MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS (Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)
DISERTASI
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L)
TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA
MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI
EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS
(Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)
SRI HERNAWATI
PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
Diterbitkan untuk Ujian Tahap II (Terbuka)
DISERTASI MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS (Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel) SRI HERNAWATI PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012 PRASYARAT GELAR DOKTOR
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS (Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)
DISERTASI Untuk Memperoleh Gelar Doktor
Dalam Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga
Dan Dipertahankan Di hadapan Panitia Ujian Doktor Tahap II (Terbuka) Oleh :
SRI HERNAWATI 090970133
PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012
LEMBAR PENGESAHAN
Telah Disetujui Untuk Ujian Doktor Tahap II (Terbuka) pada tanggal 21 September 2012 Oleh
Promotor : Nip. 19591003 198701 1 001
Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh
Ko Promotor I Nip : 19550705 198003 1 005
Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si
Ko Promotor II Nip. 19591114 198603 2 002
Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg,M.Si
Mengetahui Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran
Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga Nip. 19501216 197703 1 002
Prof. Dr. Teddy Ontoseno,dr.SpA(k)Spjp.,AKK
Disertasi ini telah diuji dan dinilai oleh panitia penguji pada ujian Tertutup (Tahap I) Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Pada Tanggal 17 September 2012
Panitia Penguji : Ketua : Prof. M.Coen Pramono D.,drg.,S.U.,Sp.BM Anggota :
1. Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, drh
2. Dr. I Ketut Sudiana, MS
3. Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg.,M.Kes
4. Dr. Hari Basuki Notobroto, M.Kes.,dr
5. Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM
6. Prof. Dr. Aulanni’am, Drh., DES Ditetapkan dengan Surat Keputusan
Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga
Nomor : 182/H3.1.1/KD/2012 Tanggal : 11 September 2012
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan judul
“Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2, VEGF, Wild p53 dan Apoptosis”
Penelitian Disertasi ini menjadi salah satu persyaratan yang harus ditempuh oleh mahasiswa Program Pendidikan S-3 Ilmu Kedokteran di Universitas Airlangga.
Disertasi ini dapat diselesaikan berkat dorongan, bimbingan, arahan, saran dan perbaikan dari banyak pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati, perkenankan saya menghaturkan terimakasih yang tulus serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat :
Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh. selaku promotor yang dengan penuh perhatian telah meluangkan waktu, memberikan dorongan semangat dengan penuh kesabaran, memberikan bimbingan dan saran sehingga ujian disertasi ini dapat diselesaikan.
Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si, selaku Ko-Promotor I yang dengan penuh perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran, sehingga ujian Disertasi ini dapat diselesaikan.
Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg, M.Si. selaku Ko-Promotor II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran, sehingga ujian disertasi ini dapat diselesaikan.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga saya haturkan kepada : Rektor Universitas Airlangga, Prof. Dr. H. Fasich, Apt. yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada
Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya.
Prof. Dr. Agung Pranoto, dr., M.Kes., SpPD.,KEM.,FINASIN Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk mengikuti Pendidikan Program Doktor pada Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya. Direktur Program Pascasarjana, Prof .Dr.Hj.Sri Hajati,SH.,MS., beserta seluruh pimpinan dan staf Program Pascasarjana Universitas Airlangga atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya untuk menjadi mahasiswa Program Doktor pada Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga.
Prof. Dr. Teddy Ontoseno, dr. SpA(k)Spjp.,AKK, selaku Ketua Program Studi Program Doktor Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga yang telah banyak membantu dalam kelancaran proses pelaksanaan ujian disertasi ini.
Rektor Universitas Jember dan Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember yang telah banyak membantu saya dalam menempuh Program Doktor pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga.
Prof. M. Coen Pramono D., drg., SU., Sp. BM, Dr. Hari Basuki Notobroto, Mkes, dr, Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM, Prof. Dr. Aulanni’am, Drh., DES, Prof. Dr. Sukardiman., Drs., M.S yang telah banyak memberikan saran dan bimbingan yang sangat berharga mulai penyusunan pra usulan penelitian hingga penyusunan disertasi ini.
Para dosen pengajar S-3 Kedokteran dan karyawan di laboratorium biokimia, laboratorium mikroskop elektron Gramik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan Nasional yang telah memberikan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana demi kelancaran studi saya.
