Isolasi Pemurnian dan Karakterisasi Lipa
J u r n a l
N a 1t 2u( r2 ) ,I n A dp or in le s2 i0 a
1 0 :
1 2 4 - 1 2 9
4K 1n
e 0p
s 1ie2 s9Nio a 6 5 a / D I K T I / K eZp u. s
/ 2f 0a 0eh8ta i ar l, .
u1 r
a-ul9t 3u 7Ns 9aa,1nt 2 u(A r2k )r :eI dn1i d2t 4oa -n
I
S 4
S NJ
1 2
Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Bakteri Hasi
Skrining dari Tanah Tempat Pembuangan Akhir (TPA) Gunung
Tugel Banyumas
*)
Zusfahair
, Tien Setyaningtyas, Amin Fatoni
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam, FST,
Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto
Jl. Dr Soeparno 62, Karangwangkal, Purwokerto Jawa Tengah 53123
Diterima 07-11-2008
Disetujui 23-03-2009
ABSTRACT
A bacterial lipase producer was isolated from garbage dump soil and was identified its genus. Lipase was
according to production time optimized, purified using ammonium sulfate fractionation and gel chroma
Determination of enzyme characteristic studied were influence of pH, temperature, various metals
activity. The result of this research shows that the genus of isolated bacteria which produced l
Acinetobacter
sp., the lipase optimum production time is about 18 hours with the activity is about 115 uni
highest activity of lipase fractionation using ammonium sulfate is about 45% and the highest activity
with filtration gel chromatograph column using Sephadex thG-150
fraction.
at 24 Lipase from crude extract and
o
purifying product at this fraction has optimum pH 6 and optimum temperature
C. Lipase
is about
to be
40classified
2+
2+
as metalloenzyme that shows with decreasing the activity after added the EDTA. Metals
and
ion,
Zn
such as Cu
2+
were inhibited the lipase activity.
ion could
Ca
increase lipase crude extract activity but inhibited the act
2+
lipase purifying product.
ion
Hg could increase the activity of lipase purifying product.
Keywords: Acinetobacter
sp, garbage dismissal place s soil, lipase
PENDAHULUAN
seperti tanah sawah, kebun sayur dan hutan. Pemurnian
dilakukan menggunakan fraksinasi fenil-toyopearl
Lipase merupakan biokatalisator yang mempunyai
kromatografi
DEAE-sepharosa dan kromatografi
kemampuan mengkatalisis reaksi hidrolisis
lipid
Enzim yang diperoleh mempunyai
menjadi asam lemak dan gliserol. Oleh superdex-200HR.
karena
aktivitas
kemampuannya dalam menghidrolisis lipid, lipase
dapat spesifik 9854 U/mg dengan tingkat kemurni
24,3
kali ekstrak kasar.
dimanfaatkan sebagai aditif dalam industri detergen.
Tempat Pembuangan Akhir (TPA) limbah rumah
Lipase yang digunakan dalam industri detergen
tangga
dan industri kecil diduga mengandung bakter
mempunyai sifat seperti rentang pH antara
8-10,5,
0
serta tetap aktif pada0C-60
suhu
C.30
penghasil
lipase,
karena
m erupak an
tem pat
bermacam-macam sampah, seperti
Sharma et al
., (2001) melaporkan bahwa penimbunan
total
makanan
pasokan enzim di dunia masih didominasi oleh
negarayang membusuk dan limbah rumah tangga
mengandung minyak. Sampah-sampah tersebut
Eropa. Hal tersebut m endorong upaya yang
untuk
kemungkinan
juga telah membentuk kompos. Oleh
mengisolasi dan memurnikan lipase. Lipase
telah
karena
itu
tanah
TPA berpotensi mengandung bakteri
diisolasi dari hewan, tanaman dan mikroorganisme.
penghasil
lipase. Penelitian ini mempunyai tujua
Mikroorganisme penghasil lipase ditemukan
dalam
mendapatkan isolat bakteri yang dapat menghasilkan
bermacam-macam habitat seperti limbah industri,
lipase
pabrik pengolahan minyak sayur, perusahaan
susu,dari tanah TPA, dan menganalisis karakteris
enzim
tanah yang terkontaminasi dengan minyak, makananlipase yang dihasilkan.
yang membusuk, timbunan kompos (Sharma
et al.,
2001). Kojima dan Shimizu (2003) berhasil memurnikan METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan.
Alat-alat yang digunakan adalah
lipase yang diisolasi dari bermacam-macam tanah
alat-alat
*Telp: Email: -
gelas
yang
um um
digunakan
pada
Laboratorium Kimia. Bahan yang digunakan: NaCl,
I s o l a s i ,
P e m u r n 125
i a n
d a
medium NB (peptone from meat 5 g, yeast Ekstrak
ekstrak enzim kasar yang mempunyai aktivitas terti
3 g/l),
minyak olive, ammonium sulfat,dilakukan
sephadex fraksinasi.
Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan dengan
G-150, selophan, tributirin agar (komposisi per
liter : Lipase.
ammonium sulfat secara bertahap pada
pepton daging 2,5 g, pepton kasein 2,5 g, penambahan
ekstrak ragi
3 gr, agar 12 g dan tributirin 10 ml),
15, 30,tris-HCl,
45 dan 60% jenuh. Caranya sebagai berik
buffer
amonium NaOH,
sulfat sebanyak 15% dimasukkan secara
buffer natrium asetat-HCl, buffer natrium fosfat,
polivinil alkohol, aseton, etanol,
, CaCl
, CuCl
EDTA, perlahan ke dalam gelas piala yang berisi ekstrak
2
2
sambil diaduk dengan
magnetic stirrer
sampai terbentuk
HgCl2,
endapan. Ekstrak kasar lipase kemudian disentri
Prosedur Kerja.
Penelitian ini akan dilakukan
dengan langkah sebagai berikut:
pada 10.000 g selama 20 menit. Endapan yang diperol
dinamakan F1. F1 dilarutkan dalam NaCl 1% dan
Isolasi Mikroorganisme Penghasil Lipase.
0
disimpan
C. 4Supernatan hasil fraksinasi
Mikroorganisme diisolasi dari sampel tanah
Tempat pada suhu
pertama ditambah ammonium sulfat sebanyak 30%,
Pembuangan Akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas.
selanjutnya dilakukan prosedur yang sama sehingg
Skrining mikroorganisme penghasil lipase menggunakan
F2. Prosedur yang sama dilakukan unt
cawan petri yang berisi medium tributirin diperoleh
agar. Kultur
diinkubasi
0
menghasilkan fraksi ammonium sulfat 45% (F3) da
pada
C selama
37
2 hari. Koloni penghasil
60% indeks
(F4). Seluruh fraksi yang dihasilkan didia
lipase yang memperlihatkan zona bening diukur
selophan (Saxena
et al.,
2003). Fraksi
lipolitiknya. Indeks lipolitik dinyatakan menggunakan
sebagai nisbah
hasil
dialisis dinamakan FHD1 (fraksi 15%), FH
antara diameter zona bening dengan diameter
koloni.
