Pengujian Protein secara Kuantitatif dan

PENGUJIAN PROTEIN
SECARA KUANTITATIF DAN KUALITATIF
LAPORAN PRAKTIKUM
Diajukan Sebagai Syarat Untuk Memenuhi Tugas
Praktikum Biokimia pada
Program Studi Teknik Produksi Tanaman Pangan Hortikultura
Jurusan Produksi Pertanian
Politeknik Negeri Jember
Oleh:
HIKMATULLAH ADICAHYO
NIM: A42140400

PROGRAM STUDI TEKNIK PRODUKSI TANAMAN
PANGAN HORTIKULTURA
JURUSAN PRODUKSI PERTANIAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2014
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Protein adalah senyawa terpenting penyusun sel hidup. Senyawa ini terdapat
dalam semua jaringan hidup baik tumbuhan maupun hewan. Fungsi biologis

protein sangat beragam, antara lain sebagai pembangun, pengatur, pertahanan, dan
sebagai sumber energi. Tidak ada kelompok senyawa lain yang fungsinya
beragam seperti protein. Oleh karena itulah, kelompok senyawa ini disebut

protein, istilah yang berasal dari bahasa Yunani proteios yang berarti “peringkat
satu” atau “yang utama”.
Ditinjau dari komposisi kimianya, protein merupakan polimer dari sekitar 20
jenis α-amino. Massa molekul relatifnya berkisar dari sekitar 6.000 hingga
beberapa juta. Unsur utama penyusun protein adalah C, H, O dan N. Banyak juga
protein yang mengandung belerang (S) dan dalam jumlah yang lebih sedikit
fosforus (P). Beberapa protein mengandung besi, mangan, tembaga dan iodin.
Rangkaian yang terdiri dari 10 atau lebih asam amino disebut polipeptida. Ia
disebut protein jika massa molekul relatifnya mencapai atau lebih dari 10.000
Asam amino adalah suatu golongan senyawa karbin yang setidak-tidaknya
mengandung satu gugus karboksil (-COOH) dan satu gugus amino (-NH 2). Asam
amino bersifat amfoter (dapat bereaksi baik dengan asam maupun dengan basa).
Jika direaksikan dengan asam, maka asam amino akan menentukan struktur,
kelarutan, serta fungsi biologis dari protein. Kecuali glisin, semua asam amino
bersifat optis aktif, karena adanya atom C-α yang bersifat asimetris. Asam amino
tersebut dapat disintesis dalam tubuh, kecuali asam amino essensial. Asam amino

yang dapat disintesis dalam tubuh disebut asam amino nonessensial.
Suatu polipeptida atau protein dapat mengalami hidrolisis jika dipanaskan
dengan asam klorida pekat, sekitar 6 M. Memanaskan larutan protein dapat
menyebabkan denaturasi protein. Denaturasi juga dapat disebabkan oleh
perubahan pH yang ekstrim, oleh beberapa pelarut seperti alkohol atau aseton,
oleh zat terlarut seperti urea, oleh detergen, atau oleh pengguncangan yang
intensif. Protein dalam bentuk alamiahnya disebut protein asli (natif), dan setelah
denaturasi disebut protein terdenaturasi. Protein terdenaturasi hampir selalu
kehilangan fungsi biologisnya.
1.2 Tujuan
Untuk mengetahui cara kerja pada setiap penentuan uji kualitatif dan
kuantitatif pada protein
1.3 Manfaat

Mahasiswa dapat mengetahui cara kerja pada setiap penentuan uji kualitatif
dan kuantitatif pada protein

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
Protein yang merupakan suatu biopolimer heterogen dari molekul menjadi
asam amino, dapat terhidrolisa atau terurai menjadi komponen – komponen yang

lebih kecil, dengan pemanasan dalam larutan asam kuat seperti HCl, atau dalam
larutan alkali seperti NaOH, juga oleh beberapa jenis enzim yang disebut dengan
enzim proteolitik (Sudarmadji, 1989).

