Lyrawati, D. (2004) DNA recombination and genetic techniques, transmission of human disease and
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Lyrawati, D. (2004) DNA recombination and genetic techniques, transmission of human disease and
computer resources for the clinical and molecular geneticist (transl.Indonesian). Agric. Fac. Unibraw
Publ., Indonesia (ISBN 979-508-543-3).
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Page 1 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Te k nik D N A da n ge ne t ik pa da st udi
PETER KOPP AND J. LARRY JAMESON
diterjemahkan bebas (tanpa ijin) oleh D. Lyrawati
untuk membantu peserta Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Analisis DNA m olekuler t elah m enj adi bagian int egral
pada sem ua bidang spesialisasi kedokt er an.
Walaupun
genom m anusia berukuran sangat besar dan kom pleks,
nam un kem aj uan yang dicapai saat ini dalam proy ek
genom m anusia Hum an Genom e Proj ect ( HGP) t elah sangat
m eningkat kan penget ahuan kit a m engenai dasar- dasar
penyakit pada m anusia.
Analisis DNA m olek uler dan
genet ik m em berikan dam pak yang t idak sedikit di klinik
diant aranya adalah digunak annya pendek at an bar u unt uk
m endiagnosis penyak it , m endet eksi pat ogen, skr ining
fakt or
predisposisi
penyakit ,
konseling
genet ik ,
pengem bangan obat , farm akot erapi dan, unt uk beberapa
kasus, t erapi gen.
Lebih dari 3000 penyakit m anusia diket ahui disebabkan
oleh adanya cacat pada sat u gen t unggal dan yang
dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel.
Selain it u,
banyak proses penyakit dipengaruhi oleh lat arbelakang
genet ik ( genet ic background) si penderit a.
Seringkali
dit em ui adanya int eraksi yang kom plek s ant ara fakt or
lingkungan dan predisposisi genet ik . Banyak diant aranya
( m isalnya hipert ensi, peny akit ar t er i j ant ung, asm a,
diabet es) t er m asuk golongan penyakit yang m enj adi
m asalah kesehat an um um ut am a dan unt uk m enget ahui
pat ogenesis penyakit t ersebut m asih m er upakan t ant angan
yang sangat besar.
Bent uk lain dari penyakit genet ik
adalah sindrom a yang disebabkan oleh aberasi krom osom
dan sindrom a kanker yang m enurun, sert a defek pada DNA
sel som at ik yang j uga t erj adi pada kanker.
D N A da n t r a n sm isi in for m a si ge n e t ik . Makrom olek ul
DNA unt ai ganda m engandung infor m asi genet ik .
DNA
t erdiri dari dua unt ai yang saling kom plem en dan m elilit
m em bent uk heliks ganda ( double helix ) . Set iap unt ainy a
t erdiri dar i em pat m acam basa yang t erat ur linear: adenin
( A) , t im in ( T) , cyt osine ( C) dan guanin ( G) . Uruan basabasa t ersebut yang akan m em bent uk sekuens DNA. Kedua
unt ai DNA t erikat m elalui ikat an hidrogen yang t erbent uk
ant ara basa- basa kom plem ent er G dengan C, at au A
dengan T. Kar ena rant ai nuk leot ida dalam DNA unt ai ganda
berdasarkan sifat kom plem en yang sangat ket at , set iap
unt ai dapat bert indak sebagai cet akan unt uk m em bent uk
unt ai baru. Replikasi sem ikonservat if ini akan m enj am in
bahwa t iap sel yang m em belah akan m enerim a salinan DNA
yang ident ik.
Unt uk suat u gen, pada bagian sekuens yang m enyandi
( coding sequence) , t iap set yang t erdir i dari 3 basa DNA
akan
m em bent uk
kodon,
kode
genet ik
unt uk
m enginkorporasikan salah sat u dari 20 asam am ino yang
t erdapat dalam prot ein ( Gam bar 2- 1) . Dengan dem ik ian
sat u seri kodon akan m enet ukan asam am ino yang ak an
disint esis m enj adi sat u polipept ida t ert ent u.
I nst r uk si
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
penyandi- prot ein pada DNA y ang m enyandi suat u gen akan
dit ranskripsikan m enj adi m RNA. m RNA ini dit ranslokasik an
dari int i ke sit oplasm a, t em pat t erj adinya t ranslasi oleh
ribosom , dit erj em ahkan m enj adi unt aian asam am ino
( sint esis prot ein) .
Penj elasan yang m endet il m engenai t eknik genet ik
m olekuler t idak akan dibahas pada bab ini, sedangk an
beberapa konsep dasar dan t eknik yang esensial dan
berguna unt uk analisis genom dan penyak it genet ik t elah
dibahas pada bab Teknik Rek om binan.
Uk u r a n da n or ga n isa si ge n om m a n u sia .
Genom
disandi oleh polim er DNA yang t erpisah m enj adi beberapa
segm en, yang disebut krom osom . Pada m anusia, set iap sel
som at ik bersifat diploid dan m engandung 2 set 23
krom osom . Seorang anak m enerim a sat u kopi t iap
krom osom dar i ibu, dan sat u kopi dari bapak. Duapuluh
dua krom osom aut osom m em punyai 2 kopi, dan m irip baik
pada wanit a m aupun pr ia. Krom osom X dan Y berbeda.
Hanya sebagian kecil pada lengan pendek dari krom osom X
dan krom osom Y, pseudoaut osom al region ( PAR) , yang
m em punyai hom ologi. Per em puan m em punyai 2 krom osom
X ( XX) , sedangkan lak i- laki heerogam et ( XY) . DNA sat u
krom osom at au haploid t erdiri dari 3 x 109 pb ( 3000Mb) ,
dengan
krom osom
t erk ecil
m engandung
~ 50
Mb
( krom osom 21) dan t erbesar ~ 263 Mb ( krom osom 1) .
Sat u gen t erdiri dar i sekuens DNA regulat or, sekuens
penyandi ( ekson) dan sekuens int ron. Sekuens suat u gen
yang m enyandi prot ein t erlet ak pada ek son, yang dipot ong
dan disam bung kem bali ( splice) m em bent uk m RNA.
Berdasarkan
j um lah
m RNA
yang
diekspresik an,
diperk irakan genom m anusia m engandung 70.000 sam pai
10.000 gen. Ukuran dan st rukt ur gen sangat bervar iasi.
Gen- gen kecil t erdiri dari beberapa rat us pasangbasa,
sedangkan gen t erbesar yang diket ahui saat ini, gen pada
krom osom X yang m enyandi prot ein dist ropin, m engandung
2 x 106 pb dengan lebih dari 100 int ron. Mut asi pada gen ii
m engakibat kan 2 kondisi klois yang berbeda, Duchene
Muscular Dyst r ophy ( DMD) dan Becker Muscular Dist rophy
( BMD) .
Beberapa daerah krom osom , t erut am a daerah
dekat sent rom er , t idak m engandung gen, sedangk an
daerah lain m engandung banyak sekali gen. Terkadang,
gen berk elom pok m enj adi k lust er di m ana beberapa salinan
gen dengan fungsi yang m irip berdekat an sat u sam a lain.
Cont oh klust er gen adalah gen horm on per t um buhan, at au
gen yang m enyandi globin dan . Tapi ada j uga, gen- gen
dengan fungsi yang ham pir sam a t er let ak pada krom osom
yang berbeda.
Gen yang diekspresi hanya ~ 20% dari t ot al genom .
Sebagian besar DNA genom bukan m erupakan salinan se-
Page 2 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
segm en krom osom dari ibu ( m at ernal) m engalam i
rekom binasi dengan krom osom hom olog dari ayah
( pat ernal) m em bent uk krom osom hibrid m enggant ikan
krom osom asal. Rekom binasi dem ik ian sering t erj adi, dan
nam pak nya t erdapat sat u chiasm a pada t iap lengan
krom osom . Set elah pert ukaran ini selesai, krom osom ak an
disegregasikan secara acak. Karena ada 23 krom osom ,
23
m aka ada 2
( > 8 j ut a) kem ungkinan kom binasi
krom osom .
Bersam a dengan pert ukaran yang t erj adi
selam a r ekom binasi, segregasi krom osom m enghasilkan
diversit as ( keanekaragam an) genet ik gam et yang sangat
t inggi.
Set elah pem belahan m eiosis pert am a, yang
m enghasilkan dua sel ( 2n) , k edua krom at id pada t iap
krom osom ak an t erpisah selam a proses pem belahan
m eiosis k e dua sehingga ak an dihasilkan 4 gam et yang
m asing- m asing m em ilik i sat u krom at id ( 1n) .
Ga m ba r 2 - 1 Kode genet ik.
Kodon suat u asam am ino
t erdiri dari t iga nukleot ida ( t riplet ) . Sat u asam am ino dapat
disandi oleh beberapa kodon yang berbeda ( degener asi
kode genet ik) . Sekuens unt uk kodon st ar t dan kodon st op
t er m asuk j uga kode genet ik.
kuen t unggal, m elainkan t erdiri dari sekuen berulang
dengan berbagai t ipe.
Short int erspersed repet it ive
elem ent s ( SI NE: 100- 500 pb) dan long int erpersed
repet it it ive elem ent s ( LI NE: 6000- 7000 pb) t ersebar pada
genom . Bent uk lain sekuens berulang, m ik rosat elit , t erdir i
dari 10- 50 salinan ber ulang dari sekuens y ang sederhana.
Fungsinya belum j elas, t api sekuens dem ikian dapat
digunakan sebagai alat unt uk pem et aan genet ik dan linkage.
M it osis da n m e iosis. Unt uk keperluan pert um buhan
dan perkem bangan j aringan, sel eukar iot ik m engalam i
sik lus pem belahan sel dan diferensiasi. Tiap pem belahan
sel ( m it osis) m enghasilkan 2 sel diploid ( set krom osom 2n)
yang ident ik secara genet ik . Pada t ahap awal m it osis t iap
krom osom parent al diduplik asi, m enghasilkan 2 pasang
krom at id ( 2n4n) . Krom osom kem udian m em endek dan
m em bran int i m enghilang.
Pada m et afase, krom osom
t ersusun pada bagian ek uat orial. Kedua krom at id yang
kem bar berada pada sent r om er, m elekat pada spindel
m it ot ik. Kem udian krom at id akan berpisah dan m igrasi ke
uj ung yang saling berlawanan.
Set elah m em bran int i
t erbent uk m engelilingi m asing- m asing krom at id, sel
m em belah dan t erbent uklah dua sel diploid.
Gam et , oosit dan sper m , m engandung hany a sat u salinan
unt uk t iap krom osom , sat u set krom osom haploid. Ket ika
sper m m em fer t ilisasi sel t elur , kedua set kr om osom haploid
bergabung, m em bent uk sat u zigot yang m engandung 2
salinan
unt uk
t iap
krom osom
( diploid
at au
2n) .
Pem bent ukan gam et haploid dari sel germ inal diploid
( oogonia, sperm at oonia) t erj adi m elalui proses m eiosis,
yang t erdir i dari 2 pem belahan sel. Selam a pem belahan
m it ot ik pert am a, t erj adi pert ukaran ant ara krom osom krom osom yang hom olog sehingga m enghasilkan gam et
yang secara genet ik berbeda.
Set elah pem bent ukan 2
krom at id ( 2n4n) , krom osom yang hom olog berpasangan
dan m em bent uk chiasm at a ( Gam bar 1- 2) . Salah sat u dari
kedua krom at id dapat berpasangan dengan krom osom yang
hom olog dan m engalam ai proses crossing- over, di m ana
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 2 Crossing- ov er dan rekom binasi.
Selam a
pem bent ukan chiasm a, salah sat u dari kedua krom at id
pada sat u krom osom berpasangan dengan sat u krom at id
krom osom hom olog. Rekom binasi genet ik m elalui crossingover m enghasilkan segm en krom osom rekom binan dan
nonrekom binan pada gam et .
Rekom binasi dem ik ian
seringkali t erj adi, dan bersam a- sam a dengan segr egasi
acak krom osom m at ernal dan pat ernal, m aka ak an
m engakibat kan keanekaragam an genet ik pada gam et .
Ge n ot ip da n fe n ot ip.
