Pewarnaan Negatif dan Kapsul docx

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN NEGATIF & KAPSUL (Burri-Gins)

Rabu, 18 Maret 2015
Kelompok II
Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama

NPM

Iman Firmansyah

260110130044

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai

TTD

Shintya N. A

Benedictus G

PEWARNAAN NEGATIF & KAPSUL

I. Tujuan
1. Mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna – pewarna
sederhana, dengan menggunakan prosedur pewarnaan negatif. Memahami
setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur
tersebut.
2. Mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul
(pewarnaan Burri-Gins). Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi
kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Pewarnaan Negatif
Pewarnaan ini tidak akan menembus atau berikatan dengan dinding sel

bakteri karena daya tolak menolak antara muatan negatif pewarna dan
muatan negatif dinding sel bakteri. Pewarna akan membentuk deposit
disekitar bakteri atau menghasilkan latar belakang hitam sehingga bakteri
tampak tidak berwarna, sementara latar belakangnya berwarna gelap
(Harley, 2002).
2. Tolak Menolak Muatan
Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung
bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan
ditolak oleh dinding sel bakteri, Oleh karena itu dinding sel menjadi tidak
berwarna (Hadiutomo, 1990).
3. Kapsul Bakteri
Merupakan lapisan lendir yang menyelubungi dinding sel bakteri yang
berfungsi untuk perlindungan diri terhadap antibodi yang dihasilkan sel
inang (Anshori, 2009).

III. Teori Dasar
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus,
spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi
beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil.

Sedangkan pada coccus dibagi menjadi

monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum
hanya

dibagi

dua

yaitu

setengah

melengkung

dan

melengkung

(Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan
zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar
belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang
mengandung zat pati dan granula fosfat (Dwidjoseputro, 1998).
Pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Zat warna tidak akan
mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel
tampak transparan dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif atau
peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif.
Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan
negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh
dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna

yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin.
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada

pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras
dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu
bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih
tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiutomo,
1990).
Klebsiella

pneumonia

adalah

anggota

keluarga

bakteri

Enterobacteraceae yang gram negatif, berbentuk batang, non – motil, bakteri
berkapsul dan anaerob fakultatif. Klebsiella pneumonia dapat menyebabkan
berbagai infeksi yang biasanya menyerang sistem pernafasan dan saluran
kemih seperti pneumonia dan infeksi saluran urine (Agustina, 2014).
Kapsul adalah lapisan polimer yang terdapat diluar dinding sel.
Kapsul pada bakteri dapat diamati dengan mikroskop dengan teknik
pewarnaan, baik secara langsung maupun tidak langsung (Hadiutomo,1990).
Contoh bakteri yang berkapsul adalah Klebsiella pneumonia. Bakteri
ini diteliti dan diidentifikasi pertama kali oleh bakteriologis Jerman bernama
Edwin Klebs. Klebsiella pneumonia terdapat dalam feses dan saluran nafas

sebanyak 5% pada orang normal. Klebsiella pneumonia salah satu bakteri
gram negative, bakteri yang non motil (tidak melakukan pergerakan secara
sel),

merupakan

bakteri

fakultatif

an

aerob,

bakteri

ini

dapat

memfermentasikan laktosa. Klebsiella pneumonia dapat menyebabkan
pneumonia (Elfidasari, 2013).
Pada sebagian bakteri, terutama yang hidup dilingkungan alami,
dikelilingi oleh suatu lapisan lendir (gelatinous) yang disebut kapsul dan
slime. Sebagian besar bakteri mensekresikan suatu lapisan berlendir yang
mengakumulasi mengelilingi permukaan luar sel dan menyelubungi dinding
sel (Fadilah, 2011).
Sebagian

ahli berpendapat lapisan lendir merupakan modifikasi

dinding sel terluar yang berasal dari penggembungan dan gelatinisasi
konstituennya. Sebagian lagi berpendapat bahwa lapisan lendir adalah produk

sekretori yang mempunyai komposisi kimia berbeda dengan dinding sel.
Clifton menyatakan bahwa lapisan lendir ini disusun oleh karbohidrat yang
disimpan disekeliling dinding sel. Bila lapisan ini cukup tebal dan
mempunyai bentuk yang jelas, disebut dengan kapsul (Fadilah, 2011).
Adanya kapsul yang tebal pada berbagai bakteri patogen merupakan
indikasi umum tingginya virulensi mikroorganisme. Berbagai penyakit
terbukti disebabkan oleh bakteri yang mempunyai kapsul seperti Bacillus
antrachis (penyebab antraks), Clostridium pefringens (penyebab gang –

