KRIM SECARA KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI AlCl3

VALIDASI PENETAPAN KADAR KUERSETIN DALAM SEDIAAN

KRIM SECARA KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI AlCl

3 SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Selvi Indrayani

NIM : 048114099

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

HALAMAN PERSEMBAHAN

Jika kita melakukan suatu hal 1-2 kali itu baru mencoba ,

Lebih dari 2 kali itu baru disebut berjuang Karya ini kupersembahkan kepada Papa & mama yang kucintai

2 Pipin & W ,ooh-oohku yang kusayangi Almamaterku

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya Mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Selvi Indrayani Nomor Mahasiswa : 048114099

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : Validasi Penetapan Kadar Kuersetin Dalam Sediaan Krim secara Kolorimetri dengan Pereaksi AlCl

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memerikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal 25 Mei 2008 Yang menyatakan

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas semua berkat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi Jurusan Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Pada kesempatan ini penulis hendak mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta,

2. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen pembimbing yang telah membantu penulis selama mengerjakan penelitian ini,

3. Rini Dwi Astuti, S. Farm, Apt., selaku dosen pengampu proyek yang telah memberi kesempatan pada penulis untuk bergabung dalam proyek ini,

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah memberi masukkan yang membangun,

5. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku kepala program studi dan dosen penguji yang telah meluangkan waktunya untuk memberi masukkan dan diskusi,

6. Segenap dosen fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberi bekal ilmu kepada penulis,

7. Keluarga besar: Gyu-gyu, Gyumei, Yiyi, Hijong, Devi, dan Kevin yang selalu mendukung,

8. Teman-teman proyek “Teh” : Dian ‘Sapi’, Agung, Rinta, Yoyo, Dona, Tere, Resti, Ika, dan Feri untuk kerja sama dalam tim,

9. Teman-teman kos “Dewi”: Cie Ratih ‘pigem’, Cie Nike, Cie Indah, Cie Lanny, Cie Lia ‘KKT’, Chika, Novi, Cie Aning, Cie Yohana, Cie Melissa dan teman-teman 1 kos lainnya, terima kasih untuk kebersamaannya hingga sekarang,

10. Teman-teman kecilku: Nita, Linda, Happy, Angel, Wina, Novi, Susan A., Nana, Belina, Tasia, Bobby yang telah memberikan warna tersendiri dalam kehidupan penulis,

11. Adi Krisnawan, S.T., yang telah memberi dukungan, nasihat, dan menunjukkan hal-hal yang baik kepada penulis,

12. Teman-teman kuliah seluruh mahasiswa farmasi USD angkatan 2004 khususnya minat FST yang memberikan keceriaan selama kuliah,

13. Mas Parlan, Pak Prapto, Mas Kunto, Mas Sarwanto, Mas Otok dan segenap laboran yang telah banyak membantu penulis selama bekerja di laboratoium,

14. Kepada semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu penulis mengucapkan terima kasih. Tanpa kalian semua penulis bukanlah siapa-siapa.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dan kelemahan dalam penulisan skripsi ini mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis. Penulis terbuka menerima masukkan, saran, dan kritik dari pembaca. Harapan penulis semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca. Atas perhatiannya penulis ucapkan terima kasih.

Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta,

22 Februari 2008 Penulis, Selvi Indrayani

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN............................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN............................................................................ iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS .............................................................. v PRAKATA.............................................................................................................vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA.............................................................. viii DAFTAR ISI.......................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvi

INTISARI...................................................................................................….... xvii

ABSTRACT ........................................................................................................ xviii

BAB I. PENGANTAR ............................................................................................1 A. Latar belakang .............................................................................................1 B. Perumusan masalah .....................................................................................3 C. Keaslian karya .............................................................................................3 D. Manfaat penelitian ...................................................................................... 4 E. Tujuan penelitian ........................................................................................ 4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................... 5

A. Krim ........................................................................................................... 5

B. Analisis Sediaan Krim ................................................................................ 6

C. Flavonoid ....................................................................................................7

1. Struktur dan kegunaan flavonoid ......................................................... 7

2. Isolasi flavonoid ................................................................................... 8

3. Kuersetin .............................................................................................. 8

4. Metode kuantifikasi flavonoid ............................................................. 9

D. Ekstraksi Cair-cair .................................................................................... 10

E. Spektrofotometri Visibel .......................................................................... 11

1. Interaksi elektron dengan radiasi elektromagnetik..............................11

2. Analisis kuantitatif menggunakan spektrofotometri visibel .............. 11

3. Kolorimetri ......................................................................................... 12

F. Validasi Metode Analisis ......................................................................... 12

G. Landasan teori .......................................................................................... 14

H. Hipotesis ................................................................................................... 15

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 16 A. Jenis dan rancangan penelitian ..................................................................16 B. Definisi operasional ..................................................................................16 C. Variabel penelitian.....................................................................................16 D. Alat dan bahan penelitian ......................................................................... 17 E. Tata cara penelitian ...................................................................................17