Sat u segm en DNA yang
dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel ( m isalnya gen)
disebut lokus ( locus, j am ak: loci) . I nform asi genet ik pada
sat u lokus gen disebut sebagai genot ip. Perbedaan urut an
DNA, yang berart i j uga per bedaan genot ip, disebut alel
( allele) . Jika dua alel ada pada sat u lokus, m aka ada t iga
kem ungkinan genot ip. Genot ipe bisa ident ik ( hom ozigot )
unt uk salah sat u dar i kedua alel t ersebut , at au bisa t erdiri
dari kom binasi kedua alel ( het erozigot ) . Jik a t erdapat lebih
dari dua alel, m aka j um lah k em ungkinan genot ip j uga ak an
m eningkat .
Fenot ip adalah karakt erist ik yang dapat dilihat at au
diukur pada sat u individu. I st ilah w ild t y pe dipakai unt uk
m enerangkan/ m eruj uk pada gen yang norm al, t er m asuk
varian alel yang berbeda.
Genot ip m ut an t idak selalu
m engubah fenot ip. Jika fenot ip alel m ut an dapat dikenali
pada kondisi hom ozigot , berart i alel dem ikian adalah resesif.
Jika kedua alel dapat dikenali pada kondisi het erozigot ,
berart i alel- alel bersifat kodom inan ( m isalnya alel A dan B
pada sist em golongan darah ABO) .
Keanekaragam an genet ik yang t ersebar luas di alam
t erlihat pada adanya variasi fenot ip ant ar , dan dalam , grup
Page 3 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
et nik yang berbeda.
Polim orfism e biokim ia, yang t idak
langsung dapat dianggap sebagai fenot ipe, j uga dapat
t erdet ek si pada banyak prot ein nor m al yang t erdapat pada
berbagai bent uk pada suat u populasi.
Varian dem ikian
dapat dij elaskan karena adanya m ult ipel alel pada t ingk at
gen. Polim orfism e dem ikian ant ara lain t er lihat pada sist em
golongan darah ABO.
Hasil analisis genet ika m olek uler
m enunj ukkan bahwa t ernyat a variasi genet ik sangat
banyak. Set iap 1 dari 200 pb pada genom m anusia bersifat
polim orfik , t erut am a pada daerah genom yang t idak
m enyandi
( noncoding) ,
t erm asuk
di
ant aranya
perubahan/ per bedaan sat u pasangan basa dan variasi
sekuens
ber ulang
( repet it ive
sequence) .
Suat u
polim orfism e dapat m engubah sekuens prot ein j ika
polim orfism e t erlet ak pada daerah penyandi ( coding region)
dan subst it usi t ersebut m engubah asam am ino yang disandi
oleh kodon t ert ent u.
Polim orfism e dit urunkan secara
Mendel, sat u sifat yang ber guna unt uk st udi linkage dan
unt uk aplikasi forensik.
Polim orfism e m ungk in t idak m em pengar uhi fenot ip, at au
hanya berperan pada keanekaragam an populasi dan t idak
berasosiasi dengan penyakit . At au, polim orfism e m ungk in
m em pengaruhi kerent anan t erhadap, at au ekpresi suat u
penyakit t er t ent u. Keanekaragam an genet ik yang t inggi
akan m eningkat kan kem am puan suat u populasi unt uk
beradapt asi
t erhadap
perubahan
lingkungan,
dan
m enurunkan r esiko penyak it resesif.
H e t e r oge n it a s ge n e t ik Het erogenit as genet ik adalah
perubahan fenot ip yang nam paknya m irip walaupun defek
( cacat ) t erj adi pada gen yang berbeda.
Misalny a,
het erogenit as genet ik pada Mat ur it y - Onset Diabet es of
Young ( MODY) , yang dapat disebabkan oleh defek pada gen
glukokinase, at au pada gen yang m enyandi HNF- 1
( Hepat ocy t e nuclear fact or- 1) at au HNF- 4.
Het erogenit as alel at au int ragen adalah perubahan
genot ip pada lokus yang sam a yang m engakibat k an
fenot ipe yang sam a at au m ir ip. Pada cy st ic fibrosis, lebih
dari 600 m ut asi t elah diket ahui pada gen yang m enyandi
prot ein regulat or kondukt ans t ransm em bran cyst ic fibrosis
( cyst ic fibrosis t ransm em brane condunt ance regulat or
prot ein, CFTR) . Pada het erogenit as alel, st udi linkage ak an
m engident ifikasi
lokus
y ang
sam a.
Sebaliknya,
het erogenit as genet ik m enghasilkan fenot ip yang m irip, t api
analisis linkage akan m engident ifikasi lokus- lokus yang
berbeda pada keluarga yang berbeda.
Re st r ict ion e n don u cle a se.
Endonuk lease rest r iksi
adalah enzim bakt eri yang m engenal dan m em ot ong DNA
pada sekuens nukleot ida yang t er t ent u, disebut sit us
rest r iksi ( lihat bab Teknik Rekom binan) .
Sit us rest r iksi
yang paling banyak adalah sekuens 4- 6 pb. Banyak dari
sekuens ini bersifat palindrom ik ( sim et ri pada dua aksis) .
Pada suat u fragm en DNA secara acak enzim rest r iksi yang
m engenal sekuens 4- basa akan m enem ukan t arget
4
sekuensnya set iap 4 ( 256) basa, sedangk an pem ot ong 66
basa set iap 4 ( 4036) basa.
Pem ot ongan yang t erj adi
dapat m enghasilkan DNA uj ung t um pul ( blunt end) at au
uj ung pendek ‘runcing’ unt ai t unggal DNA ( cohesive/ st icky
end) .
Kem am puan m enggunakan enzim endonuklease
rest r iksi sangat pent ing unt uk m anipulasi DNA, yang ant ar a
lain dapat diaplikasikan unt uk analisis Sout hern dan kloning
fragm en DNA.
Jika variasi sekuens m engak ibat k an
hilangnya at au sebaliknya t im bulnya sit us rest r iksi, m aka
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
disebut polim orfism e panj ang fragm en r est r iksi ( RFLP) .
Marker polim or fik ini dapat digunakan unt uk st udi linkage.
PCR Polym erase chain react ion ( PCR) , dik enalkan pada
1985, t elah m engubah cara m enganalisis DNA secara
berm akna, dan t elah m enj adi dasar biologi m olekuler dan
analisis genet ik. PCR m em ungkinkan unt uk m em perbany ak
segm en DNA t ert ent u sam pai j ut aan kali lipat . Pada t ahap
pert am a, cet akan DNA unt ai ganda ( dsDNA) didenat ur asi
dengan pem anasan ( Gam bar 2- 3) . Tahap kedua, pr im er
oligonk leot ida sint et is t ert ent u sek it ar 20 pb dit em pelkan
( anneal)
pada kedua sisi fragm en DNA.
Unt ai
kom plem ent er yang t erlet ak diant ara kedua prim er
kem udian disint esis dengan DNA polim erase. Prosedur ini
biasanya diulang sek it ar 30 kali m enggunakan blok
pem anas ot om at is. Pada t iap siklus, sem ua dsDNA y ang
ada dari siklus sebelum ny a bert indak sebagai cet akan.
Karena pada akhir t iap sik lus j um lah DNA m enj adi dua k ali
lipat , m aka j um lah DNA yang direplikasi akan m eningk at
secara eksponensial.
Ga m ba r 2 - 3 Polym erase Chain React ion ( PCR) . PCR
m enghasilkan salinan segm en DNA t er t ent u dalam j um lah
banyak. DNA unt ai ganda ( double st randed, ds) didenat urasi, prim er oligonukleot ida sint et is spesifik sepanj ang 20
basa dit em pelkan ( annealed) pada kedua sisi segm en yang
dikendaki, dan unt ai kom plem ent er disint esis oleh DNA
polim erase yang t ahan panas. Pada t iap siklus, sem ua
dsDNA yang ada dari sik lus sebelum nya bert indak sebagai
cet akan. Kar ena pada akhir t iap siklus j um lah DNA m enj adi
dua kali lipat , m aka j um lah DNA yang direplikasi akan
m eningkat secara eksponensial.
Page 4 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Rever se- t ranscript ase- PCR ( RT- PCR) adalah salah sat u
st rat egi lain y ang pent ing unt uk analisis m olekuler. Mat er i
awal yang dipakai dalam hal ini adalah m RNA.
m RNA
t ersebut dit ranskrip- balik m enj adi cDNA dengan enzim
reverse t ranscript ase ( sint esis unt ai- pert am a) . Kem udian,
segm en cDNA dapat diperbanyak dengan cara PCR seper t i
yang t elah dit erangkan sebelum nya.
Se k u e n sin g
DNA
Beberapa
prot okol
t elah
dikem bangkan unt uk m enent ukan sekuens nukleot ida DNA.
Pada dua m et ode t radisional ( Maxam - Gilbert dan Sanger ) ,
cet akan DNA digunakan unt uk m em buat fragm en DNA,
yang berbeda ukuran.
Menggunakan elekt roforesis gel
resolusi t inggi, m olekul DNA dipisahkan pada t ingk at
resolusi sat u basa, sehingga sek uens cet akan DNA dapat
diperk irakan.
Sekuensing Maxam - Gilbert m em anfaat k an
zat kim ia yang m em ot ong DNA pada basa t ert ent u,
sehingga dihasilkan fragm en- fragm en dengan panj ang yang
berbeda.
Pada sek uensing m et ode Sanger, rant ai DNA
dengan berbagai panj ang dibuat dengan m enggunak an
dideoksinukleot ida unt uk m enghent ikan ext ension DNA oleh
DNA polim erase ( chain t er m inat ion m et hod) .
Dengan
m engelekt roforesis 4 reak si secara paralel ( sat u unt uk t iap
dideoksinukleot ida) dan m em isahkan pr oduk ext ension
secara elek t roforesis pada gel poliakrilam id, m aka dapat
dilak ukan penent uan sekuens DNA cet akan.
Prosedur
ot om at is biasanya didasarkan
pada
m et ode chain
t er m inat ion dan m enggunakan dideoksinukleot ida at au
prim er yang dilabel fluorescent , kem udian diikut i dengan
analisis sek uens langsung dengan kom put er .
Cont oh
sekuensing dapat dilihat pada Gam bar 2- 4.
Saat ini sedang dikem bangk an t ek nologi sekuensing DNA
yang lebih cepat , lebih sensit if dan lebih hem at biaya.
Met odologi yang diek splorasi ant ara lain det eksi basa yang
dilabel fluorescent pada flow cyt om et ry, pem bacaan
langsung sek uens basa unt ai DNA m enggunakan scanning,
t unneling,
at au
m ikroskopi
at om ic
force,
analisis
spekt roskopi m assa, dan analisis sekuens m enggunak an
chips
DNA
yang
m engandung
banyak
koleksi
oligonukleot ida unt uk dapat m enghibridisasikan DNA.
Sit oge n e t ik da n Flu or e sce n t in Sit u H ibr idiza t ion
( FI SH ) Krom osom dapat dicat dan dilihat m enggunak an
m ikroskop cahaya. Krom osom m enunj ukkan pola pit a yang
khas elap dan t erang yang m enggam barkan variasi regional
kom posisi DNA.
Perbedaan ukuran pola pit a ( banding)
m em ungkinkan kit a unt uk m em bedakan ke22 krom osom
ot osom dan k rom osom sex unt uk m em nent ukan karyot ip
seorang
individu.
Analisis
sit ogenet ik
ini
dapat
m enunj ukkan adanya ket idaknorm alan pada krom osom ,
t er m asuk adanya krom osom yang hilang at au sebaliknya
bert am bah ( t erlalu banyak ) , delesi besar, insersi, at au
t ranslokasi.
Fluorescent in sit u hibridizat ion ( FI SH) m erupakan
gabungan dari sit ogenet ik konvensional dan hibr idisasi DNA.
Krom osom dipersiapkan dari sel berint i dan dihibr idisasi
dengan probe DNA yang dilabel fluorochrom e yang spesifik
unt uk berbagai lokus. Aberasi num erik dan st ruk t ur dapat
didet eksi dengan m enganilisis pola fluor esensi/ pendar an.
FI SH m ulai m enggant ik an cara analisis sit ogenet ik
konvensional. Resulusi FI SH yang t inggi berguna unt uk
diagnosis dan j uga unt uk m em buat pet a krom osom . Jika
digunakan krom osom
int erfase,
probe FI SH dapat
m eningkat kan resolusi pet a sam pai ~ 100.000 pb.
