BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum
Panjang gelombang analisis ditentukan dengan membuat kurva serapan kloramfenikol baku menggunakan spektrofotometer
Ultraviolet UV
. Spektrum hasil pengukuran kloramfenikol baku dapat dilihat pada gambar 6
Gambar 6.
Kurva Serapan Kloramfenikol Baku 15 ppm Secara
S pektrofotometri UV
Dari kurva diatas, dapat dilihat bahwa kloramfenikol memberikan serapan pada panjang gelombang 278 nm. Hasil yang diperoleh berbeda dengan panjang
gelombang yang digunakan dalam prosedur SNI 7541.1:2009 yang menjadi pedoman pada penelitian ini. Dimana menurut SNI 7541.1:2009, panjang
gelombang kloramfenikol yang digunakan adalah 270 nm. Namun menurut Ditjen POM 1979 dan Moffat et all 2005, kloramfenikol memberikan serapan
maksimum pada panjang gelombang 278 nm. Selisih panjang gelombang
Universitas Sumatera Utara
maksimum yang didapat adalah 8 nm. Berdasarkan hal tersebut maka analisis kloramfenikol dalam penelitian ini digunakan panjang gelombang 278 nm.
4.2 Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku
Kurva kalibrasi kloramfenikol Baku dibuat dengan konsentrasi 0,03 ; 0,07 ; 0,1 ; 0,3 ; 0,5 µgml. Dari kurva kalibrasi diperoleh hubungan yang linier antara
luas area dan konsentrasi dengan koefisien korelasi r = 0,9997. Koefisien korelasi yang diperoleh ini masih dalam batas penerimaan nilai koefisien korelasi
yaitu r = 0,995 Moffat, et all. Dari hasil perhitungan, diperoleh persamaan regresi
5765 ,
44 4589
, 15754
− =
X Y
. Kurva kalibrasi kloramfenikol dapat dilihat
pada gambar 7.
Gambar 7. Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku
Universitas Sumatera Utara
Kromatogram hasil penyuntikan larutan kloramfenikol Baku untuk penentuan kurva kalibrasi dapat dilihat pada lampiran 2. Hal. 49 dan perhitungan persamaan
regresi dapat dilihat pada lampiran 3, Hal. 52.
4.3 Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel
Penetapan kadar residu kloramfenikol dalam ikan gurami dan ikan mas telah dilakukan mengikuti prosedur SNI 7541.1:2009, menggunakan fase gerak metanol
– air dengan perbandingan 50:50. Tetapi dari hasil penelitian tidak diperoleh kondisi yang sesuai dan hasil yang kurang baik, dimana waktu tambat yang
dihasilkan terlalu lama dan jumlah lempeng yang kurang begitu besar. Oleh karena itu, di lakukan optimasi fase gerak dengan memvariasikan komposisi
metanol dan air. Waktu tambat kloramfenikol yang diperoleh pada perbandingan 50:50 adalah 7,71 menit dengan nilai asimetris 2,05 sedangkan pada
perbandingan 55:45 diperoleh waktu tambat yang relatif singkat yaitu 5,95 menit dengan nilai asimetri 1,83 dan nilai lempeng teoritis yang paling besar diantara
perbandingan fase gerak lainnya. Menurut Rohman, 2007, Jumlah lempeng merupakan salah satu parameter yang digunakan untuk menilai kualitas
pemisahan kromatografi yakni efisiensi. Oleh karena itu, semakin besar jumlah lempeng yang dihasilkan akan menunjukkan bahwa kolom mampu memisahkan
komponen dalam campuran dengan baik berarti efisiensi kolom besar. Berdasarkan hal tersebut maka perbandingan komposisi fase gerak yang
digunakan dalam penelitian ini adalah metanol – air 55:45 dengan laju alir 1mlmenit. Data hasil analisis perbandingan komposisi fase gerak dapat dilihat
pada tabel 1. Kromatogram kloramfenikol baku untuk mencari perbandingan komposisi fase gerak yang optimal dapat dilihat pada lampiran 1 Hal. 45.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 1. Data Hasil Analisis Kloramfenikol Baku 10 ppm pada Berbagai
Perbandingan Komposisi Fase Gerak Perbandingan Fase Gerak
Waktu tambat menit
Asym Jumlah
Lempeng Teoritis N
Metanol Air
40 60
14,49 2,56
3685 50
50 7,71
2,05 2840
55 45
5,95 1,83
4050 60
40 4,83
1,91 3705
65 35
4,11 1,86
3355 70
30 3,61
1,87 2889
75 25
3,29 2,04
2673 Dari hasil penyuntikan larutan sampel diperoleh waktu tambat salah satu
puncak yaitu 6,02 menit. Waktu tambat ini berdekatan dengan waktu tambat kloramfenikol baku yang dianalisis dengan KCKT pada kondisi yang sama yaitu
5,96 menit. Meskipun waktu tambat yang dihasilkan tidak sama persis, namun puncak yang diamati dalam kromatogram sampel dapat diterima sebagai puncak
kloramfenikol karena waktu tambat 6,02 menit masih berada pada rentang waktu tambat yang diterima dan pada sampel blanko tidak terlihat adanya puncak
kloramfenikol pada menit 5-6 gambar 8D . Menurut Wetson and Brown 1997, rentang waktu tambat yang dapat diterima yaitu ± 5 dari waktu tambat baku.
