ISOLASI DNA DARI TANAMAN Brassica juncea
ISOLASI DNA DARI TANAMAN Brassica juncea
Khurin’in (1112095000006)¹
drh. Bhintarti S. Hastari, M.Biomed²
Festy Aulyaur Rahmah, S.Si²
Nugroho Adi Maulana³
Indina Reihannisha³
¹Mahasiswa Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
²Dosen praktikum Biologi Molekular
³Asisten praktikum Biologi Mlekular
Jl. Ir. H. Juanda No.95 Ciputat 15412 Indonesia
Hurin.rin02@gmail.com
17 Oktober 2014
ABSTRAK
Isolasi DNA tanaman adalah langkah pertaman dalam teknik pemuliaan tanaman untuk mengeksploitasi
genetik tanaman sehingga didapat sifat tanaman yang unggul. Dalam praktikum isolasi DNA tanaman
kali ini digunakan daun muda dan segar dari tanaman sawi hijau yang sedikit kontaminan DNA dan
metabolit sekundernya. Sawi hijau merupakan salah satu komoditi tanaman yang populer di pasaran,
mudah ditemukan dengan harga terjangkau. Beberapa teknik yang perlu diperhatikan dalam isolasi DNA
tanaman yaitu proses isolasi jaringan secara mekanik seperti penggerusan untuk mempermudah proses
pelisisan dinding sel tanaman yang strukturnya lebih kompleks dibandingkan struktur dinding sel bakteri.
Selain itu perlu juga diperhatikan metabolit sekunder yang terdapat pada bagian tanaman yang akan
diisolasi karena dapat menjadi kontaminan sehingga menghambat proses isolasi DNA.
Kata kunci : Isolasi, DNA, tanaman
I.
DASAR TEORI
Sawi hijau (Brassica juncea) merupakan
berbunga. Seluruh bagian dari tanaman ini
komoditi tanaman sayuran yang populer di
diambil kecuali akarnya (Susanti, 2012).
Isolasi DNA pada tanaman digunakan
pasaran. Sawi hijau mudah tumbuh di dataran
sebagai
rendah ataupun dataran tinggi sehingga mudah
pemuliaan
didapat. Pada suhu yang sejuk akan lebih cepat
potensi genetik suatu tanaman (Stoskopf et al.,
langkah
awal
tanaman
dalam
untuk
melakukan
mengeksploitasi
1993) yang bertujuan memaksimumkan hasil
jenis
pada suatu kondisi lingkungan tertentu dalam
(Kusumawaty, 2012).
DNA yang diisolasi dari tanaman
suatu
usaha
budidaya
pertanian
dengan
meminimalkan keluaran. Salah satunya lewat
modifikasi keragaman tanaman. Keberhasilan
usaha pemuliaan tanaman sangat tergantung pada
kemampuan mengidentifikasi induk jenis unggul
yang
sifatnya
akan
digabungkan
melalui
persilangan serta mengenali dan menyeleksi
dalam populasi yang bersegeregasi secara efektif
dan hal ini dapat dilakukan melalui tahap isolasi
DNA terlebih dahulu (Shivanna dan Sawhney,
jumlah
Berbagai teknik analisis dalam pemulian
ukuran
yang
sama
seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan
metabolit
sekunder
seperti
tanin,
pigmen,
alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari
hewan lebih banyak mengandung protein. Salah
satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi
adalah proses destruksi dinding sel untuk
melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena
tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan
seringkali
kontaminasi
1997).
dan
pada
beberapa
tersebut
sulit
jenis
tanaman,
dipisahkan
dari
ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di
tanaman dan biologi molekuler yang berdasarkan
atas
pada hibridisasi molekuler atau Polymerase
misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi
Chain Reaction (PCR) membutuhkan DNA
dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan
dalam jumlah yang cukup dan kualitas yang
PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki
baik. Oleh karena kandungan senyawa sekunder
kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan
dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap
teknik dan metode khusus untuk menghancurkan
tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang
sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel
optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat
(Kusumawaty, 2012).
digunakan
sebagai
bahan
dalam
dapat
menghambat
aktivitas
enzim,
analisis
molekuler. Optimasi prosedur tersebut dapat
II.
