Isolasi DNA dengan metode DIXIT dan PCI
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
ISOLASI DNA METODE DIXIT DAN PCI (Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol)
Kelompok 7 :
1. Sri Wahyu Purnami
4411412015
2. Silviatun Nihayah
4411412042
3. Intan Latifa Amalia
4411412068
4. Fatchun Naim
4411412051
Tanggal Praktikum
Jumat, 10Oktober 2014
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
BAB VI DAN VII
ISOLASI DNA METODE DIXIT (1998) DAN PCI
(Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol)
I.
Tujuan
Untuk melakukan ekstraksi DNA dari berbagai sumber dari jaringan tumbuhan dan
hewan dengan metode dixit (1998) dan PCI.
II.
Landasan Teori
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999)
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa
diisolasi. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi
esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa
polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah yang berbeda,
dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan
menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air
rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan
semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Zubaidah,2004
dalam Jamilah,2005)
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian
DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa
protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.
Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan
atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat
dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur
adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi
DNA.
Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan
lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut
dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga
tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut
meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat
seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa
jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benarbenar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk
menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka
mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.
Plasmid
merupakan
DNA
yang
tidakterlaluesensialbagifungsikehidupanbakteri,
tetapipentingdalampengaturansiklushidupdanperumbuhandalamlokasihidupnya.
Kebanyakan
Plasmid
plasmid
adalahsirkulardantersusundaribeberaparibupasanganbasa.
mempunyaititikori
(origin
sehinggamampumereplikasidiritanpapengaturandari
Replikasidimulaidarititikorihinggasemua
plasmid
of
replication)
DNA
kromosom.
tereplikasi
(Pierce,
2005:203dalamSaputra, 2013).
Isolasi
DNA
merupakanlangkah
yang
Prinsipnyaadadua,
tepatuntukmempelajari
DNA.
yaitusentrifugasidanpresipitasi.
Sentrifugasimerupakanteknikuntukmemisahkancampuranberdasarkanberatmolekulko
mponennya.
Molekul
yang
mempunyaiberatmolekulbesarakanberada
di
bagianbawahtabungdanmolekulringanakanberadapadabagianatastabung.
Hasilsentrifugasiakanmenunjukkanduamacamfraksi
yaitusupernatanpadabagianatasdanpeletpadabagianbawah
115dalamSaputra, 2013)
yang
(Campbell
terpisah,
dkk,
2002:
Langkahawalsetiappercobaan di bidangbiologimolekuleradalahmemperoleh
DNA
yang
dapatberasaldariberbeagaijaringanatauselmakhlukhidup.
Prinsipdasarisolasi / ekstrasi DNA adalahpenghancurandindingdanmembrane sel,
pemisahan DNA dari debris seldanpurifikasi DNA. Dalammelakukanmetodeekstrasi
DNA
yang
digunakansangatbegantungpadasumber
apakahdariselataujaringan,
hewan,
tumbuhan,
DNA-nya,
ataumikroorganisme.
(Mustikaningtyas, 2014)
Metode yang digunakanuntukmengisolasi DNA dariberbagaijenistanaman,
organ
tanaman,
maupunjaringannyadapatdilakukandenganberbagaicara.
Namunpadaintinyaterdapattigafaktorutama
yang
sangatpentinguntukdalammelakukanpurifikasidanekstraksi DNA secaramaksimal.
Pertamaadalahcaradalammenghomogenkanjaringantanamankhususnyaadalahdinding
selnya.
Keduaadalahkomposisidarilarutan
buffer
yang
ditambahkandalampenggerusanjaringantanamandan
yang
ketigaadalahpenghilanganenzimpenghambat-polisakarida.
Inkubasisampeldalam water bath bersuhu 60 derajat C selama 60 menit. Hal
inidilakukanuntukoptimalisasikerja
buffer
ekstrak.
Selanjutnyadilakukansentrifugasisampeldengankecepatan 12000 rpm selama 10
menithalinidilakukanuntukmemisahkan
debris
dankomponensel
lain
yang
menjadipengotordengan DNA.