Teman-teman angkatan 2009/2010 pendidikan Program Doktor Bidang Ilmu Kedokteran pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga. Selama ini kita telah saling menemani, memotivasi, mengingatkan dan memberi masukan yang semuanya memberi nilai tambah dalam rangkaian penyusunan disertasi ini.
Pada kesempatan ini saya menyampaikan terimakasih ,rasa hormat dan penuh kasih kepada : Orangtua saya, ayahanda tercinta Samiruddin (Alm) dan ibunda Sunaryati, tidak lupa kepada seluruh saudara dan keluarga besar saya ucapkan terimakasih yang tak terhingga. Terimakasih atas semua kebaikan dan doa yang telah diberikan.
Suami saya, Rahardja Putranto,drg.,M.Mkes tercinta, yang hingga saat ini mendampingi saya menjalani kehidupan, memberikan dorongan. Kepada anak- anakku tercinta Amelia Clarissa Putranto dan Safira Rahmaningtyas Putranto, terima kasih banyak atas cinta dan pengorbanan yang telah kalian berikan selama ini.Mama mohon maaf atas berkurangnya waktu kebersamaan selama Mama menyelesaikan pendidikan.
Saya ucapkan terima kasih pada semua pihak yang telah membantu dalam terselesaikannya disertasi ini. Saya berharap disertasi ini akan dapat memberikan manfaat bagi masyarakat, khususnya bagi pengembangan dunia pendidikan dan kesehatan. Semoga Allah SWT melimpahkan taufik dan hidayah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu penyelesaian disertasi ini. Amien Ya Rabbal Allamin.
Surabaya, September 2012 Penulis
RINGKASAN Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga
Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,
VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah kanker urutan keenam di dunia, setiap tahun angka kejadiannya semakin meningkat. Di negara berkembang, kejadian ini mempunyai angka yang tinggi. Kemajuan di bidang bedah, radiasi dan kemoterapi telah berkembang dengan pesat, tetapi hasilnya masih relatif belum menggembirakan. Pasien yang mempunyai umur panjang kurang dari 50%. Terjadinya kanker bisa disebabkan karena hambatan apoptosis.
Apoptosis merupakan suatu mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel
yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya sehingga dapat menyelamatkan organisme. Delima (PGL) salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitas sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima (PGL) dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima (Punica
granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis.
Metode penelitian ini adalah eksperimental laboratories. Hewan coba yang digunakan adalah mencit Strain Swiss Webster (Balb/c), 30 ekor mencit jantan umur 5 bulan, dibagi 5 kelompok. Kelompok kontrol (K0/K-, K1/K+) dan 3 kelompok perlakuan (P1, P2, P3). Paparan benzopirene diberikan untuk hewan coba pada kelompok (K1, P1, P2, P3) dengan dosis 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml
olium olivarum diberikan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Pemberian ellagic acid , PGL, mahkota dewa pada kelompok (P1, P2, P3 ) dengan dosis 75 mg/kg
bb mencit, diberikan tiap hari selama 4 minggu per oral. Teknik pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan tunnel assay analisis data menggunakan uji MANOVA, LSD, uji korelasi dan regresi.
Hasil pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2, dan tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF, dan tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53, tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K1. Pemeriksaan preparat dengan teknik tunnel
assay menunjukkan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat
meningkatkan apoptosis, dan tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok
P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 dan K1. Hasil uji korelasi menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan penurunan ekspresi VEGF, tetapi ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.
Kesimpulan penelitian ini adalah bahwa ada mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.
SUMMARY Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts (Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 Wild and Apoptosis
Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world, every year the number of events increases. In developing countries, these events have a high number. The developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have improved dramatically, but the results are still relatively encouraging. In facts, patients who have a long life are still less than 50%. The occurrence of cancer could be due to apoptosis resistance. Apoptosis is an efficient mechanism to eliminate cells that are unnecessary and potentially dangerous so as to save the organism. Pomegranate (PGL) is one of medicinal plants that have anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate extract (PGL) can kill cells undergoing transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of the research was to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2, VEGF, p53 and Apoptosis Wild. The research method was experimental laboratories. Experimental animals used were Swiss Webster mice strains (Balb / c), 30 male mice aged 5 months, divided 5 groups. The control group (K0/K-, K1 / K +) and 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure benzopirene was given to experimental animals in the group (K1, P1, P2, P3) at a dose of 0.04 mg benzopirene / 0.04 ml olium olivarum given 3 times a week for 4 weeks. Usage of ellagic acid, PGL, mahkota dewa on the groups (P1, P2, P3) at a dose of 75 mg / kg bb mice, given daily for 4 weeks per oral. Examination techniques with imunohistokimia technique and tunnel assay data analysis using MANOVA test, LSD, correlation and regression testing.