(fraksi
30%), FHD3 (fraksi 45%) dan FHD4 (fraksi 6
Isolat yang memiliki indeks lipolitik terbesar
dinamakan
isolat potensial penghasil lipase
et al.
,(Gupta
2003). Seluruh fraksi diuji aktivitas, kadar protein,
spesifik,
tingkat kemurniannya.
Identifikasi isolat penghasil lipase
yang
Kromatografi Kolom Filtrasi Fraksi
Gel.
potensial.
Uji biokimia dan uji morfologi (pengamatan
endapan
amonim sulfat yang memiliki unit
sel) dilakukan untuk identifikasi bakteri.
Uji biokimia
aktiv
yang
paling
tinggi dilanjutkan pemurniannya den
meliputi uji katalase, uji oksidase, dan uji
reduksi
nitrat.
filtrasi gel sephadex G-150. Langka
Bakteri ditumbuhkan dalam medium tumbuh metode
untuk
adalah sebagai berikut (Subardjo
et al.,
mengetahui jenis bakteri tersebut. Bakterilangkahnya
selanjutnya
1997). dan uji
diidentifikasi melalui serangkaian uji biokimiawi
Pembuatan kolom sephadex G150. Tepung
morfologi. Identifikasi dilakukan di Laboratorium
sephadex
G150 sebanyak 7 g dikembangkan dengan
Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas
Jendral
400 ml akuades dan diinkubasi pada suhu kamar
Soedirman Purwokerto.
Produksi Lipase.
Isolat
potensial
selama 72 jam. Suspensi ini dibiarkan sampa
diinokulasi
Gel yang mengapung dibuang, sedangkan
ke dalam 10 ml medium inokulum (medium mengendap.
NB),
diinkubasi
selama 2 hari dengan pengocokangel
300yang
rpm mengendap dijaga agar tetap terendam dala
0
akuades. Gelembung-gelembung udara yang terdapat
pada suhu 37
C. Medium NB sebanyak 50 ml
di dalam partikel-partikel gel dikeluarkan denga
diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambah
mengurangi
inokulum bakteri 0,5 ml dan minyak olive
sebagai tekanan udara diatas permukaan suspens
induser 0,5 ml. Medium produksi diinkubasi menggunakan
pada suhu pompa vakum. Gel kemudian direndam
370C sambil digoyang dengan kecepatan 300dalam
rpm buffer tris HCl pH 7,2. Kelebihan buffer d
yang mengendap disisakan lebih kurang 1 cm. G
selama 6, 12, 18, 24, 30 dan 36 jam dangel
diamati
dan dimasukan lewat batan
aktivitas lipase yang dihasilkan isolat diaduk
bakteriperlahan-lahan
pada
interval waktu tersebut.
pengaduk ke dalam kolom gelas dengan panjang
30 cm dan diameter 2,5 cm dan buffer tris HCl pH
Ekstraksi Lipase.
Medium produksi yang telah
diinkubasi diekstraksi
dengan menggunakan setinggi
sentrifus5 cm. Gel dibiarkan mengendap semuanya.
Pemurnian Lipase dengan Kolom Sephadex
pada kecepatan 10.000 g selama 20 menit. Supernatan
G-150.
Sebanyak 5 ml fraksi hasil dianalisis de
yang diperoleh disebut ekstrak enzim kasar.
Enzim
aktivitas tertinggi dimasukkan ke dalam kolom den
enzim kasar diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
1 2 6
J u r n a l
N a 1t 2 u( r2 ) :I n1 d2 4o -n 1e2 s9 i a
Z u s f a eh ta i ar l, .
Penentuan pH Optimum.Posedur kerja
hati-hati agar gel tidak rusak. Kolom dihubungkan
penentuan
dengan sumber eluen lewat pipa plastik.
Kolom pH optimum sama seperti pada uji aktivitas
tetapi
dengan variasi pH. Variasi pH yang dilakuk
Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan
buffer
pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 adalah
menit 5, 6, 7, 8, dan 9. Nilai pH optimum merupaka
pada saat enzim mempunyai aktivitas tertinggi. U
per tetes. Kran kolom kaca dibuka, eluat pH
ditampung
untuk pH 5 digunakan 100 mM buffer natriu
dalam botol ampul sebanyak 100 buah. Semuaaktivitas
eluat
asetatHCl, untuk pH 6-7 digunakan 100 mM buffer
ditentukan aktivitas, aktivitas spesifik
dan kadar
natrium
fosfat, sedangkan untuk pH 8, dan 9 digunaka
proteinnya. Fraksi yang mempunyai aktivitas
paling
buffer tris
tinggi selanjutnya ditentukan tingkat kemurnian
dan HCl.
Penentuan
Suhu Optimum.
Penentuan suhu
beberapa karakteristiknya meliputi pH optimum,
suhu
optimum, pengaruh beberapa logam berat.
optimum dilakukan seperti uji aktivitas dengan var
0
suhu 30, 40, 50, 60 ,70, 80,
C .
dan
Pengujian
90
Pengukuran Aktivitas Lipase
.Aktivitas lipase
dilakukan pada pH optimum yang telah diperoleh dari
diukur dengan medium emulsi minyak olive. Campuran
sebelumnya.
reaksi mengandung 2,5 mL emulsi 2 : 1 : tahap
1 = gum
Pengaruh
arab : Bufer fosfat 0,2M (pH 8) : minyak olive),
ditambahEDTA dan Logam terhadap Aktivitas
0
Penentuan pengaruh penambahan EDTA dan
0,2 mL larutan enzim, diinkubasi
C pada
selama
37 Lipase.
+2
+2
+2
ion 2,5
logam (Ca
, Zn
Cu 2+, Hg
) ditentukan dengan
30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan
ml aseton/etanol
dibebaskan
menambahkan
EDTA dan ion-ion logam masing-masing
1/1 (v/v). Asam lemak
yang
dititrasi
dengan
0,05
N dengan
NaOH
-2
konsentrasi
M10
sebanyak 0,06 ml ke dalam
larutan sampel sehingga konsentrasi akhir larutan pa
menggunakan phenoptalin (pp) sebagai indikator.
saatyang
uji aktivitas dilakukan-3 adalah
M. Sebagai
10
Pengukuran 1 unit enzim (U) adalah jumlah
pembanding aktivitas dilakukan uji pada sampel enzi
menyebabkan perubahan m
m1ol substrat (minyak olive)
permenit pada keadaan pengukuran optimum (Kojima
tanpa penambahan EDTA dan ion-ion logam.
& Shimizu, 2003).
Penentuan Kadar Protein.
Sebayak 0,5 ml
HASIL DAN PEMBAHASAN
sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil
ditambah dengan 5 ml pereaksi C. Larutan-larutan
Lipase dari Tanah TPA.
