 24 jam dengan beberapa konsentrasi EECA + NPK dan dibandingkan terhadap Asam Retinoat (AR). Ekspresi protein AQP3 secara imunositokimia dengan antibodi A.nti-Aquaporin3 (abl25219) serta analisis kuantitatif menggunakan program ImageJ.

  EECA + NPK meningkatkan ekspresi AQP3 pada selfibroblas dan keratinosit kulit pada selfibroblas optimal pada konsentrasi 12.5 mg/mL dan keratinosit pada konsentrasi 3.125 mg/mL setelah pajanan selama 24 jam.

  EECA + NPK terbukti meningkatkan ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas dan keratinosit sehingga dapat digunakan sebagai bahan aktif pada kosmetik pelembab. (MDV1 2016:42 /S: 7S -17S) Kata kunci: AquaporinS, fibroblas, keratinosit, Centella asiatica, nanopartikel kitosan ABSTRACT

  Skin hydration and elasticity decreased with aging process. Aquaporin-3 (AQP3) is a major protein implicated in skin hidration and decreased with skin aging skin, therefore A QP3 is a key protein as a target for drug development in skin aging treatment. AQP3 expression showed in cytoplasma of human dermal fibroblast and human epidermal keratinocyte AQP3 but decreased with aging process. Centella asiatica and chitosan are

natural product has been used for anti aging cosmetic formulation.

  In this study we evaluated the ability of Centella asiatica ethanolic extract encapsulated into chitosan nanoparticle (CAEE+CNP) in the expression ofAQP3 in human dermal fibroblast and Human epidermal keratinocyte.

  Human dermal fibroblast and human epidermal keratinocyte were incubated for 24 hours in several CAEE+CNP concentrations and compared to retinoic acid (RA). immunocytochemistry study ofAQPS expression were evaluated with Anti-Aquaporin3 antibody (ab!25219) and calculated quantitatively using ImageJ software.

  CAEE+CNP increases the expression ofAQP3 in human dermal fibroblast and human epidermal keratinocyte. The optimal doses achivedat 12.5 mg/mL for fibroblast and 3.125 mg/mL for keratinocyte after exposed for 24 hours.

  CAEE+CNP increased AQP3 in human dermal fibroblast and human epidermal keratinocyte, can be used as active ingridientfor cosmetic moisturizer. (MDVI 2016:42 /S: 7S -17S) Keywords: Aquaporin 3, Centella asiatica, chitosan nanoparticles, fibroblast, hydration, keratinocyte, proliferation

  Korespondensi: Jl. Letjen S. Parman No. 1 Jakarta 11440 Telp: 021-5670815 Email: lindajuliantiwijayadi@gmail.com

  '

  21 Kitosan adalah polisakarida yang terdiri atas unit asetat dan deasetilasi kitin berasal dari kulit krustasea termasuk udang.

  23

  biokompatibel dan biodegradable meningkatkan penetrasi dan sebagai senyawa aktif antipenuaan kulit.

  23 Sifat kitosan yang

  '

  22

  Sifatnya hypoallergenic dan antibakteri alami serta berguna sebagai agen penyembuhan luka.

  memiliki potensi aktivitas biologis yang tinggi sebagai antioksidan, penggunaan klinisnya terbatas karena stabilitas fisik yang kurang baik karena memiliki sifat sangat higroskopis. Bentuk padat ekstrak Centella asiatica segera mencair dalam beberapa menit bila terpapar suhuruang. Pengembangan nanopartikel untuk enkapsulasi ekstrak dapat melindungi dan menstabilkan dari pengaruh eksternal.

  24 Nanofibril

  20 Meskipun ekstrak Centella asiatica

  utama yang terkandung dalam Centella asiatica yaitu triterpens: asam asiatik, asam madekasik, asiatikosida dan madekasosida.

  19 Ada 4 bahan aktif

  18 Centella asiatica dapat digunakan sebagai bahan aktif kosmetik herbal antipenuaan.

  '

  16

• - 8

  kitin, bentuk murni kitosan memiliki struktur molekular yang menyerupai asam hialuronat. Hal ini menjadikan kitin sebagai senyawa yang dapat memperbaiki sawar kulit, meningkatkan kelembaban, dan senyawa anti aging yang efektif.

• 28
• 30

  14

  Nanocarrier (LNC) menunjukan peningkatan kemampuan

  in vitro Centella asiatica ekstrak etanol (CAEE) dalam

  Bahan alami (herbal) sangat menarik untuk diteliti karena memiliki sifat farmaseutikal yang menguntungkan sebagai bahan aktif obat atau kosmetik.Kombinasi dari nanopartikel kitosan dan ekstrak Centella asiatica sebagai bahan aktif seharusnya dapat meningkatkan efek hidrasi sebagai kosmetik pelembab kulit. AR dapat meningkatkan ekspresi protein AQP3 pada keratinosit. Namun belum ada penelitian tentang efek EECA+NPK terhadap peningkatan ekspresi AQP3 pada sel fibroblas dasn keratinosit. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi aktivitas

  32

  hidrasi kulit. Pengembangan baru dari sistem penghantar obat ini berupa nanopartikel kopolimer kitin-kitosan.

  Nanopartikel memiliki sifat fisik yang unik dan ideal untuk digunakan pada berbagai produk perawatan kulit di pasaran saat ini.si Tokoferil asetat (TA) yang dibungkus oleh Lipid

  25

  29

  nanoparticle berukuran 100-300 nm

  Umumnya obat atau kosmetik menggunakan teknologi penghantar berupa lipid, seperti liposom dan solid lipid

  27

  26 Sistem nanocarrier sebagai teknologi penghantar (delivery) kosmetik inovatif telah digunakan secara luas.

  '

• 33

  Tanaman tropis ini telah digunakan untuk berbagai tujuan pengobatan antara lain penyembuhan luka, pengobatan asma, luka, kusta, lupus eritematosus, psoriasis, penyakit pembuluh darah vena, untuk perbaikan ingatan, dan sebagai antidepresan, antibakteri, antijamur, dan agen antikanker.