The results of the examinations with imunohistokimia technique and pomegranate extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of Bcl-2, and did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of VEGF, and did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could increase the expression of p53 wild, did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but differs significantly with the K1. Examination preparations tunnel assay techniques showed the extract of pomegranate (PGL) / P2 standardized to enhance apoptosis, and did not differ significantly by group P1, P3, but differed significantly with the K0 and K1. Correlation test results showed that there was a positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 with decreased
VEGF expression, but there is a negative correlation between the decreased expression of Bcl-2 with increased expression of p53 wild, and there is a positive correlation between the increase in p53 wild with increased expression of apoptosis.
The conclusion of the research was that there was a mechanism of action of pomegranate extract (PGL) to apoptosis through the intrinsic pathway, and there was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and VEGF expression.
ABSTRAK Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga
Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,
VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah merupakan kanker urutan keenam di dunia. Perkembangan kemajuan di bidang bedah, radiasi dan kemoterapi belum memberikan hasil yang signifikan. Pasien karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang berumur panjang kurang dari 50%. Terjadinya kanker salah satu disebabkan oleh karena hambatan apoptosis sel dan mutasi. Delima (PGL) merupakan alternatif dan salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitasnya sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi
BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini
adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima
(Punica granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis.
Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratories, tiga puluh ekor mencit jantan umur 5 bulan dibagi secara random menjadi 5 kelompok; 2 kelompok control (K0, K1), 3 kelompok perlakuan (P1,P2,P3). Paparan
benzopirene dengan dosis 0,04 mg benzopirene/0,04 ml olium olivarum
selama 4 minggu, 3 kali seminggu. Pemberian
ellagic acid, PGL, mahkota dewa
dengan dosis 75 mg/kg bb mencit setiap hari selama 4 minggu. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan teknik
imunohistokimia dan tunnel assay.
Hasil penelitian berdasarkan teknik
imunohistokimia menujukkan bahwa
pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi
Bcl-
2,
VEGF, dapat meningkatkan ekspresi wild p53 dengan teknik pemeriksaan tunnel assay, dan meningkatkan ekspresi apoptosis. Hasil uji korelasi
menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi
Bcl-2 dengan
penurunan ekspresi
VEGF, ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2
dengan peningkatan ekspresi
wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan
ekspresi wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.
Kesimpulan penelitian ini adalah ada mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap
apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah
antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.
Kata Kunci : Delima, transformasi sel, apoptosis.
ABSTRACT Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts (Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells
Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 wild and Apoptosis
Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world. The developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have not yielded significant results. Patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity that have a long life is still less than 50%. One occurrence of cancer was caused by cell apoptosis and mutation. Pomegranate (PGL) is an alternative and one that has the medicinal plants as anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate extract (PGL) standardized to kill the cells undergoing transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of this study was to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2,
VEGF, p53 and Apoptosis Wild.
The research method used was experimental laboratories, thirty male mice aged 5 months were randomly divided into 5 groups: 2 groups of control (K0, K1), 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure of benzopirene with a dose of 0.04 mg benzopirene/ 0.04 ml olium olivarum for 4 weeks, 3 times a week. Usage of ellagic acid, PGL,
mahkota dewa with a dose of 75 mg / kg bb mice every day for
4 weeks. Examinations were done by using
imunohistokimia and tunnel as say techniques.
The results based on the technique of
imunohistokimia showed that
pomegranate extract (PGL) standardized could reduce the expression of Bcl-2,
VEGF, p53, could increase the expression of wild-
tunnel as say examination
techniques, and could increase expression of apoptosis. Correlation test results showed that there was a positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 and decreased expression of VEGF, there was a negative correlation between the decreased expression of Bcl-2 and increased expression of p53 wild, and there was a positive correlation between the increased expression of p53 and increased expression of wild apoptosis.