1. Pembuatan pereaksi ............................................................................ 17

2. Pembuatan larutan baku ..................................................................... 18

3. Pembuatan blangko ............................................................................ 19

1. Tahap pemecahan sediaan krim ......................................................... 32

2. Presisi ................................................................................................. 39

1. Akurasi ............................................................................................... 38

E. Analisis validitas penetapan kadar sampel kuersetin dalam sediaan krim.38

D. Penetapan kadar sampel kuersetin dalam sediaan krim ........................... 36

3. Ekstraksi cair-cair ............................................................................... 34

2. Tahap hidrolisis glikosida flavonoid .................................................. 33

C. Ekstraksi kuersetin dari sediaan krim ...................................................... 31

4. Optimasi metode ................................................................................ 19

3. Penetapan kurva baku kuersetin ......................................................... 29

2. Penetapan panjang gelombang maksimum ........................................ 26

1. Penetapan operating time .................................................................. 24

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 23 A. Pamilihan baku ......................................................................................... 23 B. Optimasi metode ...................................................................................... 24

F. Analisis hasil ............................................................................................ 22

5. Penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim ................................. 20

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 41 A. Kesimpulan .............................................................................................. 41 B. Saran ......................................................................................................... 41 C. Keterbatasan ............................................................................................. 41 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 42

LAMPIRAN ......................................................................................................... 45 BIOGRAFI PENULIS ......................................................................................... 57

DAFTAR TABEL

Tabel I. Kriteria akurasi metode analisis ............................................................ 13 Tabel II. Kriteria presisi metode analisis ............................................................. 13 Tabel III. Formula basis krim ............................................................................... 20 Tabel IV. Hasil penetapan panjang gelombang maksimum ...................... .......... 28 Tabel V. Data hubungan antara kadar kuersetin dengan absorbansi kompleks antara kuersetin dengan AlCl ............................................................... 29

3 Tabel VI. Data recovery sampel kuersetin dalam sediaan krim ........................... 38

Tabel VII. Data koefisien variasi sampel kuersetin hasil ekstraksi dari sediaan krim ………………………………………………………………… 40

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Sistem emulsi tipe O/W dan W/O ........................................................ 5 Gambar 2. Kerangka dasar flavonoid ..................................................................... 7 Gambar 3. Sistem penomoran flavonoid ................................................................ 7

Gambar 4. Struktur golongan flavonol .................................................................. 8 Gambar 5. Struktur kuersetin ................................................................................. 8 Gambar 6. Reaksi pembentukan kompleks antara AlCl dengan flavonol ............ 9

3 Gambar 7. Reaksi pembentukan kompleks antara AlCl 3 dengan flavon ............. 10

Gambar 8. Struktur katekin (A) dan struktur kuersetin (B) serta gugus-gugus yang dapat bereaksi dengan AlCl .............................................................. 24

3 Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan AlCl 3 ......... 25

Gambar 10. Spektrum pengukuran operating time kompleks antara kuersetin dengan AlCl

3 ................................................................................... 26

Gambar 11. Spektrum pengukuran panjang gelombang maksimum dari kompleks kuersetin dengan AlCl

3 .................................................................... 27

Gambar 12. Grafik hubungan antara kadar kuersetin dengan absorbansi kompleks antara kuersetin dengan AlCl ......................................................... 30

Gambar 13. Struktur trietanolaminstearat, penyabunan dari asam stearat dan

trietanolamin ................................................................................... 32 Gambar 14. Mekanisme reaksi hidrolisis glikosida flavonoid menjadi gula dan aglikon menggunakan asam ............................................................ 33 Gambar 15. Struktur metil paraben (A) dan struktur kuersetin (B) ..................... 36

Gambar 17. Gambar struktur setil alkohol ........................................................... 56 Gambar 18. Gambar struktur asam stearat ........................................................... 56 Gambar 19. Gambar struktur metil paraben ......................................................... 56 Gambar 20. Gambar struktur asam sitrat ............................................................. 20 Gambar 21. Gambar struktur trietanolamin ......................................................... 57

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan kurva baku kuersetin ................................................... 45 Lampiran 2. Perhitungan kadar kuersetin terhitung yang ditambahkan ke dalam sediaan krim .................................................................................... 48 Lampiran 3. Perhitungan kadar kuersetin terukur dalam sediaan krim ............... 50 Lampiran 4. Perhitungan recovery dan koefisien variasi kadar kuersetin dalam sediaan krim .................................................................................... 51 Lampiran 5. Dokumentasi .................................................................................... 52 Lampiran 6. Tabel toleransi alat-alat gelas .......................................................... 54 Lampiran 7. Struktur dan kelarutan komponen penyusun formula basis krim .... 55

INTISARI

Khasiat teh untuk kesehatan telah diketahui sejak lama. Salah satu kandungan dari teh yaitu flavonoid memliki aktivitas antioksidan serta memiliki gugus kromofor sehingga dapat dijadikan zat aktif dalam krim sunscreen.