  13 Centella asiatica dikenal sebagai pegagan di

  Malaysia, pennywort dan gotu kola di Amerika, dan pegagan di Indonesia.

  klinis kulit menua adalah penurunan kadar air dan fungsi sawar kulit termasuk xerosis kutis, kerapuhan kulit dan perlambatan penyembuhan luka

   Efek iritasi deterjen cair pencuci alat makan kajian berdasarkan MDVI

   Vol. 42 No. Suplemen Tahun 2015, 7S-17S PENDAHULUAN

  Kadar air stratum komeum (SK) memiliki pengaruh besar pada penampilan dan sifat fisik kulit. Faktor-faktor yang mengontrol kadar air SK, yaitu kelembaban eksternal, komposisi lipid, protein, dan konsentrasi osmolaritas penahan air serta faktor pelembab alamiyaitu asam amino bebas, ion, dan zat terlarut fungsional lainnya.

  1

  '

  2 Pada

  penuaan kulit dan beberapa penyakit kulit hidrasi SK berkurang, termasuk dermatitis atopik, eksim, kronik psoriasis, xerosis senilis, dan iktiosis herediter.

  3

  '

  4 Penuaan kulit adalah hasil proses yang kompleks antara

  gabungan penuaan kronologis karena faktor genetik (penuaan intrinsik) dan pengaruh faktor eksternal (penuaan ekstrinsik). Penuaan kulit menyebabkan berbagai modifikasi dalam sel dan jaringan pada dermal dan epidermal yang berperan dalam sifat fisik dan mekanik kulit.

  3

  "

  6 Gambaran

  6 Faktor penting lain yang berperan pada hidrasi kulit

  nanopartikel kitosan (EECA + NPK) pada berbagai konsentrasi dan dibandingkan dengan asam retinoat sebagai baku emas terhadap ekspresi protein AQP3 pada fibroblas dermis dan keratinosit epidermis kulit manusia.

  '

  meningkatkan ekspresi protein AQP3 pada keratinosit tetapi sering menimbulkan efek samping sehingga perlu dikembangkan inovasi kosmetik anti penuaan kulit yang efektif dan aman.

  12 AR dapat

  kosmetik anti penuaan kulit, tetapi memiliki efek samping yaitu iritasi kulit, kulit kering dan kemerahan

  11 Asam retinoat (AR) banyak digunakan dalam

  sel fibroblas belum jelas, tetapi diduga berperan terhadap migrasi sel pada proses penyembuhan luka. Aktivasi AQPs oleh obat topikal bermanfaat dalam penyembuhan luka dan pengobatan kulit menua dini, sehingga AQPs tampaknya menjadi protein kunci sebagai target untuk pengobatan di masa depan untuk mengatur hidrasi kulit terutama pada kulit kering

  10 Peran AQP3 pada

  7

  adalah adanya aquaglyceroporins

  keratinosit, AQPs mempengaruhi hidrasi kulit dengan mengatur transportasi air dan gliserol serta berperan pada proliferasi dan diferensiasi keratinosit

  9 Pada sel

  kecil yaitu gliserol dan ureai Aquaporin 3 (AQPs) adalah protein utama yang mempengaruhi hidrasi kulit dan ekspresinya menurun pada penuaan kulit.

  Aquaglyceroporins permeabel terhadap air serta zat terlarut

  Aquaporim (AQPs) adalah sekelompok kecil protein, hidrofobik, protein membran integral yang berfungsi terutama sebagai pori-pori air yang selektif, memfasilitasi transportasi air secara osmotik melintasi membran plasma sel. Setidaknya ada 13 AQPs mamalia (AQPo - AQPn), yang telah dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan permeabilitas mereka. AQPs 1, 2,4, 5, dan 8 berfungsi sebagai pembawa airselektif; AQPs 3, 7, 9, dan 10, disebut "aquaglyceroporins", berfungsi sebagai transporter air serta gliserol dan zat terlarut kecil lainnya.

  7

• 15

  

L Yulianti, dkk Ekspresiprotein aquaporin3 padafwroblas dan keratinosit kulit manusiayang aiinduksi oleh ekstrak etanol Centella asiatica

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

  Kultur sel

  dalam kondisi gelap. Untuk counterstain dan mounting, sel diinkubasi dengan hematoxylin 5-7 kali, cuci dengan H2O 3 menit, fiksasi dengan etanol 96% 5x, fiksasi dengan etanol absolut 5x, dan mounted dengan gliserin gel dan coverslip.

  Gambar 1. Transmisi mikrograf elektron (TEM) ekstrak etanol pegagan dalam nanopartikel kitosan (CAEE+NPK); pembesaran xlOO, 000; skalabar=50,0nm.

  besar partikel 94,3 ± 26,6 nm dan indeks polidispersitas 0,308.

  Nanotech Indonesia Puspitek Serpong. Hasil pengukuran

  EECA+ NPK yang digunakan tampak pada gambar dengan 50 nm(Gambar 1). EECA+NPK dibuat dengan metode gelasi ionik. Analisis ukuran partikel EECA+NPK dengan menggunakan Beckman Particle size analyzer CV

  HASIL Karakteristik EECA+NPK

  Pada penelitian ini untuk menilai kemaknaan dilakukan uji t tidak berpasangan antara 2 kelompok dan uji ANOVA one way pada analisis lebih dari 2 kelompok, bila data numerik terdistribusi normal. Dan bila uji ANOVA bermakna dilanjutkan dengan uji post hocTukey. Nilai kemaknaan ditentukan pada p < 0,05. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program Statiscal Package for the Social Science (SPSS) versi 20.

  Analisis statistic

  Selanjutnya ekspresi protein AQP3 dievaluasi pada sel fibroblas dan keratinosit menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x. Analisis kuantitatif dengan program ImageJ. Pemeriksaan imunositokimia ini dilakukan di laboratorium TEM Lembaga Eijkman Salemba Jakarta.