Pe m e t a a n ge n
Karena ukuran dan sedem ikian
kom pleksnya genom m anusia, unt uk m enget ahui ident it as
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 4 Sekuensing DNA ot om at is m enggunakan
dideoksinukleot ida yang dilabel fluorescent .
Diant ar a
banyak m et ode sek uensing DNA, m et odologi chain
t er m inat ion adalah prosedur yang paling banyak dipakai,
t er m asuk penggunaan prosedur ot om at isnya yang t er us
m eningkat .
Prosedur
ot om at is
m enggunakan
dideoksinukleot ida ( at au prim er ) yang dilabel fluor escent
dan analisis sekuens dilakukan langsung m elalui kom put er .
Prim er sek uensing dit em pelkan pada cet akan DNA.
Dideoksinuk leot ida yang m engandung label fluorescent
yang berbeda dit am bahk an ke dalam reak si unt uk
m enghent ikan polim er isasi DNA.
Dideoksinuk leot ida
berkom pet isi dengan deoksinukleot ida ( nukleot ida nor m al)
pada reaksi ext ension DNA, j ika dideoksinukleot ida yang
t erinkorporasi pada saat polim er isasi/ ex t ension m aka r eaksi
polim er isasi akan berhent i karena nuk leot ida baru t idak
dapat dit am bahkan pada uj ung 3’nya.
Hasil reaksi ini
dipisahkan dengan elekt roforesis, yang kem udian langsung
dianalisis dengan kom put er .
dan lokasi suat u gen t idaklah m udah. Pet a seluruh genom
sekarang sedang dibuat unt uk m em udahkan m encari lokasi
suat u gen.
Berbagai m acam pet a ( genet ik dan fisik)
m enggam barkan urut an m arka/ pet anda dan j arak ant ar
m arka- m arka t ersebut pada krom osom . Salah sat u t uj uan
Hum an Genom e Proj ect adalah unt uk m eningkat kan
resolusi pet a- pet a t er sebut sam pai lokasi unt uk set iap gen
diket ahui dengan t epat .
Page 5 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Ga m ba r 2 - 5 Pet a kandungan STS Ada at au t idaknya STS,
frgam en pendek DNA yang diket ahui sekuensnya, dapat
dit ent ukan dalam berbagai klon krom osom ragi t iruan
( yeast art ificial chrom osom es, YACs) . Perbandingan ant ara
sekuens STS dalam beberapa klon YAC m em ungk ink an
unt uk m enent ukan urut annya.
Pet a genet ik m enent ukan posisi relat if gen at au lokus
berdasarkan frekuensi rekom binasi r elat if t erhadap lokuslokus lain pada krom osom y ang sam a. Hal ini dinyat ak an
sebagai unit rekom binasi at au cent iMorgans ( cM) . Pet a
genet ik ~ 40% lebih panj ang pada krom osom yang diperoleh
dari wanit a karena frekuensi rekom binasi yang lebih t inggi
selam a pem bent ukan sel t elur ( oocyt e) . Sekuen polim orfik
apapun yang dapat diikut i pola penurunannya berguna
unt uk pem et aan. Salah sat u cont oh m arka yang berguna
adalah RFLP dan m ikrosat ellit e repeat s.
Pet a genet ik
kem udian disusun berdasarkan st udi linkage yang m enguj i
seberapa sering dua m ark a dit urunkan bersam a- sam a.
Lokasi krom osom at au gen yang bert anggung j awab unt uk
suat u penyakit yang m enur un dapat dit ent ukan dengan
m engikut i pola penurunan m arka DNA.
Posisi lokus- lokus pada pet a fisik dit unj ukkan dengan
nilai absolut .
Berbagai pet a fisik berbeda t ingkat
resolusinya. Pet a sit ogenet ik at au krom osom m enent ukan
posisi relat if lokus genet ik pada pit a krom osom khas yang
t eram at i di bawah m ikrokop cahaya.
Pet a cDNA
m em ungkinkan unt uk m elakukan analisis daerah genom
yang diek spresikan. Set elah cDNA disint esis dari m RNA
m enggunakan reverse t ranscr ipt ase, asal cDNA dapat
dipet akan pada daerah krom osom t er t ent u dengan cara
hibr idisasi. Sequence- t agged sit es ( STS) adalah segm en
pendek DNA y ang diket ahui lokasinya pada pet a genet ik.
STS dapat digunakan unt uk koleksi fragm en DNA yang
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 6 Analisis linkage pada m ult iple endocr ine
neoplasia t ype 1 ( MEN- 1) ( A) . Sk em a krom osom m anusia
11 yang m enggam barkan posisi gen MEN- 1 pada pit a q13.
Pada individu m anapun, t erdapat alel dari bapak ( pat er nal)
dan ibu ( m at ernal) unt uk MEN 1.
Mar ka m ikrosat elit
hipot et is A dan B dit unj ukkan di dekat lokus MEN 1. Marka
A lebih dekat pada gen MEN 1. Genot ipe didefinisik an
berdasarkan j um lah ulangan pada m ikrosat elit , sedem ikian
rupa sehingga alel bapak ( pat ernal) adalah ‘3- 4’ dan alel
ibu ( m at ernal) adalah ‘2- 2’. Berdasarkan pedigr ee ( at au
sekuensing DNA kalau ada) , genot ipe 3- 4 t erlihat
berhubungan ( link) dengan gen MEN 1.
( B) .
Silsilah
keluarga yang penderit a MEN- 1.
Alel anggot a keluarga
dit andaidengan genot ipe berdasarkan m ik rosat elit pada A
dan B.
Penyakit dibawa oleh anggot a keluarga yang
m em punyai alel ‘3- 4’ ( t ebal) .
Baik penderit a m aupun
pem baw a dit andai dengan ar sir. Per hat ikan bahwa laki- laki
pada generasi ke I I , yang bukan m erupakan bagian dari
keluarga yang asli, j uga m em punyai ale ‘3- 4’, t et api t idak
m enderit a, hal ini m enunj ukkan bahwa genot ipe khusus ini
hanya berhubungan ( link) unt uk sat u keluarga ini, t idak
unt uk populasi um um .
diklon ke dalam yeast ar t ificial chrom osom es ( YACs) . Ada
at au t idak nya STS t er t ent u pada suat u fragm en klon daapt
dibandingkan dengan YACs lain unt uk m engident ifikasi k lon
yang overlap.
Dengan cara ini DNA y ang berdekat an
( cont igs) dapat dikarakt erisasi ( Gam bar 2- 5) . Pet a fisik
dengan resolusi t inggi akan dapat m enunj ukkan sekuens
DNA kom plit pada t iap krom osom dalam genom m anusia.
Lin k a ge
Linkage genet ik m erupakan dasar unt uk
penyusunan pet a genet ik, dan digunakan unt uk m endet ek si
gen baru dengan cara posit ional cloning.
Linkage j uga
digunakan unt uk m em perkir akan penurunan/ t ransm isi gen
Page 6 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
penyakit t er t ent u. Syarat unt uk analisis linkage adalah
adanya berbagai polim orfism e sek uens, m isalnya RFLP,
perbedaan j um lah repeat s berdekat an ( v ariable num ber of
t andem repeat s/ VNTR) , aTau m ikrosat elit , yang digunakan
unt uk m em bedakan asal alel ( parent al origin) . Lokus gen
pada kroosom orangt ua dapat m engalam i r ekkom binasi
at au t et ap ( nonrecom binant ) . Frekuensi rekom binasi yang
t eram at i ant ar a dua lokus m erupakan fungsi dari j arak
ant ar lokus dan dinyat akan sebagai cent iMorgan ( cM) . Jik a
frekuensi rekom binasi ant ar a dua lokus adalah 1% , m aka
kedua lokus t ersebut dikat ak an berj arak 1 cM ( 1 cM adalah
~ 1Mb DNA) . Karena frek uensi rekom binasi m eningkat
sesuai dengan j arak genet ik, m aka m ak in dekat j arak ant ar
dua lok us berart i m ak in t inggi kem ungkinan bahwa
keduanya dir urunkan secara bersam a- sam a ( genet ic
linkage) .
Sat u set m arka yang sangat berdekat an dan
dit urunkan bersam a- sam a akan m em bent uk haplot ype.
Lokus DNA diident ifikasikan dengan nom enklat ur spesifik.
Misalnya, lok us D7S525 berart i krom osom m anusia 7,
segm en 525, dan t er let ak pada lengan pendek krom osom 7.
Unt uk m engident ifikasi lokus krom osom yang dit urunkan
( segr egat e) bersam a- sam a suat u penyak it , perlu dilakukan
penent uan genot ipe DNA sam pel dari sat u at au lebih silsilah
keluarga ( pedigree) .
Set elah it u, kit a akan dapat
m enent ukan apakah m ark a alel t ert ent u dit urunk an
bersam a- sam a ( cosegregat e) dengan peny akit . Jika pada
suat u st udi k eluarga digunakan sat u seri m arka genet ik
unt uk m enet apkan linkage suat u fenot ip penyakit , m ak a
m arka- m arka yang dekat dengan gen penyakit ak an
m em punyai k em ungkinan lebih k ecil unt uk m engalam i
rekom binasi dan akan m em peroleh nilai linkage yang lebih
t inggi. Dat a y ang diperoleh dari karakt erisasi banyak lok us
kem udian dianalisis dengan program kom put er. Link age
biasanya dinyat akan sebagai nilai Lod ( logarit hm of odds) ,
yang m erupak an rasio kem ungkinan bahw a suat u penyakit
dan m arka t er t ent u m em punyai hubungan ( linked) . Nilai
Lod dinyat ak an sebagai logarit m a dasar 10 yang
m enunj ukkan bahwa angka posit if berart i berhubungan
( linkage) dan angka negat if berar t i t idak berhubungan
( nonlinkage) . Nilai Lod + 3 ( 1000: 1) biasanya dianggap
m enunj ukkan adanya linkage, sedangkan nilai - 2 berart i
t idak ada linkage.
Cont oh penggunaan analisis linkage dit unj ukkan pada
Gam bar 2- 6.
Dalam kasus ini, gen penyakit ot osom al
dom inan, m ult iple endocrine neoplasia t ype 1 ( MEN- 1) ,
diket ahui ber lokasi pada krom osom 11q13.
Marka
m ikrosat elit polim orfik hipot et is
berada cukup dekat
dengan gen MEN- 1, yang m enyandi prot ein m enin ( saat ini
belum dik et ahui fungsinya) . Pada pedigree t er lihat pada
generasi I kak ek ( penderit a) m em bawa alel 3 dan 4 pada
krom osom dengan gen MEN- 1 t er m ut asi dan alel 2 dan 2
pada krom osom 11 lainnya.
Sesuai dengan linkage
genot ipe 3/ 4 pada lokus MEN- 1, pada generasi I I anak lakilakinya j uga pender it a, sedangkan anak perem puannya
( yang m ewarisi genot ip 2/ 2 dari ayahnya) bukan pender it a.
Pada generasi ke t iga, t ransm isi genot ipe 3/ 4 m enunj uk kan
resiko t erj adinya MEN- 1, dengan anggapan t idak t erj adi
rekom binasi genet ik ant ara alel 3/ 4 dan gen MEN- 1. Jika
m ut asi spesifik dalam gen MEN- 1 dapat diident ifikasi dalam
keluarga t ersebut , m aka t ransm isi m ut asi it u sendir i dapat
diik ut i, dengan dem ikian dapat m enghilangkan keraguan
yang disebabk an oleh adany a rekom binasi.
Klon in g ge n DNA dapat diperbanyak dengan kloning
fragm en DNA ke dalam vekt or yang sesuai yang dapat
dipropagasikan ke dalam sel host . Vek t or- vekt or t ersebut
ant ara lain m olekul DNA yang diperoleh dari virus, bakt er i,
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
at au ragi yang dapat m elakukan replikasi t anpa t ergant ung
pada genom sel host . Set elah vekt or dan DNA yang ak an
disisipkan didigest i dengan enzim rest r iksi, vekt or dan DNA
dapat digabung m enggunak an DNA ligase. Vekt or yang
m em bawa fragm en kem udian dipindahkan ke dalam sel
host ( bak t eri, ragi at au sel eukarit ik) unt uk ber eplikasi.