MATERI DAN METODE
dilakukan terhadap komposisi larutan bufer
Praktikum isolasi DNA tanaman ini
lisisnya ataupun teknik penanganan fisik dalam
dilaksanakan pada hari Jum’at, 24 Oktober 2014
pemisahan DNA genom dari senyawa lain. Pada
pkl. 13.30-16.00 WIB di Laboritorium Biologi
prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan
Dasar Pusat Laboritorium Terpadu Fakultas
melindungi DNA genom dari degradasi akibat
Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah
senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel
Jakarta.
dihancurkan atau kerusakan akibat penanganan
fisik (Miligan, 1992).
Pada dasarnya
isolasi
DNA
dapat
dilakukan dari berbagai sumber, antara lain
organ manusia, darah, daun, daging buah,
serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik
ikan. Pada individu yang sama DNA yang
diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki
Alat-alat
yang
digunakan
yaitu
mikropipet, refrigerated centrifuge, water bath
dan refrigerator.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu daun
sawi, bufer ekstraksi, kloroform, isoamilalkohol,
isopropanol dan bufer TE.
Daun sawi muda yang segar ditimbang
0,3 gram dan dimasukkan ke dalam tabung
mikro steril. Dilunakkan daun selama 10 menit
lainnya serta pertulangan daunnya tidak banyak
pada suhu ruang, tip steril digunakan sebagai
dan keras mempermudah pengerjaan dalam
penumbuk
menggunakan
proses isolasi jaringan. Selain itu akar memiliki
penambahan buffer). 500 ʯL bufer ekstraksi
struktur yang keras sehingga sulit dalam proses
(200 mM Tris-HCl pH 7,5), 250 mM NaCl, 25
isolasi
mM EDTA, dan 0,5% SDS) dimasukkan
terdapat banyak metabolit-metabolit sekunder
kedalam tabung lalu divortex selama 5 menit.
yang dapat menjadi kontaminan yang sulit
daun
Tabung
(tanpa
kemudian
diinkubasi
dalam
jaringannya,
dipisahkan
dari
sedangkan
ekstrak
pada
asam
buah
nukleat
waterbath pada suhu 60 ºC selama 30 menit.
(Kusumawaty, 2012). Adapun hasil dari berbagai
Ditambahkan kloroform: isoamil alkohol (24:1)
tahapan dalam isolasi DNA dari tanaman sawi
sebanyak 1 x volume sampel. Tabung kemudian
hijau dapat dilihat pada tabel 3.1.
dikocok dan lalu disentrifuga pada 15.000 x
selama 5 menit pada suhu 4ºC. diambil
uspernatan lalu dipindahkan ke tabung mikro
Tabel 3.1. Hasil isolasi DNA sawi hijau
(Brassica juncea)
Tahap
Proses
tabung sebanyak 1x volume sampel. Tabung
Isolasi
(bahan)
Pelunakan
kemudian dikocok dan diinkubasi pada suhu -20
jaringan
daun
yang baru. Isopropanol ditambahkan kedalam
ºC
selama
15
menit.
Tabung
kemudian
itu
ditambahkan
dibuang
100
ʯL
supernatannya
bufer
TE.
(tip
steril secara
disentrifuugasi pada 15.000 x g selama 5 menit
setelah
Hasil
manual)
dan
Tabung
Daun menjadi
dimasukkan kedalam es selama 5 menit dan
kemudian disentrifugasi kembali pada 15.000 x g
halus
Lisis sel
Pelisisan
selama 2 menit. Diambil supernatan yang
sel dengan
mengandung DNA kemudian dipindahkan ke
500
tabung yang baru dan simpan tabung pada suhu
bufer
-20 ˚ C.
ekstraksi
ʯL
HASIL DAN PEMBAHASAN
mM Ekstrak daun
dalam larutan
Tris-HCl
Isolasi DNA dari tanaman sawi hijau
pH
7,5), bufer ekstrak
(Brassica juncea) pada tahap pertama yaitu
250
mM
dilakukan isolasi jaringan yang diambil dari daun
NaCl,
sawi hijau yang masih muda dan segar.
mM EDTA,
Pemilihian sawi hijau adalah karena sawi hijau
dan
merupakan komoditi sayuran yang mudah
SDS)
didapat dan harganya terjangkau (Susanti, 2012),
divorteks
selain itu struktur daunnya yang tidak tebal, tidak
(5 menit).