  (Diaminobenzidine) dan dibilas dengan PBS selama 3 menit

  Fibroblas dermis dan keratinosit epidermis kulit manusia diperoleh dari Fakultas Kedokteran Universitas Yarsi, Jakarta, dalam suspensi medium RPMI (Roswell Park

  EECA (simplisia berasal dari Tawangmangu), NPK dan EECA+NPK disiapkan oleh laboratorium Teknologi Farmasi dan Medika BPPT PUSPITEK Serpong. Pada penelitian ini digunakan EECA+NPK dengan 3 konsentrasi yaitu 3,125, 6,25 dan 12,5 mg/mL. Kitosan didapat dari Sigma (derajat deasetilisasi >'3D85%), asam asetat glasial (Merck), dan dosium tripolifosfat (Sigma). AR didapatkan dari perusahaan kimia BASF. AR dibuat untuk bahan uji dengan konsentrasi 0.25, 0.5, 1 mg/mL untuk uji imunositokimia Ekstrak etanol Pegagan yang dikemas ke dalam nanopartikel kitosan dengan metode gelasi ionotropik. Efek ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas dermis dan sel keratinosit epidermis kulit manusia dievaluasi secara in vitro setelah pemajanan dengan EECA + NPK dan AR selama 24 jam.

  PBS selama 3x5 menit. Untuk blocking dan inkubasi dalam 1% BSA (Bovine Serum Albumin) di PBST selama 30 menit, kemudian dilanjutkan dengan inkubasi dengan antibodi primer selama 24 jam pada suhu 4°C, dengan pengenceran 1:10 untuk sel fibroblas dan 1:25 untuk keratinosit.

  (Phosphate Buffered Saline Tweeri) kemudian dicuci dengan

  Selanjutnya difiksasi dengan methanol, acetone selama 15 menit, kemudian dicuci dengan PBS dingin selama 2x5 menit. Untuk permeabilisasi diinkubasi dalam PBS-T

  coverslip, dan dibilas di PBS (Phosphate Buffered Saline).

  Persiapan awal: coverslip dibungkus dengan polieteilen atau poli-L-lisin selama 1 jam, dibilas dengan H2O steril 3x5menit, keringkan dan sterilkan di bawah sinar ultraviolet selama 4 jam. Tumbuhkan sel pada kaca

  Teknik imunositokimia protein aquaporin3 pada fibroblas dan keratinosit

  perlakuan dengan bahan uji pada berbagai konsentrasi. 1). EECA + NPK(3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL dan 12,5 mg/mL); 2). AR (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, dan 1 mg/mL). Digunakan kultur fibroblas passase ke-7 dan kultur keratinosit passase ke-2 yang dibuat dari kultur sel primer kulit preputium anak usia 4-8 tahun.

  Memorial Institute) yang mengandunglO% Fetal Bovine Serum (FBS) dan 1% penisilin-streptomisin dan diberi

  Kemudian sel dituang dan dicuci dengan PBS selama 3x5 menit. Lalu diinkubasi lagi dengan antibodi sekunder selama 1 jam, kemudian dicuci kembali dengan PBS selama 3x5 menit. Terakhir diinkubasi lagi dalam DAB

   Efek iritasi deterjen cair pencuci alat makan kajian berdasarkan MDVI

   Vol. 42 No. Suplemen Tahun 2015, 7S-17S

Ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK

  Gambar 2. Sel fibroblas mengekspresikan AQP3 (warna coklat) setelah 24 jam dipajankan terhadap EECA+NPK pada konsentrasi (a) tanpa pajanan; (b) 3.125 mg/mL; (c) 6.25 mg/mL; dan (d) 12.5 mg/mL, divisualisasi dengan perbesaran 400x.

  

Hasil penelitian ini menunjukkan adanya peningkatan konsentrasi 3.125, 6.25, 12.5 mg/mL selama 24 jam, hasil

ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas dermis kulit optimal pada konsentrasi 12,5 mg/mL. manusia setelah dipajankan dengan EECA+NPK dengan

  

Ekspresi protein AQP3 pada sel flbroblas setelah 24 jam dipajankan dengan AR

  Gambar 3. Sel fibroblas yang mengekspresikan protein AQP3 (coklat) setelah 24 jam dipajankan oleh AR pada konsentrasi (a) tanpa pajanan; (b) 0.25 mg/mL; (c) 0.5 mg/mL; dan (d) 1 mg/mL, divisualisasi dengan perbesaran 400x.

  

L Yulianti, dkk Ekspresiprotein aquaporin3 padafwroblas dan keratinosit kulit manusiayang aiinduksi oleh ekstrak etanol Centella asiatica

Penelitian ini menunjukan peningkatan ekspresi AQP3 tertinggi ekspresi AQP3 pada konsentrasi AR 0.25

pada fibroblas terjadi setelah pemajanan dengan AR mg/mL. Hasil ekspresi AQP3 pada flbroblas makin

konsentrasi 0.25; 0.5; dan 1 mg/mL selama 24 jam, dan menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi AR.

  

Perbandingan analisis ekspresi AQP3 pada sel fibroblas setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK dan AR

menggunakan program ImageJ

  Gambar4. Perbandingan analisis ekspresi AQP3 pada sel fibroblas setelah 24 jam dipajankan oleh EECA+NPK dan AR menggunakan program ImageJ Keterangan :

• : post Hoc Tukey berbeda bermakna antara EECA+NPK 3,125mg/ml dengan AR 0,25 mg/ml (p<0,05)
• : post Hoc Tukey berbeda bermakna antara EECA+NPK 6,25mg/ml dengan AR 0,5 mg/ml (p<0,05)
• : post Hoc Tukey berbeda bermakna antara AR 0,25 mg/ml dengan kontrol (p<0,05)
• : post Hoc Tukey berbeda bermakna antara AR 0,5 mg/ml dengan kontrol (p<0,05)

  Data kuantitatif pada Gambar 4, menunjukan Penelitian kami juga memperlihatkan EECA+NPK dan AR memberikan ekspresi AQP3 yang peningkatkan ekspresi AQP3 pada fibroblas setelah lebih tinggi dari kontrol. Dari foto hasil imunositokimia dipajankan dengan AR baik konsentrasi 0.25,0.5, dan 1 protein AQP3 pada sel fibroblas dilakukan analisis mg/mL selama 24 jam, pada konsentrasi AR 0.25 mg/mL kuantitatif berdasarkan densitas warna menggunakan ekspresi AQP3 pada sel fibroblas paling kuat. ImageJ didapatkan bahwa setelah pajanan EECA+NPK dan AR selama 24 jam memberikan ekspresi AQP3 yang lebih tinggi dari kontrol negatif.