Biasanya protein mengandung 100-1000 molekul asam amino dan
mempunyai berat molekul 16000-1.0000.0000. Komposisi dasar dari protein
sekitar 55 % karbon, 7 % hidrogen, 23 % oksigen, 16 % nitrogen, 1 % sulfur dan
kurang dari 1 % fosfor. Protein dapat digolongkan menurut struktur susunan
molekulnya, larutannya, adanya senyawa lain dalam

molekul, tingkat

degradasinya dan fungsinya (Winarno, 1984 ; Tarigan, 1983).
Satu unit asam amino dalam rantai polipeptida disebut residu. Rantai
polipeptida mempunyai arah sebab unit penyusun mempunyai ujung yang berbeda
yaitu gugus amino-a dan gugus karboksil-a. Ujung amino diletakkan pada awal
rantai polipeptida, berarti urutan asam amino dalam rantai polipeptida ditulis
dengan diawali oleh residu amino- terminal (Styrer, 2000).
Kalau susunan asam amino jumlah dan jenisnya di dalam protein makanan
sama dengan susunan yang diperlukan tubuh untuk sintesa protein tubuh, maka

semua asam amino protein makanan tersebut akan dipergunakan, sehingga
efisisensi penggunaannya menjadi 100 %. Bila ada satu atau lebih asam amino
essensial mempunyai kwantum yang lebih rendah dari yang diperlukan untuk
sintesa protein tubuh, maka hanya sebagian saja dari seluruh asam amino essensial
makanan tersebut dapat dipergunakan, sehingga efisiensi penggunaan protein
makanan tersebut lebih rendah dari 100 %. Jadi persentase penggunaan protein
makanan (kualitas protein makanan) ditentukan oleh ada atau tidaknya semua
jenis asam amino essensial di dalam makanan tersebut mencukupi kebutuhan
untuk sintesa protein tubuh .(Djaeni, 2008).
Kadar asam amino dalam suatu protein tidak secara kuantitatif
menunjukkan nilai gizinya karena pembatas dalam penggunaan protein adalah
nilai cerna protein. Pengolahan dapat menaikkan dan menurunkan nilai cerna
protein. Denaturasi protein oleh pemanasan dapat mempermudah hidrolisis
protein oleh protease dalam usus halus, namun demikian pemanasan juga dapat
menurunkan

mutu

protein

akibat

perombakan

protein

(Harris,

2009).

Penentuan protein metode pengendapan alkohol adalah kompetisi
pembentukan antara protein-air dengan alkohol-air. Alkohol dapat mengendapkan
protein karena gugus fungsional dari alkohol lebih kuat mengikat air sehingga

kelarutan protein dalam air berkurang. Pada protein ujung C asam amino yang
terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa
protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukan oleh adanya endapan yang
terbentuk (Rismaka, 2009).

BAB 3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum uji kuantitatif dan kualititatif protein ini dilakukan di
Laboratorium Biosains pada hari Selasa, tanggal 2 Desember 2014 pukul 07.00 –
09.00 WIB.

3.2 Alat dan Bahan
Alat :


Tabung reaksi



Rak tabung reaksi



Pipet ukur



Pipet tetes



Waterbath



Mortal dan pastle



Mikropipet



Blue tips



Eppendorf tube



Vortex



Sentrifuge



Spektrofotometer



Kuvet

Bahan :



Albumin 2 %



Gelatin 2 %



Kasein 2 %



Reagent Millon



NaOH 0,1 N



Cu SO4 0,1 N



Buffer Assetat pH 4,7



Alkohol 95 %



Kedelai



Tris Buffer



Bovine Serum Albumin (BSA)



Aquadest

3.3 Cara Kerja
Uji Millon
1. Menyiapkan 3 tabung reaksi
2. Mengisi tabung reaksi pertama dengan 2 mL albumin, mengisi tabung kedua
dengan 2 mL gelatin dan mengisi tabung ketiga dengan 2 mL kasein.
3. Menambahkan reagent millon sebanyak 4 tetes pada masing-masing tabung,
maka akan terjadi endapan.
4. Kemudian memanaskan dalam pemanas air yang mendidih.
5. Mengamati perubahan yang terjadi, reaksi positif ditunjukkan dengan
perubahan menjadi warna merah.
Uji Biuret
1. Menyiapkan 3 tabung reaksi
2. Mengisi tabung reaksi pertama dengan 2% albumin, mengisi tabung kedua
dengan 2% gelatin dan mengisi tabung ketiga dengan 2% kasein.
3. Menambahkan 1 mL NaOH 0,1 N dan CuSO4 0,1 N sebanyak 2 tetes pada
masing-masing tabung.
4. Mengamati perubahan yang terjadi, reaksi positif ditunjukkan dengan
terbentuknya cincin warna ungu.
Uji Pengendapan oleh Alkohol
1. Menyiapkan 3 tabung reaksi dan mengisi masing-masing dengan 5 mL albumin
2%
2. Menambahkan ke dalam tabung pertama 1 mL HCL 0,1M dan 6 mL etanol
95%, tabung kedua 1 mL HCL 0,1M dan 6 mL etanol 95% serta tabung ketiga
1 mL Buffer Asetat dan 6 mL etanol 95%.
3. Mengamati perubahan yang terjadi, reaksi positif ditunjukkan dengan
banyaknya pengendapan
Uji Bradford
Preparasi Sampel
1. Menggerus dan mengomogenkan 1 gram sampel kedelai menggunakan mortar
dan menambahkan 5 ml Tris Buffer.

