IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction
SKRIPSI
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction
Disusun oleh :
HAYYU MAHARANI
061211131064
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI ( Bossondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction ( PCR )
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan Pada
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga oleh
HAYYU MAHARANI
061211131064 Menyetujui
Komisi Pembimbing,
(Dr. Mufasirin, drh., M.Si.) .S.)
Pembimbing Utama Pembimbing Serta
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang berjudul :
IDENTIFIKASI Trypanosoma evansi PADA SAPI BALI (Bos sondaicus) BERDASARKAN MORFOMETRI DAN Polymerase Chain Reaction
Tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surabaya, Februari 2016 Hayyu Maharani
NIM. 061211131064 Telah diuji pada Seminar Hasil Penelitian Tanggal : 22 Januari 2016 KOMISI PENILAI SEMINAR HASIL PENELITIAN Ketua : Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si Sekretaris : M. Yunus, drh., M. Kes., Ph.D Anggota : Dr. Jola Rahmahani, drh., M.Kes Pembimbing I : Dr. Mufasirin, drh., M.Si Pembimbing II : Retno Bijanti, drh., M.S
Telah diuji pada Tanggal: 09 Februari 2016
KOMISI PENGUJI SKRIPSI Ketua : Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si Anggota : M. Yunus, drh., M. Kes., Ph.D
Dr. Jola Rahmahani, drh., M.Kes Dr. Mufasirin, drh., M.Si Retno Bijanti, drh., M.S
Surabaya, 11 Februari 2016 Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga Dekan, Prof. Dr. Pudji Srianto,drh., M.Kes.
NIP. 195601051986011001
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur Kehadirat Allah SWT atas karunia yang telah dilimpahkan sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan skipsi dengan judul“Identifikasi Trypanosoma evansipada Sapi Bali (Bos
sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction”.Pada
kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada: Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Prof. Dr. Pudji Srianto, drh., M.Kes.dan staf pimpinan serta Prof. Hj. Romziah Sidik, PhD., drh. atas kesempatan mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.
Dr. Mufasirin, drh., M.Si. selaku dosen pembimbing pertama yang bersedia memberikan bimbingan, sarandan nasehat yang berguna selama penelitian serta dalam penyusunan naskah skripsi ini.
Retno Bijanti, drh., M.S.selaku pembimbing serta sekaligus sebagai dosen pembimbing penelitian yang tiada henti membimbing penulis dengan ikhlas dalam pelaksanaan penelitian dari awal hingga akhir dan memberi saya dorongan untuk segera menyelesaikan penulisan skripsi.
Dr. Poedji Hastutiek, drh., M.Si. selaku ketua penguji, Muchammad Yunus, drh., M.Kes., Ph.D. selaku sekretaris penguji, dan Dr. Jola Rahmahani, drh, M.Kes.selaku anggota, atas saran yang membangun dalam penyusunan skripsi.
Dr. I Komang Wiarsa Sardjana, drh., DEA.selaku dosen wali, atas segala nasehat, kritik, saran dan bimbingan yang diberikan selama mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
Ketua Departemen Parasitologi Veteriner dan staf Laboratorium Biologi Molekuler Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga yang telah memberikan ijin dan bantuan pada penelitian ini.
Seluruh staf pengajar Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga atas wawasan keilmuan selama mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran
Terima kasih kepada drh. Dilasdita Kartika Pradana selaku staf di Balai Besar Veteriner Bali yang telah berkenan memberikan banyak bantuan selama penelitian ini berlangsung.
Ayahanda Slamet Adi Wibowo dan Ibunda Siti Solekah serta kakak Taju Mahadhikara yang telah memberikan dukungan, semangat, terutama doa yang sangat memotivasi penulis dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi. Radiaprima Kartika Wijaya, terima kasih atas bantuan, dukungan, semangat dan doanya.
Terima kasih kepada teman seperjuangan yang telah banyak membantu dan mendukung penelitian ini Lusiana Fitriyanti, Amira Nadia dan Anggun Rahmawati, serta teman-teman yang namanya tidak mungkin disebutkan satu persatu yang telah membantu terselesaikanya skripsi ini.
Semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satupersatu yang telah mendukung baik secara langsung maupun tidak langsung demi terselesaikannyapenelitian ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaatbagi pembaca dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Surabaya, 22 Januari 2016 Penulis
DAFTAR ISI Halaman
HALAMAN JUDUL ......................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... ii HALAMAN IDENTITAS .............................................................................. iii ABSTRACT .................................................................................................... vi UCAPAN TERIMAKASIH ........................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ........................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xiii SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG ...................................................... xiv
BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................1
1.1 Latar Belakang Penelitian ...............................................................1
1.2 Rumusan Masalah ...........................................................................5
1.3 Landasan Teori ................................................................................5
1.4 Tujuan Penelitian .............................................................................7
1.5 Manfaat Penelitian ...........................................................................7
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................8
2.1 Surra ................................................................................................8
2.1.1 Penyebab ...............................................................................8
2.1.2 Morfologi Trypanosoma evansi ............................................8
2.1.3 Hewan yang rentan ..............................................................10
2.1.4 Penularan .............................................................................10
2.1.5 Gejala klinis.........................................................................11
2.1.6 Patogenesis ..........................................................................12
2.1.7 Diagnosis .............................................................................13
2.2 Sapi Bali ........................................................................................14
2.4 Polymerase Chain Reaction ..........................................................17
3.4.3 Isolasi DNA .........................................................................22
4.2 Hasil Pemeriksaan Menggunakan Metode PCR ...........................27
4.1 Hasil Pemeriksaan Ulas Darah dan Morfometri ...........................26
BAB 4 HASIL PENELITIAN ........................................................................26
3.6 Bagan Kerangka Operasional ........................................................25
3.5 Analisis Data .................................................................................24
3.4.5 Analisis hasil PCR ...............................................................24
3.4.4 Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) .........................23
3.4.3.2 Ekstraksi DNA.............................................................22
3.4.3.1 Persiapan reagen isolasi ...............................................22
3.4.2 Pemeriksaan morfometri .....................................................21
BAB 3 METODE PENELITIAN....................................................................19
3.4.1 Pembuatan ulas darah ..........................................................21
3.4 Metode Penelitian .........................................................................21
3.3.1.4 Alat penelitian ..................................................................20
3.3.1.3 Bahan isolasi DNA ...........................................................20
3.3.1.2 Bahan ulas darah ..............................................................19
3.3.1.1 Sampel ..............................................................................19
3.3 Materi Penelitian ...........................................................................19
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian .......................................................19
3.1 Jenis Penelitian ..............................................................................19
BAB 5 PEMBAHASAN .................................................................................29 BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN ..........................................................34 RINGKASAN .................................................................................................35 DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................38 LAMPIRAN ....................................................................................................44
DAFTAR TABEL Tabel Halaman
3.3 Susunan dan Posisi Nucleotida untuk Primer ITS1 CF/BR ...............20
4.1 Hasil Pemeriksaan Morfometri Trypanosoma sp. ..............................27
DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman
2.1 Morfologi Trypanosoma evansi ............................................................9
2.2 Sapi Bali betina ...................................................................................14
2.3 Sapi Bali jantan ...................................................................................15
3.1 Bagan kerangka operasional penelitian ...............................................25
4.1 Hasil pemeriksaan ulas darah Sapi Bali ..............................................26
4.2 Hasil elektroforesis PCR pada darah Sapi Bali ...................................28
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Gen Trypanosoma evansi ................................................................... 44
2. Letak penempelan primer foward ITS1 CF/BR pada sequence gen
Trypanosoma evansi
...........................................................................46
3. Letak penempelan primer reverse ITS1 CF/BR pada sequence gen Trypanosoma evansi .....................................................................46
SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG
% = Persen ºC = Derajat Celcius µl = microliter bp = base pairs dATP = Deoxyadenine Triphospate dCTP = Deoxycitosine Triphospate ddH2O =
Double Distilled Water
dGTP = Deoxyguanine Triphospate DNA = Deoxyribonucleic Acid dNTP = Deoxynucleatide Triphospate dTTP = Deoxytimine Triphospate EDTA = Ethylen Diamine Tetra Acid ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr = Ethidium Bromida GPI = Glikosilphosphatidilinositol mA = mili Ampere mg = miligram mm = milimeter ng = nanogram nm = nanometer nt = nukleotida PCR = Polymerase Chain Reaction pH = power of Hydrogen Primer F = Primer Forward Primer R = Primer Reverse Rpm = Revolutions per minute rpm = Rotation per minute TBE = Tris Borat EDTA UV = Ultra Violet
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Penyakit surra merupakan salah satu penyakit strategis yang menyerang hewan ternak yang disebabkan oleh Trypanosoma evansi (Luckins et al., 1992; Dargantes et al., 2005). Trypanosomaevansi banyak ditemukan dalam darahdanataujaringan hewan vertebrata(FAO, 1994).Parasitini ditularkan secara mekanis oleh vektor lalat penghisap darah seperti Tabanus sp dan Stomoxys sp(Payne et al., 1991, Luckins et al., 1992).
Trypanosoma evansi
mempunyai induk semang yang beragam dari hewan liar sampai hewan domestik termasuk ternak.Hewan domestik yang rentan adalah kuda, sapi, kerbau, kambing, domba, babi, anjing dan kucing, sedangkan hewan liar yang rentan diantaranya adalah badak (Vellayan et al., 2004), rusa (Adrian et
al.,
2010), wallaby (Reid et al., 2001) dan bisa berpotensi sebagai sumber infeksi untuk hewan domestik (Dargantes et al., 2005). Khusus pada sapi dan kerbau di Indonesia, infeksi T. evansi dapat menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat besar dikarenakan ternak tersebut merupakan sumber produksi daging dan susu (Manuel, 1998).