  Ekspresi protein AQP3 pada keratinosit setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK

  Gambar 5. Keratinosit yang mengekspresikan protein AQP3 (coklat) setelah 24 jam dipajankan oleh EECA+NPK pada konsentrasi (a) tanpa pajanan; (b) 3.125 mg/mL; (c) 6.25 mg/mL; dan (d) 12.5 mg/mL, Divisualisasi dengan perbesaran 400x.

   Efek iritasi deterjen cair pencuci alat makan kajian berdasarkan MDVI

   Vol. 42 No. Suplemen Tahun 2015, 7S-17S

Setelah 24 jam diinkubasi dengan EECA+NPK konsentrasi 12,5 mg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa

konsentrasi 3.125 mg/mL dan 6.25 mg/mL terjadi peningkatan ekspresi AQP3 pada keratinosit tidak linier

peningkatan ekspresi protein AQP3 dalam sitoplasma sel bergantung pada konsentrasi. keratinosit tetapi ekspresi AQP3 menurun pada pajanan

  Ekspresi protein AQP3 pada keratinosit setelah 24 jam dipajankan dengan AR

  Gambar 6. Keratinosit yang mengekspresikan protein AQP3 (coklat) setelah 24 jam dipajankan dengan AR ( asam retinoat) pada beberapa konsentrasi (a) tanpa pajanan; (b) 0.25 mg/mL; (c) 0.5 mg/mL; dan (d) 1 mg/mL. Divisualisasi dengan perbesaran 400x.

  

Pada penelitian ini tampak jelas ekspresi AQP3 pada protein AQP3 pada keratinosit berbanding lurus dengan

peningkatan konsentrasi seperti terlihat pada gambar 6. keratinosit meningkat setelah 24 jam dipajankan dengan AR konsentrasi 0.25, 0.5 dan 1 mg/mL. Intensitas ekspresi

  Perbandingan analisis ekspresi AQP3 pada keratinosit setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK dan AR menggunakan program ImageJ

  Gambar 7. Analisis rerata ekspresi AQP3 pada keratinosit setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK dan AR menggunakan program ImageJ Keterangan: *: post Hoc Tukey berbeda bermakna antara EECA+NPK 12,5 mg/mL dengan kontrol (p<0,05) **:post Hoc Tukey berbeda bermakna antara AR 0,5 mg/mL dengan kontrol (p<0,05) ***:post Hoc Tukey berbeda bermakna antara AR 1 mg/mL dengan kontrol (p<0,05)

  

L Yulianti, dkk Ekspresiprotein aquaporin3 padafwroblas dan keratinosit kulit manusiayang aiinduksi oleh ekstrak etanol Centella asiatica

34 Dalam penelitian ini kami menggunakan kitosan dari Sigma dengan derajat deasetilasi lebih dari 75%.

  memperlihatkan bahwa protein AQP3 dalam membran dan sitoplasma sel fibroblas kulit manusia terekspresi kuat pada kelompok usia <20 tahun dan 30-40 tahun tetapi menurun secara bermakna pada kelompok usia diatas 60 tahun. Penelitian ini menggunakan sel fibroblas dari kulit yang tidak terpajan sinar matahari. Hal ini membuktikan tingkat ekspresi AQP3 pada sel fibroblas berkaitan dengan usia dan mengindikasikan AQP3 memegang peranan penting pada proses penuaan intrinsik kulit manusia.

  Hasil ekspresi AQP3 pada fibroblas setelah dipajankan terhadap EECA+NPK 6,25 mg/mL, AR 0,5 mg/mL, dan kontrol didapatkan ada perbedaan yang bermakna dengan menggunakan uji ANOVA one way p=0,002. Kemudian dilanjutkan dengan post hoc Tukey didapatkan adanya perbedaan yang bermakna antara AR dengan kontrol p=0,002 dan tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara EECA+NPK dengan kontrol p=0,073 serta terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok EECA+NPK dengan AR p=0,006. Hasil ekspresi AQP3 pada fibroblas setelah dipajankan terhadap EECA+NPK 12,5

  Hasil ekspresi AQP3 pada fibroblas setelah dipajankan terhadap EECA+NPK 3,125 mg/niL, AR 0,25 mg/mL, dan kontrol didapatkan ada perbedaan yang bermakna dengan menggunakan uji ANOVA one way p=0,001. Kemudian dilanjutkan dengan post hoc Tukey didapatkan adanya perbedaan yang bermakna antara AR dengan kontrol p=0,002 dan tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara EECA+NPK dengan kontrol p=0,256 serta terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok EECA+NPK dengan ARp<0,001.

  Ekspresi AQP3 pada fibroblas meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi pajanan EECA+NPK, sebaliknya pada pajanan AR terjadi penurunan ekspresi AQP3 seiring dengan peningkatan konsentrasi. EECA+NPK dengan AR

  Perbandingan analisis ekspresi AQP3 pada sel fibroblas setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK dan AR menggunakan program ImageJ

  dalam penelitiannya menunjukkan "over expression " AQP3 pada sel HPMC (Human Peritoneal Mesothelial Cells) setelah diinkubasi dengan TGF menyebabkan migrasi sel HPMC yang lebih cepat dan mengakibatkan fibrosis, namun belum diketahui efeknya pada fibroblas. Penemuan Ryu dkk. Ini memberikan bukti baru bahwa dengan mengatur ekspresi AQP3 pada sel HPMC dapat mengontrol migrasi sel yang berperan pada proses penyembuhan luka dan mencegah fibrosis.