Sampel tanah diambil dari
tersebut dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar
selama
(TPA) Gunung Tugel, Purwokerto Selatan, Banyumas.
10 menit, kemudian ditambah Follin CiocalteuBakteri
sebanyak
ditumbuhkan pada medium tributirin agar, da
0,5 ml, dikocok dan dibiarkan selama 30
menit.
koloni terpilih untuk produksi lipase adalah ko
Serapan larutan diukur pada panjang gelombang
dengan zona jernih terbesar, yang menunjukkan lebih
750 nm. Kontrol dibuat dengan cara yang sama,
dengan
banyak
trigliserida dari medium dihidrolisis enzim l
sampelnya akuades. Standar protein dibuatbakteri
dengan tersebut. Isolat yang mempunyai zona jern
memasukkan 0,5 ml kasein
Hamersteindalam buferterbesar, selanjutnya diidentifikasi jenis bakterin
Tris-HCl ke dalam 6 buah tabung reaksi digunakan
dengan
untuk memproduksi enzim lipase. Hasil
konsentrasi 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0
mg
per
ml,koloni bakteri penghasil lipase yang t
identifikasi
selanjutnya
perlakuan
sama
seperti
sam
pelproduksi terlihat dalam Tabel 1.
untuk
(Lowry 1964 dalam Bollag
et al.,
1996).
Penentuan Waktu Produksi Optimum.
Waktu
Karakterisasi Enzim.
Karakterisasi enzim
produksi optimum ditentukan dengan mengisolasi
meliputi pH optimum, suhu optimum dan penentuan
enzim yang dihasilkan dalam rentang waktu inkubasi
pengaruh beberapa logam berat terhadap aktivitas lipase
Tabel 1. Hasil identifikasi bakteri tanah TPA Gunung Tugel penghasil lipase
Morfologi koloni
Tumbuh diNutrient Agar
dengan ciri koloni : kol
kecil, bentuk teratur te
berlekuk, ukuran kecil,
jernih, permukaan mengki
elevasi cembung rendah
Bentuk selGram Uji katalUji oksidaUji reduk
nitrat
Asam dari
Pendugaan jenis M
karbohidrat
Glucose (+)
Coccus
(-)
(+)
(-)
(-)
Acinetobacter,
sp.
Fructose(+)
I s o l a s i ,
P e m u r n 127
i a n
d a
0-30 jam, dan diamati tiap 6 jam selamapori-pori
18 jam. yang sangat halus. Molekul protein yan
dapat menembus
Aktivitas lipase yang dihasilkan isolat bakteri
dibuat pori-pori dan tertahan selama ali
kurva terhadap waktu produksi (Gambar 1). ke bawah kolom. Molekul protein yang lebih be
akan terelusi lebih dahulu oleh pelarutnya di
Fraksinasi lipase dengan amonium sulfat.
molekul
Fraksinasi dengan amonium sulfat merupakan
salah yang lebih kecil, sehingga dapat ter
fraksi berdasarkan ukuran molekul
satu cara pemurnian protein melalui pemisahan
proses
Kecepatan aliran molekul protein tergantung d
pengendapan garam. Pada proses ini protein dipisahkan
kemampuannya
memasuki pori-pori (Blaber, 1998).
dari komponen nonprotein yang terdapat di
dalam
Kolom kromatografi yang digunakan adalah
larutannya. Penambahan garam amonium sulfat akan
sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 7,2
menurunkan kelarutan protein karena terjadinya
kompetisi antara ion garam yang ditambahkanHasil
denganfraksinasi terlihat pada Gambar 2, y
mempunyai
dua fraksi dengan aktivitas lipase ti
protein yang terlarut sehingga terjadi
salting .efek
out
yaitu
fraksi 24 dengan aktivitas 2880 U/ml dan
Fraksinasi amonium sulfat dilakukan dengan
tingkat
dengan aktivitas 2560 U/ml. Fraksi 24 selanju
kejenuhan 15%, 30%, 45% dan 60% jenuh. 37
Hasil
dilakukan karakterisasi.
pemurnian lipase Acinetobacter
dari
sp. terlihat dalam
Karakterisasi Lipase. Penentuan pH dan
Tabel 2. Data ini menunjukkan fraksi 45% mempunyai
suhu
optimum.Hasil
aktivitas spesifik tertinggi yaitu 442,396
U/mg dan penentuan pH optimum ekstrak kasar
dan sehingga
hasil permurnian lipase terlihat dalam Gamba
tingkat kermurnian 6,28 kali ekstrak kasarnya,
Pada grafik tersebut terlihat pH optimum lipase
fraksi 45% dimurnikan lebih lanjut menggunakan
pH 6,0. Secara umum, lipase bakteri mempunyai p
kromatografi kolom gel filtrasi.
Menggunakan optimum netral dan alkali, dengan pengecualian li
P. fluorescens
mempunyai pH optimum 4,8 (Gupta
Kromatografi Kolom Gel Filtrasi.
Fraksi 45% dari
et al.,
2004). Lipase yang dihasilkan dalam penelit
amonium sulfat dengan kemurnian tertinggi dilanjutkan
ini
termasuk
lipase bakteri pada umumnya dengan p
dengan pemurnian menggunakan kromatografi kolom
Pemurnian
Lipase
netral.
filtrasi gel. Pemisahan protein enzim padaoptimum
metode mendekati
ini
Suhu optimum ekstrak kasar dan hasil permurnia
didasarkan atas perbedaan ukuran molekul protein
lipase pada penelitian ini ditentukan dalam jang
melalui sebuah kolom yang dinamakan sephadex.
Aktivitas (U/ml)
200
150
100
50
3500
0.7
3000
2500
0.6
0.5
2000
0.4
1500
0.3
1000
0.2
500
0.1
0
0
0
0
5
5
10
15
20
25
10
15
20(jam) 25
Waktu inkubasi
0
0 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 55 60 65 70 75 80
Fraksi
Fraksi
30
Kadar Protein (mg/ml)
Aktivitas (U/ml)
Sephadex terbuat dari protein berhidrat tinggi dengan
Kadar Protein
AAktifitas
s
30
Gambar 1. Aktivitas lipase terhadap waktu produksi Gambar 2. Aktivitas dan kadar protein lipase fraksi-fraks
pemurnian dengan filtrasi gel
Tabel 2. Hasil pemurnian protease dengan fraksinasi amonium sulfat
Volume
sample
(ml)
Protein
(mg/ml)
Ekstrak kasar
25
1,632
40,800
FS-15%
23
1,296
FS-30%
26,5
FS-45%
FS-60%
Tahap pemurnian
Total
protein
(mg)
Aktivitas
(U/ml)
Total
Aktivitas
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
Tingkat
kermurnian
115
2875
70,469
1
29,80
8
500
11500
385,800
5,47
1,252
33,178
500
13250
399,255
5,67
24,5
0,633
15,509
280
6860
442,396
6,28
25
0,724
18,100
100
2500
138,076
1,96
J u r n a l
Aktivitas (U/ml
1 2 8
N a 1t 2 u( r2 ) :I n1 d2 4o -n 1e2 s9 i a
Z u s f a eh ta i ar l, .