Trypanosoma evansi
pada beberapa ternak mempunyai ukuran yang bermacam-macam tergantung dari induk semang dan daerah geografisnya. Secara umum T. evansi mempunyai panjang berkisar antara 15-34 µm dengan rata–rata 24 µm. Bentuk tubuh silinder tetapi kadang–kadang terjadi bentuk stumpy/gemuk.
brucei
yang memiliki panjang berkisar antara 12-26 µm, T. gambiense dengan panjang berkisar antara 15-30 µm dan T. cruzi dengan panjang berkisar antara 15- 20 µm (Levine, 1985).
Kasus penyakit surra pertama kali dilaporkan di Indonesia pada tahun 1897 pada populasi kuda di Pulau Jawa.Semenjak itu, secara sporadik menyebar ke seluruh wilayah Indonesia (Partoutomo, 1996). Menurut Sukanto (1994),paling tidak ada 11 provinsi di Indonesia (Aceh, Sumatra Utara, Lampung, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Kalimantan Selatan, Sulawesi Utara, Nusa Tenggara Barat, Bali dan Nusa Tenggara Timur) merupakan daerah endemik penyakit surra.
Penyakit surra pada sapi dan kerbau umumnya berlangsung lebih lambat, bersifat kronis dan bahkan tanpa menunjukkan gejala klinis atau subklinis.Respons imun terhadap infeksi T. evansi pada kerbau dan sapi relatif lebih baik dari pada kuda sehingga ternak ruminansia besar tersebut lebih tahan terhadap serangan penyakit surra. Penyakit dapat bersifat akut dan mewabah pada ternak ruminansia ketika hewan mengalami stres, karena dipekerjakan atau difungsikan terlampau berat, akibat kekurangan pakan atau air dan faktor kondisi lingkungan kritis dan cuaca yang ekstrim (Soulsby,1982).
Di antara berbagai bangsa sapi yang terdapat di Indonesia, Sapi Bali merupakan salah satu jenis sapi yang terdapat dalam jumlah yang cukup banyak dan tersebar hampir ke seluruh Indonesia. Menurut Guntoro (2002), pada tahun 1990 jumlah populasi Sapi Bali di seluruh Indonesia mencapai sekitar 3 juta ekor yang tersebar di berbagai provinsi, mulai dari Aceh hingga Irian Jaya. Dari populasi yaitu Sulawesi Selatan sekitar 1.200.000 ekor, Nusa Tenggara Timur 600.000 ekor, Bali 450.000 ekordan Nusa Tenggara Barat 350.000 ekor.Sementara pada tahun 2002 seluruh populasi Sapi Bali di Indonesia diperkirakan mencapai hampir 3,5 juta ekor (Guntoro 2002).
Sapi Bali (Bos sondaicus) merupakan jenis sapi yang unggul.Sapi Bali didomestikasi pertama kali di Pulau Bali.Perkembangan Sapi Bali sangat cepat dibandingkan dengan breed sapi potong lain di Indonesia, sehingga apabila Sapi Bali terkena suatu penyakit seperti penyakit surra akan mudah menular (Handiwirawan dan Subandriyo 2004). Penyakit surra pada Sapi Bali pernah terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun 1971.Sebanyak 516 ekor Sapi Bali terserang penyakit surra (Mastra, 2011).Pada tahun 2009, kasus penyakit surra pada Sapi Bali juga terjadi di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten Paser, Provinsi Kalimantan Timur.Dari 19 sampel yang diuji di laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru terdapat 8 sampel yang positif penyakit surra (BPPV Regional V Banjarbaru, 2009).
Diagnosispenyakit surra di Indonesia umumnya masih berdasarkan laporan kasus diagnosa klinis, pemeriksaan laboratoris secara mikroskopis terhadap sampel preparat ulas darah dan atau teknik sentrifugasi mikrohematokrit. Akurasi data diagnosis klinis dan sensitivitas metoda uji laboratoris tersebut relatif belum optimal terutama pada manifestasi penyakit sub klinis sehingga cenderung tidak mencerminkan kejadian penyakit yang sesungguhnya (Mastra, 2011). Pada faseakut, tanda klinisyang biasa terlihat dilapanganadalah ini biasa terjadi pada kuda (Luckins, 1998; Thumbi, 2008).Sebagian penyakit berlangsungkronis yang biasa terjadi pada sapi dan kerbau dan hasil pemeriksaan ulas darah jumlahparasitdalam darah sedikit sekali bahkan tidak terdeteksi. Tingkatparasitemia yang rendah akan menyebabkan diagnosis parasitologi
Trypanosomafalse evansi
terhadap negatif. DeteksiT. tidak berhasilketikajumlahparasitterlalu rendah, seperti pada infeksikronis(Nantulya, 1994; Masakeetal., 2002; Desquesnes, 2002).Perlu ada alternatif teknik diagnosis yang lebih sensitif terhadap infeksi Trypanosoma pada sapi yaitu penanda molekuler dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
Pengembangan dan penerapan teknik PCR telah banyak digunakan untuk diagnosis infeksi Trypanosomapada hewan.Untuk mengoptimalkandiagnosis dengan PCR perlu mempertimbangkan beberapa faktor yang mempengaruhi sensitivitas PCR, seperti kuantitas dan kualitas DNA yang ada di dalam sampel (González et al., 2006).Pemeriksaan morfometri dan teknik PCR penting untuk memperkuat diagnosis penyakit surra secara parasitologis
T.evansi
karenaketerbatasandiagnosis yang ada dan disarankan untuk menggunakan kombinasidaridua atau lebihteknik untukmeningkatkan akurasidiagnosis(Monzonet al., 1990).