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental karena tidak ada manipulasi terhadap subjek penelitian. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui akurasi dan presisi dari penetapan kadar kuersetin dalam krim dengan basis krim yang telah dioptimasi oleh Prasetya (2008). Kuersetin merupakan salah satu jenis flavonoid golongan flavonol yang digunakan sebagai baku atau standar dalam penetapan kadar tersebut. Penelitian ini merupakan penelitian awal untuk menetapkan kadar flavonoid dalam sediaan krim dengan kandungan flavonoid teh sebagai senyawa aktif. Kompleks antara AlCl

3 dan kuersetin dapat diukur pada panjang gelombang visibel (427,4 nm).

Parameter validitas metode analisis yang digunakan adalah akurasi dan presisi. Parameter tersebut diperoleh dengan perhitungan recovery dan koefisien variasi (CV). Dari percobaan didapatkan nilai recovery sebesar 89,49 - 96,85 %, koefisien variasi sebesar 3,14%. Dapat disimpulkan bahwa penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim dengan metode kolorimetri memiliki nilai validitas yang baik.

Kata kunci : validasi, penetapan kadar, kuersetin, krim, akurasi, presisi

ABSTRACT

Tea effects for health have been known for a long time. Tea contain flavonoid which have antioxidant activity and chromophore so it can be used as active compound in sunscreen cream.

It is non experimental research, because there was no manipulation to the research subject. The aim for this study is to know the accuracy and precision of determination method of quercetin in cream using base cream created by Prasetya (2008). Quercetin is one of flavonoid group that can be used as standard in this experiment. This research is useful as first phase experiment which can be applicated to determine flavonoid concentration in cream that contains tea flavonoid as active compound. The complex between AlCl

3 and quercetin can be measured at visible wavelength (427,4 nm).

Accuracy and precision was used to measure the validity of analysis method. The measurements were obtained from analyzing recovery and Coefficient variance (CV). The result of the recovery was 89,49 - 96,85 %, and the result of coefficient varians was 3.14%. It could be concluded that the determination of quercetin in cream using colometric method has good accuracy and precision Keyword : validity, determination concentration, quercetin, cream, precision, accuracy

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Krim merupakan salah satu bentuk sediaan yang banyak digunakan

untuk penyakit topikal. Di dunia industri, perlu dilakukan pengujian terhadap produk akhir, terlebih jika digunakan senyawa yang berasal dari bahan alam (Lund, 1994). Analisis kuantitatif senyawa aktif dalam sediaan krim diperlukan sebagai kontrol kualitas untuk menjamin bahwa proses produksi telah dilakukan dengan benar dan dapat dipercaya. Hal ini didasarkan pada asumsi bahwa efek yang dihasilkan dalam suatu sediaan disebabkan karena kandungan senyawa aktifnya.

Salah satu jenis senyawa yang digunakan sebagai zat aktif dalam sediaan krim adalah flavonoid teh. Tokusoglu dkk., (2003) mengemukakan kegunaan flavonoid antara lain sebagai agen antiinflamasi, antioksidan dan antialergi. Aktivitas flavonoid teh sebagai antioksidan dapat digunakan untuk melindungi kulit dari pengaruh buruk sinar UV yang berasal dari paparan sinar matahari (Svobodova dkk, 2003). Selain itu, flavonoid teh memiliki gugus kromofor yang mengabsorpsi sinar UV sehingga dapat digunakan sebagai zat aktif dalam krim

sunscreen .

Kuersetin merupakan salah satu jenis flavonoid golongan flavonol (Bruneton 1999). Kuersetin digunakan sebagai baku untuk penetapan kadar dalam sediaan krim dengan metode kolorimetri. Penelitian ini bermanfaat sebagai penelitian awal yang dapat dikembangkan untuk menetapkan kadar flavonoid dalam sediaan krim dengan kandungan flavonoid teh sebagai senyawa aktif.

