Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Oleh:
ANIFA BINTAR RAHMAWATI
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
ABSTRAK
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan
Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24
subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C
(Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A.
mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi
terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m.
ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada
usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di
lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA
mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom
b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b
dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA
berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu
mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data
DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.
ABSTRACT
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on
cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on
morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the
African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O).
Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia
generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become
threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive
Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the
Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research
was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA.
Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by
using restriction site of cyt b/BglII. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse
primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme
revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This
indicated that there were no AHB in Java, so far.
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
Anifa Bintar Rahmawati
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen
Sitokrom B Dari DNA Mitokondria
Nama
: Anifa Bintar Rahmawati
NRP
: G34102010
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi
NIP 131 999 583
Drs. Chandra Widjaja,MM
NIP 080 057 508
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala
rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin,
MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat
besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya
terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan
Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada
seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah,
Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi
mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di
Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian,
Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan
terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang
memberikan semangat didalam hatiku.
Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan
Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta
doanya selama ini.
Bogor, Mei 2007
Anifa Bintar Rahmawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga
bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire.
Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan
menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah
mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan
studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi
dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah
Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan
pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum
Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar
Indonesian Toray Science Fondation pada tahun 2006, sebagai peserta.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL............................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE
Koleksi Lebah .........................................................................................................................
Ekstraksi dan Isolasi DNA ......................................................................................................
Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera .........................................................................
Elektroforesis dan Visualisasi DNA........................................................................................
Pengukuran pita DNA .............................................................................................................
PCR-RFLP ..............................................................................................................................
Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA..........................................
1
1
2
2
2
2
3
HASIL
Amplifikasi DNA ....................................................................................................................
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII.....................
Pengurutan DNA A. mellifera ................................................................................................
Alignment DNA......................................................................................................................
3
3
3
3
PEMBAHASAN .....................................................................................................................
7
KESIMPULAN ...................................................................................................
7
SARAN ...............................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
8
LAMPIRAN........................................................................................................
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera ..........
2
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse
sitokrom b .................................................................................................................................
3
2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII .................
3
3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ..................................................................
4
4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ........................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta,
dan Jawa Barat.......................................................................................................................... 9
2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward
sitokrom b ............................................................................................................................... 11
3. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse
sitokrom b ............................................................................................................................... 12
PENDAHULUAN
Latar belakang
Apis mellifera termasuk kedalam Ordo
Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili
Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera
adalah lebah madu yang dibudidayakan
karena produksi madunya yang tinggi. Lebah
madu ada yang hingga saat ini belum semua
dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah
dapat dibudidayakan adalah dari kelompok
lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan
lebah madu yang belum dapat dibudiyakan
yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreniformis, A. florea dan A. laboriosa.
Lebah A. mellifera merupakan spesies lebah madu yang persebarannya paling luas. A.
mellifera ditemukan di sebagian besar daerah
gurun pasir dan daerah dengan temperatur
yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami
A. mellifera adalah di daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa.
Berdasarkan analisis morfometrika, Ruttner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi
empat kelompok garis keturunan (lineage).
Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera
yang daerah persebarannya meliputi daerah
Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C
meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur
Tengah. Pengelompokan yang sama juga dihasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan
DNA mitokondria.
Peternak lebah di dunia banyak mengimpor beberapa subspesies A. mellifera yaitu A.
m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa.
Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983).
Peternakan lebah menjadi terancam sejak
lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari
Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956.
Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan
untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya
baik di daerah tropis. A. m. scutellata mengalami hibridisasi dengan lebah madu Eropa
yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang
menghasilkan Africanized honey bee (AHB)
(Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas,
sengat yang mematikan dan sangat cepat
dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999).
Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil
ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California
(Schneider et al. 2003).
Secara morfologi peternak lebah tidak
dapat membedakan antara lebah AHB dan
lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian
dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan
dengan menggunakan penanda molekuler
mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturunkan secara maternal melalui sitoplasma, tidak
mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi
rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b
pada DNA mitokondria yang dipotong dengan
enzim BglII dapat digunakan untuk mendeteksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991)
enzim BglII mampu untuk memotong gen
sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi
AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b,
enzim dan daerah gen lain dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB.
Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan
cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).
Hingga saat ini belum ada usaha untuk
mendeteksi keberadaan AHB di peternakan
lebah madu di Indonesia khususnya di Balai
Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan
untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. mellifera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b
pada DNA mitokondria.
Bahan dan Metode
Koleksi Lebah
Contoh lebah diperoleh dari hasil
pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005
yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan
Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Sebanyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati
dan Jember disimpan dalam tabung berisi
etanol absolut.
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh
peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin
2006). Secara garis besar tahap persiapan dan
pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai
berikut.
Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah
dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10
mM untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan
adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks
lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml
diletakkan dalam steroform berisi nitrogen
cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi
alkohol (Sambrook et al. 1989).