1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas, maka dapat dirumuskan masalah yaitu : Bagaimana identifikasi dan morfologi Trypanosoma
evansi
yang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan
Polymerase Chain Reaction
?
1.3. Landasan Teori
Pada tahun 1968-1969 wabah surra pada Sapi Bali terjadi di beberapa daerah di Indonesia, termasuk terjadi di Flores, Provinsi Nusa Tenggara Timur pada tahun 1971 terserang sebanyak 516 ekor Sapi Bali. Sementara dalam tahun 1974-1976 terjadi peningkatan kasus penyakit Surra di Provinsi Nusa Tenggara Barat (Sukanto et al., 1994). Prevalensi Trypanosomiasis pada Sapi Bali di Kabupaten/Kota Bima dan Sumbawa Besarrata-rata sebesar 15,3%. Hasil ini mengindikasikan bahwa kejadian infeksi secara alami oleh parasit darah patogen T. evansi pada Sapi Bali di Kabupaten/Kota Bima dan Sumbawa Besar tersebar luas dan cendrung bersifat endemis (Mastra, 2011).Menurut data pengujian dan diagnosa laboratorium BPPV Regional V Banjarbaru, pada tahun 2009 terjadi kasus penyakit surra di Kecamatan Batu Engau, Kabupaten Paser Provinsi Kalimantan Timur pada Sapi Bali.Dari 19 sampel yang diuji terdapat 8 sampel positif penyakit surra (BPPV Regional V Banjarbaru, 2009).
Periode antara inokulasi pada hewan sehat dan waktu Trypanosoma dapat dideteksi dalam plasma darah dengan observasi langsung disebut masa/periode menjadi dua kategori yaitu : kategori akut apabila jumlah parasit dalam darah sangat tinggi dan terlihat gejala klinis. Dikategorikan kronis apabila jumlah parasit dalam darah sedikit dan tidak tampak gejala klinis.Trypanosomiasis adalah penyakit yang serius di banyak negara, seperti Afrika, Asia dan Amerika Latin (Duvallet et al., 1999)
Trypanosoma evansi
memiliki morfologi yang mirip dengan Trypanosoma lain seperti T. equiperdum, T. brucei, T. gambiense dan T. rhodesiense.
Permukaan tubuhT.evansi diselubungi oleh lapisan protein tunggal yaitu glikoprotein yang dapat berubah-ubah bentuk (variable surface glycoprotein).
Kemampuan glikoprotein yangdapat berubah bentuk, maka T. evansi dapat memperdaya sistem kekebalan tubuh induk semang. Konsekuensinya akan terjadi variasi antigenik (antigenic variation) tubuh akan selalu berusaha membentuk antibodi yang berbeda-beda sesuai denganprotein permukaan yang ditampilkan oleh T. evansi (Davilaet al., 2003).
Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengidentifikasi Trypanosoma, baik dengan cara yang sederhana seperti pemeriksaan ulas darah dengan pewarnaan, sampai dengan pemeriksaan dengan metode Polymerase Chain
Reaction
(PCR). Metode PCR dapat mendeteksi asam nukleat parasit.Polymerase
Chain Reaction
merupakan metode yang sangat sensitif yang dapat mendeteksi satu Trypanosoma/ml darah (Davila etal.,2003) atau bahkan satu pikogram dari DNA Trypanosoma yang ada pada DNA inang (Clausen etal.,1998).
Polymerase Chain Reaction
adalah suatu metode memperbanyak fragmen DNA.Polymerase Chain Reaction juga dapat digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA tertentu dalam sampel.Proses PCR melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang masing–masing siklus terdiri atas tiga tahapan.Polymerase Chain Reaction memanfaatkan enzim DNA polymerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Siklus PCR terdiri dari tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan polimerasi (Gumilar et al., 2008).
1.4. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi
Trypanosoma evansi
yang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction.