2.
3.
4.
5.

Mengambil cairan yang homogen dan memasukkan dalam eppendorf tube.
Memvortex selama 10 menit.
Mensentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10.000
Mengambil supernatant dan memindahkan pada eppendorf tube yang baru,
untuk dihitung protein terlarut totalnya.

Penyiapan Kurva Standart
1. Menyiapkan 6 eppendorf dan mengisi dengan larutan dibawah ini :
µg BSA
0 µg
5 µg
10 µg
15 µg
20 µg
40 µg

µl H20
40 µl
35 µl
30 µl
25 µl
20 µl
0

2. Menghomogenkan keenam eppendorf tube tersebut dengan vortex.
3. Mengukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 595 nm.
4. Setelah itu membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi
protein dalam tabung beserta persamaan garisnya.

Pengukuran Sampel
1. Memipet sebanyak 100 µl larutan sampel protein dalam eppendorf tube dan
menambahkan sebanyak 960 µl reagent Bradford, membuat sebanyak tiga kali
ulangan.
2. Menghomogenkan menggunakan vortex
3. Setelah homogen memasukkan ke dalam kuvet dan mengukur absorbansinya
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
4. Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi
sampel.
5. Menentukan konsentrasi sampel dengan memasukkan nilai absorbansi ke
persamaan garis yang sudah diperoleh pada penentuan kurva standart

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Uji Millon
LARUTAN
Kasein
Albumin
Gelatin

REAKSI
Terdapat endapan (positif)
Terdapat endapan (positif)
Tidak ada endapan (negatif)

Uji Biuret
LARUTAN
Kasein

REAKSI
Terjadi perubahan warna menjadi
ungu muda (positif), ikatan peptida

Albumin

lebih rendah dari gelatin (++)
Terjadi perubahan warna menjadi
ungu muda (positif), ikatan peptida

paling rendah (+)
Terjadi perubahan warna menjadi

Gelatin

ungu muda (positif), ikatan peptida
paling tinggi (+++)
Uji Pengendapan oleh Alkohol
LARUTAN
Albumin + HCL

REAKSI
Setelah penambahan etanol, larutan

Albumin + NaOH

tetap bening (negatif)
Setelah penambahan etanol, larutan

Albumin + Buffer

tetap bening (negatif)
Setelah penambahan etanol, larutan
menjadi keruh (positif)

4 Uji Bradford
Absorbansi sampel = 1,460
Dengan gelombang (Å 595 nm)

Kurva Standar Protein
1.8
1.6

f(x) = 0.04x + 0.08
R² = 0.93

1.4
1.2

Absorbansi
Linear (Absorbansi)

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

5

10 15 20 25 30 35 40 45

4.2 Pembahasan
Uji Millon
Pereaksi Millon pada dasarnya digunakan untuk uji spesifik asam amino
tirosin. Reagent Millon adalah HgNO3 dalam asam nitrat dan sedikit asam nitrit.