1000
900
Hasil
Pemurnian
Ekstrak Kasar
800
700
600
500
400
300
200
100
0
8
9
10
pH
Gambar 3. Aktivitas lipase terhadap pH medium reaksi
enzimatis
Gambar
5. Pengaruh EDTA dan logam pada aktivitas lipase
Aktivitas (U/ml
5
6
7
2004). Kalsium merangsang lipase
B. subtilis
dari168,
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
Hasil pemurni
Ekstrak kas
B. thermoleovorans
ID1,
P. aeruginosa
EF2,S. aureus
226,S. hyicus
, C. viscosumdanAcinetobacter
sp.
RAG-1, sedangkan lipase P.dari
aeruginosa
10145
justru dihambat oleh ion kalsium. Aktivitas lipase s
2+
2+
umum dihambat oleh logam berat seperti
, Ni
, Co
0
2+
Hg 2+ dan Sn
, serta sedikit dihambat2+ oleh
dan Zn
30
40 Suhu 50
60
70
Mg 2+(Guptaet
Gambar 4. Aktivitas lipase terhadap suhu inkubasi selama
reaksi
enzimatis
penambahan
al.,
2004). Hasil penelitian pengaruh
EDTA dan berbagai logam terlihat
Gambar 5. Gambar tersebut menunjukkan bahwa
0
0
aktivitas lipase yang dihasilkan dalam percobaan
suhu 30
C sampai 60
C . Hasil penentuan suhu
secarapada
umum dihambat EDTA dan beberapa logam yang
optimum terlihat dalam Gambar 4. Lipase bakteri
digunakan, namun ada perbedaan yaitu aktivitas ekstra
umumnya mempunyai suhu optimum dalam jangkauan
0
kasar
meningkat dengan adanya 2+ion
, sedangkan
Ca
30-60C. Meskipun demikian ada beberapa lipase
yang
lipase
hasil pemurnian aktivitasnya meningkat denga
suhu optimumnya di atas atau di bawah jangkauan
suhu
ion 2+
Hg
.
tersebut. Lipase yang tetap stabil pada adanya
suhu tinggi
ditemukan
pada
,Chromobacterium,
spesies
bakteri
Bacillus
Pseudomonas, dan
KESIMPULAN
Staphylococcus
. Lipase yang dihasilkan
Bacillus
sp.
Salah satu species bakteri dari tanah TPA Gunung
0
tetap stabil pada suhu
C selama
70
150 menit (Gupta
Tugel Kabupaten Banyumas yang dapat menghasilkan
et al.,
2004). Lipase yang dihasilkan dalam penelitian
lipase ekstra seluler teridentifikasi sebag
ini mempunyai kinetika suhu seperti lipase Acinetobacter,
bakteri padasp.
0
umumnya, yaitu suhu optimum
C . 40
Aktivitas spesifik tertinggi hasil pemurnian li
Pengaruh EDTA dan berbagai Ion Logam.
diperoleh pada hasil fraksi amonium sulfat 45% (FS
Beberapa enzim termasuk lipase tertentu aktivitasnya
45%) sebesar 442,4 U/mg protein dengan tingkat
dipengaruhi oleh logam, hal ini disebabkan kemurnian
yang logam 6,28 kali ekstrak kasar. Pemurnian filtr
tersebut merupakan kofaktor lipase, sehingga
gel dengan
sephadex G-150, kemurnian tertinggi pada
meningkatkan aktivitas, sedangkan beberapafraksi
logam24 dengan aktivitas 2880 U/ml, dan aktivi
tertentu dapat menurunk an aktivitasspesifik
yang 8195,8 U/mg protein. Lipase yang dihasilk
0
mempengaruhi stabilitas konformasi. EDTA merupakan
mempunyai pH optimum 6, dan suhu optimum
C. 40
senyawa pengkelat logam, apabila enzim lipase dalam
Aktivitas lipase ini dihambat oleh EDTA dan
2+
2+
penelitian ini membutuhkan kofaktor logam,
maka ion logam seperti
beberapa
danCuZn
. Ion 2+
Ca
ketika ditambahkan EDTA aktivitasnya akan meningkatkan
menurun
aktivitas ekstrak kasar lipase, tet
2+
, karena kofaktornya terkelat oleh EDTA tersebut.
menghambat aktivitas lipase hasil pemurnian.
Ion Hg
Kofaktor secara umum tidak diperlukanmeningkatkan
untuk
aktivitas lipase hasil pemurnian, tet
aktivitas lipase, tetapi kation divalen seperti
kalsium
menghambat
aktivitas ekstrak kasar lipase.
kadang merangsang aktivitas enzim et
(Gupta
al.,
I s o l a s i ,
P e m u r n 129
i a n
d a
Overview of production, purification and biochemical prope
Appl. Microbiol Biotechnol.
64: 763-781.
Gupta, R., Rathi, P., Gupta, N. & Bradoo,
2003. Lipase
S.
assay
Penulis mengucapkan terimakasih kepada
for conventional and molecular screening: an overvi
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi atas bantuan
Biotechnol. Appl. Biochem.
37: 63-67.
Kojima
Y.
&
Shimizu,
2003.
S.
Purification and characterization
dana untuk penelitian ini melalui Program Penelitian
oh the lipase from
Pseudomonas fluorescens
HU380.
Dosen Muda tahun 2006.
Journal Bioscence and Bioengineering.
96: 219-226.
Saxena, R.K., Sheoran, A., Giri, B. & Davidson,
2003. W.S.
Purification strategies for microbial
J. Microb
lipases.
Meth.
52: 1-18.
DAFTAR PUSTAKA
Sharma, R., Chisti, Y. & Banerjee,
2001,
U.C.Productin,
Blaber, M.
1998. Protein Purification: Column Chromatographypurification,
characterization
and
applications of l
Ion Exchange, Dialysis and Concentration
. In Molecular
Biotech Adv.
19:627-662.
http://wine
1.sb.fsu.edu/bch
Biology and Biotechnology.
Subardjo, B., Maryanto, J. Kartini, Suyata, Hartiwi, D.
5425/lect 30/htm. (7 June 2004).
Kusumaharti, I.A.
1997. Pengembangan potensi bakteri
Bollag, D.M., Rozycki, M.D. & Edelstein,
1996.Protein
S.I.
bongkrekPseudomonas cocovenenansX-128 untuk
Methods nd
2 Ed. New York: John Willey dan Sons.
produksi gliserol, asam lemak dan
J. lipase.
Agrin.
1: 1-4.