1.5. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini dapat memberikan informasi tentang identifikasi dan morfologi Trypanosoma evansiyang terdapat pada Sapi Bali (Bos sondaicus) berdasarkan morfometri dan Polymerase Chain Reaction, sehingga dapat menambah pengetahuan dan sebagai referensi untuk penelitian selanjutnya.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Penyakit Surra
2.1.1. Penyebab
Penyakit surra adalah nama penyakit yang diberikan pada hewan yang terserang protozoa darah Trypanosoma evansi. Taksonomi Trypanosoma menurut Levine (1985) adalah :
Kingdom : Animal Filum : Sarcomastigophora Sub Filum : Mastigophora Kelas : Zoomastighoporasida Ordo : Kinetoplastorida Sub Ordo : Trypanosomarina Family : Trypanosomatidae Genus : Trypanosoma Spesies : Trypanosoma evansi
2.1.2. Mofologi Trypanosoma evansi Trypanosoma evansi
berbentuk seperti daun, aktif membelah dengan
binary fission
.Di bagian tengah tubuh terdapat inti yang mengandung kariosoma (trofonukleus) yangbesar dan terletak hampir sentral (Ausvetplan, 2006).Gambar morfologi T. evansi dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1 Morfologi Trypanosoma evansi Sumber : Levine (1985).Trypanosoma evansi
mempunyai karakteristik ramping, ukuran kecil, dibandingkan dengan Trypanosoma theileri, tetapi lebih besar dibandingkan dengan T. congolense, mempunyai flagela bebas dan bergerak aktif (Desquesnes
et al.,
2002).Pada Gambar 2.1 terlihat bahwa flagela timbul pada ujung posterior dari bagian parabasal dan membentang sampai bagian anterior.Flagela di luar ujung anterior tubuh sebagai flagela bebas berbentuk seperti cambuk.Flagela di sepanjang tubuh membentuk membran bergelombang yang disebut undulating
membran
.Trypanosoma evansi mempunyai panjang 15-34 µm dengan rata – rata 24 µm. Tubuh berbentuk silinder, tetapi kadangberbentuk stumpy/gemuk (Levine, 1985).
2.1.3. Hewan yang rentan
Hampir semua hewan berdarah panas rentan terhadap penyakit surra, kecuali bangsa burung.Kuda paling tinggi kerentanannya diikuti unta, anjing, sapi dan kerbau.Hewan percobaan seperti tikus, marmut dan kelinci juga termasuk hewan yang rentan. Pada sapi dan kerbau, penyakit ini bersifat kronis, tetapi dalam kondisi tertentu seperti kurang makan dan kerja terlalu keras, keganasan penyakit akan meningkat dengan mortalitas sampai 80 % (Levine, 1985).
Trypanosoma evansi
mempunyai inang yang beragam dari hewan liar sampai hewan domestik. Diantara hewan domestik yang rentan adalah kuda, sapi, kerbau, kambing, domba, babi, anjing dan kucing, sedangkan hewan liar yang rentan diantaranya adalah badak (Vellayan et al., 2004), rusa (Adrianet
al.
, 2010), wallaby (Reid et al., 2001), dan bisa berpotensi sebagai sumber infeksi untuk hewan domestik (Dargantes et al., 2005). Hewan coba seperti tikus dan mencit juga sangat peka terhadap infeksi T. evansi (OIE, 2009).
2.1.4. Penularan
Penyakit surra di Indonesia ditularkan oleh lalat penghisap darah Tabanus sp, Haematopota sp, Chrysop sp, Stomoxys spdan Haematobiasp. (Jones et al., 1996). Insekta merupakan vektor mekanik, karena tidak terjadi perkembangan siklus di dalam vektor dan Trypanosoma tertinggal di dalam probosis (Levine, 1985). Penularan infeksi Trypanosoma evansi sangat cepat pada beberapa hewan karena sifat lalat, khususnya Tabanus sp yang menghisap darah terputus–putus yangpaling menonjol populasinya sebagai penyebar infeksi Trypanosoma evansi di Indonesia adalah Tabanus rubidus dan Tabanus megalops (Sasmita dkk., 2013).
Sebaran penyakit yang luas sangat dipengaruhi oleh topografi daerah dan manajemen atau cara pemeliharaan ternak terutama yang dipelihara secara tradisional dengan cara menggembalakan ternak secara bersama-sama di areal padang pengembalaan. Batas tanah pertanian tidak jelas, ladang terbuka yang hanya dibatasi oleh semak, sungai dan hutan masih banyak dijumpai didaerah ini sebagai tempat berkumpul hewan ternak untuk merumput dan mencariair minum.
Kondisi lingkungan seperti ini juga sangat digemari oleh lalat pengisap darah seperti Tabanus sp.,Stomoxyssp. Lalat Tabanus sp., merupakan salah satu vektor penularan secara mekanik Trypanosomiasis yang sangat potensial pada hewan ternak (Soulsby, 1982).