rene), dan Streptococcus pneumonia (penyebab pneumonia). Selain itu,
adanya kapsul meningkatkan virulensi dan infektifitas bakteri pathogen. Hal
ini disebabkan karena kapsul mampu melindungi bakteri pathogen dari
fagositosis oleh makrofag dan leukosit polimorfonuklear hewan tingkat tinggi
(Fadilah, 2011).
Istilah slime diberikan untuk lapisan lendir yang menyelubungi satu

koloni bakteri. Slime dibedakan dari kapsul berdasarkan berdasarkan
ketebalan dan viskositasnya. Kapsul memiliki struktur yang lebih lebar dan
definit serta mudah diamati. Slime bersifat lebih mudah larut dan kurang
kental dibanding kapsul. Kapsul adalah bagian dari sel, sedangkan slime
adalah hasil sekresi. Kapsul memiliki bentuk yang jelas, baik densitas dan
kerangkanya, sementara slime berbentuk amorf dan dapat dilepaskan
sehingga menjadi struktur yang bentuknya bermacam – macam, sering
terdapat disekitar sel bakteri dan berkurang densitasnya bila jaraknya jauh
dari sel. Gladwin dan tarttler menambahkan bahwa kapsul merupakan lapisan
lendir yang mengelilingi satu sel tunggal bakteri, sedangkan slime adalaha
lapisan lendir yang mengelilingi satu koloni kecil (mikrokoloni) bakteri
(Fadilah, 2011).
Kapsul membantu sel berkompetisi dalam lingkungan alami dan
memudahkan sel melekat ke suatu permukaan substrat. Kapsul merupakan
pelindung bakteri yang mencegah terjadinya fagositosis oleh makrofag dan
leukosit polimorfonuklear hewan tingkat tinggi. Beishir menambahkan bahwa

fungsi proteksi kapsul ini terjadi melalui peran kapsul sebagai barrier osmotic
antara sel dengan lingkungan. Virulensi berbagai bakteri berkapsul berkaitan
erat dengan adanya kapsul itu sendiri, Antibodi terhadap kapsul tersebut

meningkatkan fagositosis melalui perusakan intra sel secara perlahan. Bila
kapsul suatu bakteri hilang, maka sifat virulensinya ikut hilang. Neidhart
menambahkan kapsul berperan sebagai determinan utama kemampuan sel
bakteri untuk mengkolonisasi niche tertentu (misal : Streptococcus mutans
pada gigi) (Fadilah, 2011).
Kapsul dan slime umumnya terdiri senyawa polisakarida. Polisakarida
ini bervariasi dalam hal komposisi dan kompleksitasnya. Polisakarida yang
paling sederhana adalah monopolisakarida

polimer dari monosakarida

termasuk selulosa, levans, dekstrans, dan glukans. Sebagian besar
polisakarida ini bersifat kompleks, biasanya memiliki asam uronat sebagai
konstituen tambahan. Konstituen monomer dari polisakarida ini mencangkup
heksosa netral, khususnya D-glukosa, D-galaktosa, dan D-mannosa; methul
pentose seperti L-fukosa & L-ramnosa; polyol seperti ribitol dan gliserol;
gula amino dan juga asam uronat. Fosfor juga sering ditemukan, khususnya
pada polisakarida yang memiliki polyols asam teikoat. Kapsul dari beberapa
jenis Bacillus ( misalnya B. antrachis & B. subtilis ) terdiri dari senyawa
polipeptida seperti asam glutamin (Fadilah, 2011).

IV. Alat dan Bahan
1. Alat :
a. Bak Pewarna.
b. Buku Gambar
c. Kaca Objek.
d. Kapas.
e. Kertas Saring.
f. Korek api

g. Mikroskop Majemuk.
h. Ose.
i. Pembakar Spirtus.
j. Pensil warna Merah, Biru, Ungu
k. Spidol
2. Bahan :
a. Air Suling dalam Botol Semprot.
b. Alkohol 70%.
c. Desinfektan.
d. Emersi Oil.
e. Suspensi bakteri Klebsiella sp.
f. Zat Warna Air Fuksin.
g. Zat Warna Tinta Cina.
3. Gambar alat :

V. Prosedur
1. Pewarnaan Negatif
Disediakan dua kaca objek yang sudah di sterilisasi dengan
desinfektan dan alkohol 70%. Fiksasi Ose dengan pembakar spirtus.Satu
ose suspensi bakteri dan satu tetes tinta cina (1:1) diletakkan di dekat
ujung kanan kaca objek pertama. Keduanya dicampurkan menggunakan
kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada
kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45 o, kaca objek kedua
ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri. Preparat
dibiarkan hingga mengering dengan sendirinya. Satu tetes minyak emersi
diteteskan pada preparat lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai
dengan lensa objektif berkekuatan terendah 10X, 40 X lalu diganti dengan
lensa objektif berkekuatan 100X. Hasil diamati dan digambar.Sel bakteri
akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang yang
gelap.