Supernatan
yang
telahdiperolehselanjutnyadiambildanditambahkandenganlarutanPhenol:Chloroform:I
solamylAlkohol
(PCI)atau
dixit.
Hal
inidilakukanuntukmengekstraksi
DNA
darikontaminan. Fenolmerupakanpelarutorganik yang dapatmelarutkan protein, lipid
danmolekul lain sepergipolisakaridasehinggadiharapkanakandidapatkansupernatan
yang
berisi
DNA
bebaskontaminan.
Setelahpencampuran,
homogenattersebutdivorteksuntukoptimalisasihomogenasi.
Selanjutnyadilakukansentrifugasihomogenatdengan
tersebutdengankecepatan
13000
rpm
didapatkanadalahsupernatandanpelet
Kemudiandiambilsupernatanpadalapisan
selama
yang
5
menitdalam.
PCI
Hasil
yang
beradapadatigalapisanlapisanatas.
paling
atasdanditambahkanlarutanChloroform:IsoamylAlkoholuntukpresipitasilanjutan.
Kemudiankembalidilakukanvorteksdansentrifugasi.
Hasil yang didapatkanakanterbentukkembalisupernatandanpeletpadaeppendorf,
kemudiandilakukanpengambilansupernatan.
Supernatanditambahkandenganamoniumnitratdanetanolabsolutuntukpresipitasilanjut
andanmenghilangkankontaminan.
filamen
Seharusnyahasildapatdiketahuiterbentukfilamen-
DNA
dalamlarutanjernihtersebut.
Kemudiandilakukaninkubasiselamasatumalamuntukoptimalisasipresipitasi.
Fungsialat-alatisolasi
yang
DNA.
Sentrifuseberfungsimemisahkanantarabagian
padatdancair
(supernatant
Mikropipetberfungsiuntukmengambillarutan
supernatant
Ependorfberfungsiuntukwadahsampel
akan
yang
berfungsiuntukmemanaskan
Mortirberfungsiuntukmenghaluskansampel
di
dandebsis).
danzatkimia
ekstraksi
DNA
yang
lain.
Water
bath
sampel.
kan
di
ekstraksi.
Timbanganberfungsiuntukmenimbangjumlahsampel yang dibutuhkan. Thermometer
berfungsiuntukmengukursuhu.
Petridishberfungsiuntukmembersihkansampel..Erlemenyerberfungsiuntukmencairkan
agarose. Incubator berfungsiuntukinkubasisampel. Pinsetberfungsiuntukmengambil
material kecil. Sarungtanganberfungsiuntukmelindungitangandarizatberbahaya.
III.
PERMASALAHAN
a. Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan jaringan tumbuhan dan hewan yang
dapat digunakan sebagai sumber DNA.
b. Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan metod ekstraksi DNA.
c. Bagaimana mahasiswa mampu melakukan ekstraksi DNA dari jaringan hewan
dan tumbuhan.
IV.
ALAT DAN BAHAN
V.
METODE
A.
Langkah kerja Isolasi DNA Metode Dixit (1998) Dimodifikasi
1. Menggerus0.5 g sampel dengan menambahkan 3ml buffer ekstraksi
2. Menambahkan 600µl 20% SDS, mengkocok dengan kuat
3. Menginkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit, mengkocok perlahan
tiap 5 menit
4. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5
menit
5. Memiindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan 1 ml
Potassium asetat
6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit
7. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2
menit
8. Memindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan isopropanol
sebanyak 2/3 volume supernatant.