Kedua kromatogram hasil analisis KCKT dapat dilihat pada gambar 8A dan 8B. Maka untuk mempertegas hal tersebut, ditambahkan sedikit larutan
kloramfenikol baku ke dalam larutan sampel spiking method, lalu dianalisis kembali dengan KCKT pada kondisi yang sama. Hasil analisis menunjukkan
terjadi peningkatan luas dan tinggi puncak kloramfenikol dari yang diamati sebelumnya. Jadi dapat disimpulkan bahwa puncak yang diamati dalam larutan
sampel adalah benar merupakan puncak kloramfenikol. Kromatogram larutan sampel yang dianalisis setelah spiking dapat dilihat pada gambar 8C.
Universitas Sumatera Utara
RT Luas Puncak
5,95 166900
A
RT Luas Puncak
6,05 2762
B
C RT
Luas Puncak 6,02
34807
D Gambar 8.
Kromatogram Hasil Penyuntikan Kloramfenikol Baku 10 ppm A, Larutan Sampel Ikan B, dan Larutan Sampel yang telah di-Spike
dengan Larutan Baku Pembanding Kloramfenikol C Larutan Sampel Blanko D dengan Kondisi KCKT yang Sama.
Universitas Sumatera Utara
Hasil pengolahan data penyuntikan larutan sampel secara
KCKT
menggunakan kolom C18 Phenomenex dengan perbandingan fase gerak metanol - air 55 : 45,
volume penyuntikan 10 µ l, laju alir 1 mlmenit, detektor
UV
-
V
is L - 2420 pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh 278 nm. Kadar residu
kloramfenikol dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area pada Y dari persamaan regresi
5765 ,
44 4589
, 15754
− =
X Y
. Hasil perhitungan residu kloramfenikol dalam sampel setelah diuji secara statistik dapat dilihat pada tabel2.
Tabel 2. Hasil Penetapan Kadar Kloramfenikol dalam Sampel Ikan Gurami dan
Ikan Mas Secara Statistik NO.
Ikan Gurami Osphronemus goramy
Rentang Kadar Residu Kloramfenikol mgkg
1 Ikan Gurami PG
1
0,0617±0,0162 2
Ikan Gurami PG
2
0,0786 ±0,0045 3
Ikan Gurami PG
3
0,1190±0,0111 4
Ikan Gurami PG
4
0,0767±0,0048
NO. Ikan Mas
Cyprinus carpio Rentang Kadar Residu
Kloramfenikol mgkg 1
Ikan Mas PM
1
0,0676±0,0035 2
Ikan Mas PM
2
0,0735±0,0094 3
Ikan Mas PM
3
0,2169±0,0448 4
Ikan Mas PM
4
0,2092±0,0075
Berdasarkan data tersebut, residu kloramfenikol yang di peroleh dari empat pasar di kota Binjai tidak memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan oleh RSNI
No. : 05 – TAN – 1996.
4.4 Hasil Uji Validasi