2. Pewarnaan Kapsul
Disediakan dua kaca objek yang sudah di sterilisasi dengan
desinfektan dan alkohol 70%. Fiksasi Ose dengan pembakar spirtus. Satu
ose suspensi bakteri dan satu tetes tinta cina (1:1) diletakkan di dekat
ujung kanan kaca objek pertama. Keduanya dicampurkan menggunakan
kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada
kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45o, kaca objek kedua
ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri. Preparat
difiksasi sebanyak 3 kali di atas api. Preparat digenangi pewarna air fuksin
selama 5 menit, zat berwarna yang berlebih dibuang lalu dikeringkan
dengan kertas saring. Satu tetes minyak emersi diteteskan pada preparat
lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan lensa objektif
berkekuatan terendah 40 X. Hasil diamati dan digambar.Sel bakteri akan
tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang yang gelap.

VI. Data Pengamatan
No
1

Perlakuan
Pewarnaan negatif.

Hasil
Perbesaran 10X

Sampel bakteri Klebsiella sp
+ Tinta cina + minyak
emersi + dilihat dengan
mikroskop perbesaran 10X,
40X, 100X

Perbesaran 40 X

Perbesaran 100X

2.

Pewarnaan kapsul.
Sampel bakteri Klebsiella sp
+ Tinta cina + fiksasi diatas
pembakar spirtus + Pewarna
Air fuksin + minyak emersi
+ dilihat dengan mikroskop
perbesaran 40X.

VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa
pewarnaan negatif dan pewarnaan kapsul. Beberapa mikroba sulit diwarnai
dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan
negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin,
kemudian digesekkan diatas kaca objek .Zat warna tidak akan mewarnai
bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop
mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay,
1994).
Sedangkan pewarnaan kapsul bisa dilakukan dengan menggunakan
nigrosin, merah kongo atau tinta cina. Setelah ditambahkan pewarna yang
tidak menembus kapsul, maka kapsul dapat tampak dengan menggunakan
mikroskop cahaya. Ini merupakan penampilan negatif kapsul yang terlihat
jernih dengan latar belakang gelap (Schlegel, 1994).
Sampel bakteri yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
suspensi bakteri Klebsiella sp. Klebsiella sp salah satu bakteri gram negative,
bakteri yang non motil (tidak melakukan pergerakan secara sel), merupakan
bakteri fakultatif an aerob, bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa
(Elfidasari, 2013).
Pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara
memasukan kaca objek kedalam larutan desinfektan dan alkohol 70%.
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi
dari semua kehidupan dalam bentuk apapun (Curtis, 1999). Setelah
melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek,
tetapi sebelumnya ose di fiksasi. Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk
menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan
grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan
bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur
selnya (Lay, 1994).

Setelah fiksasi selesai kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca
objek. Lalu tinta cina sebanyak satu tetes, diteteskan di dekat olesan suspensi

bakteri lalu keduanya dicampurkan menggunakan kaca objek kedua hingga
homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada kaca objek pertama dengan
membentuk sudut 45o lalu kaca objek kedua ditarik sepanjang kaca objek
pertama dengan diseret ke arah kiri setelah itu preparat dibiarkan hingga
mengering dengan sendirinya. Kaca objek tidak perlu difiksasi karena
pewarnaan negatif dilakukan untuk melihat bentuk-bentuk sel (Pelczar,
2006).
Tinta cina cina bersifat asam dan tidak dapat menembus atau
berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena tinta cina memiliki muatan negatif
dari komponen kromoforik yang akanbertolakan dengan muatan negatif yang
dimiliki oleh sitoplasma bakteri sehingga tinta cina hanya akan memberi
warna hitam pada latarnya saja (Dwidjoseputro, 1998).
Setelah kering tambahkan atau teteskan sedikit minyak emersi.
Setetes minyak imersi diteteskan di bawah permukaan kaca objek dan setetes
lainnya ke atas lensa depan kondensor. Cara tersebut dilakukan untuk
menghindari kemungkinan terbentuknya gelembung udara antara kaca objek
dan kondensor. Minyak emersi biasanya dipakai pada pembesaran lensa
objektif 100X lebih (Kadaryanto, 2006). Kemudian dilihat dengan
mikroskop, dengan perbesaran 10X, 40X, 100X.
Hasil pengamatan didapat bakteri Klebsiella pneumoniae yang
berwarna bening karena tinta cina yang memiliki muatan negatif dari
komponen kromoforik tidak dapat menembus sitoplasma bakteri yang juga
bermuatan negatif yang terjadi tolak menolak muatan . Bakteri Klebsiella
pneumoniae teramati di perbesaran 10X, 40X, dan 100X.