9. Mengkocok perlahan membentuk angka 8.
10. Menyentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 10,000 rpm selama 2menit.
11. Membuang supernatant, kemudian mencuci pellet menggunakan 1 ml
ethanol 70%
12. Menyentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 10,000 rpm selama 1 menit
13. Mengeringkan pellet padasuhu37 °C selama 60 menit.
14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpanpadasuhu -20 °C
B. Langkah Kerja Isolasi DNA Metode PCI
1. Menggerus 30 mg sampeldengan mortar hinggahalus, tambahkan 500 µl
buffer ekstraksi
2. Tambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex
3. Inkubasidalamwaterbath 55 °Cselama 60 menit, kocokperlahantiap
10menit
4. Tambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putarpelanselama
60menitpadasuhuruang
5. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 3,000 rpm selama 5menit
6. Pindah supernatant ke tube baru, tambahkan 50 µl 5 M NaCldan 1 ml
ethanol absolutdingin, kocokperlahan
7. Inkubasidi freezer selama 60 menit
8. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
9. Buang supernatant
10. Tambahkan 1 ml ethanol 70% ke pellet
11. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
12. Buang supernatant dantiriskansampaitidakadasisa ethanol yang
tertinggal
13. Keringkansisa ethanol padasuhu 37 °Cselama 60 menit
14. Tambahkan 50-100 µl buffer TE pada pellet dansimpanpada freezer
VI.
Hasil dan Pembahasan
1. Hasil Pengamatan
a. Isolasi DNA Metode Dixit (1998) Dimodifikasi
No.
Kegiatan
Gambar
1.
Menggerus 0.5 g sampel dengan
menambahkan 3ml buffer ekstraksi
2.
Menambahkan 600µl
mengkocok dengan kuat
3.
Menginkubasi pada suhu 65 °C selama
30 menit, mengkocok perlahan tiap 5
menit
20%
SDS,
4.
Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit
5.
Memindahkan supernatant ke tube
baru, dan menambahkan 1 ml
Potassium asetat
6.
Menginkubasi pada suhu -20 °C selama
10 menit
7.
Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit
8.
Memindahkan supernatant ke tube
baru, dan menambahkan isopropanol
sebanyak 2/3 volume supernatant.
9.
Mengkocok
angka 8.
10.
Menyentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit.
11.
Membuang supernatant, kemudian
mencuci pellet menggunakan 1 ml
ethanol 70%
perlahan
membentuk
12.
Menyentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 1 menit
13.
Mengeringkan pellet pada suhu37 °C
selama 60 menit.
14.
Melarutkan pellet dalam 100µl buffer
TE, simpanpadasuhu -20 °C
b. Isolasi DNA Metode PCI
No.
Perlakuan
1.
Menggerus 30 mg sampel dengan
mortar hingga halus, tambahkan 500 µl
buffer ekstraksi
2.
Menambahkan 20 µl proteinase K
(10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex
Gambar
3.
Menginkubasi dalam water bath 55
°Cselama 60 menit, kocokperlahantiap
10menit
4.
Menambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl
phenol,
400
µl
CIAA.
Memutarpelanselama
60menitpadasuhuruang
5.
Mensentrifuspadasuhu
4
°C
dengankecepatan 3,000 rpm selama
5menit
6.
Memindah supernatant ke tube baru,
dan menambahkan 50 µl 5 M NaCldan 1
ml
ethanol
absolutdingin,
kocokperlahan
7.
Menginkubasidi
menit
8.
Mensentrifuspadasuhu
4
°C
dengankecepatan 8,000 rpm selama 5
menit
9.
Membuang supernatant
10.
Menambahkan 1 ml ethanol 70% ke
pellet
freezer selama
60
11.
Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
12.
Membuang
supernatant
dan
meniriskan sampai tidak ada sisa
ethanol yang tertinggal
13.
Mengeringkansisa ethanol padasuhu 37
°Cselama 60 menit
14.
Menambahkan 50-100 µl buffer TE
pada
freezer
c. Pembahasan
VII.
KESIMPULAN
pellet
danmenyimpannyapada
DaftarPustaka
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak
Nanas(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah
sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika . Skripsi. Malang: Program
Sarjana (diaksespada 11 Oktober 2014 pukul 10.55 WIB)
Mustikaningtyas. 2014. Buku Ajar PraktikumBiologiMolekuler . Semarang: FMIPA
UNNES
Saputra, Eka. 2013. LaporanPraktikumBioteknologiTransformasi Gen
keDalamE.ColidanIsolat Plasmid Rekombinan. Haluoleo: FMIPA
ISOLASI DNA METODE DIXIT DAN PCI (Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol)
Kelompok 7 :
1. Sri Wahyu Purnami
4411412015
2. Silviatun Nihayah
4411412042
3. Intan Latifa Amalia
4411412068
4. Fatchun Naim
4411412051
Tanggal Praktikum
Jumat, 10Oktober 2014
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
BAB VI DAN VII
ISOLASI DNA METODE DIXIT (1998) DAN PCI
(Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol)
I.