  37

  Peran AQP3 pada sel fibroblas kulit manusia belum jelas diduga meregulasi migrasi sel fibroblas. Ryu dkk

  36 Ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas setelah 24 jam dipajankan dengan AR

  '

  35

  pada sel fibroblas kulit manusia sehingga diharapkan dapat dipakai sebagai bahan aktif untuk mempercepat penyembuhan luka atas dasar protein AQP3 sebagai target pengobatan untuk meningkatkan penyembuhan luka yang menjadi lebih lambat akibat proses penuaan.

  9 EECA+NPK dapat meningkatkan ekspresi AQP3

  diketahui secara pasti, diduga AQP3 berperan untuk meregulasi migrasi sel fibroblas. Ekspresi AQP3 menurun pada sel fibroblas kulit lansia usia diatas 60 tahun, hal ini dapat menjelaskan mengapa proses penyembuhan luka menjadi lebih lambat pada usia lanjut. AQP3 diduga terlibat pada proses migrasi sel fibroblas dermis kulit manusia yang berperan selama proses penyembuhan luka dalam keadaan normal.

  9

  Ekspresi AQP3 pada keratinosit menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi pajanan CAEE+NPK, sebaliknya terjadi pada pajanan AR yang mengekspresikan AQP3 semakin tinggi seiring dengan peningkatan konsentrasi AR.

  24

  PEMBAHASAN Karakteristik EECA+NPK Leonida dkk.

  32

  meneliti penggunaan kitosan sebagai antimikroba, mempercepat penyembuhan luka, dan anti penuaan kulit. Dalam penelitiannya dilaporkanbahwa "nano-

  sizing" dapat mengubah sifat. Ketika zat yang dikenal diubah

  menjadi nanopartikel, menghasilkan sifat yang sama sekali berbeda dan dapat tak terduga. Hal ini berarti bahwa nanopartikel dapat menciptakan sifat zat baru yang berbeda dengan sifat sebelumnya dan menciptakan entitas kimia baru dari yang lama.

  Sebuah studi oleh Howling dkk.

  menunjukkan bahwa kitosan dengan tingkat deasitilasi yang relatif tinggi sangat merangsang proliferasi fibroblas sedangkan kitosan dengan rendahnya tingkat deasetilasi menunjukkan efek yang kurang optimal.

  membuktikan bahwa inkubasi dengan EGF dalam sel fibroblas dapat menginduksi ekspresi AQP3, yang berdampak pada percepatan penyembuhan luka dan bergantung pada konsentrasi. Penelitian Ji Li dkk

  Pada penelitian ini digunakan ekstrak etanol pegagan dalam nanopartikel kitosan dengan ukuran 96.8nm dan nanopartikel kitosan berukuran 58 nm sebagai pembawa yang juga berperan sebagai bahan aktif. Studi Okonogi dkk

  21

  menggunakan nanopartikel sebagai pembawa ekstrak pegagan mendapatkan hasil bahwa nanopartikel kitosan sebagai sistem pembawa yang menjanjikan untuk menstabilkan ekstrak Centella asiatica.

  Ekspresi Protein AQP3 pada sel fibroblas setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK

  EECA+NPK meningkatkan ekspresi AQP3 pada sel fibroblas bergantung pada konsentrasi. Penelitian Cao dkk

  11

9 Peran AQP3 pada sel fibroblas kulit manusia belum

  41

• 42 Penelitian Ji Li dkk.

  9

  membuktikan bahwa penurunan tingkat ekspresi AQP3 pada keratinosit epidermis manusia berkaitan dengan usia yang mengindikasikan bahwa AQP3 memegang peranan penting pada proses penuaan kulit terutama untuk meningkatkan hidrasi kulit.

  7

  '

  43 AQP3 juga penting pada

  penyembuhan luka, sebagai saluran air yang memfasilitasi migrasi keratinosit, dan sebagai saluran gliserol yang berperan meningkatkan proliferasi dan diferensiasi keratinosit.

  Saat ini mulai banyak kosmetik anti penuaan kulit yang diformulasikan dengan bahan aktif dan diklaim dapat meningkatkan ekspresi protein AQP3 pada keratinosit lapisan epidermis.

  44 Peningkatan ekspresi protein AQP3

  7

  sebagai protein target dalam perbaikan resistensi, kualitas permukaan kulit, dan integritas sawar kulit. Mekanisme fisiologis AQP3 mengatur hidrasi kulit pada lapisan epidermis yaitu lapisan basal, lapisan spinosum, lapisan granulosum sepanjang proses diferensiasi keratinosit berlangsung.

  '

  43 Hasil penelitian menunjukkan EECA+NPK dapat

  meningkatkan ekspresi protein AQP3 pada keratinosit setelah pajanan 24 jam optimal pada konsentrasi 3,125 mg/mL sekitar 1,5 kali dibandingkan dengan kontrol (tanpa pajanan). Hasil ini mengindikasikan bahwa EECA+NPK dapat digunakan sebagai bahan aktif kosmetik pelembab untuk meningkatkan hidrasi kulit dengan konsentrasi rendah.

  Ekspresi protein AQP3 pada keratinosit setelah 24 jam dipajankan dengan AR

  Pada penelitian kami tampak jelas ekspresi AQP3 pada sel keratinosit meningkat setelah paparan dengan asam retinoat konsentrasi 0.25, 0.5 dan 1 mg/mL. intensitas ekspresi protein AQP3 pada sel karatinosit berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi. Perhitungan pada penelitian ini dilakukan secara kuantitatif dengan menggunakan program ImageJ.