Penelitian mengenai penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim belum pernah dilakukan, oleh karena itu dibutuhkan suatu metode penetapan kadar yang tervalidasi. Suatu metode perlu divalidasi agar ketika digunakan dengan benar dapat memberikan hasil yang sesuai untuk tujuan analisis (Anonim, 2004). Penelitian ini berguna untuk menemukan langkah kerja yang tepat dan untuk mengetahui apakah prosedur penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim memenuhi parameter metode analisis yang ditentukan. Suatu prosedur analitik mencakup informasi mengenai preparasi sampel, termasuk metode ekstraksi zat aktif dari produk (Anonim, 2004). Prosedur penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim pada penelitian ini merupakan modifikasi prosedur ekstraksi aglikon flavonoid dalam tanaman yang dilakukan oleh Janeska dkk. (2007).

Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian Prasetya (2008) yang telah mengoptimasi formula sediaan krim sunscreen ekstrak kering polifenol teh hijau (Camelia sinensis) dengan asam stearat dan VCO sebagai fase minyak. Sediaan krim yang telah dioptimasi dalam penelitian tersebut digunakan sebagai basis krim untuk penetapan kadar kuersetin pada penelitian ini.

Penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim pada penelitian ini dilakukan dengan metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida (AlCl ).

3 Metode ini dipilih karena reaksi warna dapat meningkatkan kepekaan dan

selektifitas metode (Fell, 1986). Flavonoid dapat membentuk kompleks warna dengan AlCl sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan metode kolorimetri.

3 Menurut Mursyidi (1990), dengan adanya pereaksi AlCl

3 , terjadi kompleks tahan

asam pada gugus hidroksi dan keton yang bertetangga. Sedangkan dengan gugus hidroksi pada kedudukan orto, kompleks yang terjadi tidak tahan asam.

Metode kolorimetri yang sama juga pernah digunakan oleh Pertiwi (2006) untuk penetapan kadar flavonoid dalam fraksi air dan fraksi etil asetat ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam..Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa metode tersebut dapat diaplikasikan untuk menetapkan kadar flavonoid total dalam teh hijau dan teh hitam dan memiliki tingkat validitas yang baik.

Berdasarkan penelitian tersebut, maka kuersetin dalam sediaan krim pada penelitian ini dapat ditetapkan kadarnya menggunakan metode kolorimetri dengan pereaksi AlCl 3 .

B. Perumusan Masalah

Permasalahan yang akan diteliti adalah apakah penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl memenuhi

parameter validasi metode analisis yang baik?

C. Keaslian Karya

Sejauh yang diketahui penulis, penelitian mengenai validasi penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl

3 belum pernah dilakukan.

D. Manfaat Penelitian

Dari penelitian ini diharapkan dapat:

1. Menambah wawasan di bidang ilmu pengetahuan mengenai penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim dengan secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl

3 yang tervalidasi

2. Penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan jika hendak dilakukan penelitian sejenis maupun penelitian pengembangan dari penelitian ini.

E. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian yang dilakukan adalah mengetahui validitas penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl .

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Krim Krim adalah bentuk sediaan setengah padat mengandung satu atau lebih

bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar yang sesuai. Krim merupakan bentuk sediaan setengah padat yang mempunyai konsistensi relatif cair diformulasi sebagai emulsi air dalam minyak atau minyak dalam air. Sekarang ini produksi lebih diarahkan untuk emulsi minyak dalam air yang dapat dicuci dengan air dan ditujukan untuk penggunaan kosmetika dan estetika (Anonim, 1995).

Gambar 1. Sistem emulsi tipe O/W dan W/O

Emulsi adalah sistem heterogen yang mengandung minimal satu cairan yang tidak campur, didispersikan pada cairan lainnya dalam bentuk droplet.

Emulsi terdiri dari fase dispers (fase internal), medium dispers (fase eksternal), dan agen pengemulsi. Diameter droplet umumnya 0,1 sampai 10 µm. Krim ditujukan untuk penggunaan eksternal.

Istilah krim biasanya ditujukan untuk emulsi tipe minyak dalam air sehingga lebih sesuai untuk penggunaan eksternal. Emulsi air dalam minyak bersifat tidak larut air, tidak mudah tercuci, dan terasa berminyak, sedangkan emulsi minyak dalam air akan bercampur dengan air, tercuci oleh air, dan tidak terasa berminyak (Allen, 2002). Salah satu aplikasi bentuk sediaan krim yaitu sebagai sediaan sunscreen.

Sunscreen merupakan bahan yang menyerap atau memantulkan radiasi sehingga

melemahkan energi ultraviolet sebelum terpenetrasi ke kulit (Stanfield, 2003).