2.1.5. Gejala klinis
Gejala klinis yang khas penyakit surra adalah adanya oedema atau pembengkakan pada daerah ventral atau bagian bawah tubuh seperti leher, legok lapar dan kaki.Gejala klinis lain adalah terjadi perdarahan di bawah kulit, hidung, mata dan anus. Gejala lain adalah anemia, demam selang seling (intermittent
fever
) dan pada akhirnya terjadi kematian.Gejala klinis rambut rontok dapat terjadi karena kondisi tubuh hewan yang menurun dan nafsu makan berkurang (Ismudiono dkk., 2006). Gejala klinis khas yang lain apabila parasit menuju cairan
Bentuk akut penyakit dapat berlangsung sampai tiga bulan dan ditandai dengan demam tidak teratur, penurunan berat badan yang progresif, keratokonjungtivitis berulang dan plak urtikaria pada leher.Tanda klinis pada kasus kronis kurang terlihat jelas.Pada hewan yang terinfeksi T. evansi, produksiakan turun, hewan tampak lesu,rambut kasar, anemia dan demam berulang (Hoare, 1972).
2.1.6. Patogenesis
Patogenesis penyaki surra bermula dari kelenjar saliva vektor lalat dan ditularkan pada inang melalui gigitan (Wiser, 1999).Infeksi ditularkan dengan penetrasi T. evansi ke dalam jaringan subkutan atau submukosa (Losos, 1986). Parasit tersebut kemudian memasuki sistem peredaran darah, berkembang dan akan bertambah secara logaritmik di dalam darah dalam waktu satu sampai tiga hari setelah parasit ditemukan di dalam aliran darah (Noble and Noble., 1982; Jefrey et al., 1983). Kerusakan endotel pembuluh darah menyebabkan oedema dan perdarahan (Ressang, 1984).
Trypanosoma evansi
menyebabkan reaksi inflamasi pada jaringan darah dengan diikuti multifikasi parasit (Losos, 1986).Trypanosoma evansi bertambah dalam darah secara berkala dan hal ini disertai demam pada hewan.Serangan demam yang berulang disebabkan oleh invasi masal T. evansi ke dalam darah atau perkembangbiakan yang cepat dalam darah (Ressang, 1984).
Trypanosoma evansi
mengeluarkan toksin yang dikenal dengan nama
(Levine, 1985). Trypanotoksin dapat merusak membran eritrosit yang dimulai dengan ikatan antara kompleks antigen–antibodi atau komplemen, proses tersebut
et al
menyebabkan anemia hemolitik (Morrison ., 1981).Gangguan imunopatologik yang paling penting pada trypanosomiasis adalah imunosupresi yang ditandai anemia. Ikatan kompleks antigen – antibodi atau komplemen yang beredar dalam darah pada permukaan eritrosit, bertanggung jawab terhadap destruksi eritrosit dan proses ini menyebabkan terjadi hemolisis (Noble and Noble., 1982).
Anemia hemolitik menyebabkan peningkatan destruksi eritrosit dengan cara fagositosis pada limpa, hati, sumsum tulang dan di sirkulasi darah (Morrison
et al.,
1981). Peningkatan destruksi eritrosit ditandai dengan adanya splenomegali (Losos, 1986).
2.1.7. Diagnosis
Diagnosis penyakit surra berdasarkan gejala klinis yang muncul dan
dilakukan uji parasit, uji serologis dan uji molekuler untuk diagnosis konfirmatif
di laboratorium.Uji parasit diantaranya dilakukan dengan pemeriksaan
haematologi (mikroskopik), Microhematocrite Centrifugation Technique (MHCT)
dan Mouse Inoculation Test (MIT). Uji serologi dapat dilakukan dengan metode
Card Agglutination Test For Trypanosomes(CATT) dan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA), sedangkan uji molekuler menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Solihat, 2002).
2.2. Sapi Bali
Sapi Bali merupakan sapi potong asli Indonesia dan merupakan hasil domestikasi dari Banteng (Bos bibos) (Hardjosubroto, 1994), dan merupakan sapi asli Pulau Bali (Sutan, 1988).Sapi Bali menjadi primadona sapi potong di Indonesia karena mempunyai kemampuan reproduksi tinggi, serta dapat digunakan sebagai ternak kerja di sawah dan ladang (Moran, 1990; Putu et al., 1998), persentase karkas tinggi, daging tanpa lemak (Pane, 1990), daya adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan dan persentase kelahiran dapat mencapai 80 persen (Tanari, 2001).Beberapa kekurangan Sapi Bali yaitu pertumbuhan lambat, peka terhadap penyakit jembrana, penyakit Malignant Catarrhal Fever (MCF) dan penyakit surra (Hardjosubroto, 1994).Gambar Sapi Bali dapat dilihat pada Gambar 2.2 dan 2.3.