Dengan cara ini dapat diper oleh sej um lah besar DNA unt uk
st udi ekperim ent al lebih lanj ut .
Manipulasi
dem ikian
dapat
dilakukan
unt uk
m em perbanyak fragm en DNA t unggal, at au unt uk m em buat
library di m ana sem ua fragm en yang berasal dari DNA
genom akhirnya akan dir epresent asikan sebagai koleksi
koloni. Pada prinsipnya library genom adalah fragm en dar i
seluruh genom yang diklon. Library genom j uga dapat
dibuat dar i krom osom t unggal yang t elah diseleksi
m enggunakan fluorescence- act ivat ed cell sort ers ( FACS) .
Library cDNA dapat dibuat m enggunakan m RNA j aringan
t ert ent u. Beberapa m odifikasi dapat dilakukan unt uk
m eningkat kan j um lah m RNA spesifik ( m isalnya dengan
seleksi poly( A) at au ber dasarkan uk uran) , sehingga
kem ungkinan unt uk m em peroleh klon spesifik j uga lebih
t inggi.
Set elah library dipersiapkan, langkah berik ut nya adalah
m engisolasi k lon rekom binan yang m engandung sek uens
genom at au gen penyandi.
Jika t er dapat infor m asi
m engenai prot ein yang disandi, m ikrosek uensing sekuens
sebagian
asam
am ino akan
m em ungkinkan
unt uk
m ensint esis oligonukleot ida berdasarkan kode genet ik.
Karena kode genet ik ada beberapa ( degeneracy) , st rat egi
ini
m enggunakan
sekelom pok
oligonukleot ida.
Oligonukleot ida dilabel radioakt if dan dihibridisasi pada k lon
library. Klon dengan sinyal posit if diisolasi dan diperbany ak.
Sekuensing fr agm en DNA yang disisipkan pada vek t or
t ersebut akan dapat m em berikan infor m asi, walaupun
hanya sebagian, m engenai gen yang dit elit i.
Kloning gen j uga dapat dilakukan t anpa m enget ahui
t erlebih dahulu inform asi m engenai prot ein yang berkait an.
St rat egi ini disebut posit ional cloning at au reverse genet ic
( Gam bar 2- 7) . Pendekat an ini m ulai dikenal pada akhir
1980an dan t elah berhasil m engident ifikasi banyak gen
t er m asuk gen penyebab cy st ic fobrosis, Duchenne m uscular
dyst rophy , polycyst ic k idney disease, dan sindrom a MEN.
Langkah per t am a t erdiri dari penet apan genet ic linkage
anat ra fenot ipe penyak it dan m arka DNA.
Hal ini
m em ungkinkan
unt uk
m enent ukan
krom osom
yang
m engandung gen kandidat . I dent ifikasi m ar ka- m arka yang
t erlet ak dekat dengan gen m enj adi t it ik awal unt uk
m elakukan chrom osom e walking at au j um ping, bergerak
m endekat i gen yang ingin diket ahui.
Met ode ini dapat
digunakan unt uk skrining DNA yang t erlet ak di ant ara
m aka- m arka
unt uk
m enget ahui adanya gen
y ang
fungsional.
Jika sat u at au beberapa kandidat gen
t erident ifikasi,
gen- gen
t ersebut
dapat
diklon
dan
disekuensing.
Langkah t erakhir adalah m enunj uk kan
bahwa gen y ang t elah diisolasi t ersebut m engandung
m ut asi yang dit urunkan ( segr egat e) bersam a- sam a dengan
penyakit .
M u t a si
Mut asi, secara luas, didefinisikan sebagai
perubahan pada sekuens prim er nuk leot ida DNA, t anpa
m em per hat ikan akibat / konsekuensi fungsionalnya. Mut asi
yang t erj adi pada sel germ inal ( germ cell) ak an
m engakibat kan adanya m ut asi pada set iap sel organism e
yang
bersangkut an,
dan
akan
dit urunkan
kepada
ket ur unannya. Beberapa m ut asi bersifat let al, sedangkan
beerapa lainnya kurang berbahaya, beberapa bahkan
m em ber ikan k eunt ungan dari segi evolusi. Mut asi som at ik,
Page 7 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Ga m ba r 2 - 7
Posit ional cloning.
Skem a garis besar
langkah- langk ah ident ifikasi suat u gen penyakit dengan
cara posit ional cloning.
t erbat as pada sekelom pok sel pada suat u j aringan,
berperan pent ing pada pem bent ukan neoplasm a. Dengan
perkecualian pada t riplet repeat s yang dapat m akin panj ang,
m ut asi biasany a bersifat st abil ( Tabel 2- 1) .
Secara st ruk t ural, m ut asi sangat bervar iasi.
Mut asi
dapat m elibat k an seluruh genom e seper t i yang t erj adi pada
t riploi, m aupun perubahan st rukt ur at au j um lah krom osom .
Delesi besar dapat m em pengaruhi bagian dari gen, seluruh
gen at au j ika beberapa gen t erlibat , m ut asi dapat berak ibat
pada sindrom a. Persilangan yang t idak seim bang anat ar a
gen- gen yang hom olog dapat m engak ibat kan m ut asi fusi
gen, sepert i pada but a warna.
Mut asi dapat j uga
m elibat kan perubahan pada beberapa at au sat u pasang
basa.
Mut asi sat u basa disebut m ut asi t it ik ( point
m ut at ion) . Analog dengan perubahan krom osom , m ut asi
t it ik m ungk in t erdir i dari subst it usi, delesi at au inser si.
Subst it usi disebut t ransisi j ik a basa purin digant ikan oleh
basa pur in lain ( AG) at au pir im idin digant ikan oleh
pirim idin lain ( CT) . Perubahan dar i purin ke pir im idin
at au sebalik nya disebut t r ansver sI .
Delesi at au insersi
m eny ebabkan pergeseran pem bacaan k odon basa yang
dit erj em ahkan m enj adi asam am ino ( shift of t ranslat ional
reading
fram e) ,
yang
biasanya
m enyebabkan
penghent ian/ st op yang lebih awal ( nonsense m ut at ion) .
Mut asi pada daerah int ron dapat m enghilangkan at au
m enim bulkan sit us awal/ ak hir pem ot ongan ( splice donor
at au splice accept or sit es) , yang m engakibat kan pot ongan
( spliced) m RNA gen yang t erm ut asi m enj adi t idak nor m al.
Mut asi j uga dapat dit em ukan pada sekuens regulat or suat u
gen dana dapat m enyebabkanberkurang at au t idak adany a
t ranskr ipsi gen yang bersangkut an.
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 8
Sout her n blot
Sout hern blot dapat
digunakan unt uk m endet eksi perubahan pada st ruk t ur gen
( m isalnya delesi, insersi, variable num ber t andem
repeat s/ VNTR) ,
at au
rest ict ion
fragm ent
lengt h
polym orphism ( RFLP) . DNA genom didigest i dengan sat u
at au beberapa enzim rest r ik si.
Hasil digest i dipisahkan
dengan gel agarose dan dit ransfer ke m em bran. Hibridisasi
DNA, yang t elah diim obilisasi, dengan probe yang dilabel
radioakt if m em ungk inkan unt uk m endet eksi fragm en
t ert ent u secar a radiografi. Sepert i t er lihat pada gam bar,
RFLP dapat m enghasilkan per bedaan panj ang fragm en yang
didet eksi.
Polim orfism e dem ik ian digunakan pada st udi
linkage unt uk m enilai apak ah suat u penyakit dit ur unk an
bersam a- sam a ( cosegregat e) dengan m arka genet ik
t ert ent u.
Pada
beber apa
sindrom a
kanker ,
predisposisi
pem bent ukan t um or dapat dit urunkan. Pada kasus ret inoblast om a, t um or berkem bang j ika kedua salinan gen
ret inoblast om a m enj adi defekt if m elalui dua kej adian
som at ik ( spor adic ret inoblast om a) at au m elalui hilangny a
Page 8 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
kedua nor m al alel secara som at is pada seorang indiv idu
dengan efek heredit er pada alel yang lain ( heredit ary
ret inoblast om a) . Two- hit m odel ini, diusulk an per t am a kali
oleh Knudson, berlak u pada beberapa sindrom a kank er .
Alel yang defekt if dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel
dan m engikut i pola dom inan, t et api pem bent ukan t um orny a
( t um or igenesis) disebabkan oleh hilangny a gen supresor
t um or yang resesif pada j aringan yang ber sangkut an. Pada
kasus lain, pem bent ukan kanker biasanya m em er luk an
defek pada beberapa gen, y ang disebut proses m ult ist ep
carcinogenesis.
Uj i m ut asi DNA m em punyai beberapa keunt ungan
dibanding analisis pada t ingkat prot ein.
DNA m udah
diisolasi, dan regulasi DNA pada berbagai j aringan t idak
berbeda, 2 karakt erist ik yang berlainan dengan prot ein.
DNA dapat diisolasi dari berbagai m acam sum ber , t er m asuk
sel darah put ih, sam pel j arigan, sel kulit dan akar ram but .
Banyak m et ode t elah dikem bangkan unt uk m enganalisis
m ut asi ( Tabel 2- 1) .
Mut asi besar, delesi, insersi,
rearrangem ent s, at au ekspansi t r iple repeat s dapat
didet eksi dengan cara Sout her n blot at au PCR.
Pada
analisis Sout hern, DNA dengan berat m olekul t inggi
didigest i dengan enzim rest riksi, m enghasilkan banyak
fragm en yang kem udian dapat
dipisahkan dengan
elek t roforesis pada gel.
Set elah DNA dit ransfer ke
m em bran, DNA dapat dinat urasi dan dihibridisasi dengan
probe yang dilabel radioakt if yang ak an m endet ek si
sekuens t ert ent u di ant ara fragm en- fragm en yang t ak
t erhit ung j um lahnya.
Per bedaan pola hibr idisasi yang
diperoleh dari Sout hern blot dapat m enunj ukkan adanya
delesi at au inser si pada DNA genom ( Gam bar 2- 8) .
Sebagai cont oh Sout hern blot dapat digunakan unt uk
m endiagnosis varian t alasem ia- di Asia Tenggara. Pada
beberapa kasus resesif aut osom , dit em ukan adanya delesi
besar pada kedua gen - globin dar i k lust er gen 30 kb pada
krom osom 1.
Karena delesi j uga m elalui gen - globin,
m aka m engak ibat kan hydrops fet alis dan k em at ian dalam
kandungan.
RT- PCR berguna j uga unt uk m endet ek si ket idakadaan
at au berkurangnya ek spresi m RNA akibat alel yang
t er m ut asi. Sk rining unt uk m enget ahui adanya m ut asi t it ik
dapat dilakuk an dengan beberapa m et ode ( Tabel- 2- 2) .
Met ode didasarkan pada m ism at ch ant ara dupleks asam
nukleat , pem isahan DNA unt ai t unggal at au ganda dengan
elek t roforesis, at au sekuensing fragm en DNA yang
diperbanyak dengan PCR. Sekuensing DNA dapat dilak ukan
secara langsung pada hasil PCR ( am plikon) at au
m enggunakan fragm en yang diklon ke dalam vekt or
plasm id. Sensit iv it as m et ode- m et ode ini bervariasi ant ar a
80 sam pai 100% . Uj i prot ein t erpot ong ( pr ot ein t runcat ion
t est / PTT) dapat digunakan unt uk m endet eksi m ut asi yang
m engakibat kan penghent ian sint esis polipept ida dini. cDNA
yang diisolasi dit ranskripsikan dan dit ranslasi secara in vit ro,
kem udian prot ein dianalisis dengan elekt roforesis gel.
Perbandingan dengan prot ein wild- t ype ( norm al) dilakuk an
unt uk m endet eksi m ut an yang t erpot ong ( t r uncat ed) .
Pendekat an ini t erut am a ber guna unt uk m endet ek si m ut asi
pada gen yang besar yang m engakibat kan hilangnya fungsi.