Gupta, R., Gupta, N. & Rathi,
2004.P. Bacterial lipases: an
UCAPAN TERIMAKASIH
View publication stats
N a 1t 2u( r2 ) ,I n A dp or in le s2 i0 a
1 0 :
1 2 4 - 1 2 9
4K 1n
e 0p
s 1ie2 s9Nio a 6 5 a / D I K T I / K eZp u. s
/ 2f 0a 0eh8ta i ar l, .
u1 r
a-ul9t 3u 7Ns 9aa,1nt 2 u(A r2k )r :eI dn1i d2t 4oa -n
I
S 4
S NJ
1 2
Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Bakteri Hasi
Skrining dari Tanah Tempat Pembuangan Akhir (TPA) Gunung
Tugel Banyumas
*)
Zusfahair
, Tien Setyaningtyas, Amin Fatoni
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam, FST,
Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto
Jl. Dr Soeparno 62, Karangwangkal, Purwokerto Jawa Tengah 53123
Diterima 07-11-2008
Disetujui 23-03-2009
ABSTRACT
A bacterial lipase producer was isolated from garbage dump soil and was identified its genus. Lipase was
according to production time optimized, purified using ammonium sulfate fractionation and gel chroma
Determination of enzyme characteristic studied were influence of pH, temperature, various metals
activity. The result of this research shows that the genus of isolated bacteria which produced l
Acinetobacter
sp., the lipase optimum production time is about 18 hours with the activity is about 115 uni
highest activity of lipase fractionation using ammonium sulfate is about 45% and the highest activity
with filtration gel chromatograph column using Sephadex thG-150
fraction.
at 24 Lipase from crude extract and
o
purifying product at this fraction has optimum pH 6 and optimum temperature
C. Lipase
is about
to be
40classified
2+
2+
as metalloenzyme that shows with decreasing the activity after added the EDTA. Metals
and
ion,
Zn
such as Cu
2+
were inhibited the lipase activity.
ion could
Ca
increase lipase crude extract activity but inhibited the act
2+
lipase purifying product.
ion
Hg could increase the activity of lipase purifying product.
Keywords: Acinetobacter
sp, garbage dismissal place s soil, lipase
PENDAHULUAN
seperti tanah sawah, kebun sayur dan hutan. Pemurnian
dilakukan menggunakan fraksinasi fenil-toyopearl
Lipase merupakan biokatalisator yang mempunyai
kromatografi
DEAE-sepharosa dan kromatografi
kemampuan mengkatalisis reaksi hidrolisis
lipid
Enzim yang diperoleh mempunyai
menjadi asam lemak dan gliserol. Oleh superdex-200HR.
karena
aktivitas
kemampuannya dalam menghidrolisis lipid, lipase
dapat spesifik 9854 U/mg dengan tingkat kemurni
24,3
kali ekstrak kasar.
dimanfaatkan sebagai aditif dalam industri detergen.
Tempat Pembuangan Akhir (TPA) limbah rumah
Lipase yang digunakan dalam industri detergen
tangga
dan industri kecil diduga mengandung bakter
mempunyai sifat seperti rentang pH antara
8-10,5,
0
serta tetap aktif pada0C-60
suhu
C.30
penghasil
lipase,
karena
m erupak an
tem pat
bermacam-macam sampah, seperti
Sharma et al
., (2001) melaporkan bahwa penimbunan
total
makanan
pasokan enzim di dunia masih didominasi oleh
negarayang membusuk dan limbah rumah tangga
mengandung minyak. Sampah-sampah tersebut
Eropa. Hal tersebut m endorong upaya yang
untuk
kemungkinan
juga telah membentuk kompos. Oleh
mengisolasi dan memurnikan lipase. Lipase
telah
karena
itu
tanah
TPA berpotensi mengandung bakteri
diisolasi dari hewan, tanaman dan mikroorganisme.
penghasil
lipase. Penelitian ini mempunyai tujua
Mikroorganisme penghasil lipase ditemukan
dalam
mendapatkan isolat bakteri yang dapat menghasilkan
bermacam-macam habitat seperti limbah industri,
lipase
pabrik pengolahan minyak sayur, perusahaan
susu,dari tanah TPA, dan menganalisis karakteris
enzim
tanah yang terkontaminasi dengan minyak, makananlipase yang dihasilkan.
yang membusuk, timbunan kompos (Sharma
et al.,
2001). Kojima dan Shimizu (2003) berhasil memurnikan METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan.
Alat-alat yang digunakan adalah
lipase yang diisolasi dari bermacam-macam tanah
alat-alat
*Telp: Email: -
gelas
yang
um um
digunakan
pada
Laboratorium Kimia. Bahan yang digunakan: NaCl,
I s o l a s i ,
P e m u r n 125
i a n
d a
medium NB (peptone from meat 5 g, yeast Ekstrak
ekstrak enzim kasar yang mempunyai aktivitas terti
3 g/l),
minyak olive, ammonium sulfat,dilakukan
sephadex fraksinasi.
Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan dengan
G-150, selophan, tributirin agar (komposisi per
liter : Lipase.
ammonium sulfat secara bertahap pada
pepton daging 2,5 g, pepton kasein 2,5 g, penambahan
ekstrak ragi
3 gr, agar 12 g dan tributirin 10 ml),
15, 30,tris-HCl,
45 dan 60% jenuh. Caranya sebagai berik
buffer
amonium NaOH,
sulfat sebanyak 15% dimasukkan secara
buffer natrium asetat-HCl, buffer natrium fosfat,
polivinil alkohol, aseton, etanol,
, CaCl
, CuCl
EDTA, perlahan ke dalam gelas piala yang berisi ekstrak
2
2
sambil diaduk dengan
magnetic stirrer
sampai terbentuk
HgCl2,
endapan. Ekstrak kasar lipase kemudian disentri
Prosedur Kerja.
Penelitian ini akan dilakukan
dengan langkah sebagai berikut:
pada 10.000 g selama 20 menit. Endapan yang diperol
dinamakan F1. F1 dilarutkan dalam NaCl 1% dan
Isolasi Mikroorganisme Penghasil Lipase.
0
disimpan
C. 4Supernatan hasil fraksinasi
Mikroorganisme diisolasi dari sampel tanah
Tempat pada suhu
pertama ditambah ammonium sulfat sebanyak 30%,
Pembuangan Akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas.
selanjutnya dilakukan prosedur yang sama sehingg
Skrining mikroorganisme penghasil lipase menggunakan
F2. Prosedur yang sama dilakukan unt
cawan petri yang berisi medium tributirin diperoleh
agar. Kultur
diinkubasi
0
menghasilkan fraksi ammonium sulfat 45% (F3) da
pada
C selama
37
2 hari. Koloni penghasil
60% indeks
(F4). Seluruh fraksi yang dihasilkan didia
lipase yang memperlihatkan zona bening diukur
selophan (Saxena
et al.,
2003). Fraksi
lipolitiknya. Indeks lipolitik dinyatakan menggunakan
sebagai nisbah
hasil
dialisis dinamakan FHD1 (fraksi 15%), FH
antara diameter zona bening dengan diameter
koloni.