Reaksi Millon digunakan khusus untuk protein yang mengandung asam amino
dengan radikal hidroksi fenil sebagai penyusunnya akan membentuk gumpalan
berwarna putih akan terbentuk dan segera berubah menjadi merah pada
pendidihan. Karena pada praktikum kali ini kepekatan reagent Millon kurang
tinggi maka tidak terjadi perubahan warna hanya terjadi pengendapan
Uji Biuret
Uji Biuret didasarkan pada reaksi antara ion Cu 2+dan ikatan peptide dalam
suasanabasa. Warna kompleks ungu menunjukkan adanya protein. Intensitas
warna yang dihasilkan merupakan ukuran jumlah ikatan peptida yang ada dalam
protein. Ion Cu2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan
polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua
buah ikatan peptide atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau ikatan
peptida. Protein melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks
warna. Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang
mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom
karbon.
Uji Pengendapan oleh Alkohol
Penambahan alkohol yang merupakan pelarut organik akan menurunkan
kelarutan protein, karena kelarutan suatu protein tergantung dari kedudukan dan
distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar pada molekul. Mampu
mengendapkan logam dalam suasan asam dan pada pH 4,7 yang merupakan titik
isoelektrik. Pada reaksi pengendapan dengan alkohol, larutan albumin akan
membentuk endapan yang disebabkan karena adanya gugus hidrofobik polar
(yang menarik gugus non-polar) didalam molekul protein dan menghasilkan
protein dipol. Menurut teori, albumin + HCl dan albumin + NaOH membentuk
larutan bening sedangkan albumin + buffer asetat pH 4,7 agak keruh. Hal ini
disebabkan karena pada pH 4,7 merupakan titik isoelektrik albumin. Titik
isoelektrik merupakan pH dimana kelarutn protein minimum karena jumlah ion

positif dan ion negatif sama sehingga penambahan senyawa organik seperti aseton
dan alkohol yang bersifat nonpolar (muatan = 0) cenderung menurunkan kelarutan
protein. Sedangkan dengan penambahan asam atau basa menyebabkan larutan
albumin kelihatan agak bening, hal ini menandakan naiknya kelarutan albumin.
Hal ini berdasarkan sifat protein yang amfoter (protein dalam suasana pelarut
yang bersifat asam akan bertindak sebagai basa dan dalam suasana pelarut yang
bersifat basa akan bertindak sebagai asam).
Uji Bradford
Dapat diketahui dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva
standar BSA dengan persamaan regresi y = 0,0407x + 0,081. Apabila absorbansi
sampel adalah 1,460 dari ekstrak enzim kasar yang diperoleh dari Kedelai. lalu
dimasukkan ke dalam persamaan regresi, maka diperoleh rata‐rata kadar
proteinnya adalah 33,88 µg/µl Oleh karena itu, dari hasil percobaan tersebut
dapat diketahui bahwa protein tersebut terlarut pada Tris Buffer.
Konsentrasi
0
5
10
15
20
40

Absorbansi
0
0,199
0,401
0,902
1,072
1,572

Hasil absorbansi ini merupakan hasil yang cukup baik karena pada
absorbansi (1,460) dan konsentrasinya= 33,8 nilainya berada antara konsentrasi
20 – 40 dan berada pada hasil absorbansi larutan standart. Hasil absorbansi yang
cukup bagus maka tidak perlu dilakukan pengenceran kembali.

BAB 5 PENUTUP
5.1 Kesimpulan


Uji Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam

nitrat. Apabila

pereaksi

ini

ditambahkan

pada

larutan

protein,

akan

menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan.
Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa
merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.


Uji Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan

larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa
yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang
lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna
merah violet atau biru violet.


Uji Pengendapan oleh Alkohol
Cara pengujian protein pengendapan alkohol adalah dengan cara

menambahkan 6 ml alkohol 95% pada bahan yang telah ditetesi larutan HCL 0,1
M dan NaOH 0,1 M sebelumnya.

Ada tidaknya kandungan protein dalam suatu bahan pangan dapat
diketahui dengan uji kadar protein metode pengendapan alkohol. Jika setelah
ditambahkan alkohol 95% terbentuk endapan, maka terdapat kandungan protein
dalam bahan tersebut
5.2 Saran
Sebaiknya, alat dan bahan yang digunakan selama percobaan bisa
dilengkapi, untuk memudahkan praktikan dalam melakukan percobaan sehingga
praktikum dapat berjalan lancar, sesuai dengan penuntun, dan tidak ada yang
tertunda.

DAFTAR PUSTAKA
Rismaka, 2009. http://www.rismaka.net/2009/06/uji-kualitatif-protein-dan%20asam-ami no.html.
Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian.
Penerbit Liberty: Yogyakarta
Winarno, F., G., 1991, Kimia Pangan dan Gizi, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.