Ta be l 2 - 1
Con t oh Je n is M u t a si
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Page 9 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Ta be l 2 - 2
M e t ode D e t e k si M u t a si
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Page 10 of 10
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Lyrawati, D. (2004) DNA recombination and genetic techniques, transmission of human disease and
computer resources for the clinical and molecular geneticist (transl.Indonesian). Agric. Fac. Unibraw
Publ., Indonesia (ISBN 979-508-543-3).
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Page 1 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Te k nik D N A da n ge ne t ik pa da st udi
PETER KOPP AND J. LARRY JAMESON
diterjemahkan bebas (tanpa ijin) oleh D. Lyrawati
untuk membantu peserta Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Analisis DNA m olekuler t elah m enj adi bagian int egral
pada sem ua bidang spesialisasi kedokt er an.
Walaupun
genom m anusia berukuran sangat besar dan kom pleks,
nam un kem aj uan yang dicapai saat ini dalam proy ek
genom m anusia Hum an Genom e Proj ect ( HGP) t elah sangat
m eningkat kan penget ahuan kit a m engenai dasar- dasar
penyakit pada m anusia.
Analisis DNA m olek uler dan
genet ik m em berikan dam pak yang t idak sedikit di klinik
diant aranya adalah digunak annya pendek at an bar u unt uk
m endiagnosis penyak it , m endet eksi pat ogen, skr ining
fakt or
predisposisi
penyakit ,
konseling
genet ik ,
pengem bangan obat , farm akot erapi dan, unt uk beberapa
kasus, t erapi gen.
Lebih dari 3000 penyakit m anusia diket ahui disebabkan
oleh adanya cacat pada sat u gen t unggal dan yang
dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel.
Selain it u,
banyak proses penyakit dipengaruhi oleh lat arbelakang
genet ik ( genet ic background) si penderit a.
Seringkali
dit em ui adanya int eraksi yang kom plek s ant ara fakt or
lingkungan dan predisposisi genet ik . Banyak diant aranya
( m isalnya hipert ensi, peny akit ar t er i j ant ung, asm a,
diabet es) t er m asuk golongan penyakit yang m enj adi
m asalah kesehat an um um ut am a dan unt uk m enget ahui
pat ogenesis penyakit t ersebut m asih m er upakan t ant angan
yang sangat besar.
Bent uk lain dari penyakit genet ik
adalah sindrom a yang disebabkan oleh aberasi krom osom
dan sindrom a kanker yang m enurun, sert a defek pada DNA
sel som at ik yang j uga t erj adi pada kanker.
D N A da n t r a n sm isi in for m a si ge n e t ik . Makrom olek ul
DNA unt ai ganda m engandung infor m asi genet ik .
DNA
t erdiri dari dua unt ai yang saling kom plem en dan m elilit
m em bent uk heliks ganda ( double helix ) . Set iap unt ainy a
t erdiri dar i em pat m acam basa yang t erat ur linear: adenin
( A) , t im in ( T) , cyt osine ( C) dan guanin ( G) . Uruan basabasa t ersebut yang akan m em bent uk sekuens DNA. Kedua
unt ai DNA t erikat m elalui ikat an hidrogen yang t erbent uk
ant ara basa- basa kom plem ent er G dengan C, at au A
dengan T. Kar ena rant ai nuk leot ida dalam DNA unt ai ganda
berdasarkan sifat kom plem en yang sangat ket at , set iap
unt ai dapat bert indak sebagai cet akan unt uk m em bent uk
unt ai baru. Replikasi sem ikonservat if ini akan m enj am in
bahwa t iap sel yang m em belah akan m enerim a salinan DNA
yang ident ik.
Unt uk suat u gen, pada bagian sekuens yang m enyandi
( coding sequence) , t iap set yang t erdir i dari 3 basa DNA
akan
m em bent uk
kodon,
kode
genet ik
unt uk
m enginkorporasikan salah sat u dari 20 asam am ino yang
t erdapat dalam prot ein ( Gam bar 2- 1) . Dengan dem ik ian
sat u seri kodon akan m enet ukan asam am ino yang ak an
disint esis m enj adi sat u polipept ida t ert ent u.
I nst r uk si
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
penyandi- prot ein pada DNA y ang m enyandi suat u gen akan
dit ranskripsikan m enj adi m RNA. m RNA ini dit ranslokasik an
dari int i ke sit oplasm a, t em pat t erj adinya t ranslasi oleh
ribosom , dit erj em ahkan m enj adi unt aian asam am ino
( sint esis prot ein) .
Penj elasan yang m endet il m engenai t eknik genet ik
m olekuler t idak akan dibahas pada bab ini, sedangk an
beberapa konsep dasar dan t eknik yang esensial dan
berguna unt uk analisis genom dan penyak it genet ik t elah
dibahas pada bab Teknik Rek om binan.
Uk u r a n da n or ga n isa si ge n om m a n u sia .
Genom
disandi oleh polim er DNA yang t erpisah m enj adi beberapa
segm en, yang disebut krom osom . Pada m anusia, set iap sel
som at ik bersifat diploid dan m engandung 2 set 23
krom osom . Seorang anak m enerim a sat u kopi t iap
krom osom dar i ibu, dan sat u kopi dari bapak. Duapuluh
dua krom osom aut osom m em punyai 2 kopi, dan m irip baik
pada wanit a m aupun pr ia. Krom osom X dan Y berbeda.
Hanya sebagian kecil pada lengan pendek dari krom osom X
dan krom osom Y, pseudoaut osom al region ( PAR) , yang
m em punyai hom ologi. Per em puan m em punyai 2 krom osom
X ( XX) , sedangkan lak i- laki heerogam et ( XY) . DNA sat u
krom osom at au haploid t erdiri dari 3 x 109 pb ( 3000Mb) ,
dengan
krom osom
t erk ecil
m engandung
~ 50
Mb
( krom osom 21) dan t erbesar ~ 263 Mb ( krom osom 1) .
Sat u gen t erdiri dar i sekuens DNA regulat or, sekuens
penyandi ( ekson) dan sekuens int ron. Sekuens suat u gen
yang m enyandi prot ein t erlet ak pada ek son, yang dipot ong
dan disam bung kem bali ( splice) m em bent uk m RNA.
Berdasarkan
j um lah
m RNA
yang
diekspresik an,
diperk irakan genom m anusia m engandung 70.000 sam pai
10.000 gen. Ukuran dan st rukt ur gen sangat bervar iasi.
Gen- gen kecil t erdiri dari beberapa rat us pasangbasa,
sedangkan gen t erbesar yang diket ahui saat ini, gen pada
krom osom X yang m enyandi prot ein dist ropin, m engandung
2 x 106 pb dengan lebih dari 100 int ron. Mut asi pada gen ii
m engakibat kan 2 kondisi klois yang berbeda, Duchene
Muscular Dyst r ophy ( DMD) dan Becker Muscular Dist rophy
( BMD) .
Beberapa daerah krom osom , t erut am a daerah
dekat sent rom er , t idak m engandung gen, sedangk an
daerah lain m engandung banyak sekali gen. Terkadang,
gen berk elom pok m enj adi k lust er di m ana beberapa salinan
gen dengan fungsi yang m irip berdekat an sat u sam a lain.
Cont oh klust er gen adalah gen horm on per t um buhan, at au
gen yang m enyandi globin dan . Tapi ada j uga, gen- gen
dengan fungsi yang ham pir sam a t er let ak pada krom osom
yang berbeda.
Gen yang diekspresi hanya ~ 20% dari t ot al genom .
Sebagian besar DNA genom bukan m erupakan salinan se-
Page 2 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
segm en krom osom dari ibu ( m at ernal) m engalam i
rekom binasi dengan krom osom hom olog dari ayah
( pat ernal) m em bent uk krom osom hibrid m enggant ikan
krom osom asal. Rekom binasi dem ik ian sering t erj adi, dan
nam pak nya t erdapat sat u chiasm a pada t iap lengan
krom osom . Set elah pert ukaran ini selesai, krom osom ak an
disegregasikan secara acak. Karena ada 23 krom osom ,
23
m aka ada 2
( > 8 j ut a) kem ungkinan kom binasi
krom osom .
Bersam a dengan pert ukaran yang t erj adi
selam a r ekom binasi, segregasi krom osom m enghasilkan
diversit as ( keanekaragam an) genet ik gam et yang sangat
t inggi.
Set elah pem belahan m eiosis pert am a, yang
m enghasilkan dua sel ( 2n) , k edua krom at id pada t iap
krom osom ak an t erpisah selam a proses pem belahan
m eiosis k e dua sehingga ak an dihasilkan 4 gam et yang
m asing- m asing m em ilik i sat u krom at id ( 1n) .
Ga m ba r 2 - 1 Kode genet ik.
Kodon suat u asam am ino
t erdiri dari t iga nukleot ida ( t riplet ) . Sat u asam am ino dapat
disandi oleh beberapa kodon yang berbeda ( degener asi
kode genet ik) . Sekuens unt uk kodon st ar t dan kodon st op
t er m asuk j uga kode genet ik.
kuen t unggal, m elainkan t erdiri dari sekuen berulang
dengan berbagai t ipe.
Short int erspersed repet it ive
elem ent s ( SI NE: 100- 500 pb) dan long int erpersed
repet it it ive elem ent s ( LI NE: 6000- 7000 pb) t ersebar pada
genom . Bent uk lain sekuens berulang, m ik rosat elit , t erdir i
dari 10- 50 salinan ber ulang dari sekuens y ang sederhana.
Fungsinya belum j elas, t api sekuens dem ikian dapat
digunakan sebagai alat unt uk pem et aan genet ik dan linkage.
M it osis da n m e iosis. Unt uk keperluan pert um buhan
dan perkem bangan j aringan, sel eukar iot ik m engalam i
sik lus pem belahan sel dan diferensiasi. Tiap pem belahan
sel ( m it osis) m enghasilkan 2 sel diploid ( set krom osom 2n)
yang ident ik secara genet ik . Pada t ahap awal m it osis t iap
krom osom parent al diduplik asi, m enghasilkan 2 pasang
krom at id ( 2n4n) . Krom osom kem udian m em endek dan
m em bran int i m enghilang.
Pada m et afase, krom osom
t ersusun pada bagian ek uat orial. Kedua krom at id yang
kem bar berada pada sent r om er, m elekat pada spindel
m it ot ik. Kem udian krom at id akan berpisah dan m igrasi ke
uj ung yang saling berlawanan.
Set elah m em bran int i
t erbent uk m engelilingi m asing- m asing krom at id, sel
m em belah dan t erbent uklah dua sel diploid.
Gam et , oosit dan sper m , m engandung hany a sat u salinan
unt uk t iap krom osom , sat u set krom osom haploid. Ket ika
sper m m em fer t ilisasi sel t elur , kedua set kr om osom haploid
bergabung, m em bent uk sat u zigot yang m engandung 2
salinan
unt uk
t iap
krom osom
( diploid
at au
2n) .
Pem bent ukan gam et haploid dari sel germ inal diploid
( oogonia, sperm at oonia) t erj adi m elalui proses m eiosis,
yang t erdir i dari 2 pem belahan sel. Selam a pem belahan
m it ot ik pert am a, t erj adi pert ukaran ant ara krom osom krom osom yang hom olog sehingga m enghasilkan gam et
yang secara genet ik berbeda.
Set elah pem bent ukan 2
krom at id ( 2n4n) , krom osom yang hom olog berpasangan
dan m em bent uk chiasm at a ( Gam bar 1- 2) . Salah sat u dari
kedua krom at id dapat berpasangan dengan krom osom yang
hom olog dan m engalam ai proses crossing- over, di m ana
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 2 Crossing- ov er dan rekom binasi.
Selam a
pem bent ukan chiasm a, salah sat u dari kedua krom at id
pada sat u krom osom berpasangan dengan sat u krom at id
krom osom hom olog. Rekom binasi genet ik m elalui crossingover m enghasilkan segm en krom osom rekom binan dan
nonrekom binan pada gam et .
Rekom binasi dem ik ian
seringkali t erj adi, dan bersam a- sam a dengan segr egasi
acak krom osom m at ernal dan pat ernal, m aka ak an
m engakibat kan keanekaragam an genet ik pada gam et .
Ge n ot ip da n fe n ot ip.