(fraksi
30%), FHD3 (fraksi 45%) dan FHD4 (fraksi 6
Isolat yang memiliki indeks lipolitik terbesar
dinamakan
isolat potensial penghasil lipase
et al.
,(Gupta
2003). Seluruh fraksi diuji aktivitas, kadar protein,
spesifik,
tingkat kemurniannya.
Identifikasi isolat penghasil lipase
yang
Kromatografi Kolom Filtrasi Fraksi
Gel.
potensial.
Uji biokimia dan uji morfologi (pengamatan
endapan
amonim sulfat yang memiliki unit
sel) dilakukan untuk identifikasi bakteri.
Uji biokimia
aktiv
yang
paling
tinggi dilanjutkan pemurniannya den
meliputi uji katalase, uji oksidase, dan uji
reduksi
nitrat.
filtrasi gel sephadex G-150. Langka
Bakteri ditumbuhkan dalam medium tumbuh metode
untuk
adalah sebagai berikut (Subardjo
et al.,
mengetahui jenis bakteri tersebut. Bakterilangkahnya
selanjutnya
1997). dan uji
diidentifikasi melalui serangkaian uji biokimiawi
Pembuatan kolom sephadex G150. Tepung
morfologi. Identifikasi dilakukan di Laboratorium
sephadex
G150 sebanyak 7 g dikembangkan dengan
Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas
Jendral
400 ml akuades dan diinkubasi pada suhu kamar
Soedirman Purwokerto.
Produksi Lipase.
Isolat
potensial
selama 72 jam. Suspensi ini dibiarkan sampa
diinokulasi
Gel yang mengapung dibuang, sedangkan
ke dalam 10 ml medium inokulum (medium mengendap.
NB),
diinkubasi
selama 2 hari dengan pengocokangel
300yang
rpm mengendap dijaga agar tetap terendam dala
0
akuades. Gelembung-gelembung udara yang terdapat
pada suhu 37
C. Medium NB sebanyak 50 ml
di dalam partikel-partikel gel dikeluarkan denga
diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambah
mengurangi
inokulum bakteri 0,5 ml dan minyak olive
sebagai tekanan udara diatas permukaan suspens
induser 0,5 ml. Medium produksi diinkubasi menggunakan
pada suhu pompa vakum. Gel kemudian direndam
370C sambil digoyang dengan kecepatan 300dalam
rpm buffer tris HCl pH 7,2. Kelebihan buffer d
yang mengendap disisakan lebih kurang 1 cm. G
selama 6, 12, 18, 24, 30 dan 36 jam dangel
diamati
dan dimasukan lewat batan
aktivitas lipase yang dihasilkan isolat diaduk
bakteriperlahan-lahan
pada
interval waktu tersebut.
pengaduk ke dalam kolom gelas dengan panjang
30 cm dan diameter 2,5 cm dan buffer tris HCl pH
Ekstraksi Lipase.
Medium produksi yang telah
diinkubasi diekstraksi
dengan menggunakan setinggi
sentrifus5 cm. Gel dibiarkan mengendap semuanya.
Pemurnian Lipase dengan Kolom Sephadex
pada kecepatan 10.000 g selama 20 menit. Supernatan
G-150.
Sebanyak 5 ml fraksi hasil dianalisis de
yang diperoleh disebut ekstrak enzim kasar.
Enzim
aktivitas tertinggi dimasukkan ke dalam kolom den
enzim kasar diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
1 2 6
J u r n a l
N a 1t 2 u( r2 ) :I n1 d2 4o -n 1e2 s9 i a
Z u s f a eh ta i ar l, .
Penentuan pH Optimum.Posedur kerja
hati-hati agar gel tidak rusak. Kolom dihubungkan
penentuan
dengan sumber eluen lewat pipa plastik.
Kolom pH optimum sama seperti pada uji aktivitas
tetapi
dengan variasi pH. Variasi pH yang dilakuk
Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan
buffer
pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 adalah
menit 5, 6, 7, 8, dan 9. Nilai pH optimum merupaka
pada saat enzim mempunyai aktivitas tertinggi. U
per tetes. Kran kolom kaca dibuka, eluat pH
ditampung
untuk pH 5 digunakan 100 mM buffer natriu
dalam botol ampul sebanyak 100 buah. Semuaaktivitas
eluat
asetatHCl, untuk pH 6-7 digunakan 100 mM buffer
ditentukan aktivitas, aktivitas spesifik
dan kadar
natrium
fosfat, sedangkan untuk pH 8, dan 9 digunaka
proteinnya. Fraksi yang mempunyai aktivitas
paling
buffer tris
tinggi selanjutnya ditentukan tingkat kemurnian
dan HCl.
Penentuan
Suhu Optimum.
Penentuan suhu
beberapa karakteristiknya meliputi pH optimum,
suhu
optimum, pengaruh beberapa logam berat.
optimum dilakukan seperti uji aktivitas dengan var
0
suhu 30, 40, 50, 60 ,70, 80,
C .
dan
Pengujian
90
Pengukuran Aktivitas Lipase
.Aktivitas lipase
dilakukan pada pH optimum yang telah diperoleh dari
diukur dengan medium emulsi minyak olive. Campuran
sebelumnya.
reaksi mengandung 2,5 mL emulsi 2 : 1 : tahap
1 = gum
Pengaruh
arab : Bufer fosfat 0,2M (pH 8) : minyak olive),
ditambahEDTA dan Logam terhadap Aktivitas
0
Penentuan pengaruh penambahan EDTA dan
0,2 mL larutan enzim, diinkubasi
C pada
selama
37 Lipase.
+2
+2
+2
ion 2,5
logam (Ca
, Zn
Cu 2+, Hg
) ditentukan dengan
30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan
ml aseton/etanol
dibebaskan
menambahkan
EDTA dan ion-ion logam masing-masing
1/1 (v/v). Asam lemak
yang
dititrasi
dengan
0,05
N dengan
NaOH
-2
konsentrasi
M10
sebanyak 0,06 ml ke dalam
larutan sampel sehingga konsentrasi akhir larutan pa
menggunakan phenoptalin (pp) sebagai indikator.
saatyang
uji aktivitas dilakukan-3 adalah
M. Sebagai
10
Pengukuran 1 unit enzim (U) adalah jumlah
pembanding aktivitas dilakukan uji pada sampel enzi
menyebabkan perubahan m
m1ol substrat (minyak olive)
permenit pada keadaan pengukuran optimum (Kojima
tanpa penambahan EDTA dan ion-ion logam.
& Shimizu, 2003).
Penentuan Kadar Protein.
Sebayak 0,5 ml
HASIL DAN PEMBAHASAN
sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil
ditambah dengan 5 ml pereaksi C. Larutan-larutan
Lipase dari Tanah TPA.