Gambar 2.2 Sapi Bali Betina Sumber :Wibisono (2009).Gambar 2.3 Sapi Bali Jantan Sumber :Wibisono (2009).Menurut Hardjosubroto (1994), Sapi Bali mempunyai klasifikasi taksonomi sebagai berikut : Phylum : Chordata Subphylum : Vertebrata Class : Mamalia Sub class : Theria Infra class : Eutheria Ordo : Artiodactyla Sub ordo : Ruminantia Infra ordo : Pecora Famili : Bovidae Genus : Bos (cattle) Sub-Genus : Bovine Group : Taurinae
Sapi Bali (Bos sondaicus) berasal dari domestikasi Banteng dan dapat beradaptasi dengan baik pada lingkungan setempat, dan sekarang sudah menyebar di luar wilayah Indonesia (tropis dan sub tropis) (McCool, 1992; Sivarajasingham, 1992; Talib et al., 1998).Sapi Bali juga dapat ditemukan di kebun binatang dan Taman Safari di luar negeri, secara liar dan terpelihara juga dapat dilihat pada hutan-hutan tropis dan negara Asia Tenggara dan Australia Utara (Talib et al., 1998).
Sapi Bali mempunyai ciri khusus antara lain, warna bulu merah bata, tetapi yang jantan dewasa berubah menjadi hitam. Satu karakter lain yakni perubahan warna sapi jantan kebirian dari warna hitam kembali pada warna semula yakni coklat muda keemasan yang diduga karena hormon testosteron sebagai hasil produk testes. Karakteristik lain yang harus dipenuhi dari ternak Sapi Bali murni yaitu warna putih pada bagian belakang paha, pinggiran bibir atas, dan pada paha kaki bawah mulai tarsus dan carpus sampai batas pinggir atas kuku, bulu pada ujung ekor hitam, bulu pada bagian dalam telinga putih dan terdapat garis hitam yang jelas pada bagian atas punggung. Bentuk tanduk pada jantan yang paling ideal disebut bentuk tanduk silak congklok, yaitu jalannya pertumbuhan tanduk dimulai dari dasar sedikit keluar lalu membengkok ke atas, kemudian pada ujung membengkok sedikit keluar.Pada sapibetina bentuk tanduk yang ideal yang disebut manggul gangsa yaitu pertumbuhan tanduk satu garis dengan dahi arah ke belakang sedikit melengkung ke bawah dan pada ujung sedikit mengarah ke bawah dan ke dalam.Tanduk ini berwarna hitam (Hardjosubroto, 1994).
2.3. Morfometri
Morfometri adalah suatu metode yang digunakan untuk menganalisis organisme secara kuantitatif yang mencakup ukuran dan bentuk.Morfometri digunakan sebagai alat untuk identifikasi parasit sejak zaman dahulu.Morfometri dapat digunakan untuk mengukur dan mendeteksi perubahan bentuk.Tujuan utama dari morfometri adalah untuk statistik uji hipotesis tentang faktor yang mempengaruhi bentuk.Ukuran dan bentukdariparasitdapat membuatkesalahan tentangidentifikasi spesies parasit karena pada beberapa spesies parasit ditemukan memiliki ukuran dan bentuk yang hampir sama,oleh karena itupengukuran morfometridapat membantu untuk mengidentifikasiparasit (Javidet al., 2013).
2.4. Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction
adalah metode amplifikasi suatu sekuen DNA tertentu.Polymerase Chain Reaction merupakan cara yang sensitif, selektif dan sangat cepat untuk memperbanyak sekuen DNA yang diinginkan (Murray et al., 2006). Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandagakan, (2) oligonukleotida (primer), yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sinstesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua, yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’ – fosfat dan oligonukleotida dengan deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), yang terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP dan (4) enzim DNA polimerase yaitu enzim yang berfungsi sebagai katalis dalam reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga berperan penting adalah buffer PCR (Yuwono, 2006).
Reaksi pelipatgandaan fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA tamplate (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (95ºC) selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55ºC sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Proses
annealing
bisa dilakukan selama 1-2 menit. Setelah dilakukan annealing, oligonukleotida (primer) menempel pada DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72ºC selama 1,5 menit. Pada suhu ini, DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk, dengan ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi, selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95ºC. Rantai DNA yang baru tersebut, selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerase selanjutnya (Yuwono, 2006).
BAB 3 MATERI DAN METODE
3.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratoris yang hasilnya disajikan secara deskriptif.
3.2. Tempat dan Waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Departemen Parasitologi Veteriner dan Laboratorium Biologi Molekuler Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya. Waktu pelaksanaan penelitian pada bulan Agustus 2015 – September 2015.
3.3. Materi penelitian
3.3.1. Bahan penelitian
3.3.1.1. Sampel
Sebanyak dua sampel diperoleh dari darah Sapi Baliyang diduga terinfeksi
Trypanosoma evansi
berasal dari Kabupaten Jembrana yang didapatkan dari Balai Besar Veteriner Bali. Sampel darah sebanyak 3 ml diambil melalui vena jugularis, menggunakan 5 ml tabung venoject yang berisi larutan Ethylen Diamine
Tetra Acid (EDTA).