Denaturasi
(200
III.
terdapat trikom ataupun modifikasi epidermis
Purifikasi
25
0,5%
dan
tahap I
dan
presipitasi
1
2
protein
Pemekatan
Presipitasi
DNA
DNA
(isopropan
3
(kloroform:
ol
isoanil
alkohol
(24:1) 1 x
1x
a
volume
sampel)
Terbentuk tiga
volume
fasa:
1. Fasa Atas :
sampel)
DNA murni
a. Pelet
atau
presipitat DNA
Pengaweta
Presipitat
n DNA
DNA
a
ditambah
dan air
bufer TE
(supernatan)
2. Interfasa :
b
protein dan
a. Bufer TE
b. Presipitat DNA
zat-zat sisa
atau sampah
3. Fasa organik :
murni
kloroform dan
Tahap pertama yaitu isolasi jaringan
senyawasenyawa
organik terikat
dimana pada tahap ini daun sawi hijau ditumbuk
dengan tip steril hingga halus. Tahap ini
bertujuan untuk mempermudah tahap pelisisan
sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki
dinding sel yang kuat dan seringkali pada
beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut
sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat.
Kehadiran
kontaminasi
di
atas
dapat
menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA
tidak
sensitif
oleh
enzim
restriksi
dan
menggangu proses amplifikasi DNA dengan
PCR, sehingga memerlukan teknik dan metode
khusus untuk menghancurkan sel hingga isi
dapat terpisah atau keluar dari sel salah satunya
yaitu dengan penumbukan (Kusumawaty, 2012).
Tahap kedua setelah penumbukan yaitu
lisis
sel.
Pelisisan
sel
yaitu
dengan
menambahkan 500 ʯL bufer ekstraksi (200 mM
Tris-HCl pH 7,5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA,
dan 0,5% SDS) kedalam tabung berisi daun yagn
sudah dihaluskan kemudian divorteks selama 5
di fasa paling atas akibat adanya penambahan
menit
kloroform.
agar
homogen.
Penambahan
bufer
ekstraksi yaitu untuk merusak membran sel dan
Tahap selanjutnya adalah pemekatan
menjaga struktur DNA selama proses pelisisan
DNA.
dengan berbagai campuran. NaCl berfungsi
memisahkan DNA dari larutan dapat dilakukan
untuk menghilangkan polisakarida, sebagaimana
dengan presipitasi dengan menggunakan alkohol
telah dijelaskan sebelumnya bahwa dinding sel
seperti
tanaman mengandung polisakarida dan metabolit
isopropanol umumnya dilakukan dalam kondisi
lain
Keberadaan
suhu dingin yaitu dengan diinkubasi pada suhu
polisacharida dan metabolit sekunder dalam sel
-20ºC selama 15 menit, suhu ini mendukung
tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam
DNA dalam bentuk presipitat. Setelah perlakuan
nukleat (Wilkins dan Smarts, 1996). EDTA
itu, DNA akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan
berfungsi untuk mencegah koagulasi DNA
dengan sentrifugasi.
sedangkan
merusak
dengan isopropanol langsung terlihat adanya
membran sel. Setelah dilakukan vorteks, tabung
pemisahan larutan menjadi dua fasa, dan DNA
kemudian diinkubasi di waterbath pada suhu
terprepitisasi dibawah (lampiran 7.)
60ºC
(Kusumawaty,
SDS
selama
2012).
berfungsi
30
menit,
untuk
tujuannya
agar
mengoptimalkan kerja dari bufer ekstrak.
Cara
sederhana
isopropanol.
Tahap
dan
murah
Proses
untuk
presipitasi
Pada saat penambahan
berikutnya
yaitu
pengawetan
prespitat DNA pada yang telah didapat dengan
Tahap ketiga yaitu purifikasi DNA, tahap
menggunakan bufer TE dan disimpan pada suhu
ini berfungsi untuk memisahkan DNA dengan
-20ºC.
Perlakuan
penyimpanan
pada
suhu
protein lain dan sisa-sisa dari larutan pada saat
tersebut dan penambahan Bufer TE berfungsi
proses pelisisan sel. Pada tahap ini ditambahkan
untuk mengawetkan DNA, dan menjaga kondisi
CIAA (24:1) sebanyak 1 x volume sampel.
pellet DNA tidak rusak.