Sampel tanah diambil dari
tersebut dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar
selama
(TPA) Gunung Tugel, Purwokerto Selatan, Banyumas.
10 menit, kemudian ditambah Follin CiocalteuBakteri
sebanyak
ditumbuhkan pada medium tributirin agar, da
0,5 ml, dikocok dan dibiarkan selama 30
menit.
koloni terpilih untuk produksi lipase adalah ko
Serapan larutan diukur pada panjang gelombang
dengan zona jernih terbesar, yang menunjukkan lebih
750 nm. Kontrol dibuat dengan cara yang sama,
dengan
banyak
trigliserida dari medium dihidrolisis enzim l
sampelnya akuades. Standar protein dibuatbakteri
dengan tersebut. Isolat yang mempunyai zona jern
memasukkan 0,5 ml kasein
Hamersteindalam buferterbesar, selanjutnya diidentifikasi jenis bakterin
Tris-HCl ke dalam 6 buah tabung reaksi digunakan
dengan
untuk memproduksi enzim lipase. Hasil
konsentrasi 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0
mg
per
ml,koloni bakteri penghasil lipase yang t
identifikasi
selanjutnya
perlakuan
sama
seperti
sam
pelproduksi terlihat dalam Tabel 1.
untuk
(Lowry 1964 dalam Bollag
et al.,
1996).
Penentuan Waktu Produksi Optimum.
Waktu
Karakterisasi Enzim.
Karakterisasi enzim
produksi optimum ditentukan dengan mengisolasi
meliputi pH optimum, suhu optimum dan penentuan
enzim yang dihasilkan dalam rentang waktu inkubasi
pengaruh beberapa logam berat terhadap aktivitas lipase
Tabel 1. Hasil identifikasi bakteri tanah TPA Gunung Tugel penghasil lipase
Morfologi koloni
Tumbuh diNutrient Agar
dengan ciri koloni : kol
kecil, bentuk teratur te
berlekuk, ukuran kecil,
jernih, permukaan mengki
elevasi cembung rendah
Bentuk selGram Uji katalUji oksidaUji reduk
nitrat
Asam dari
Pendugaan jenis M
karbohidrat
Glucose (+)
Coccus
(-)
(+)
(-)
(-)
Acinetobacter,
sp.
Fructose(+)
I s o l a s i ,
P e m u r n 127
i a n
d a
0-30 jam, dan diamati tiap 6 jam selamapori-pori
18 jam. yang sangat halus. Molekul protein yan
dapat menembus
Aktivitas lipase yang dihasilkan isolat bakteri
dibuat pori-pori dan tertahan selama ali
kurva terhadap waktu produksi (Gambar 1). ke bawah kolom. Molekul protein yang lebih be
akan terelusi lebih dahulu oleh pelarutnya di
Fraksinasi lipase dengan amonium sulfat.
molekul
Fraksinasi dengan amonium sulfat merupakan
salah yang lebih kecil, sehingga dapat ter
fraksi berdasarkan ukuran molekul
satu cara pemurnian protein melalui pemisahan
proses
Kecepatan aliran molekul protein tergantung d
pengendapan garam. Pada proses ini protein dipisahkan
kemampuannya
memasuki pori-pori (Blaber, 1998).
dari komponen nonprotein yang terdapat di
dalam
Kolom kromatografi yang digunakan adalah
larutannya. Penambahan garam amonium sulfat akan
sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 7,2
menurunkan kelarutan protein karena terjadinya
kompetisi antara ion garam yang ditambahkanHasil
denganfraksinasi terlihat pada Gambar 2, y
mempunyai
dua fraksi dengan aktivitas lipase ti
protein yang terlarut sehingga terjadi
salting .efek
out
yaitu
fraksi 24 dengan aktivitas 2880 U/ml dan
Fraksinasi amonium sulfat dilakukan dengan
tingkat
dengan aktivitas 2560 U/ml. Fraksi 24 selanju
kejenuhan 15%, 30%, 45% dan 60% jenuh. 37
Hasil
dilakukan karakterisasi.
pemurnian lipase Acinetobacter
dari
sp. terlihat dalam
Karakterisasi Lipase. Penentuan pH dan
Tabel 2. Data ini menunjukkan fraksi 45% mempunyai
suhu
optimum.Hasil
aktivitas spesifik tertinggi yaitu 442,396
U/mg dan penentuan pH optimum ekstrak kasar
dan sehingga
hasil permurnian lipase terlihat dalam Gamba
tingkat kermurnian 6,28 kali ekstrak kasarnya,
Pada grafik tersebut terlihat pH optimum lipase
fraksi 45% dimurnikan lebih lanjut menggunakan
pH 6,0. Secara umum, lipase bakteri mempunyai p
kromatografi kolom gel filtrasi.
Menggunakan optimum netral dan alkali, dengan pengecualian li
P. fluorescens
mempunyai pH optimum 4,8 (Gupta
Kromatografi Kolom Gel Filtrasi.
Fraksi 45% dari
et al.,
2004). Lipase yang dihasilkan dalam penelit
amonium sulfat dengan kemurnian tertinggi dilanjutkan
ini
termasuk
lipase bakteri pada umumnya dengan p
dengan pemurnian menggunakan kromatografi kolom
Pemurnian
Lipase
netral.
filtrasi gel. Pemisahan protein enzim padaoptimum
metode mendekati
ini
Suhu optimum ekstrak kasar dan hasil permurnia
didasarkan atas perbedaan ukuran molekul protein
lipase pada penelitian ini ditentukan dalam jang
melalui sebuah kolom yang dinamakan sephadex.
Aktivitas (U/ml)
200
150
100
50
3500
0.7
3000
2500
0.6
0.5
2000
0.4
1500
0.3
1000
0.2
500
0.1
0
0
0
0
5
5
10
15
20
25
10
15
20(jam) 25
Waktu inkubasi
0
0 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 55 60 65 70 75 80
Fraksi
Fraksi
30
Kadar Protein (mg/ml)
Aktivitas (U/ml)
Sephadex terbuat dari protein berhidrat tinggi dengan
Kadar Protein
AAktifitas
s
30
Gambar 1. Aktivitas lipase terhadap waktu produksi Gambar 2. Aktivitas dan kadar protein lipase fraksi-fraks
pemurnian dengan filtrasi gel
Tabel 2. Hasil pemurnian protease dengan fraksinasi amonium sulfat
Volume
sample
(ml)
Protein
(mg/ml)
Ekstrak kasar
25
1,632
40,800
FS-15%
23
1,296
FS-30%
26,5
FS-45%
FS-60%
Tahap pemurnian
Total
protein
(mg)
Aktivitas
(U/ml)
Total
Aktivitas
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
Tingkat
kermurnian
115
2875
70,469
1
29,80
8
500
11500
385,800
5,47
1,252
33,178
500
13250
399,255
5,67
24,5
0,633
15,509
280
6860
442,396
6,28
25
0,724
18,100
100
2500
138,076
1,96
J u r n a l
Aktivitas (U/ml
1 2 8
N a 1t 2 u( r2 ) :I n1 d2 4o -n 1e2 s9 i a
Z u s f a eh ta i ar l, .