B. Analisis Sediaan Krim

Analisis senyawa dalam sediaan krim dapat dilakukan dengan cara merusak bentuk sediaan kemudian mengekstraksi senyawa dalam sediaan tersebut dengan pelarut yang sesuai. Krim pada dasarnya merupakan sistem emulsi yang berisi fase minyak, fase air, dan emulgator. Emulgator berfungsi menurunkan tegangan permukaan antara fase air dan fase minyak sehingga terbentuk sistem emulsi. Sifat khas dari emulgator adalah memiliki gugus polar dan nonpolar pada strukturnya. Jika emulgator dalam sediaan krim dirusak, maka sistem emulsi akan terpecah dan terjadi pemisahan fase air dan fase minyak (Voigt, 1994).

Selanjutnya, untuk memisahkan analit dari senyawa-senyawa lain dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut organik.

Emulgator menurut jenisnya terbagi menjadi emulgaor ionik (anionik dan kationik), emulgator nonionik, dan emulgator amfoter. Contoh emulgator amfoterik adalah N-alkil asam amino, contoh emulgator nonionik adalah eter alkil/aril polioksietilen, contoh emulgator kationik yaitu alkoksialkilamin. Salah satu emulgator anionik adalah trietanolaminstearat, yang disebut juga dengan sabun organik. Emulgator anionik dapat dirusak strukturnya menggunakan asam.

Ion H dari asam akan ditangkap oleh gugus R-COO menjadi R-COOH, sehingga trietanolaminstearat akan kembali menjadi bentuk trietanolamin dan asam stearat (Cunniff, 1995; Senzel, 1977).

C. Flavonoid

1. Struktur dan kegunaan flavonoid

Tokusoglu dkk. (2003) mengemukakan flavonoid mempunyai aktivitas antara lain sebagai agen antiinflamasi, antioksidan dan antialergi. Selain itu, flavonoid juga memiliki aktivitas sebagai antivirus dan antikarsinogenik (Harborne, 1994). Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik dan banyak menghambat reaksi oksidasi dan bertindak sebagai penangkap radikal yang baik dari radikal hidroksi dan superoksida (Robinson,1995). Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika bereaksi dengan radikal bebas, flavonoid membentuk radikal baru yang distabilkan oleh efek resonansi benzen.

3' 4' 2' _{C C C}

8 _{H H H} ₂ ₂ ₂ _O B

2 5' 7 1'

6' A C

5 _O Gambar 2. Kerangka dasar flavonoid Gambar 3. Sistem penomoran flavonoid

2. Isolasi flavonoid

Flavonoid berupa senyawa polifenol, sehingga mempunyai sifat kimia seperti fenol. Adanya gula yang terikat pada aglikon akan menaikkan kepolaritasan dari flavonoid. Senyawa polar akan larut dalam pelarut polar, oleh karena itu glikosida flavonoid larut dalam pelarut polar (Mursyidi, 1990). Secara umum, glikosida larut dalam air dan alkohol. Bentuk gula dari flavonoid bersifat larut air, sedangkan aglikon flavonoid bersifat lipofilik (Bruneton, 1999).

Hidrolisis glikosida flavonoid akan menghasilkan aglikon flavonoid dan gula yang selanjutnya dapat dipisahkan dan diidentifikasi. Untuk tujuan ini digunakan cara hidrolisis, yaitu dengan asam, enzim, dan basa (Mursyidi, 1990).

3. Kuersetin

Kuersetin adalah senyawa flavonoid golongan aglikon flavonol. Dalam tumbuhan, flavonoid biasanya terikat dalam bentuk glikosida flavonoid (Robinson, 1995). Budavari (1989) menyebutkan bahwa aglikon kuersetin tidak larut dalam air. Menurut Chebil dkk. (2007) aseton merupakan pelarut yang paling baik untuk melarutkan flavonoid. Kuersetin mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, antiinflamasi, antiplatelet, antineoplastik, antiviral, dan antihistamin (Susan, 2003). _OH _OH _OH _OH _{HO O} _OH HO O _OH OH O ^O

4. Metode kuantifikasi flavonoid

Metode kuantifikasi flavonoid klasik yang paling banyak digunakan adalah kolorimetri atau spektrofotometri, dengan menggunakan pereaksi AlCl

3 (Bruneton, 1999).

Aluminium klorida digunakan sebagai pereaksi pengompleks dengan gugus orto-dihidroksi dan menimbulkan pergeseran khas menuju pita panjang gelombang tinggi yang berguna pada analisis beberapa golongan flavonoid (Robinson, 1995).