Sat u segm en DNA yang
dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel ( m isalnya gen)
disebut lokus ( locus, j am ak: loci) . I nform asi genet ik pada
sat u lokus gen disebut sebagai genot ip. Perbedaan urut an
DNA, yang berart i j uga per bedaan genot ip, disebut alel
( allele) . Jika dua alel ada pada sat u lokus, m aka ada t iga
kem ungkinan genot ip. Genot ipe bisa ident ik ( hom ozigot )
unt uk salah sat u dar i kedua alel t ersebut , at au bisa t erdiri
dari kom binasi kedua alel ( het erozigot ) . Jik a t erdapat lebih
dari dua alel, m aka j um lah k em ungkinan genot ip j uga ak an
m eningkat .
Fenot ip adalah karakt erist ik yang dapat dilihat at au
diukur pada sat u individu. I st ilah w ild t y pe dipakai unt uk
m enerangkan/ m eruj uk pada gen yang norm al, t er m asuk
varian alel yang berbeda.
Genot ip m ut an t idak selalu
m engubah fenot ip. Jika fenot ip alel m ut an dapat dikenali
pada kondisi hom ozigot , berart i alel dem ikian adalah resesif.
Jika kedua alel dapat dikenali pada kondisi het erozigot ,
berart i alel- alel bersifat kodom inan ( m isalnya alel A dan B
pada sist em golongan darah ABO) .
Keanekaragam an genet ik yang t ersebar luas di alam
t erlihat pada adanya variasi fenot ip ant ar , dan dalam , grup
Page 3 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
et nik yang berbeda.
Polim orfism e biokim ia, yang t idak
langsung dapat dianggap sebagai fenot ipe, j uga dapat
t erdet ek si pada banyak prot ein nor m al yang t erdapat pada
berbagai bent uk pada suat u populasi.
Varian dem ikian
dapat dij elaskan karena adanya m ult ipel alel pada t ingk at
gen. Polim orfism e dem ikian ant ara lain t er lihat pada sist em
golongan darah ABO.
Hasil analisis genet ika m olek uler
m enunj ukkan bahwa t ernyat a variasi genet ik sangat
banyak. Set iap 1 dari 200 pb pada genom m anusia bersifat
polim orfik , t erut am a pada daerah genom yang t idak
m enyandi
( noncoding) ,
t erm asuk
di
ant aranya
perubahan/ per bedaan sat u pasangan basa dan variasi
sekuens
ber ulang
( repet it ive
sequence) .
Suat u
polim orfism e dapat m engubah sekuens prot ein j ika
polim orfism e t erlet ak pada daerah penyandi ( coding region)
dan subst it usi t ersebut m engubah asam am ino yang disandi
oleh kodon t ert ent u.
Polim orfism e dit urunkan secara
Mendel, sat u sifat yang ber guna unt uk st udi linkage dan
unt uk aplikasi forensik.
Polim orfism e m ungk in t idak m em pengar uhi fenot ip, at au
hanya berperan pada keanekaragam an populasi dan t idak
berasosiasi dengan penyakit . At au, polim orfism e m ungk in
m em pengaruhi kerent anan t erhadap, at au ekpresi suat u
penyakit t er t ent u. Keanekaragam an genet ik yang t inggi
akan m eningkat kan kem am puan suat u populasi unt uk
beradapt asi
t erhadap
perubahan
lingkungan,
dan
m enurunkan r esiko penyak it resesif.
H e t e r oge n it a s ge n e t ik Het erogenit as genet ik adalah
perubahan fenot ip yang nam paknya m irip walaupun defek
( cacat ) t erj adi pada gen yang berbeda.
Misalny a,
het erogenit as genet ik pada Mat ur it y - Onset Diabet es of
Young ( MODY) , yang dapat disebabkan oleh defek pada gen
glukokinase, at au pada gen yang m enyandi HNF- 1
( Hepat ocy t e nuclear fact or- 1) at au HNF- 4.
Het erogenit as alel at au int ragen adalah perubahan
genot ip pada lokus yang sam a yang m engakibat k an
fenot ipe yang sam a at au m ir ip. Pada cy st ic fibrosis, lebih
dari 600 m ut asi t elah diket ahui pada gen yang m enyandi
prot ein regulat or kondukt ans t ransm em bran cyst ic fibrosis
( cyst ic fibrosis t ransm em brane condunt ance regulat or
prot ein, CFTR) . Pada het erogenit as alel, st udi linkage ak an
m engident ifikasi
lokus
y ang
sam a.
Sebaliknya,
het erogenit as genet ik m enghasilkan fenot ip yang m irip, t api
analisis linkage akan m engident ifikasi lokus- lokus yang
berbeda pada keluarga yang berbeda.
Re st r ict ion e n don u cle a se.
Endonuk lease rest r iksi
adalah enzim bakt eri yang m engenal dan m em ot ong DNA
pada sekuens nukleot ida yang t er t ent u, disebut sit us
rest r iksi ( lihat bab Teknik Rekom binan) .
Sit us rest r iksi
yang paling banyak adalah sekuens 4- 6 pb. Banyak dari
sekuens ini bersifat palindrom ik ( sim et ri pada dua aksis) .
Pada suat u fragm en DNA secara acak enzim rest r iksi yang
m engenal sekuens 4- basa akan m enem ukan t arget
4
sekuensnya set iap 4 ( 256) basa, sedangk an pem ot ong 66
basa set iap 4 ( 4036) basa.
Pem ot ongan yang t erj adi
dapat m enghasilkan DNA uj ung t um pul ( blunt end) at au
uj ung pendek ‘runcing’ unt ai t unggal DNA ( cohesive/ st icky
end) .
Kem am puan m enggunakan enzim endonuklease
rest r iksi sangat pent ing unt uk m anipulasi DNA, yang ant ar a
lain dapat diaplikasikan unt uk analisis Sout hern dan kloning
fragm en DNA.
Jika variasi sekuens m engak ibat k an
hilangnya at au sebaliknya t im bulnya sit us rest r iksi, m aka
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
disebut polim orfism e panj ang fragm en r est r iksi ( RFLP) .
Marker polim or fik ini dapat digunakan unt uk st udi linkage.
PCR Polym erase chain react ion ( PCR) , dik enalkan pada
1985, t elah m engubah cara m enganalisis DNA secara
berm akna, dan t elah m enj adi dasar biologi m olekuler dan
analisis genet ik. PCR m em ungkinkan unt uk m em perbany ak
segm en DNA t ert ent u sam pai j ut aan kali lipat . Pada t ahap
pert am a, cet akan DNA unt ai ganda ( dsDNA) didenat ur asi
dengan pem anasan ( Gam bar 2- 3) . Tahap kedua, pr im er
oligonk leot ida sint et is t ert ent u sek it ar 20 pb dit em pelkan
( anneal)
pada kedua sisi fragm en DNA.
Unt ai
kom plem ent er yang t erlet ak diant ara kedua prim er
kem udian disint esis dengan DNA polim erase. Prosedur ini
biasanya diulang sek it ar 30 kali m enggunakan blok
pem anas ot om at is. Pada t iap siklus, sem ua dsDNA y ang
ada dari siklus sebelum ny a bert indak sebagai cet akan.
Karena pada akhir t iap sik lus j um lah DNA m enj adi dua k ali
lipat , m aka j um lah DNA yang direplikasi akan m eningk at
secara eksponensial.
Ga m ba r 2 - 3 Polym erase Chain React ion ( PCR) . PCR
m enghasilkan salinan segm en DNA t er t ent u dalam j um lah
banyak. DNA unt ai ganda ( double st randed, ds) didenat urasi, prim er oligonukleot ida sint et is spesifik sepanj ang 20
basa dit em pelkan ( annealed) pada kedua sisi segm en yang
dikendaki, dan unt ai kom plem ent er disint esis oleh DNA
polim erase yang t ahan panas. Pada t iap siklus, sem ua
dsDNA yang ada dari sik lus sebelum nya bert indak sebagai
cet akan. Kar ena pada akhir t iap siklus j um lah DNA m enj adi
dua kali lipat , m aka j um lah DNA yang direplikasi akan
m eningkat secara eksponensial.
Page 4 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Rever se- t ranscript ase- PCR ( RT- PCR) adalah salah sat u
st rat egi lain y ang pent ing unt uk analisis m olekuler. Mat er i
awal yang dipakai dalam hal ini adalah m RNA.
m RNA
t ersebut dit ranskrip- balik m enj adi cDNA dengan enzim
reverse t ranscript ase ( sint esis unt ai- pert am a) . Kem udian,
segm en cDNA dapat diperbanyak dengan cara PCR seper t i
yang t elah dit erangkan sebelum nya.
Se k u e n sin g
DNA
Beberapa
prot okol
t elah
dikem bangkan unt uk m enent ukan sekuens nukleot ida DNA.
Pada dua m et ode t radisional ( Maxam - Gilbert dan Sanger ) ,
cet akan DNA digunakan unt uk m em buat fragm en DNA,
yang berbeda ukuran.
Menggunakan elekt roforesis gel
resolusi t inggi, m olekul DNA dipisahkan pada t ingk at
resolusi sat u basa, sehingga sek uens cet akan DNA dapat
diperk irakan.
Sekuensing Maxam - Gilbert m em anfaat k an
zat kim ia yang m em ot ong DNA pada basa t ert ent u,
sehingga dihasilkan fragm en- fragm en dengan panj ang yang
berbeda.
Pada sek uensing m et ode Sanger, rant ai DNA
dengan berbagai panj ang dibuat dengan m enggunak an
dideoksinukleot ida unt uk m enghent ikan ext ension DNA oleh
DNA polim erase ( chain t er m inat ion m et hod) .
Dengan
m engelekt roforesis 4 reak si secara paralel ( sat u unt uk t iap
dideoksinukleot ida) dan m em isahkan pr oduk ext ension
secara elek t roforesis pada gel poliakrilam id, m aka dapat
dilak ukan penent uan sekuens DNA cet akan.
Prosedur
ot om at is biasanya didasarkan
pada
m et ode chain
t er m inat ion dan m enggunakan dideoksinukleot ida at au
prim er yang dilabel fluorescent , kem udian diikut i dengan
analisis sek uens langsung dengan kom put er .
Cont oh
sekuensing dapat dilihat pada Gam bar 2- 4.
Saat ini sedang dikem bangk an t ek nologi sekuensing DNA
yang lebih cepat , lebih sensit if dan lebih hem at biaya.
Met odologi yang diek splorasi ant ara lain det eksi basa yang
dilabel fluorescent pada flow cyt om et ry, pem bacaan
langsung sek uens basa unt ai DNA m enggunakan scanning,
t unneling,
at au
m ikroskopi
at om ic
force,
analisis
spekt roskopi m assa, dan analisis sekuens m enggunak an
chips
DNA
yang
m engandung
banyak
koleksi
oligonukleot ida unt uk dapat m enghibridisasikan DNA.
Sit oge n e t ik da n Flu or e sce n t in Sit u H ibr idiza t ion
( FI SH ) Krom osom dapat dicat dan dilihat m enggunak an
m ikroskop cahaya. Krom osom m enunj ukkan pola pit a yang
khas elap dan t erang yang m enggam barkan variasi regional
kom posisi DNA.
Perbedaan ukuran pola pit a ( banding)
m em ungkinkan kit a unt uk m em bedakan ke22 krom osom
ot osom dan k rom osom sex unt uk m em nent ukan karyot ip
seorang
individu.
Analisis
sit ogenet ik
ini
dapat
m enunj ukkan adanya ket idaknorm alan pada krom osom ,
t er m asuk adanya krom osom yang hilang at au sebaliknya
bert am bah ( t erlalu banyak ) , delesi besar, insersi, at au
t ranslokasi.
Fluorescent in sit u hibridizat ion ( FI SH) m erupakan
gabungan dari sit ogenet ik konvensional dan hibr idisasi DNA.
Krom osom dipersiapkan dari sel berint i dan dihibr idisasi
dengan probe DNA yang dilabel fluorochrom e yang spesifik
unt uk berbagai lokus. Aberasi num erik dan st ruk t ur dapat
didet eksi dengan m enganilisis pola fluor esensi/ pendar an.
FI SH m ulai m enggant ik an cara analisis sit ogenet ik
konvensional. Resulusi FI SH yang t inggi berguna unt uk
diagnosis dan j uga unt uk m em buat pet a krom osom . Jika
digunakan krom osom
int erfase,
probe FI SH dapat
m eningkat kan resolusi pet a sam pai ~ 100.000 pb.