1000
900
Hasil
Pemurnian
Ekstrak Kasar
800
700
600
500
400
300
200
100
0
8
9
10
pH
Gambar 3. Aktivitas lipase terhadap pH medium reaksi
enzimatis
Gambar
5. Pengaruh EDTA dan logam pada aktivitas lipase
Aktivitas (U/ml
5
6
7
2004). Kalsium merangsang lipase
B. subtilis
dari168,
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
Hasil pemurni
Ekstrak kas
B. thermoleovorans
ID1,
P. aeruginosa
EF2,S. aureus
226,S. hyicus
, C. viscosumdanAcinetobacter
sp.
RAG-1, sedangkan lipase P.dari
aeruginosa
10145
justru dihambat oleh ion kalsium. Aktivitas lipase s
2+
2+
umum dihambat oleh logam berat seperti
, Ni
, Co
0
2+
Hg 2+ dan Sn
, serta sedikit dihambat2+ oleh
dan Zn
30
40 Suhu 50
60
70
Mg 2+(Guptaet
Gambar 4. Aktivitas lipase terhadap suhu inkubasi selama
reaksi
enzimatis
penambahan
al.,
2004). Hasil penelitian pengaruh
EDTA dan berbagai logam terlihat
Gambar 5. Gambar tersebut menunjukkan bahwa
0
0
aktivitas lipase yang dihasilkan dalam percobaan
suhu 30
C sampai 60
C . Hasil penentuan suhu
secarapada
umum dihambat EDTA dan beberapa logam yang
optimum terlihat dalam Gambar 4. Lipase bakteri
digunakan, namun ada perbedaan yaitu aktivitas ekstra
umumnya mempunyai suhu optimum dalam jangkauan
0
kasar
meningkat dengan adanya 2+ion
, sedangkan
Ca
30-60C. Meskipun demikian ada beberapa lipase
yang
lipase
hasil pemurnian aktivitasnya meningkat denga
suhu optimumnya di atas atau di bawah jangkauan
suhu
ion 2+
Hg
.
tersebut. Lipase yang tetap stabil pada adanya
suhu tinggi
ditemukan
pada
,Chromobacterium,
spesies
bakteri
Bacillus
Pseudomonas, dan
KESIMPULAN
Staphylococcus
. Lipase yang dihasilkan
Bacillus
sp.
Salah satu species bakteri dari tanah TPA Gunung
0
tetap stabil pada suhu
C selama
70
150 menit (Gupta
Tugel Kabupaten Banyumas yang dapat menghasilkan
et al.,
2004). Lipase yang dihasilkan dalam penelitian
lipase ekstra seluler teridentifikasi sebag
ini mempunyai kinetika suhu seperti lipase Acinetobacter,
bakteri padasp.
0
umumnya, yaitu suhu optimum
C . 40
Aktivitas spesifik tertinggi hasil pemurnian li
Pengaruh EDTA dan berbagai Ion Logam.
diperoleh pada hasil fraksi amonium sulfat 45% (FS
Beberapa enzim termasuk lipase tertentu aktivitasnya
45%) sebesar 442,4 U/mg protein dengan tingkat
dipengaruhi oleh logam, hal ini disebabkan kemurnian
yang logam 6,28 kali ekstrak kasar. Pemurnian filtr
tersebut merupakan kofaktor lipase, sehingga
gel dengan
sephadex G-150, kemurnian tertinggi pada
meningkatkan aktivitas, sedangkan beberapafraksi
logam24 dengan aktivitas 2880 U/ml, dan aktivi
tertentu dapat menurunk an aktivitasspesifik
yang 8195,8 U/mg protein. Lipase yang dihasilk
0
mempengaruhi stabilitas konformasi. EDTA merupakan
mempunyai pH optimum 6, dan suhu optimum
C. 40
senyawa pengkelat logam, apabila enzim lipase dalam
Aktivitas lipase ini dihambat oleh EDTA dan
2+
2+
penelitian ini membutuhkan kofaktor logam,
maka ion logam seperti
beberapa
danCuZn
. Ion 2+
Ca
ketika ditambahkan EDTA aktivitasnya akan meningkatkan
menurun
aktivitas ekstrak kasar lipase, tet
2+
, karena kofaktornya terkelat oleh EDTA tersebut.
menghambat aktivitas lipase hasil pemurnian.
Ion Hg
Kofaktor secara umum tidak diperlukanmeningkatkan
untuk
aktivitas lipase hasil pemurnian, tet
aktivitas lipase, tetapi kation divalen seperti
kalsium
menghambat
aktivitas ekstrak kasar lipase.
kadang merangsang aktivitas enzim et
(Gupta
al.,
I s o l a s i ,
P e m u r n 129
i a n
d a
Overview of production, purification and biochemical prope
Appl. Microbiol Biotechnol.
64: 763-781.
Gupta, R., Rathi, P., Gupta, N. & Bradoo,
2003. Lipase
S.
assay
Penulis mengucapkan terimakasih kepada
for conventional and molecular screening: an overvi
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi atas bantuan
Biotechnol. Appl. Biochem.
37: 63-67.
Kojima
Y.
&
Shimizu,
2003.
S.
Purification and characterization
dana untuk penelitian ini melalui Program Penelitian
oh the lipase from
Pseudomonas fluorescens
HU380.
Dosen Muda tahun 2006.
Journal Bioscence and Bioengineering.
96: 219-226.
Saxena, R.K., Sheoran, A., Giri, B. & Davidson,
2003. W.S.
Purification strategies for microbial
J. Microb
lipases.
Meth.
52: 1-18.
DAFTAR PUSTAKA
Sharma, R., Chisti, Y. & Banerjee,
2001,
U.C.Productin,
Blaber, M.
1998. Protein Purification: Column Chromatographypurification,
characterization
and
applications of l
Ion Exchange, Dialysis and Concentration
. In Molecular
Biotech Adv.
19:627-662.
http://wine
1.sb.fsu.edu/bch
Biology and Biotechnology.
Subardjo, B., Maryanto, J. Kartini, Suyata, Hartiwi, D.
5425/lect 30/htm. (7 June 2004).
Kusumaharti, I.A.
1997. Pengembangan potensi bakteri
Bollag, D.M., Rozycki, M.D. & Edelstein,
1996.Protein
S.I.
bongkrekPseudomonas cocovenenansX-128 untuk
Methods nd
2 Ed. New York: John Willey dan Sons.
produksi gliserol, asam lemak dan
J. lipase.
Agrin.
1: 1-4.
Gupta, R., Gupta, N. & Rathi,
2004.P. Bacterial lipases: an
UCAPAN TERIMAKASIH
View publication stats