Pereaksi AlCl

3 dan flavonoid akan membentuk kompleks tahan asam

antara gugus hidroksi dan keton yang bertetangga. Sedangkan dengan gugus hidroksi pada kedudukan orto, kompleks yang terjadi tidak tahan asam (Mursyidi, 1990).

Tipe kompleks yang dihasilkan antara AlCl

3 dengan beberapa flavon dan

flavonol dengan ada atau tidaknya asam digambarkan sebagai berikut: _OH _OH _{O Al} _O _Cl _OH _OH ^{HO O} ^{HO O} ^{HO O}

AlCl

_OH _{O Al} _Cl _O _Cl H _O _Cl _Al _O _Cl

3 O

Flavonol

Gambar 6. Reaksi pembentukan kompleks antara AlCl dengan flavonol

₃

_OH _OH _{HO O} _{O Al} _O Cl _{HO O} _OH _OH

HO O

H AlCl _{OH O}

3 _{Cl Cl} _{O O} _Al _{Cl Cl} _{O O} _Al Flavon

Gambar 7. Reaksi pembentukan kompleks antara AlCl ^{3 dengan flavon}

D. Ekstraksi Cair-cair

Ekstraksi adalah suatu metode pemisahan komponen dari suatu campuran dengan menggunakan suatu pelarut. Metode ini paling sering digunakan untuk proses pemisahan. Alat yang digunakan tidak khusus dan sederhana, jika tidak dinyatakan lain, maka alat yang digunakan untuk pemisahan adalah corong pisah (Khopkar,1990).

Ekstraksi pelarut dapat dilakukan baik dalam tingkat makro maupun mikro. Prinsip metode ini didasarkan pada distribusi zat tersebut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Zat terlarut dapat ditransfer pada jumlah yang berbeda dalam kedua fase pelarut (Khopkar,1990).

Pada kesetimbangan akan terjadi:

[ ]

X KD = [ ]

2 X

1 adalah kadar zat terlarut pada pase pertama (fase organik), [ ]

sedangkan [

X 2 ] adalah kadar zat terlarut pada fase kedua (fase air). Semakin

besar nilai koefisien distribusi (KD), maka semakin besar kadar zat yang terlarut pada fase organik. Sedangkan nilai KD yang kecil menunjukkan bahwa kadar zat yang terlarut dalam fase organik kecil (Khopkar,1990).

E. Spektrofotometri Visibel

1. Interaksi elektron dengan radiasi elektromagnetik

Suatu senyawa organik memiliki tiga macam elektron, antara lain elektron pi ( π), sigma (σ), dan elektron pasangan bebas (n). Jika suatu molekul terpancar radiasi elektromagnetik, maka akan terjadi eksitasi elektron ke tingkat yang lebih tinggi (Mulya dan Suharman, 1995). Metode spektroskopik analisis tergantung pada pengukuran radiasi elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit (Skoog, 1994).

Eksitasi elektron σ ke σ* terjadi pada ikatan tunggal, eksitasi elektron π ke

π* terjadi pada ikatan rangkap dua dan tiga. Sedangkan eksitasi elektron n ke σ* atau n ke π* terjadi pada atom yang memiliki pasangan elektron bebas (Mulya dan Suharman, 1995).

2. Analisis kuantitatif menggunakan spektrofotometri visibel

Analisis kuantitatif zat tunggal dengan metode spektrofotometri visibel dilakukan dengan mengukur harga absorbansi (A) pada panjang gelombang maksimum. Alasan dilakukan pengukuran pada panjang gelombang tersebut adalah: perubahan absorban untuk setiap satuan kadar adalah paling besar pada panjang gelombang maksimal, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Selain itu, pita serapan di sekitar panjang gelombang maksimal adalah datar dan pengukuran ulang memberikan kesalahan yang kecil sehingga akan memenuhi hukum Lambert-Beer (Mulya dan Suharman, 1995).

3. Kolorimetri

Metode kolorimetri dapat digunakan untuk penetapan kadar flavonoid yaitu dengan menggunakan pereaksi AlCl

3 . Terjadi kompleks tahan asam antara

gugus hidroksi dan keton yang bertetangga dengan pereaksi AlCl

3 dan

membentuk kompleks tidak tahan asam dengan gugus ortohidroksi pada flavonoid. Oleh karena itu, pereaksi AlCl digunakan untuk mendeteksi kedua

3 gugus tersebut (Mursyidi, 1990).