3.3.1.2. Bahanulas darah
Bahan untuk pemeriksaan ulas darah adalah darah, larutan pewarna
3.3.1.3. Bahanisolasi DNA
TM
Bahan untuk isolasi DNA adalah gSYNC DNA Extraction Kit (Geneaid), yang meliputi (larutan GSTBuffer, GSB Buffer, W1 Buffer, Wash
Buffer,
Proteinase K, Elution Buffer), Ethanol Absolut dan ddH
2 O.Bahan untuk
PCR adalah 2x KAPA Taq Extra Hotstart Ready Mix PCR Kit (KAPA Biosystems).Sepasang primer ITS1 CF/BR dan distilled water. Bahan untuk elektroforesis gel adalah agarosa, Tris Borat EDTA(TBE), Ethidium Bromida (EtBr), Marker DNA dan loading dye.Susunan untuk primerITS1 CF/BR dapat dilihat pada Tabel 3.3, dan posisi primer pada genom Trypanosoma evansi untuk
primer forward
pada nomor 2117-2097 dan primer reverse pada nomor 2597- 2578 dapat dilihat pada Lampiran 1.
Tabel 3.3. Susunan untuk Primer ITS1 CF/BRPanjang
Primer
Sekuens Posisi Pita
Forward
5’-CCGGAAGTTCACCGATATTG-3’ 2117- 2097 480 bp
Reverse
5’-TGCTGCGTTCTTCAACGAA- 3’ 2597-2578 Sumber : Njiruet al.(2005)
3.3.2 Alat penelitian
Alat penelitian yang digunakan adalah glove disposable, masker, Erlemeyer 1000 ml, disposablespuit 1 cc, disposable spuit 3 cc, sentrifus, tabung
Eppendorf
, mikro pipet, jarum sonde, aluminium foil, gabus, gelas obyek, gelas penutup, mikroskop, tissue, spidol marker dan frezer. Alat untuk isolasi DNA dan PCR yang digunakan dalam penelitian yaitu mesin PCR (Mastercycler Personal), Microcentrifuge (Hermle Z 400 K), water
bath
(Gemmyco Water Bath YCW-010), vortex, mikropipet, tip, tabung
Eppendorf
, microtube, timbangan digital, alat elektrophoresis, lampu UV, botol
®
reagen, cool box, optilab , mikroskop dan laptop
3.4.Metode Penelitian
3.4.1. Pembuatan ulas darah Darah diteteskan pada object glass,dibuat ulasan darah dan dikeringkan.
Kemudian difiksasi dengan methanol absolut selama 3 menit dan dikeringkan.Proses selanjutnya adalah preparat diwarnai dengan Giemsa 10% selama 45 menit. Setelah itu, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, diperiksa dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan bantuan minyak emersi.
3.4.2. Pemeriksaan morfometri
Pemeriksaan morfometri dilakukan dengan cara hasil ulas darah yang positif terdapat T. evansi diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x
®
dan difoto dengan menggunakan OptiLab . Kemudian hasil foto Trypanosoma tersebut diukur yang meliputi panjang dan lebar tubuh, panjang dan lebar inti, panjang dan lebar kinetoplas, panjang undulating membran dan jarak inti ke kinetoplas. Morfologi yang terlihat sesuai dengan deskripsi Soulsby (1982) untuk
3.4.3.Isolasi DNA
3.4.3.1. Persiapan reagen isolasi DNA
Larutan Wash buffer ditambahkan ethanol absolut sebanyak 100 ml dan kemudian dicampur. Proteinase K dilarutkan dengan pelarut dengan cara
o
ditambahkan ddH
2 O sebanyak 1,10 ml dan disimpan dalam suhu 4 C (Geneaid, 2014).
3.4.3.2. Ekstraksi DNA menggunakan prosedur menurut Geneaid (2014)
Sampel darah ditambahkan PBS sampai volume akhir 200 µl dan dicampur, kemudian dipindahkan pada 1,5 ml microsentrifus tube. 20 µl proteinase K ditambahkan pada larutan dan divortex, kemudian diinkubasi pada
o suhu 60 C selama 5 menit.Selama inkubasi tube dibalik setiap 2 menit.
Larutan yang sudah diberi PBS dan proteinase K kemudian ditambahkan
o
200 µl GSB bufferdandivortex selama 5 detik. Larutan diinkubasi pada suhu 60 C selama 5 menit untuk memastikan lisat hancur.Selama inkubasi, tube dibolak balik setiap 2 menit.
Larutan ditambahkan 200 µl alkohol absolut kemudian divortex selama 10 detik.GD column diletakkan pada tabung koleksi ukuran 2 ml, kemudian semua campuran pada GD columndipindahkan dan disentrifugasi pada 14-16.000 x g selama 1 menit. Selama dilakukan sentrifugasi, jika campuran tidak mengalir ke
GD columnmembrane