Tujuan
Untuk melakukan ekstraksi DNA dari berbagai sumber dari jaringan tumbuhan dan
hewan dengan metode dixit (1998) dan PCI.
II.
Landasan Teori
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999)
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa
diisolasi. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi
esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa
polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah yang berbeda,
dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan
menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air
rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan
semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Zubaidah,2004
dalam Jamilah,2005)
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian
DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa
protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.
Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan
atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat
dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur
adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi
DNA.
Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan
lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut
dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga
tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut
meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat
seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa
jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benarbenar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk
menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka
mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.
Plasmid
merupakan
DNA
yang
tidakterlaluesensialbagifungsikehidupanbakteri,
tetapipentingdalampengaturansiklushidupdanperumbuhandalamlokasihidupnya.
Kebanyakan
Plasmid
plasmid
adalahsirkulardantersusundaribeberaparibupasanganbasa.
mempunyaititikori
(origin
sehinggamampumereplikasidiritanpapengaturandari
Replikasidimulaidarititikorihinggasemua
plasmid
of
replication)
DNA
kromosom.
tereplikasi
(Pierce,
2005:203dalamSaputra, 2013).
Isolasi
DNA
merupakanlangkah
yang
Prinsipnyaadadua,
tepatuntukmempelajari
DNA.
yaitusentrifugasidanpresipitasi.
Sentrifugasimerupakanteknikuntukmemisahkancampuranberdasarkanberatmolekulko
mponennya.
Molekul
yang
mempunyaiberatmolekulbesarakanberada
di
bagianbawahtabungdanmolekulringanakanberadapadabagianatastabung.
Hasilsentrifugasiakanmenunjukkanduamacamfraksi
yaitusupernatanpadabagianatasdanpeletpadabagianbawah
115dalamSaputra, 2013)
yang
(Campbell
terpisah,
dkk,
2002:
Langkahawalsetiappercobaan di bidangbiologimolekuleradalahmemperoleh
DNA
yang
dapatberasaldariberbeagaijaringanatauselmakhlukhidup.
Prinsipdasarisolasi / ekstrasi DNA adalahpenghancurandindingdanmembrane sel,
pemisahan DNA dari debris seldanpurifikasi DNA. Dalammelakukanmetodeekstrasi
DNA
yang
digunakansangatbegantungpadasumber
apakahdariselataujaringan,
hewan,
tumbuhan,
DNA-nya,
ataumikroorganisme.
(Mustikaningtyas, 2014)
Metode yang digunakanuntukmengisolasi DNA dariberbagaijenistanaman,
organ
tanaman,
maupunjaringannyadapatdilakukandenganberbagaicara.
Namunpadaintinyaterdapattigafaktorutama
yang
sangatpentinguntukdalammelakukanpurifikasidanekstraksi DNA secaramaksimal.
Pertamaadalahcaradalammenghomogenkanjaringantanamankhususnyaadalahdinding
selnya.
Keduaadalahkomposisidarilarutan
buffer
yang
ditambahkandalampenggerusanjaringantanamandan
yang
ketigaadalahpenghilanganenzimpenghambat-polisakarida.
Inkubasisampeldalam water bath bersuhu 60 derajat C selama 60 menit. Hal
inidilakukanuntukoptimalisasikerja
buffer
ekstrak.
Selanjutnyadilakukansentrifugasisampeldengankecepatan 12000 rpm selama 10
menithalinidilakukanuntukmemisahkan
debris
dankomponensel
lain
yang
menjadipengotordengan DNA.