Penetapan kadar secara kolorimetri harus memenuhi beberapa kriteria, antara lain (Vogel, 1994):

1. Selektivitas reaksi warna

2. Kesebandingan antara warna dan kadar

3. Kestabilan warna

4. Reprodusibilitas

5. Kejernihan larutan

6. Sensitivitas

F. Validasi Metode Analisis

Validasi merupakan suatu dasar untuk memastikan kualitas dan reliabilitas hasil analisis (Ermer and Miller, 2005). Parameter-parameter validasi metode analisis antara lain :

1. Akurasi, menunjukkan kedekatan hasil analisis yang diperoleh menggunakan metode analisis tertentu dengan nilai yang sebenarmya. Penentuan akurasi metode analisis dapat dilakukan dengan cara membandingkan kadar terukur dari suatu senyawa standar yang sengaja ditambahkan ke dalam sampel pada jumlah yang tertentu pula. Harga perbandingan tersebut dikenal sebagai persen perolehan kembali (recovery) (Anonim, 2003). Tabel berikut ini ialah kriteria penerimaan akurasi yang baik

Tabel I. Kriteria akurasi metode analisis

Kadar zat aktif / Rata-rata recovery

impurities yang yang diterima (%)

diukur (%) 98 – 102 ≥ 10 90 - 110

≥1 0,1 – 1 80 - 120

< 0,1 75 - 125 (Anonim,2004)

2. Presisi, merupakan kedekatan suatu hasil analisis dengan hasil analisis yang lain pada beberapa penentuan kuantitatif pada sampel yang sama dan homogen dengan menggunakan metode analisis yang sama. Presisi biasanya dinyatakan dengan persen koefisien variansi (CV). Tabel berikut ini ialah kriteria penerimaan presisi yang baik

Tabel II. Kriteria presisi metode analisis

Kadar analit Kriteria presisi dalam sampel yang diterima yang diukur (%) (CV) dalam %

≥ 10,0 ≤ 2 1,0 – 10,0

≤ 5 0,1 – 1,0

≤ 10 < 0,1

≤ 20 (Anonim,2004)

3. Spesifisitas (selektivitas), menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur suatu analit dalam campuran yang kompleks tanpa adanya pengaruh dari komponen lain dalam campuran (Christian, 2004).

4. Limit of detection (LOD) merupakan jumlah analit terkecil yang masih dapat terdeteksi.

5. Limit of quantitation (LOQ) merupakan jumlah analit terkecil yang masih dapat terukur dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima.

6. Linearitas, merupakan kemampuan metode analisis untuk menghasilkan nilai yang proporsional terhadap kadar analit dalam sampel pada rentang kadar tertentu (Christian, 2004).

7. Range, merupakan rentang kadar terendah sampai kadar tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan akurasi, presisi, dan linearitas yang memadai (Anonim, 2003).

G. Landasan teori

Penetapan kadar senyawa dalam sediaan krim dapat dilakukan dengan cara merusak sediaan dan menarik analit dengan pelarut yang sesuai. Pemilihan pelarut didasarkan pada sifat kelarutan analit.

Krim terdiri atas minyak dan air yang membentuk emulsi dengan bantuan emulgator. Pada sediaan krim yang mengandung emulgator anionik, struktur emulgator tersebut dapat dirusak dengan menggunakan asam sehingga krim kembali menjadi bentuk minyak dan air yang terpisah. Kuersetin sebagai analit dalam sediaan krim memiliki kelarutan yang baik dalam etil asetat sehingga kuersetin dalam krim dapat diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat.

Kuersetin mempunyai gugus –OH yang bertetangga dengan gugus karbonil dan 2 gugus –OH pada posisi orto sehingga dapat membentuk kompleks dengan pereaksi AlCl

3 . Kompleks antara kuersetin dengan AlCl 3 dapat diukur secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer visibel.

Penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl dinyatakan valid jika memenuhi parameter validasi metode

3 analisis.

Hipotesis

Berdasarkan landasan teori di atas, maka penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl memiliki validitas

3 yang baik.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian non eksperimental karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek penelitian. B. Definisi Operasional

1. Penetapan kadar kuersetin dilakukan menggunakan metode kolorimetri dengan menggunakan pereaksi AlCl

2. Parameter validasi penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim yang digunakan adalah akurasi dan presisi.

3. Penentuan akurasi dan presisi penetapan kadar kuersetin dalam krim dilakukan dengan menambahkan larutan baku kuersetin dengan kadar tertentu ke dalam basis krim, diekstraksi, dan diukur kadarnya dengan spektrofotometer visibel.

4. Basis krim yang digunakan adalah krim dengan komposisi yang telah ditentukan, yaitu: asam stearat, virgin coconut oil (VCO), trietanolamin (TEA), cethyl alcohol, metil paraben, asam sitrat, dan air.