Pelarut organik ini secara signifikan dapat
mendenaturasi
protein
dan
melarutkan
komponen lipid, selain itu kloroform juga
menstabilkan
zona
interfase
yang
berisi
kontaminan DNA. Pada penambahan kloroform
ini akan menghasilkan tiga fasa yaitu paling atas
adalah DNA dan air, fasa kedua protein dan sisasisa kontaminan atau sampah dari sel yang
disebut juga zona interfase, dan fasa ketiga
adalah kloroform seta senyawa-senyawa organik
IV.
KESIMPULAN
Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA
dari tanaman sawi hijau (Brassica juncea) yaitu:
1. Bagian tanamna yang diambil harus
dalam keadaan masih muda dan segar
karena kontaminannya lebih sedikit.
2. Dilakukan
penggerusan
dalam
mengisolasi
struktur
kontaminannya sehingga DNA yang didapat
merupakan
DNA
murni,
selain
itu
juga
memudahkan pengambilan DNA yang terdapat
dinding
karena
selnya
kompleks dibandingkan bakteri.
yang diikatnya sehingga disebut juga fasa
organik. Fase ini memisahkan DNA dengan
jaringannya
DAFTAR PUSTAKA
lebih
Kusumawaty, Diah. 2012. Materi Kuliah; Isolasi
Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide to
DNA Kecil. Pendidikan Biologi UPI.
RNA. Isolation, Analysis and Synthesis.
Bandung.
Wiley – Liss. New York.
Miligan, B.G. 1992. Plant DNA Isolation. In:
A.R. Hoelzel (Ed). Molecular Genetic
Analysis of Populations, a Practical
Aproach. Oxford University Pres. New
York.
Shivanna K.R., Sawhney V.K. 1997. Pollen
biology and pollen biotechnology: an
introduction In Pollen Biotechnology
for Crop Production and Improvement
Cambridge University Press.
Stoskopf, N.C., Thomes D.T. dan Christie B.R.
1993. Plant Breeding, Theory and
Practice. Westview Press. Oxpord.
Susanti, T., Rondonuwu F.S. dan Sutresno A.
2012. Pengaruh musik pada range
frekuensi (3000-6000 Hz) terhadap
pertumbuhan dan produktivitas sawi
hijau (Brassica juncea). FMIPA Fisika
Universitas
Kristen
Satya
Wacana.
Diponegoro.
Wilkins, T.A. and Smart, L.B. 1996. Isolation of
RNA from Plant Tissue. Di dalam:
V1 = 0,19
5.
Ditanya: volume yang diambil untuk 2,44
ml dengan total 7,5 ml?
dd H2O (Aquades ) = 7,5 – 2,44 = 5,06
ml
LAMPIRAN
Lampiran Perhitungan Pengenceran
1.
Lampiran Gambar
Diketahui: 1 M Tris-HCL Ph 7,5 200Mm
Tris-HCL Ph 7,5 diambil sebanyak 1,5ml
dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1.V1 = M2. V2
1000. V1 = 7,5. 200
V1= 1,5 ml
2.
Diketahui: 5 M NaCl 250 Mm NaCl
diambil sebanyak 0,375 ml dengan total
7,5 ml
Lampiran 1. Penambahan Buffer Ekstraksi dan
divortex
Ditanya: V1?
M1. V1 = M2. V2
5000 . V1 = 7,5. 250
Lampiran 2. Inkubasi 30 menit suhu 60oC
V1 = 0,375 ml
3.
Diketahui: 0,5 M EDTA
25
Mm
EDTA diambil sebanyak 0,375 ml
dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V1 = M2. V2
Lampiran 3. Penambahan isopropanol
500 . V1 = 7,5 . 25
V1 = 0,375 ml
4.