Supernatan
yang
telahdiperolehselanjutnyadiambildanditambahkandenganlarutanPhenol:Chloroform:I
solamylAlkohol
(PCI)atau
dixit.
Hal
inidilakukanuntukmengekstraksi
DNA
darikontaminan. Fenolmerupakanpelarutorganik yang dapatmelarutkan protein, lipid
danmolekul lain sepergipolisakaridasehinggadiharapkanakandidapatkansupernatan
yang
berisi
DNA
bebaskontaminan.
Setelahpencampuran,
homogenattersebutdivorteksuntukoptimalisasihomogenasi.
Selanjutnyadilakukansentrifugasihomogenatdengan
tersebutdengankecepatan
13000
rpm
didapatkanadalahsupernatandanpelet
Kemudiandiambilsupernatanpadalapisan
selama
yang
5
menitdalam.
PCI
Hasil
yang
beradapadatigalapisanlapisanatas.
paling
atasdanditambahkanlarutanChloroform:IsoamylAlkoholuntukpresipitasilanjutan.
Kemudiankembalidilakukanvorteksdansentrifugasi.
Hasil yang didapatkanakanterbentukkembalisupernatandanpeletpadaeppendorf,
kemudiandilakukanpengambilansupernatan.
Supernatanditambahkandenganamoniumnitratdanetanolabsolutuntukpresipitasilanjut
andanmenghilangkankontaminan.
filamen
Seharusnyahasildapatdiketahuiterbentukfilamen-
DNA
dalamlarutanjernihtersebut.
Kemudiandilakukaninkubasiselamasatumalamuntukoptimalisasipresipitasi.
Fungsialat-alatisolasi
yang
DNA.
Sentrifuseberfungsimemisahkanantarabagian
padatdancair
(supernatant
Mikropipetberfungsiuntukmengambillarutan
supernatant
Ependorfberfungsiuntukwadahsampel
akan
yang
berfungsiuntukmemanaskan
Mortirberfungsiuntukmenghaluskansampel
di
dandebsis).
danzatkimia
ekstraksi
DNA
yang
lain.
Water
bath
sampel.
kan
di
ekstraksi.
Timbanganberfungsiuntukmenimbangjumlahsampel yang dibutuhkan. Thermometer
berfungsiuntukmengukursuhu.
Petridishberfungsiuntukmembersihkansampel..Erlemenyerberfungsiuntukmencairkan
agarose. Incubator berfungsiuntukinkubasisampel. Pinsetberfungsiuntukmengambil
material kecil. Sarungtanganberfungsiuntukmelindungitangandarizatberbahaya.
III.
PERMASALAHAN
a. Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan jaringan tumbuhan dan hewan yang
dapat digunakan sebagai sumber DNA.
b. Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan metod ekstraksi DNA.
c. Bagaimana mahasiswa mampu melakukan ekstraksi DNA dari jaringan hewan
dan tumbuhan.
IV.
ALAT DAN BAHAN
V.
METODE
A.
Langkah kerja Isolasi DNA Metode Dixit (1998) Dimodifikasi
1. Menggerus0.5 g sampel dengan menambahkan 3ml buffer ekstraksi
2. Menambahkan 600µl 20% SDS, mengkocok dengan kuat
3. Menginkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit, mengkocok perlahan
tiap 5 menit
4. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5
menit
5. Memiindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan 1 ml
Potassium asetat
6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit
7. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2
menit
8. Memindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan isopropanol
sebanyak 2/3 volume supernatant.