  Efek sinar ultraviolet menyebabkan ekspresi AQP3 menurun sehingga terjadi pengurangan permeabilitas air, penurunan migrasi, dan proliferasi keratinosit yang menghambat penyembuhan luka. Terapi ATRA dapat mengurangi efek negatif sinar ultraviolet. Temuan ini membuktikan, mendukung adanya peranan AQP3 pada dehidrasi kulit akibat pajanan sinar ultraviolet.

  45 ATRA dapat meningkatkan ekspresi AQP3 pada

  keratinosit sebagai antiphotoaging tetapi Upregulation AQP3 oleh ATRA juga diikuti peningkatan transpor air, dapat terjadi overexpression AQP3 oleh ATRA (yang bergantung pada konsentrasi dan waktu) sehingga akan meningkatkan transpor air dari dalam keratinosit yang berlebih, meningkatkan permeabilitas kulit dan meningkatkan Trans Epidermal Water Loss (TEWL), sehingga mengakibatkan efek samping kulit menjadi kering.

• - 39

  mengevaluasi efek Aquaxyl 3% terhadap ekspresi AQP3 pada keratinosit setelah pajanan 24 jam.

  AQP3 sebagai saluran air (water channel) berfungsi untuk transportasi air dan gliserol pada kulit serta mempunyai peranan penting pada hidrasi kulit.' •

  tentang induksi AQP3 oleh ekstrak Piptadenia colubrina dengan menggunakan kultur sel kulit manusia dengan konsentrasi 10 dan 20 mg/mL terayata didapatkan peningkatan bermakna pada ekspresi AQP3 mRNA yang dianalisis dengan realtime

   Efek iritasi deterjen cair pencuci alat makan kajian berdasarkan MDVI

   Vol. 42 No. Suplemen Tahun 2015, 7S-17S

  mg/rnL, AR 1 mg/mL dan kontrol didapatkan ada perbedaan yang bermakna dengan menggunakan uji ANOVA one way p=0,045. Kemudian dilanjutkan dengan post hoc Tukey didapatkan tidak adanya perbedaan yang bermakna antara AR dengan kontrol p=0,051 dan tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara EECA+NPK dengan kontrol p=0,069 serta tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok EECA+NPK dengan ARp=0,891.

  EECA+NPK dapat meningkatkan ekspresi AQP3 pada fibroblas namun tidak setinggi peningkatan oleh AR pada semua konsentrasi uji. Dengan hasil ini diharapkan tidak terjadi overexpression AQP3 yang dapat menyebabkan fibrosis.

  Peran AQP3 pada sel fibroblas kulit manusia belum jelas diduga meregulasi migrasi sel fibroblas. Ryu dkka? dalam penelitiannya menunjukkan "over expression " AQP3 pada sel HPMC (Human Peritoneal Mesothelial Cells) setelah diinkubasi dengan TGF menyebabkan migrasi sel HPMC yang lebih cepat dan mengakibatkan fibrosis, namun belum diketahui efeknya pada fibroblas. Penemuan Ryu dkk. Ini memberikan bukti baru bahwa dengan mengatur ekspresi AQP3 pada sel HPMC dapat mengontrol migrasi sel yang berperan pada proses penyembuhan luka dan mencegah fibrosis.

  Ekspresi protein AQP3 pada keratinosit setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK

  Penelitian oleh Pereda dkk

  38

  polymerase chain reaction (HT-PCR). AQP3 mulai

  Green coffee Arabica, serta penelitian Perez4o yang

  meningkat setelah 2 jam, mencapai puncak pada 6 jam, dan menurun setelah 24 jam.

  Penelitian lain juga oleh Pereda dkk

  39

  membuktikan ekstrak green coffee arabica I seed dapat meningkatkan ekspresi AQP3 pada lapisan epidermis normal kulit manusia. Setelah inkubasi selama 3-6 jam dengan konsentrasi optimal 25 mg/mL, hasil ekspresi mRNAAQP3 mencapai tingkat ekspresi relatif hingga 6.5 kali lipat lebih tinggi daripada kontrol negatif.

  Pada penelitian ini evaluasi peningkatan protein AQP3 dengan teknik imunositokimia dilakukan setelah 24 jam pajanan EECA+NPK karena diharapkan aplikasi topikal kombinasi tersebut dalam bentuk kosmetik pelembab cukup dilakukan 1 kali sehari tetapi efeknya dapat bertahan 24 jam.

  Hal ini sejalan dengan penelitian Pereda dkk..

  3&

  yang meneliti efek ekstrak Piptadenia colubrina dan ekstrak

  46 Penjelasan ini dapat menerangkan mengapa aplikasi

  

L Yulianti, dkk Ekspresiprotein aquaporin3 padafwroblas dan keratinosit kulit manusiayang aiinduksi oleh ekstrak etanol Centella asiatica

  Hasil ekspresi AQP3 pada NHEK pajanan EECA+NPK 6,25 mg/ml, AR 0,5 mg/ml, dan kontrol didapatkan ada perbedaan bermakna dengan uji ANOVA

  topikal retinol dan AR memberikan efek yang bermakna untuk pengobatan photoaging yaitu perbaikan pada kerutan, kekeringan kulit dan perlambatan penyembuhan lukai

  menggunakan ekstrak Green Coffee Arabica L Seed menunjukkan peningkatan ekspresi AQP3 pada lapisan epidermis normal kulit manusia. Untuk mengevaluasi ekspresi relatif AQP3 digunakan real time reverse transcription PCR, keratinosit diinkubasi selama 3-6 jam dengan konsentrasi optimal 25 mg/mL. hasil ekspresi mRNA AQP3 mencapai tingkat ekspresi relatif hingga 6.5 kali lipat lebih tinggi daripada kontrol negatif. Kelemahan penelitian ini menganalisis ekspresi protein AQP3 pada keratinosit setelah dipajankan dengan EECA+NPK hanya pada satu waktu (setelah 24 jam) sehingga tidak diketahui dengan pasti kapan ekspresi AQP3 mulai meningkat dan menurun pada keratinosit