Pe m e t a a n ge n
Karena ukuran dan sedem ikian
kom pleksnya genom m anusia, unt uk m enget ahui ident it as
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 4 Sekuensing DNA ot om at is m enggunakan
dideoksinukleot ida yang dilabel fluorescent .
Diant ar a
banyak m et ode sek uensing DNA, m et odologi chain
t er m inat ion adalah prosedur yang paling banyak dipakai,
t er m asuk penggunaan prosedur ot om at isnya yang t er us
m eningkat .
Prosedur
ot om at is
m enggunakan
dideoksinukleot ida ( at au prim er ) yang dilabel fluor escent
dan analisis sekuens dilakukan langsung m elalui kom put er .
Prim er sek uensing dit em pelkan pada cet akan DNA.
Dideoksinuk leot ida yang m engandung label fluorescent
yang berbeda dit am bahk an ke dalam reak si unt uk
m enghent ikan polim er isasi DNA.
Dideoksinuk leot ida
berkom pet isi dengan deoksinukleot ida ( nukleot ida nor m al)
pada reaksi ext ension DNA, j ika dideoksinukleot ida yang
t erinkorporasi pada saat polim er isasi/ ex t ension m aka r eaksi
polim er isasi akan berhent i karena nuk leot ida baru t idak
dapat dit am bahkan pada uj ung 3’nya.
Hasil reaksi ini
dipisahkan dengan elekt roforesis, yang kem udian langsung
dianalisis dengan kom put er .
dan lokasi suat u gen t idaklah m udah. Pet a seluruh genom
sekarang sedang dibuat unt uk m em udahkan m encari lokasi
suat u gen.
Berbagai m acam pet a ( genet ik dan fisik)
m enggam barkan urut an m arka/ pet anda dan j arak ant ar
m arka- m arka t ersebut pada krom osom . Salah sat u t uj uan
Hum an Genom e Proj ect adalah unt uk m eningkat kan
resolusi pet a- pet a t er sebut sam pai lokasi unt uk set iap gen
diket ahui dengan t epat .
Page 5 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Ga m ba r 2 - 5 Pet a kandungan STS Ada at au t idaknya STS,
frgam en pendek DNA yang diket ahui sekuensnya, dapat
dit ent ukan dalam berbagai klon krom osom ragi t iruan
( yeast art ificial chrom osom es, YACs) . Perbandingan ant ara
sekuens STS dalam beberapa klon YAC m em ungk ink an
unt uk m enent ukan urut annya.
Pet a genet ik m enent ukan posisi relat if gen at au lokus
berdasarkan frekuensi rekom binasi r elat if t erhadap lokuslokus lain pada krom osom y ang sam a. Hal ini dinyat ak an
sebagai unit rekom binasi at au cent iMorgans ( cM) . Pet a
genet ik ~ 40% lebih panj ang pada krom osom yang diperoleh
dari wanit a karena frekuensi rekom binasi yang lebih t inggi
selam a pem bent ukan sel t elur ( oocyt e) . Sekuen polim orfik
apapun yang dapat diikut i pola penurunannya berguna
unt uk pem et aan. Salah sat u cont oh m arka yang berguna
adalah RFLP dan m ikrosat ellit e repeat s.
Pet a genet ik
kem udian disusun berdasarkan st udi linkage yang m enguj i
seberapa sering dua m ark a dit urunkan bersam a- sam a.
Lokasi krom osom at au gen yang bert anggung j awab unt uk
suat u penyakit yang m enur un dapat dit ent ukan dengan
m engikut i pola penurunan m arka DNA.
Posisi lokus- lokus pada pet a fisik dit unj ukkan dengan
nilai absolut .
Berbagai pet a fisik berbeda t ingkat
resolusinya. Pet a sit ogenet ik at au krom osom m enent ukan
posisi relat if lokus genet ik pada pit a krom osom khas yang
t eram at i di bawah m ikrokop cahaya.
Pet a cDNA
m em ungkinkan unt uk m elakukan analisis daerah genom
yang diek spresikan. Set elah cDNA disint esis dari m RNA
m enggunakan reverse t ranscr ipt ase, asal cDNA dapat
dipet akan pada daerah krom osom t er t ent u dengan cara
hibr idisasi. Sequence- t agged sit es ( STS) adalah segm en
pendek DNA y ang diket ahui lokasinya pada pet a genet ik.
STS dapat digunakan unt uk koleksi fragm en DNA yang
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 6 Analisis linkage pada m ult iple endocr ine
neoplasia t ype 1 ( MEN- 1) ( A) . Sk em a krom osom m anusia
11 yang m enggam barkan posisi gen MEN- 1 pada pit a q13.
Pada individu m anapun, t erdapat alel dari bapak ( pat er nal)
dan ibu ( m at ernal) unt uk MEN 1.
Mar ka m ikrosat elit
hipot et is A dan B dit unj ukkan di dekat lokus MEN 1. Marka
A lebih dekat pada gen MEN 1. Genot ipe didefinisik an
berdasarkan j um lah ulangan pada m ikrosat elit , sedem ikian
rupa sehingga alel bapak ( pat ernal) adalah ‘3- 4’ dan alel
ibu ( m at ernal) adalah ‘2- 2’. Berdasarkan pedigr ee ( at au
sekuensing DNA kalau ada) , genot ipe 3- 4 t erlihat
berhubungan ( link) dengan gen MEN 1.
( B) .
Silsilah
keluarga yang penderit a MEN- 1.
Alel anggot a keluarga
dit andaidengan genot ipe berdasarkan m ik rosat elit pada A
dan B.
Penyakit dibawa oleh anggot a keluarga yang
m em punyai alel ‘3- 4’ ( t ebal) .
Baik penderit a m aupun
pem baw a dit andai dengan ar sir. Per hat ikan bahwa laki- laki
pada generasi ke I I , yang bukan m erupakan bagian dari
keluarga yang asli, j uga m em punyai ale ‘3- 4’, t et api t idak
m enderit a, hal ini m enunj ukkan bahwa genot ipe khusus ini
hanya berhubungan ( link) unt uk sat u keluarga ini, t idak
unt uk populasi um um .
diklon ke dalam yeast ar t ificial chrom osom es ( YACs) . Ada
at au t idak nya STS t er t ent u pada suat u fragm en klon daapt
dibandingkan dengan YACs lain unt uk m engident ifikasi k lon
yang overlap.
Dengan cara ini DNA y ang berdekat an
( cont igs) dapat dikarakt erisasi ( Gam bar 2- 5) . Pet a fisik
dengan resolusi t inggi akan dapat m enunj ukkan sekuens
DNA kom plit pada t iap krom osom dalam genom m anusia.
Lin k a ge
Linkage genet ik m erupakan dasar unt uk
penyusunan pet a genet ik, dan digunakan unt uk m endet ek si
gen baru dengan cara posit ional cloning.
Linkage j uga
digunakan unt uk m em perkir akan penurunan/ t ransm isi gen
Page 6 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
penyakit t er t ent u. Syarat unt uk analisis linkage adalah
adanya berbagai polim orfism e sek uens, m isalnya RFLP,
perbedaan j um lah repeat s berdekat an ( v ariable num ber of
t andem repeat s/ VNTR) , aTau m ikrosat elit , yang digunakan
unt uk m em bedakan asal alel ( parent al origin) . Lokus gen
pada kroosom orangt ua dapat m engalam i r ekkom binasi
at au t et ap ( nonrecom binant ) . Frekuensi rekom binasi yang
t eram at i ant ar a dua lokus m erupakan fungsi dari j arak
ant ar lokus dan dinyat akan sebagai cent iMorgan ( cM) . Jik a
frekuensi rekom binasi ant ar a dua lokus adalah 1% , m aka
kedua lokus t ersebut dikat ak an berj arak 1 cM ( 1 cM adalah
~ 1Mb DNA) . Karena frek uensi rekom binasi m eningkat
sesuai dengan j arak genet ik, m aka m ak in dekat j arak ant ar
dua lok us berart i m ak in t inggi kem ungkinan bahwa
keduanya dir urunkan secara bersam a- sam a ( genet ic
linkage) .
Sat u set m arka yang sangat berdekat an dan
dit urunkan bersam a- sam a akan m em bent uk haplot ype.
Lokus DNA diident ifikasikan dengan nom enklat ur spesifik.
Misalnya, lok us D7S525 berart i krom osom m anusia 7,
segm en 525, dan t er let ak pada lengan pendek krom osom 7.
Unt uk m engident ifikasi lokus krom osom yang dit urunkan
( segr egat e) bersam a- sam a suat u penyak it , perlu dilakukan
penent uan genot ipe DNA sam pel dari sat u at au lebih silsilah
keluarga ( pedigree) .
Set elah it u, kit a akan dapat
m enent ukan apakah m ark a alel t ert ent u dit urunk an
bersam a- sam a ( cosegregat e) dengan peny akit . Jika pada
suat u st udi k eluarga digunakan sat u seri m arka genet ik
unt uk m enet apkan linkage suat u fenot ip penyakit , m ak a
m arka- m arka yang dekat dengan gen penyakit ak an
m em punyai k em ungkinan lebih k ecil unt uk m engalam i
rekom binasi dan akan m em peroleh nilai linkage yang lebih
t inggi. Dat a y ang diperoleh dari karakt erisasi banyak lok us
kem udian dianalisis dengan program kom put er. Link age
biasanya dinyat akan sebagai nilai Lod ( logarit hm of odds) ,
yang m erupak an rasio kem ungkinan bahw a suat u penyakit
dan m arka t er t ent u m em punyai hubungan ( linked) . Nilai
Lod dinyat ak an sebagai logarit m a dasar 10 yang
m enunj ukkan bahwa angka posit if berart i berhubungan
( linkage) dan angka negat if berar t i t idak berhubungan
( nonlinkage) . Nilai Lod + 3 ( 1000: 1) biasanya dianggap
m enunj ukkan adanya linkage, sedangkan nilai - 2 berart i
t idak ada linkage.
Cont oh penggunaan analisis linkage dit unj ukkan pada
Gam bar 2- 6.
Dalam kasus ini, gen penyakit ot osom al
dom inan, m ult iple endocrine neoplasia t ype 1 ( MEN- 1) ,
diket ahui ber lokasi pada krom osom 11q13.
Marka
m ikrosat elit polim orfik hipot et is
berada cukup dekat
dengan gen MEN- 1, yang m enyandi prot ein m enin ( saat ini
belum dik et ahui fungsinya) . Pada pedigree t er lihat pada
generasi I kak ek ( penderit a) m em bawa alel 3 dan 4 pada
krom osom dengan gen MEN- 1 t er m ut asi dan alel 2 dan 2
pada krom osom 11 lainnya.
Sesuai dengan linkage
genot ipe 3/ 4 pada lokus MEN- 1, pada generasi I I anak lakilakinya j uga pender it a, sedangkan anak perem puannya
( yang m ewarisi genot ip 2/ 2 dari ayahnya) bukan pender it a.
Pada generasi ke t iga, t ransm isi genot ipe 3/ 4 m enunj uk kan
resiko t erj adinya MEN- 1, dengan anggapan t idak t erj adi
rekom binasi genet ik ant ara alel 3/ 4 dan gen MEN- 1. Jika
m ut asi spesifik dalam gen MEN- 1 dapat diident ifikasi dalam
keluarga t ersebut , m aka t ransm isi m ut asi it u sendir i dapat
diik ut i, dengan dem ikian dapat m enghilangkan keraguan
yang disebabk an oleh adany a rekom binasi.
Klon in g ge n DNA dapat diperbanyak dengan kloning
fragm en DNA ke dalam vekt or yang sesuai yang dapat
dipropagasikan ke dalam sel host . Vek t or- vekt or t ersebut
ant ara lain m olekul DNA yang diperoleh dari virus, bakt er i,
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
at au ragi yang dapat m elakukan replikasi t anpa t ergant ung
pada genom sel host . Set elah vekt or dan DNA yang ak an
disisipkan didigest i dengan enzim rest r iksi, vekt or dan DNA
dapat digabung m enggunak an DNA ligase. Vekt or yang
m em bawa fragm en kem udian dipindahkan ke dalam sel
host ( bak t eri, ragi at au sel eukarit ik) unt uk ber eplikasi.