9. Mengkocok perlahan membentuk angka 8.
10. Menyentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 10,000 rpm selama 2menit.
11. Membuang supernatant, kemudian mencuci pellet menggunakan 1 ml
ethanol 70%
12. Menyentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 10,000 rpm selama 1 menit
13. Mengeringkan pellet padasuhu37 °C selama 60 menit.
14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpanpadasuhu -20 °C
B. Langkah Kerja Isolasi DNA Metode PCI
1. Menggerus 30 mg sampeldengan mortar hinggahalus, tambahkan 500 µl
buffer ekstraksi
2. Tambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex
3. Inkubasidalamwaterbath 55 °Cselama 60 menit, kocokperlahantiap
10menit
4. Tambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putarpelanselama
60menitpadasuhuruang
5. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 3,000 rpm selama 5menit
6. Pindah supernatant ke tube baru, tambahkan 50 µl 5 M NaCldan 1 ml
ethanol absolutdingin, kocokperlahan
7. Inkubasidi freezer selama 60 menit
8. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
9. Buang supernatant
10. Tambahkan 1 ml ethanol 70% ke pellet
11. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
12. Buang supernatant dantiriskansampaitidakadasisa ethanol yang
tertinggal
13. Keringkansisa ethanol padasuhu 37 °Cselama 60 menit
14. Tambahkan 50-100 µl buffer TE pada pellet dansimpanpada freezer
VI.
Hasil dan Pembahasan
1. Hasil Pengamatan
a. Isolasi DNA Metode Dixit (1998) Dimodifikasi
No.
Kegiatan
Gambar
1.
Menggerus 0.5 g sampel dengan
menambahkan 3ml buffer ekstraksi
2.
Menambahkan 600µl
mengkocok dengan kuat
3.
Menginkubasi pada suhu 65 °C selama
30 menit, mengkocok perlahan tiap 5
menit
20%
SDS,
4.
Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit
5.
Memindahkan supernatant ke tube
baru, dan menambahkan 1 ml
Potassium asetat
6.
Menginkubasi pada suhu -20 °C selama
10 menit
7.
Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit
8.
Memindahkan supernatant ke tube
baru, dan menambahkan isopropanol
sebanyak 2/3 volume supernatant.
9.
Mengkocok
angka 8.
10.
Menyentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit.
11.
Membuang supernatant, kemudian
mencuci pellet menggunakan 1 ml
ethanol 70%
perlahan
membentuk
12.
Menyentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 10,000 rpm selama 1 menit
13.
Mengeringkan pellet pada suhu37 °C
selama 60 menit.
14.
Melarutkan pellet dalam 100µl buffer
TE, simpanpadasuhu -20 °C
b. Isolasi DNA Metode PCI
No.
Perlakuan
1.
Menggerus 30 mg sampel dengan
mortar hingga halus, tambahkan 500 µl
buffer ekstraksi
2.
Menambahkan 20 µl proteinase K
(10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex
Gambar
3.
Menginkubasi dalam water bath 55
°Cselama 60 menit, kocokperlahantiap
10menit
4.
Menambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl
phenol,
400
µl
CIAA.
Memutarpelanselama
60menitpadasuhuruang
5.
Mensentrifuspadasuhu
4
°C
dengankecepatan 3,000 rpm selama
5menit
6.
Memindah supernatant ke tube baru,
dan menambahkan 50 µl 5 M NaCldan 1
ml
ethanol
absolutdingin,
kocokperlahan
7.
Menginkubasidi
menit
8.
Mensentrifuspadasuhu
4
°C
dengankecepatan 8,000 rpm selama 5
menit
9.
Membuang supernatant
10.
Menambahkan 1 ml ethanol 70% ke
pellet
freezer selama
60
11.
Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
12.
Membuang
supernatant
dan
meniriskan sampai tidak ada sisa
ethanol yang tertinggal
13.
Mengeringkansisa ethanol padasuhu 37
°Cselama 60 menit
14.
Menambahkan 50-100 µl buffer TE
pada
freezer
c. Pembahasan
VII.
KESIMPULAN
pellet
danmenyimpannyapada
DaftarPustaka
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak
Nanas(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah
sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika . Skripsi. Malang: Program
Sarjana (diaksespada 11 Oktober 2014 pukul 10.55 WIB)
Mustikaningtyas. 2014. Buku Ajar PraktikumBiologiMolekuler . Semarang: FMIPA
UNNES
Saputra, Eka. 2013. LaporanPraktikumBioteknologiTransformasi Gen
keDalamE.ColidanIsolat Plasmid Rekombinan. Haluoleo: FMIPA