Diketahui: 20 % SDS 0,5 % SDS diambil
sebanyak 0,19 ml dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V2 = M2. V2
20 . V1 = 7,5 . 0,5
Lampiran 4. Sentrifugasi 6000rpm selama 10
menit
Lampiran 8. Penambahan buffer TE pada pelet
Lampiran 5. Hasil setelah di sentrifugasi
Lampiran 8. Supernatan didinginkan
Lampiran 6. Supernatan diambil
Lampiran 7. Penambahan isopropanol
Khurin’in (1112095000006)¹
drh. Bhintarti S. Hastari, M.Biomed²
Festy Aulyaur Rahmah, S.Si²
Nugroho Adi Maulana³
Indina Reihannisha³
¹Mahasiswa Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
²Dosen praktikum Biologi Molekular
³Asisten praktikum Biologi Mlekular
Jl. Ir. H. Juanda No.95 Ciputat 15412 Indonesia
Hurin.rin02@gmail.com
17 Oktober 2014
ABSTRAK
Isolasi DNA tanaman adalah langkah pertaman dalam teknik pemuliaan tanaman untuk mengeksploitasi
genetik tanaman sehingga didapat sifat tanaman yang unggul. Dalam praktikum isolasi DNA tanaman
kali ini digunakan daun muda dan segar dari tanaman sawi hijau yang sedikit kontaminan DNA dan
metabolit sekundernya. Sawi hijau merupakan salah satu komoditi tanaman yang populer di pasaran,
mudah ditemukan dengan harga terjangkau. Beberapa teknik yang perlu diperhatikan dalam isolasi DNA
tanaman yaitu proses isolasi jaringan secara mekanik seperti penggerusan untuk mempermudah proses
pelisisan dinding sel tanaman yang strukturnya lebih kompleks dibandingkan struktur dinding sel bakteri.
Selain itu perlu juga diperhatikan metabolit sekunder yang terdapat pada bagian tanaman yang akan
diisolasi karena dapat menjadi kontaminan sehingga menghambat proses isolasi DNA.
Kata kunci : Isolasi, DNA, tanaman
I.
DASAR TEORI
Sawi hijau (Brassica juncea) merupakan
berbunga. Seluruh bagian dari tanaman ini
komoditi tanaman sayuran yang populer di
diambil kecuali akarnya (Susanti, 2012).
Isolasi DNA pada tanaman digunakan
pasaran. Sawi hijau mudah tumbuh di dataran
sebagai
rendah ataupun dataran tinggi sehingga mudah
pemuliaan
didapat. Pada suhu yang sejuk akan lebih cepat
potensi genetik suatu tanaman (Stoskopf et al.,
langkah
awal
tanaman
dalam
untuk
melakukan
mengeksploitasi
1993) yang bertujuan memaksimumkan hasil
jenis
pada suatu kondisi lingkungan tertentu dalam
(Kusumawaty, 2012).
DNA yang diisolasi dari tanaman
suatu
usaha
budidaya
pertanian
dengan
meminimalkan keluaran. Salah satunya lewat
modifikasi keragaman tanaman. Keberhasilan
usaha pemuliaan tanaman sangat tergantung pada
kemampuan mengidentifikasi induk jenis unggul
yang
sifatnya
akan
digabungkan
melalui
persilangan serta mengenali dan menyeleksi
dalam populasi yang bersegeregasi secara efektif
dan hal ini dapat dilakukan melalui tahap isolasi
DNA terlebih dahulu (Shivanna dan Sawhney,
jumlah
Berbagai teknik analisis dalam pemulian
ukuran
yang
sama
seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan
metabolit
sekunder
seperti
tanin,
pigmen,
alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari
hewan lebih banyak mengandung protein. Salah
satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi
adalah proses destruksi dinding sel untuk
melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena
tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan
seringkali
kontaminasi
1997).
dan
pada
beberapa
tersebut
sulit
jenis
tanaman,
dipisahkan
dari
ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di
tanaman dan biologi molekuler yang berdasarkan
atas
pada hibridisasi molekuler atau Polymerase
misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi
Chain Reaction (PCR) membutuhkan DNA
dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan
dalam jumlah yang cukup dan kualitas yang
PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki
baik. Oleh karena kandungan senyawa sekunder
kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan
dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap
teknik dan metode khusus untuk menghancurkan
tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang
sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel
optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat
(Kusumawaty, 2012).
digunakan
sebagai
bahan
dalam
dapat
menghambat
aktivitas
enzim,
analisis
molekuler. Optimasi prosedur tersebut dapat
II.