The conclusion of this study was that there was mechanism of pomegranate extract (PGL) on apoptosis through the intrinsic pathway, and there was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and VEGF expression.
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iv UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ vi RINGKASAN .................................................................................................. x SUMMARY .................................................................................................. xii ABSTRAK .................................................................................................. xiv DAFTAR ISI .................................................................................................. xvi DAFTAR TABEL ............................................................................................ xx DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xxi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xxvi DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xxvii BAB 1 PENDAHULUAN .............................................................................
1 1.1 Latar Belakang..........................................................................
1 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................
7 1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................
7 1.3.1 Tujuan umum penelitian ...............................................
7 1.3.2 Tujuan khusus penelitian ..............................................
8 1.4 Manfaat penelitian ....................................................................
8 1.4.1 Manfaat teoritik ............................................................
8 1.4.2 Manfaat praktis penelitian ............................................
9 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................
10
2.1 Karsinogenesis ......................................................................... 10 2.1.1 Transform sel ................................................................
12 2.1.2 Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut (KSSRM) ....
13
2.1.2.1 Etiologi dan faktor predisposisi sel skuamosa rongga mulut (KSSRM) ............................................................
14
2.1.2.2 Patobiologi molekuler sel skuamosa rongga mulut (KSSRM) ......................................................................
16
2.2 Kematian Sel ............................................................................
18 2.2.1 Apoptosis ..................................................................................
18 2.2.1.1 Apoptosis fisiologis .............................................................
20 2.2.1.2 Apoptosis patologis .............................................................
21 2.2.1.3 Jalur Utama Apoptosis .........................................................
24
2.2.2 Nekrosis .................................................................................. 26 2.3 Proliferasi sel ............................................................................
28 2.4 Regulasi Apoptosis ...................................................................
29 2.4.1 Bcl-2 ......................................................................................
29 2.5 Regulasi Proliferasi ..................................................................
31 2.5.1 Wild p53 ...................................................................................
31 2.6 Angiogenesis dan VEGF ..........................................................
34 2.6.1 Angiogenesis ............................................................................
35
2.6.2 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ......................... 37
2.7 Benzopirene .............................................................................. 38
2.8 Punica granatum L (Delima) ................................................... 42
2.8.1 Klasifikasi, Nama Lain Komposisi Delima (
National Plant Date Centre, 2000) ................................................................... 42
2.8.2 Bahan Aktif Delima (PGL) ......................................................
43
2.8.3 Aktivitas Delima (PGL) sebagai
Antikanker, Antioksidan, dan Antiinflamasi............................................................................. 47
2.8.3.1 Aktivitas
Antikanker ............................................................ 47
2.8.3.2 Aktivitas
Antioksidan ........................................................... 52
2.8.3.3 Aktivitas
Antiinflamasi ........................................................ 53
2.9 Phaleria macrocarpa (Mahkota Dewa) ................................... 54
2.10 Imunohistokimia ....................................................................... 55 2.11 Tunnel Assay ............................................................................
58 BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL ..........................................................
60 3.1 Kerangka Konsep .....................................................................
60 3.2 Penjelasan Kerangka Konsep ...................................................
61 3.3 Hipotesis Penelitian ..................................................................
64
BAB 4 METODE PENELITIAN...................................................................
BAB 6 PEMBAHASAN ................................................................................ 107
82
5.4 Korelasi antara Bcl-2,
VEGF, wild p53 dan Apoptosis .......... 102
5.5 Uji Regresi antara Bcl-2,
VEGF, wild p53 dan Apoptosis ....... 104
5.6 Kerangka Hasil Penelitian ........................................................ 105
6.1 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi Protein Bcl-2 pada Sel Mukosa Rongga
5.3 Ekspresi Bcl-2, VEGF,
Mencit akibat
paparan
Benzopirene. ............................................................... 109
6.2 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi
VEGF Pada Sel Mukosa Rongga Mulut
Mencit Akibat
Paparan
wild p53 dan Jumlah sel yang mengalami apoptosis ................................................................
80
65 4.1 Jenis dan Rancangan penelitian ................................................
70 4.4 Unit Analisis .............................................................................