Pada pewarnaan negative ini lingkungan akan terwarnai hitam
yang disebabkan oleh pewarna yang digunakan adalah nigrosin atau tinta cina
yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini juga sesuai dengan pustaka yang

menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif, maka
pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel
sehingga zat warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi
sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Alcamo,1996).
Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung
bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan
ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding sel menjadi tidak
berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan dalam pewarnaan ini yaitu
tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin. Selaini itu, disebutkan juga
pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroseluler yang pada dinding
selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif
tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja
(Entjang, 2003).
Pada pewarnaan kapsul metode Burri-Gins, prosedurnya sama
seperti pewarnaan negatif tetapi di tambah dengan pewarna karbol fuksin / air
fuksin. Karbol Fuksin merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang
digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan
dalam pewarnaan mikrobakteria karena memiliki ketertarikan untuk asam
mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga
digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994). Setelah penambahan
pewarna karbol fuksin lalu di tetesi minyak emersi dan di lihat dengan
mikroskop dengan perbesaran 40X.
Hasil pengamatan didapat bakteri Klebsiella pneumoniae yang
berwarna merah yang seharusnya berwarna bening dengan warna merah
dibagian tengahnya karena zat warna air fuksin yang bersifa basa (Waluyo,
2007).
K. pneumonea adalah organisme batang pendek yang umumnya

berbentuk coccoid. Bentuk batang pendek dengan ukuran 0,5 – 1,5 mikron.
Mempunyai selubung yang lebarnya 2 sampai 3 kali ukuran kuman. Tidak

berspora, tidak bergerak dan gram negatif. Mudah dibiakkan pada media
sederhana Ibouillon agar). Pada media padat tumbuh dengan koloni mucoid (24
jam), putih keabuan dan permukaannya mengkilat. pH untuk hidup 6 – 8,7 dan
suhu 35oC. Klebsiella dapat memecah karbohidrat menjadi asam dan gas :
laktosa, sukrosa dan inositol (Depkes RI, 1989). Dari hasil praktikum
pewarnaan bakteri Klebsiella sp, ciri – ciri bakteri sama dengan yang di
cantumkan oleh Depkes RI.
VII. Simpulan
Dapat mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh
pewarna-pewarna sederhana dengan menggunakan prosedur pewarnaan,
dengan hasil bakteri bentuk batang, berwarna bening dengan latar belakang
hitam tinta cina. Setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam
prosedur tersebut dapat dipahami.
Dapat mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur
pewarnaan kapsul (pewarnaan Burri-Gins) dengan hasil bakteri berbentuk
batang, sitoplasma sel berwarna merah dan kapsul berwarna bening dengan
latar belakang hitam kemerahan. Dapat memahami setiap langkah dan reaksi
– reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Alcamo, I.E.1996. Fundamental of Microbiology 5th Edition. New York :
Addison Wesly Longman.
Agustina, Dini. 2014. Inhibition of bacterial adhesion on mice enterocyte by the
hemagglutinin pili protein 12,8 kDa klebsiella pneumoniae antibody. The

Journal of Tropical Life Science, Vol.4, No.1, pp. 19 – 25.
Anshori, M. 2009. Panduan Pembelajaran Biologi untuk SMA dan MA Kelas XI .
Jakarta : Pusat Perbukuan Departemen Pendidikan Nasional.
Curtis. 1999. Biology 5th edition. New York : Worth Publisher
Departemen Kesehatan RI. 1989. Bakteriologi Klinik. Jakarta : Bakti Husada.
Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Elfidasari, Dewi. 2013. Deteksi bakteri Klebsiella pneumonia pada beberapa jenis rokok
konsumsi masyarakat. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, Vol.2,

No.1, pp.41 – 47.

Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan.
Bandung: Citra Aditya Bakti.
Fadilah, Muhyiatul.2011. Deteksi kapsul dan slime pada bakteri patogen yang diisolasi
dari benih lele dumbo. Jurnal Sainstek Vol.III, No.2, pp.124 – 128.

Hadiutomo. 1990.Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Harley. 2002. Laboratory Exercise in Microbiology. USA: Mc Graw – Hill
Publisher.
Kadaryanto. 2006. Biologi 1 Mengungkap Rahasia Alam Kehidupan . Jakarta :
Yudhistira.
Lay, Bibiana.W.1994. Analisis Mikroba di Laboratorium .Jakarta : Rajawali.
Pelezar,chan. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah
Mada.
Waluyo. L, 2007. Mikrobiologi Umum . Jakarta: Balai Pustaka.