47 Perbandingan analisis ekspresi AQP3 pada keratinosit

  KESIMPULAN

  Penelitian ini membuktikan bahwa EECA + NPK dapat meningkatkan ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas dermis dan keratinosit epidermis kulit manusia setelah pajanan selama 24 jam. Konsentrasi optimal peningkatan ekspresi protein AQP3 pada sel fibroblas adalah 12,5 mg/mL dan 3,125 mg/mL pada keratinosit. EECA+NPK berpotensi menjadi bahan aktif kosmetika pelembab herbal inovatif yang diharapkan dapat meningkatkan hidrasi kulit.

  antara kelompok AR dengan kontrol p=0,039, dan tidak terdapat perbedaan bermakna antara EECA+NPK dengan kontrol p=0,716 serta tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok EECA+NPK dengan AR p=0,192.

  one way p=0,041. Kemudian dilanjutkan dengan post hocTukey dan didapatkan ada perbedaan yang bermakna

  Analisis kuantitatif berdasarkan densitas warna menggunakan ImageJ didapatkan bahwa pajanan EECA+NPK pada konsentrasi 3.125 dan 6.25 mg/mL menunjukkan peningkatan ekspresi protein AQP3 yang tertinggi, tetapi menurun pada pajanan 12.5 mg/mL sedangkan hasil ekspresi protein AQP3 setelah pajanan dengan AR pada ketiga konsentrasi uji menunjukkan peningkatan ekspresi AQP3 yang jauh lebih tinggi dibandingkan kontrol seperti terlihat pada gambar 7. Hasil uji statistik ekspresi AQP3 pada NHEK pajanan EECA+NPK konsentrasi 3,125 mg/ml, AR 0,25 mg/ml, dan kontrol didapatkan tidak ada perbedaan bermakna dengan uji ANOVA one way p=0,102.

  38 Penelitian lain oleh Pereda dkk

  setelah 24 jam dipajankan dengan EECA+NPK dan AR menggunakan program ImageJ

  '

  12

  ' tetapi sering menimbulkan efek samping iritasi kulit yaitu kemerahan dan kekeringan pada kulit.

  47

  '

  2

  39

DAFTAR PUSTAKA 1.

  ekstrak Piptadenia colubrina dengan konsentrasi 10 dan 20 mg/mL pada kultur sel kulit manusia ternyata didapatkan peningkatan bermakna pada ekspresi AQP3 mRNA yang dianalisi dengan real time PCR. AQP3 mulai meningkat setelah 2 jam, mencapai puncak pada 6 jam, dan menurun setelah 24 jam. Pemeriksaan imunohistokimia menunjukkan peningkatan ekspresi AQP3 dalam membran sel keratinosit setelah dipajankan dengan esktrak Piptadenia colubrina konsentrasi 10 mg/mL selama 24 jam dibandingkan kelompok kontrol tanpa pajanan.

  Berdasarkan hasil penelitian ini, EECA+NPK dapat meningkatkan ekspresi AQP3 tetapi tidak lebih tinggi daripada AR., meskipun demikian temuan ini memberi harapan bahwa in vivo EECA+NPK tidak menyebabkan kekeringan kulit seperti efek samping AR akibat

  kelompok AR dengan kontrol p=0,008, dan terdapat perbedaan bermakna antara EECA+NPK dengan AR p=0,006 serta tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok EECA+NPK dengan kontrol p=0,844.

  one way p=0,005. Kemudian dilanjutkan dengan post hoc Tukey dan didapatkan ada perbedaan yang bermakna antara

  Verdier-Sevrain S, Bonte F. Skin hydration: A review on its molecular mechanisms. J Cosmet Dermatol. 2007;6(2):75-82.

  2. Boury-Jamot M, Sougrat R, Tailhardat M, Le Varlet B, Bonte F, Dumas M, dkk. Expression and function of aquaporins in human skin: Is aquaporin-3 just a glycerol transporter? Biochim.BiophysActa. 2006;1758(8):1034-42.

  3. Zouboulis CC, Makrantonaki E. Clinical aspects and molecular diagnostics of skin aging. Clin Dermatol.

  2011;29(1): 3-14.

  4. Rhein L. Aging skin-General considerations. Dalam: Rhein L, Fluhr JW, penyunting. Aging Skin: Current and Future Theurapeutic Strategies: Allured Books; 2010:1-8 5. Rabe JH, Mamelak AJ, McElgunn PJ, Morison WL, SauderDN. Photoaging: mechanisms and repair.

  JAmAcad Dermatol. 2006;55(1):1-19.

  6. Yaar M. Clinical and histological features of instrinsic versus extrinsic skin aging. In: Gilchrest BA, Krutman J, penyunting. Skin Aging. Berlin-Heidelberg: Springer- Verlog; 2006.h. 9-21.

  7. Boury-Jamot M, Daraspe J, Bonte F, Perrier E, Schnebert S, Dumas M, dkk. Skin aquaporins: Function

  Hasil ekspresi AQP3 pada NHEK pajanan EECA+NPK 12,5 mg/mL, AR 1 mg/mL, dan kontrol didapatkan ada perbedaan bermakna dengan uji ANOVA

  overexpression AQP3 Penelitian tentang induksi AQP3 oleh

   Efek iritasi deterjen cair pencuci alat makan kajian berdasarkan MDVI

  30. Schneider M, Stracke F, Hansen S, Schaefer UF.

  25. Morganti P, Fabrizi G, Palombo P, Ruocco E, Morganti

  G, A C. Chitin-nanofibrils: A new active cosmetic carrier. J Appl Cosmet. 2008;26:113-28..

  26. Cai ZX, Mo XM, Zhang KH, Fan LP, Yin AL, He CL, dkk Fabrication of chitosan or silk fibro in composite nanofibers for wound-cheesing applications. Int J Mol Sci. 2010;ll(9):3529-39.

  27. Nasir A. Nanotechnology and dermatology: Part I--potential of nanotechnology. Clin Dermatol.

  2010;28(4):458-66.