65 4.2 Unit Eksperimental, Replikasi dan Randomisasi .....................
67 4.2.1 Unit Eksperimental ...................................................................
67 4.2.2 Replikasi ..................................................................................
68 4.2.3 Randomisasi .............................................................................
69 4.3 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel ............
69 4.3.1 Variabel Penelitian ....................................................................
69 4.3.2 Definisi Variabel Penelitian ....................................................
73 4.5 Alat penelitian ..........................................................................
80 5.1 Karakteristik Subyek Penelitian ...............................................
73 4.6 Lokasi Penelitian ......................................................................
74 4.7 Pelaksanaan Penelitian .............................................................
74 4.7.1 Persiapan Penelitian..................................................................
74 4.8 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data ........................
76 4.9 Cara Pengolahan dan Analisis Data .........................................
77 4.10 Kerangka Operasional Penelitian .............................................
79 BAB 5 HASIL PENELITIAN ......................................................................
Benzopirene ................................................................ 116
6.3 Efek Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi Protein wild p53 pada Sel Mukosa Rongga Mulut
Mencit Hewan
Coba Akibat Paparan
Benzopirene ........................................... 120
6.4 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terhadap Perubahan Ekspresi Jumlah Sel Yang Mengalami Apoptosis Pada Sel Mukosa Rongga Mulut Akibat Paparan Benzopirene .............. 124
6.5 Temuan baru ............................................................................. 128
6.5.1 Kerangka Temuan Baru ............................................................ 128
6.5.2 Keterangan Kerangka Temuan Baru ........................................ 128
BAB 7 PENUTUP.......................................................................................... 131
7.1 Kesimpulan ............................................................................... 131
7.2 Saran ......................................................................................... 131 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 133 LAMPIRAN ............................................................................................. 142
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 5.1 Uji Homogenitas Subjek Penelitian Berdasarkan Berat Badan Awal dan akhir mencit percobaan .................................................84 Tabel 5.2 Nilai Signifikansi Uji Normalitas Ekspresi Bcl-2,
VEGF, wild p53 dan jumlah sel yang mengalami apoptosis .............................
85 Tabel 5.3 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan Bcl-2 Pada Hewan Percobaan ......................................................
86 Tabel 5.4 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan
VEGF pada Hewan Percobaan ..................................................... 90
Tabel 5.5 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ..................................................94 Tabel 5.6 Rerata dan Simpangan Baku ekspresi sel yang mengalami apoptosis Hewan Percobaan ..........................................................
98 Tabel 5.7 Uji korelasi antara
wild p53, Bcl-2, VEGF terhadap apoptosis .... 102
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Tahapan-tahapan proseskarsinogenesis (Kresno, 2011) ......... 11
Gambar 2.2 Tiga jalur apoptosis yaitu jalur ekstrinsik ( death-receptorpathway), jalur intrinsik yang juga disebut jalur mitokhondria
dan jalur
perforin/granzim (Jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik merupakan jalur utama) (Kresno, 2011) ...................................
24 Gambar 2.3 Struktur Kimia
Benzopirene (Vidmar et all., 2004) ................ 41
Gambar 2.4 Reaksi aromatikhidrosilasi dan epoksidasi (Sudiana, 2008) .. 41
Gambar 2.5
Punica granatum L (Delima) ( National Plant Data Center, 2000) ..................................................................................
43 Gambar 2.6 Struktur Kimia
Punicalagin (a) dan Ellagic Acid (b) (Seeram et al., 2005) ..............................................................................
45 Gambar 3.1 Kerangka Konsep .....................................................................
60 Gambar 4.1 Rancangan Penelitian ..............................................................
65 Gambar 4.2 Kerangka Operasional Penelitian ............................................
78 Gambar 5.1 Gambaran HPA (pembentukan keratin abnormal, proliferasi sel-sel
epitel skuamous, terlihat sel-sel atipia, sel tidak
beraturan) pada transform sel ke karsinoma rongga mulut dosis 0.04 ml
benzopirene, paparan 3 x seminggu selama 4
minggu dan pembesaran 100 x dengan pewarnaan HE (penelitian pendahuluan) ..........................................................