MATERI DAN METODE
dilakukan terhadap komposisi larutan bufer
Praktikum isolasi DNA tanaman ini
lisisnya ataupun teknik penanganan fisik dalam
dilaksanakan pada hari Jum’at, 24 Oktober 2014
pemisahan DNA genom dari senyawa lain. Pada
pkl. 13.30-16.00 WIB di Laboritorium Biologi
prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan
Dasar Pusat Laboritorium Terpadu Fakultas
melindungi DNA genom dari degradasi akibat
Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah
senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel
Jakarta.
dihancurkan atau kerusakan akibat penanganan
fisik (Miligan, 1992).
Pada dasarnya
isolasi
DNA
dapat
dilakukan dari berbagai sumber, antara lain
organ manusia, darah, daun, daging buah,
serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik
ikan. Pada individu yang sama DNA yang
diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki
Alat-alat
yang
digunakan
yaitu
mikropipet, refrigerated centrifuge, water bath
dan refrigerator.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu daun
sawi, bufer ekstraksi, kloroform, isoamilalkohol,
isopropanol dan bufer TE.
Daun sawi muda yang segar ditimbang
0,3 gram dan dimasukkan ke dalam tabung
mikro steril. Dilunakkan daun selama 10 menit
lainnya serta pertulangan daunnya tidak banyak
pada suhu ruang, tip steril digunakan sebagai
dan keras mempermudah pengerjaan dalam
penumbuk
menggunakan
proses isolasi jaringan. Selain itu akar memiliki
penambahan buffer). 500 ʯL bufer ekstraksi
struktur yang keras sehingga sulit dalam proses
(200 mM Tris-HCl pH 7,5), 250 mM NaCl, 25
isolasi
mM EDTA, dan 0,5% SDS) dimasukkan
terdapat banyak metabolit-metabolit sekunder
kedalam tabung lalu divortex selama 5 menit.
yang dapat menjadi kontaminan yang sulit
daun
Tabung
(tanpa
kemudian
diinkubasi
dalam
jaringannya,
dipisahkan
dari
sedangkan
ekstrak
pada
asam
buah
nukleat
waterbath pada suhu 60 ºC selama 30 menit.
(Kusumawaty, 2012). Adapun hasil dari berbagai
Ditambahkan kloroform: isoamil alkohol (24:1)
tahapan dalam isolasi DNA dari tanaman sawi
sebanyak 1 x volume sampel. Tabung kemudian
hijau dapat dilihat pada tabel 3.1.
dikocok dan lalu disentrifuga pada 15.000 x
selama 5 menit pada suhu 4ºC. diambil
uspernatan lalu dipindahkan ke tabung mikro
Tabel 3.1. Hasil isolasi DNA sawi hijau
(Brassica juncea)
Tahap
Proses
tabung sebanyak 1x volume sampel. Tabung
Isolasi
(bahan)
Pelunakan
kemudian dikocok dan diinkubasi pada suhu -20
jaringan
daun
yang baru. Isopropanol ditambahkan kedalam
ºC
selama
15
menit.
Tabung
kemudian
itu
ditambahkan
dibuang
100
ʯL
supernatannya
bufer
TE.
(tip
steril secara
disentrifuugasi pada 15.000 x g selama 5 menit
setelah
Hasil
manual)
dan
Tabung
Daun menjadi
dimasukkan kedalam es selama 5 menit dan
kemudian disentrifugasi kembali pada 15.000 x g
halus
Lisis sel
Pelisisan
selama 2 menit. Diambil supernatan yang
sel dengan
mengandung DNA kemudian dipindahkan ke
500
tabung yang baru dan simpan tabung pada suhu
bufer
-20 ˚ C.
ekstraksi
ʯL
HASIL DAN PEMBAHASAN
mM Ekstrak daun
dalam larutan
Tris-HCl
Isolasi DNA dari tanaman sawi hijau
pH
7,5), bufer ekstrak
(Brassica juncea) pada tahap pertama yaitu
250
mM
dilakukan isolasi jaringan yang diambil dari daun
NaCl,
sawi hijau yang masih muda dan segar.
mM EDTA,
Pemilihian sawi hijau adalah karena sawi hijau
dan
merupakan komoditi sayuran yang mudah
SDS)
didapat dan harganya terjangkau (Susanti, 2012),
divorteks
selain itu struktur daunnya yang tidak tebal, tidak
(5 menit).