  28. Draelos ZD. New delivery systems for novel compounds. In: Sadirck NS LM, Berso DS, Draelos ZD, penyunting. Cosmetical Science. London: Informa UK; 2008. h. 32-9.

  29. Moddaresi M, Tamburic S, Williams S, Jones SA, Zhao Y, Brown MB. Effects of lipid nanocarriers on the performance of topical vehicles in vivo. J Cosmet Dermatol. 2009;8(2):136-43.

  Nanoparticles and their interactions with the dermal barrier. Dermatoendocrinol. 2009;1(4):197-206.

  Zhang J, Xia W, Liu P, Cheng Q, Tahirou T, Gu W, dkk. Chitosan modification and pharmaceutical/biomedical applications. Mar Drugs. 2010;8(7):1962-87.

  31. Prow TW, Grice JE, Lin LL, Faye R, Butler M, Becker W, dkk. Nanoparticles and microparticles for skin drug delivery. Adv Drug. 2011;63(6):470-91

  32. Leonida M. Nano-sizing chitosan for wound healing.

  Cosmetic and Toilettes. 2012;127(7):532.

  33. Morganti P, Morganti G, Muzzarelli RAA, Muzzarelli C. Chitin nanofibrils: A natural compound for innovative cosmeceuticals. Dalam: Anthony J, O'Lenick JR, penyunting. Natural and Organics In Cosmetics: Trends and Technology. Allured Books.

  2010:383-93.

  34. Draelos ZD, Reinvigorating cosmetic dermatology with the nanoparticle revolution. J Cosmet Dermatol.

  2011;10:251-2 35. Hara-Chikuma M, Verkman AS. Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing. J Mol Med. 2008;86(2):221-31.

  36. Dumas M, Sadick NS, Noblesse E, Juan M, Lachmann- Weber N, Boury-Jamot M, dkk. Hydrating skin by stimulating biosynthesis of aquaporins. J Drugs Dermatol. 2007; 6(6 Suppl):s20-4.

  24. Howling GI, Dettmar PW, Goddard PA, Hampson FC, Dornish M, Wood EJ. The effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin fibroblasts and keratinocytes in vitro. Biomaterials. 2001;22(22):2959- 66.

  22. Francesko A, Tzanov T. Chitin, chitosan and derivatives for wound healing and tissue engineering. Adv Biochem. Eng Biotechnol. 2011; 125:1-27 23.

   Vol. 42 No. Suplemen Tahun 2015, 7S-17S

  13. Bellemere G, Von Stetten O, Oddos T. Retinoic acid increases aquaporin 3 expression in normal human skin. J Invest Dermatol. 2008;128(3):542-8..

  in hydration, wound healing, and skin epidermis homeostasis. Handbook of Experimental Pharmacology. 2009(190):205-17.

  8. Sougrat R, Morand M, Gondran C, Barre P, Gobin R, Bonte F, dkk. Functional expression of AQP3 in human skin epidermis and reconstructed epidermis. J Invest Dermatol. 2002;118(4):678-85..

  9. Li J, Tang H, Hu X, Chen M, Xie H. Aquaporin-3 gene and protein expression in sun-protected human skin decreases with skin ageing. Australas J Dermatol. 2010;51(2):106-12.

  10. Garcia N, Gondran C, Menon G, Mur L, Oberto

  G, Guerif Y, dkk. Impact of AQP3 inducer treatment on cultured human keratinocytes, ex vivo human skin and volunteers. Int.J.Cosmet.Sci. 2011;33(5):432-42.

  11. Cao C, Sun Y, Healey S, Bi Z, Hu G, Wan S, dkk.

  EGFR-mediated expression of aquaporin-3 is involved in human skin fibroblast migration. Biochem J. 2006;400(2):225-34.

  12. Rawlings AV. Retinoids and retinoic acid treatment of skin aging. In: Rhein L, Fluhr JW, penyunting. Aging Skin: Current and Future Therapeutic Strategies. Illnois USA: Allured Books; 2010.h.219-34.

  14. Hamid AA, Shah ZM, Muse R, Mohamed S.

  21. Okonogi JS, Y. Chen. Nanoencapsulation of Centella asiatica bioactive extract. XVIth International Conference on Bioencapsulation; Dublin, Ireland 2008.

  Characterisation of antioxidative activities of various extracts of Centella asiatica (L) Urban. Food Chem. 2002;77(4):465-9.

  15. Chanchal D, Swarnlata S. Novel approaches in herbal cosmetics. J.Cosmet.Dermatol. 2008;7(2):89-95.

  16. Zainol NA, Voo SC, Sarmidi MR, Aziz RA. Profiling of centella asiatica (L.) urban extract. Malaysian J Anal Sci. 2008;12(2):322-7.

  17. Gohil KJ, Patel JA, Gajjar AK. Pharmacological Review on Centella asiatica: A Potential Herbal Cure-all. Indian J Pharm Sci. 2010;72(5):546-56.

  18. Pittella F, Dutra RC, Junior DD, Lopes MT, Barbosa NR. Antioxidant and cytotoxic activities of Centella asiatica (L) Urb. Int JMol Sci. 2009;10(9):3713-21.

  19. Bylka W, Znajdek-Awizen P, Studzinska-Sroka E, Danczak-Pazdrowska A, Brzezinska M. Centella asiatica in dermatology: An overview. Phytotherapy Research : PTR. 2014;28(8): 1117-24.

  20. Hashim P, Sidek H, Helan MH, Sabery A, Palanisamy UD, Ilham M. Triterpene composition and bioactivities of Centella asiatica. Molecules (Basel, Switzerland).

  2011;16(2): 1310-22.

  37. Ryu HM, Oh EJ, Park SH, Kim CD, Choi JY, Cho JH, dkk. Aquaporin 3 expression is up-regulated by TGF- betal in rat peritoneal mesothelial cells and plays a role in wound healing. Am J Pathol. 2012;181(6):2047-57.