81 Gambar 5.2 Gambaran HPA (pembentukan keratin abnormal, bentuk sel tidak beraturan) pada transform sel ke karsinoma rongga mulut dosis 0.02 ml
benzopirene, paparan tiga kali
seminggu selama empat minggu pembesaran 100 x dengan pewarnaan HE (penelitian pendahuluan) ..................................
82
Gambar 5.3 Gambaran secara klinis dari hasil penelitian pendahuluan dengan dosisbenzopirene 0,04 ml menunjukkan gambaran mikroskopis (kemerahan, indurasi, tumor) ...............................
82 Gambar 5.4 Grafik Uji Homogenitas Subjek Penelitian Berdasarkan Berat Badan Awal dan akhir mencit percobaan .................................
84 Gambar 5.5 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan Bcl-2 Pada Hewan Percobaan ....................
86 Gambar 5.6 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal) → (Positif)
Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
87 Gambar 5.7 Kelompok K1 / Kontrol positif (
Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
88 Gambar 5.8 Kelompok P1 ( Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............
88 Gambar 5.9 Kelompok P2 (
Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............
89 Gambar 5.10 Kelompok P3 (
Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............
89 Gambar 5.11 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan VEGF pada Hewan Percobaan ...................
90 Gambar 5.12 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal) → (Positif)
Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
91
Gambar 5.13 Kelompok K1 / Kontrol positif (Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
92 Gambar 5.14 Kelompok P1 (
Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............
92 Gambar 5.15 Kelompok P2 (
Benzopirene + PGL) → (P ositif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............
93 Gambar 5.16 Kelompok P3 (
Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............
93 Gambar 5.17 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ................
94 Gambar 5.18 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal) → (Positif)
Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
95 Gambar 5.19 Kelompok K1 / Kontrol positif (
Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan
imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
96 Gambar 5.20 Kelompok P1 (
Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .........
96 Gambar 5.21 Kelompok P2 (
Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .........
97
Gambar 5.22 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .........
97 Gambar 5.23 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ................
98 Gambar 5.24 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal) → (Positif)
Pengecatan teknik tunnel assay dengan antibodi
poliklonal
terhadap ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel .............................................................................................
99 Gambar 5.25 Kelompok K1 / Kontrol positif (
Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan teknik tunnel assay dengan antibodi
poliklonal
terhadap ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ............................................................................................. 100
Gambar 5.26 Kelompok P1 (Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan
teknik tunnel assay dengan antibodi
poliklonal terhadap
ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........ 100
Gambar 5.27 Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan
teknik tunnel assay dengan antibodi
poliklonal terhadap
ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........ 100
Gambar 5.28 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan
teknik tunnel assay dengan antibodi
poliklonal terhadap
ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........ 101
Gambar 5.29 Korelasi antara Bcl-2 dengan VEGF ........................................ 101Gambar 5.30 Korelasi antara Bcl-2 dengan wild p53 .................................... 102Gambar 5.31 Korelasi antara wild p53 dengan apoptosis ............................. 103Gambar 5.32 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wildp53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53 dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2 dengan VEGF ........................................................................... 104
Gambar 5.33 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wildp53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53 dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2 dengan VEGF ........................................................................... 104
Gambar 5.34 Kerangka hasil penelitian ....................................................... 105Gambar 6.1 Kerangka temuan baru ............................................................. 128
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1 Sertifikasi standarisasi (COA) ekstra buah delima (PGL) dan
ellagic acid .............................................................................. 142
Lampiran 2
Ethical Clearance ..................................................................... 144
Lampiran 3 Hasil uji statistik ....................................................................... 145 Lampiran 4 Prosedur pemeriksaan Imunohistokimia ................................. 168 Lampiran 5 Prosedur pemeriksaan
Tunnel Assay ....................................... 170
DAFTAR SINGKATAN / ISTILAH
HSV :
Cyclooxygenase
DNA : Deoxyribonucleic acid DAB :
Diaminoenzidine
ELISA :
Enzyme linked immunoassay
FADD :
Associated protein death domain
Fase G-1 : Gap /jeda antara akhir fase M dengan awal fase S Fase G-2 : Gap / jeda antara fase S dengan awal fase M Fase S : Interfase / fase sentesis Fase M : Fase mitosis FRAP :
Ferric reducing antioxidan power
Herpes simplex-1
Carboxy methyl cellulase
HIV :
Human immudifisiency
HPV :
Human papilloma
HIF :
Hipoxia inducible factor