Denaturasi
(200
III.
terdapat trikom ataupun modifikasi epidermis
Purifikasi
25
0,5%
dan
tahap I
dan
presipitasi
1
2
protein
Pemekatan
Presipitasi
DNA
DNA
(isopropan
3
(kloroform:
ol
isoanil
alkohol
(24:1) 1 x
1x
a
volume
sampel)
Terbentuk tiga
volume
fasa:
1. Fasa Atas :
sampel)
DNA murni
a. Pelet
atau
presipitat DNA
Pengaweta
Presipitat
n DNA
DNA
a
ditambah
dan air
bufer TE
(supernatan)
2. Interfasa :
b
protein dan
a. Bufer TE
b. Presipitat DNA
zat-zat sisa
atau sampah
3. Fasa organik :
murni
kloroform dan
Tahap pertama yaitu isolasi jaringan
senyawasenyawa
organik terikat
dimana pada tahap ini daun sawi hijau ditumbuk
dengan tip steril hingga halus. Tahap ini
bertujuan untuk mempermudah tahap pelisisan
sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki
dinding sel yang kuat dan seringkali pada
beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut
sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat.
Kehadiran
kontaminasi
di
atas
dapat
menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA
tidak
sensitif
oleh
enzim
restriksi
dan
menggangu proses amplifikasi DNA dengan
PCR, sehingga memerlukan teknik dan metode
khusus untuk menghancurkan sel hingga isi
dapat terpisah atau keluar dari sel salah satunya
yaitu dengan penumbukan (Kusumawaty, 2012).
Tahap kedua setelah penumbukan yaitu
lisis
sel.
Pelisisan
sel
yaitu
dengan
menambahkan 500 ʯL bufer ekstraksi (200 mM
Tris-HCl pH 7,5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA,
dan 0,5% SDS) kedalam tabung berisi daun yagn
sudah dihaluskan kemudian divorteks selama 5
di fasa paling atas akibat adanya penambahan
menit
kloroform.
agar
homogen.
Penambahan
bufer
ekstraksi yaitu untuk merusak membran sel dan
Tahap selanjutnya adalah pemekatan
menjaga struktur DNA selama proses pelisisan
DNA.
dengan berbagai campuran. NaCl berfungsi
memisahkan DNA dari larutan dapat dilakukan
untuk menghilangkan polisakarida, sebagaimana
dengan presipitasi dengan menggunakan alkohol
telah dijelaskan sebelumnya bahwa dinding sel
seperti
tanaman mengandung polisakarida dan metabolit
isopropanol umumnya dilakukan dalam kondisi
lain
Keberadaan
suhu dingin yaitu dengan diinkubasi pada suhu
polisacharida dan metabolit sekunder dalam sel
-20ºC selama 15 menit, suhu ini mendukung
tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam
DNA dalam bentuk presipitat. Setelah perlakuan
nukleat (Wilkins dan Smarts, 1996). EDTA
itu, DNA akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan
berfungsi untuk mencegah koagulasi DNA
dengan sentrifugasi.
sedangkan
merusak
dengan isopropanol langsung terlihat adanya
membran sel. Setelah dilakukan vorteks, tabung
pemisahan larutan menjadi dua fasa, dan DNA
kemudian diinkubasi di waterbath pada suhu
terprepitisasi dibawah (lampiran 7.)
60ºC
(Kusumawaty,
SDS
selama
2012).
berfungsi
30
menit,
untuk
tujuannya
agar
mengoptimalkan kerja dari bufer ekstrak.
Cara
sederhana
isopropanol.
Tahap
dan
murah
Proses
untuk
presipitasi
Pada saat penambahan
berikutnya
yaitu
pengawetan
prespitat DNA pada yang telah didapat dengan
Tahap ketiga yaitu purifikasi DNA, tahap
menggunakan bufer TE dan disimpan pada suhu
ini berfungsi untuk memisahkan DNA dengan
-20ºC.
Perlakuan
penyimpanan
pada
suhu
protein lain dan sisa-sisa dari larutan pada saat
tersebut dan penambahan Bufer TE berfungsi
proses pelisisan sel. Pada tahap ini ditambahkan
untuk mengawetkan DNA, dan menjaga kondisi
CIAA (24:1) sebanyak 1 x volume sampel.
pellet DNA tidak rusak.