Dengan cara ini dapat diper oleh sej um lah besar DNA unt uk
st udi ekperim ent al lebih lanj ut .
Manipulasi
dem ikian
dapat
dilakukan
unt uk
m em perbanyak fragm en DNA t unggal, at au unt uk m em buat
library di m ana sem ua fragm en yang berasal dari DNA
genom akhirnya akan dir epresent asikan sebagai koleksi
koloni. Pada prinsipnya library genom adalah fragm en dar i
seluruh genom yang diklon. Library genom j uga dapat
dibuat dar i krom osom t unggal yang t elah diseleksi
m enggunakan fluorescence- act ivat ed cell sort ers ( FACS) .
Library cDNA dapat dibuat m enggunakan m RNA j aringan
t ert ent u. Beberapa m odifikasi dapat dilakukan unt uk
m eningkat kan j um lah m RNA spesifik ( m isalnya dengan
seleksi poly( A) at au ber dasarkan uk uran) , sehingga
kem ungkinan unt uk m em peroleh klon spesifik j uga lebih
t inggi.
Set elah library dipersiapkan, langkah berik ut nya adalah
m engisolasi k lon rekom binan yang m engandung sek uens
genom at au gen penyandi.
Jika t er dapat infor m asi
m engenai prot ein yang disandi, m ikrosek uensing sekuens
sebagian
asam
am ino akan
m em ungkinkan
unt uk
m ensint esis oligonukleot ida berdasarkan kode genet ik.
Karena kode genet ik ada beberapa ( degeneracy) , st rat egi
ini
m enggunakan
sekelom pok
oligonukleot ida.
Oligonukleot ida dilabel radioakt if dan dihibridisasi pada k lon
library. Klon dengan sinyal posit if diisolasi dan diperbany ak.
Sekuensing fr agm en DNA yang disisipkan pada vek t or
t ersebut akan dapat m em berikan infor m asi, walaupun
hanya sebagian, m engenai gen yang dit elit i.
Kloning gen j uga dapat dilakukan t anpa m enget ahui
t erlebih dahulu inform asi m engenai prot ein yang berkait an.
St rat egi ini disebut posit ional cloning at au reverse genet ic
( Gam bar 2- 7) . Pendekat an ini m ulai dikenal pada akhir
1980an dan t elah berhasil m engident ifikasi banyak gen
t er m asuk gen penyebab cy st ic fobrosis, Duchenne m uscular
dyst rophy , polycyst ic k idney disease, dan sindrom a MEN.
Langkah per t am a t erdiri dari penet apan genet ic linkage
anat ra fenot ipe penyak it dan m arka DNA.
Hal ini
m em ungkinkan
unt uk
m enent ukan
krom osom
yang
m engandung gen kandidat . I dent ifikasi m ar ka- m arka yang
t erlet ak dekat dengan gen m enj adi t it ik awal unt uk
m elakukan chrom osom e walking at au j um ping, bergerak
m endekat i gen yang ingin diket ahui.
Met ode ini dapat
digunakan unt uk skrining DNA yang t erlet ak di ant ara
m aka- m arka
unt uk
m enget ahui adanya gen
y ang
fungsional.
Jika sat u at au beberapa kandidat gen
t erident ifikasi,
gen- gen
t ersebut
dapat
diklon
dan
disekuensing.
Langkah t erakhir adalah m enunj uk kan
bahwa gen y ang t elah diisolasi t ersebut m engandung
m ut asi yang dit urunkan ( segr egat e) bersam a- sam a dengan
penyakit .
M u t a si
Mut asi, secara luas, didefinisikan sebagai
perubahan pada sekuens prim er nuk leot ida DNA, t anpa
m em per hat ikan akibat / konsekuensi fungsionalnya. Mut asi
yang t erj adi pada sel germ inal ( germ cell) ak an
m engakibat kan adanya m ut asi pada set iap sel organism e
yang
bersangkut an,
dan
akan
dit urunkan
kepada
ket ur unannya. Beberapa m ut asi bersifat let al, sedangkan
beerapa lainnya kurang berbahaya, beberapa bahkan
m em ber ikan k eunt ungan dari segi evolusi. Mut asi som at ik,
Page 7 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Ga m ba r 2 - 7
Posit ional cloning.
Skem a garis besar
langkah- langk ah ident ifikasi suat u gen penyakit dengan
cara posit ional cloning.
t erbat as pada sekelom pok sel pada suat u j aringan,
berperan pent ing pada pem bent ukan neoplasm a. Dengan
perkecualian pada t riplet repeat s yang dapat m akin panj ang,
m ut asi biasany a bersifat st abil ( Tabel 2- 1) .
Secara st ruk t ural, m ut asi sangat bervar iasi.
Mut asi
dapat m elibat k an seluruh genom e seper t i yang t erj adi pada
t riploi, m aupun perubahan st rukt ur at au j um lah krom osom .
Delesi besar dapat m em pengaruhi bagian dari gen, seluruh
gen at au j ika beberapa gen t erlibat , m ut asi dapat berak ibat
pada sindrom a. Persilangan yang t idak seim bang anat ar a
gen- gen yang hom olog dapat m engak ibat kan m ut asi fusi
gen, sepert i pada but a warna.
Mut asi dapat j uga
m elibat kan perubahan pada beberapa at au sat u pasang
basa.
Mut asi sat u basa disebut m ut asi t it ik ( point
m ut at ion) . Analog dengan perubahan krom osom , m ut asi
t it ik m ungk in t erdir i dari subst it usi, delesi at au inser si.
Subst it usi disebut t ransisi j ik a basa purin digant ikan oleh
basa pur in lain ( AG) at au pir im idin digant ikan oleh
pirim idin lain ( CT) . Perubahan dar i purin ke pir im idin
at au sebalik nya disebut t r ansver sI .
Delesi at au insersi
m eny ebabkan pergeseran pem bacaan k odon basa yang
dit erj em ahkan m enj adi asam am ino ( shift of t ranslat ional
reading
fram e) ,
yang
biasanya
m enyebabkan
penghent ian/ st op yang lebih awal ( nonsense m ut at ion) .
Mut asi pada daerah int ron dapat m enghilangkan at au
m enim bulkan sit us awal/ ak hir pem ot ongan ( splice donor
at au splice accept or sit es) , yang m engakibat kan pot ongan
( spliced) m RNA gen yang t erm ut asi m enj adi t idak nor m al.
Mut asi j uga dapat dit em ukan pada sekuens regulat or suat u
gen dana dapat m enyebabkanberkurang at au t idak adany a
t ranskr ipsi gen yang bersangkut an.
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Ga m ba r 2 - 8
Sout her n blot
Sout hern blot dapat
digunakan unt uk m endet eksi perubahan pada st ruk t ur gen
( m isalnya delesi, insersi, variable num ber t andem
repeat s/ VNTR) ,
at au
rest ict ion
fragm ent
lengt h
polym orphism ( RFLP) . DNA genom didigest i dengan sat u
at au beberapa enzim rest r ik si.
Hasil digest i dipisahkan
dengan gel agarose dan dit ransfer ke m em bran. Hibridisasi
DNA, yang t elah diim obilisasi, dengan probe yang dilabel
radioakt if m em ungk inkan unt uk m endet eksi fragm en
t ert ent u secar a radiografi. Sepert i t er lihat pada gam bar,
RFLP dapat m enghasilkan per bedaan panj ang fragm en yang
didet eksi.
Polim orfism e dem ik ian digunakan pada st udi
linkage unt uk m enilai apak ah suat u penyakit dit ur unk an
bersam a- sam a ( cosegregat e) dengan m arka genet ik
t ert ent u.
Pada
beber apa
sindrom a
kanker ,
predisposisi
pem bent ukan t um or dapat dit urunkan. Pada kasus ret inoblast om a, t um or berkem bang j ika kedua salinan gen
ret inoblast om a m enj adi defekt if m elalui dua kej adian
som at ik ( spor adic ret inoblast om a) at au m elalui hilangny a
Page 8 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
kedua nor m al alel secara som at is pada seorang indiv idu
dengan efek heredit er pada alel yang lain ( heredit ary
ret inoblast om a) . Two- hit m odel ini, diusulk an per t am a kali
oleh Knudson, berlak u pada beberapa sindrom a kank er .
Alel yang defekt if dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel
dan m engikut i pola dom inan, t et api pem bent ukan t um orny a
( t um or igenesis) disebabkan oleh hilangny a gen supresor
t um or yang resesif pada j aringan yang ber sangkut an. Pada
kasus lain, pem bent ukan kanker biasanya m em er luk an
defek pada beberapa gen, y ang disebut proses m ult ist ep
carcinogenesis.
Uj i m ut asi DNA m em punyai beberapa keunt ungan
dibanding analisis pada t ingkat prot ein.
DNA m udah
diisolasi, dan regulasi DNA pada berbagai j aringan t idak
berbeda, 2 karakt erist ik yang berlainan dengan prot ein.
DNA dapat diisolasi dari berbagai m acam sum ber , t er m asuk
sel darah put ih, sam pel j arigan, sel kulit dan akar ram but .
Banyak m et ode t elah dikem bangkan unt uk m enganalisis
m ut asi ( Tabel 2- 1) .
Mut asi besar, delesi, insersi,
rearrangem ent s, at au ekspansi t r iple repeat s dapat
didet eksi dengan cara Sout her n blot at au PCR.
Pada
analisis Sout hern, DNA dengan berat m olekul t inggi
didigest i dengan enzim rest riksi, m enghasilkan banyak
fragm en yang kem udian dapat
dipisahkan dengan
elek t roforesis pada gel.
Set elah DNA dit ransfer ke
m em bran, DNA dapat dinat urasi dan dihibridisasi dengan
probe yang dilabel radioakt if yang ak an m endet ek si
sekuens t ert ent u di ant ara fragm en- fragm en yang t ak
t erhit ung j um lahnya.
Per bedaan pola hibr idisasi yang
diperoleh dari Sout hern blot dapat m enunj ukkan adanya
delesi at au inser si pada DNA genom ( Gam bar 2- 8) .
Sebagai cont oh Sout hern blot dapat digunakan unt uk
m endiagnosis varian t alasem ia- di Asia Tenggara. Pada
beberapa kasus resesif aut osom , dit em ukan adanya delesi
besar pada kedua gen - globin dar i k lust er gen 30 kb pada
krom osom 1.
Karena delesi j uga m elalui gen - globin,
m aka m engak ibat kan hydrops fet alis dan k em at ian dalam
kandungan.
RT- PCR berguna j uga unt uk m endet ek si ket idakadaan
at au berkurangnya ek spresi m RNA akibat alel yang
t er m ut asi. Sk rining unt uk m enget ahui adanya m ut asi t it ik
dapat dilakuk an dengan beberapa m et ode ( Tabel- 2- 2) .
Met ode didasarkan pada m ism at ch ant ara dupleks asam
nukleat , pem isahan DNA unt ai t unggal at au ganda dengan
elek t roforesis, at au sekuensing fragm en DNA yang
diperbanyak dengan PCR. Sekuensing DNA dapat dilak ukan
secara langsung pada hasil PCR ( am plikon) at au
m enggunakan fragm en yang diklon ke dalam vekt or
plasm id. Sensit iv it as m et ode- m et ode ini bervariasi ant ar a
80 sam pai 100% . Uj i prot ein t erpot ong ( pr ot ein t runcat ion
t est / PTT) dapat digunakan unt uk m endet eksi m ut asi yang
m engakibat kan penghent ian sint esis polipept ida dini. cDNA
yang diisolasi dit ranskripsikan dan dit ranslasi secara in vit ro,
kem udian prot ein dianalisis dengan elekt roforesis gel.
Perbandingan dengan prot ein wild- t ype ( norm al) dilakuk an
unt uk m endet eksi m ut an yang t erpot ong ( t r uncat ed) .
Pendekat an ini t erut am a ber guna unt uk m endet ek si m ut asi
pada gen yang besar yang m engakibat kan hilangnya fungsi.
Ta be l 2 - 1
Con t oh Je n is M u t a si
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Page 9 of 10
Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Principles of Molecular Medicine, Grompe et al, 1998, Humana Press
Ta be l 2 - 2
M e t ode D e t e k si M u t a si
Terj. D. Lyrawati 03Dec2003
Page 10 of 10