C. Variabel Penelitian

Variabel dalam penelitian ini adalah kadar kuersetin yang terdapat dalam sediaan krim

D. Alat dan Bahan Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis (Perkin-Elmer Lambda 20), pipet mikro 0,5 – 5,0 ml (Socorec), neraca analitik merk Scaltec SBC 22 max 60/210 g; d = 0,01/0,1 mg; e = 1 mg, waterbath, alat-alat gelas (Pyrex-Germany).

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kuersetin trihidrat p.a. (Sigma), etil asetat p.a. (Merck), aseton p.a. (Merck), HCl p.a.

(Merck), asam asetat p.a. (J.T. Bakker), metanol p.a. (J.T. Bakker), kloroform p.a. (Merck), AlCl

3 .6H

2 O p.a. (Merck), heksamin farmasetis (MKR), natrium sitrat

farmasetis (MKR), akuades, dan basis krim dengan formula sebagai berikut: Asam stearat 4,0 g

Virgin Coconut Oil (VCO) 3,5 g

Trietanolamin (TEA) 0,8 g

Cethyl Alcohol 3,5 g

Asam sitrat 0,5 g Metil paraben 0,25 g Air 60,0 g

E. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan pereaksi

a. Larutan HCl 25 % dalam akuades. HCl 37 % 67,56 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga b. Larutan heksamin 0,5 % dalam akuades. Heksamin 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga tanda.

c. Larutan natrium sitrat 0,5 % dalam akuades. Natrium sitrat 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga tanda.

d. Larutan asam asetat 5 % dalam metanol. Asam asetat glasial 25 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml. Metanol ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut hingga tanda.

e. Larutan aluminium klorida 2% dalam asam asetat 5 % dalam metanol. Aluminium klorida 2 g dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Asam asetat 5 % dalam metanol 25 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan didegassing selama 5 menit. Asam asetat 5 % dalam metanol ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda.

2. Pembuatan larutan baku

a. Larutan stok kuersetin 500 ppm. Sebanyak kurang lebih 25,0 mg serbuk kuersetin ditimbang seksama dan dimasukkan dalam labu ukur 50 ml. Etil asetat 15 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan didegassing selama 5 menit. Etil asetat ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda.

b. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm. Larutan stok kuersetin 500 ppm 2,50 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Larutan diencerkan dengan etil asetat hingga tanda.

3. Pembuatan blangko

Etil asetat 10,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Setelah itu ditambahkan AlCl

3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,0 ml dan

natrium sitrat 0,5 ml. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda.

4. Optimasi metode

a. Penetapan Operating time. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 2,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. AlCl

3 2 % (dalam asam asetat 5 %

dalam metanol) 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu tersebut. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum teoritis (428 nm) selama 60 menit.

b. Penetapan panjang gelombang absorbansi maksimum. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 1,50 ml; 3,00 ml; 4,00 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan AlCl

3 2 % (dalam asam

asetat 5 % dalam metanol) 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada rentang panjang gelombang 400-500 nm.

c. Penetapan kurva baku. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 1,00 ml; 1,50 ml; 2,00 ml; 2,50 ml; 3,00 ml; 3,50 ml; dan 4,00 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. AlCl

3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,00 ml dan

natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu ukur. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Pengukuran absorbansi dilakukan pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada panjang gelombang 427,4 nm.

5. Penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim

a. Pembuatan basis krim

Tabel III. Formula basis krim

Senyawa penyusun Komposisi formula basis krim (g) 4,0

Asam stearat 3,5

VCO Cethyl alcohol 3,5

Trietanolamin 0,8 60,0

Akuades Metil paraben 0,25 Asam sitrat 0,5 g

Asam stearat dan cethyl alcohol dilelehkan secara terpisah di atas

waterbath , kemudian dicampur dalam keadaan panas. Trietanolamin, VCO dan

metil paraben ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diaduk hingga merata. Akuades sebanyak 2/3 bagian ditambahkan ke dalam campuran dan dicampur menggunakan mikser dengan kecepatan 400 rpm selama 15 menit. Asam sitrat dilarutkan ke dalam 1/6 bagian akuades, kemudian ditambahkan ke dalam campuran sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan mikser kecepatan 400 rpm selama 30 menit. Sisa akuades ditambahkan ke dalam campuran sambil b. Ekstraksi kuersetin dari basis krim. Basis krim lebih kurang 20 g ditimbang seksama kemudian dimasukkan ke dalam labu alas bulat dengan bantuan batang pengaduk. Larutan baku kuersetin 200 ppm (dalam aseton) 5,0 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat tersebut. Aseton 25 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat. Larutan heksamin 0,5% 1,00 ml dan larutan HCl 25% 2,00 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat, refluks dengan pemanasan dalam

waterbath pada suhu 70°C selama 30 menit.