Pelarut organik ini secara signifikan dapat
mendenaturasi
protein
dan
melarutkan
komponen lipid, selain itu kloroform juga
menstabilkan
zona
interfase
yang
berisi
kontaminan DNA. Pada penambahan kloroform
ini akan menghasilkan tiga fasa yaitu paling atas
adalah DNA dan air, fasa kedua protein dan sisasisa kontaminan atau sampah dari sel yang
disebut juga zona interfase, dan fasa ketiga
adalah kloroform seta senyawa-senyawa organik
IV.
KESIMPULAN
Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA
dari tanaman sawi hijau (Brassica juncea) yaitu:
1. Bagian tanamna yang diambil harus
dalam keadaan masih muda dan segar
karena kontaminannya lebih sedikit.
2. Dilakukan
penggerusan
dalam
mengisolasi
struktur
kontaminannya sehingga DNA yang didapat
merupakan
DNA
murni,
selain
itu
juga
memudahkan pengambilan DNA yang terdapat
dinding
karena
selnya
kompleks dibandingkan bakteri.
yang diikatnya sehingga disebut juga fasa
organik. Fase ini memisahkan DNA dengan
jaringannya
DAFTAR PUSTAKA
lebih
Kusumawaty, Diah. 2012. Materi Kuliah; Isolasi
Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide to
DNA Kecil. Pendidikan Biologi UPI.
RNA. Isolation, Analysis and Synthesis.
Bandung.
Wiley – Liss. New York.
Miligan, B.G. 1992. Plant DNA Isolation. In:
A.R. Hoelzel (Ed). Molecular Genetic
Analysis of Populations, a Practical
Aproach. Oxford University Pres. New
York.
Shivanna K.R., Sawhney V.K. 1997. Pollen
biology and pollen biotechnology: an
introduction In Pollen Biotechnology
for Crop Production and Improvement
Cambridge University Press.
Stoskopf, N.C., Thomes D.T. dan Christie B.R.
1993. Plant Breeding, Theory and
Practice. Westview Press. Oxpord.
Susanti, T., Rondonuwu F.S. dan Sutresno A.
2012. Pengaruh musik pada range
frekuensi (3000-6000 Hz) terhadap
pertumbuhan dan produktivitas sawi
hijau (Brassica juncea). FMIPA Fisika
Universitas
Kristen
Satya
Wacana.
Diponegoro.
Wilkins, T.A. and Smart, L.B. 1996. Isolation of
RNA from Plant Tissue. Di dalam:
V1 = 0,19
5.
Ditanya: volume yang diambil untuk 2,44
ml dengan total 7,5 ml?
dd H2O (Aquades ) = 7,5 – 2,44 = 5,06
ml
LAMPIRAN
Lampiran Perhitungan Pengenceran
1.
Lampiran Gambar
Diketahui: 1 M Tris-HCL Ph 7,5 200Mm
Tris-HCL Ph 7,5 diambil sebanyak 1,5ml
dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1.V1 = M2. V2
1000. V1 = 7,5. 200
V1= 1,5 ml
2.
Diketahui: 5 M NaCl 250 Mm NaCl
diambil sebanyak 0,375 ml dengan total
7,5 ml
Lampiran 1. Penambahan Buffer Ekstraksi dan
divortex
Ditanya: V1?
M1. V1 = M2. V2
5000 . V1 = 7,5. 250
Lampiran 2. Inkubasi 30 menit suhu 60oC
V1 = 0,375 ml
3.
Diketahui: 0,5 M EDTA
25
Mm
EDTA diambil sebanyak 0,375 ml
dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V1 = M2. V2
Lampiran 3. Penambahan isopropanol
500 . V1 = 7,5 . 25
V1 = 0,375 ml
4.
Diketahui: 20 % SDS 0,5 % SDS diambil
sebanyak 0,19 ml dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V2 = M2. V2
20 . V1 = 7,5 . 0,5
Lampiran 4. Sentrifugasi 6000rpm selama 10
menit
Lampiran 8. Penambahan buffer TE pada pelet
Lampiran 5. Hasil setelah di sentrifugasi
Lampiran 8. Supernatan didinginkan
Lampiran 6. Supernatan diambil
Lampiran 7. Penambahan isopropanol