2
Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera
berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)
Nama Primer
Susunan nukleotida primer (5’-3’)
Sitokrom b Forward
Sitokrom b Reverse
TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC
ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium
bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasukkan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah
digerus untuk melisis membran. Kemudian
ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu
55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran
CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000
rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung steril baru,
kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform
Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan
dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000
rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi
13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).
Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000
rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam
supernatan dipresipitasi dengan menggunakan
600 µl isopropanol selama semalam pada suhu
−4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit.
Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan
pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC.
Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan
dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil
ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan
disimpan pada suhu −4 oC.
Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera
DNA lebah diamplifikasi menggunakan
mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pereaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP,
Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM primer sitokrom b reverse, 10 µM primer sitokrom b forward (Tabel 1) (Crozier et al.
1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA
hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan
tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas
ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing
(penempelan primer) pada 55 ºC selama 1
menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72
º
C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan
selama 30 siklus.
Posisi nukelotida primer
pada mitokondria total
11400-11425
11859-11884
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)
6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam
borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus listrik yang digunakan sebesar 160 V selama 90
menit. Visualisasi DNA dalam gel poli
akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak
(Silver staining) yang dilakukan dalam shaking bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil
elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB
(0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit.
Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali
masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas
lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml
akuades) selama 6 menit.
Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH,
dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemudian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua
kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel
direndam dalam campuran larutan 4 gr
Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml
akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir,
gel direndam dalam larutan asam asetat 1%
dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita
DNA.
Pengukuran pita DNA
Pengukuran pita DNA dilakukan untuk
mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel
akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada
pita penanda DNA dan pada DNA target.
Penentuan ukuran pita DNA target berdasarkan regresi menggunakan program R (the R
Development Core Team Version 1.6.0) (Venables & Ripley 1999).
PCR-RFLP
DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim restriksi BglII.
Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemotong enam basa. Situs pemotongannya adalah
AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong
basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank
L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam
total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil
amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4
µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Oleh:
ANIFA BINTAR RAHMAWATI
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
ABSTRAK
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan
Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24
subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C
(Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A.
mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi
terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m.
ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada
usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di
lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA
mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom
b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b
dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA
berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu
mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data
DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.
ABSTRACT
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on
cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on
morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the
African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O).
Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia
generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become
threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive
Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the
Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research
was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA.
Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by
using restriction site of cyt b/BglII. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse
primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme
revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This
indicated that there were no AHB in Java, so far.
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
Anifa Bintar Rahmawati
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen
Sitokrom B Dari DNA Mitokondria
Nama
: Anifa Bintar Rahmawati
NRP
: G34102010
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi
NIP 131 999 583
Drs. Chandra Widjaja,MM
NIP 080 057 508
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala
rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin,
MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat
besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya
terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan
Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada
seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah,
Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi
mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di
Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian,
Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan
terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang
memberikan semangat didalam hatiku.
Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan
Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta
doanya selama ini.
Bogor, Mei 2007
Anifa Bintar Rahmawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga
bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire.
Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan
menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah
mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan
studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi
dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah
Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan
pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum
Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar
Indonesian Toray Science Fondation pada tahun 2006, sebagai peserta.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL............................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE
Koleksi Lebah .........................................................................................................................
Ekstraksi dan Isolasi DNA ......................................................................................................
Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera .........................................................................
Elektroforesis dan Visualisasi DNA........................................................................................
Pengukuran pita DNA .............................................................................................................
PCR-RFLP ..............................................................................................................................
Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA..........................................
1
1
2
2
2
2
3
HASIL
Amplifikasi DNA ....................................................................................................................
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII.....................
Pengurutan DNA A. mellifera ................................................................................................
Alignment DNA......................................................................................................................
3
3
3
3
PEMBAHASAN .....................................................................................................................
7
KESIMPULAN ...................................................................................................
7
SARAN ...............................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
8
LAMPIRAN........................................................................................................
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera ..........
2
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse
sitokrom b .................................................................................................................................
3
2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII .................
3
3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ..................................................................
4
4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ........................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta,
dan Jawa Barat.......................................................................................................................... 9
2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward
sitokrom b ............................................................................................................................... 11
3. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse
sitokrom b ............................................................................................................................... 12
PENDAHULUAN
Latar belakang
Apis mellifera termasuk kedalam Ordo
Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili
Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera
adalah lebah madu yang dibudidayakan
karena produksi madunya yang tinggi. Lebah
madu ada yang hingga saat ini belum semua
dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah
dapat dibudidayakan adalah dari kelompok
lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan
lebah madu yang belum dapat dibudiyakan
yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreniformis, A. florea dan A. laboriosa.
Lebah A. mellifera merupakan spesies lebah madu yang persebarannya paling luas. A.
mellifera ditemukan di sebagian besar daerah
gurun pasir dan daerah dengan temperatur
yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami
A. mellifera adalah di daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa.
Berdasarkan analisis morfometrika, Ruttner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi
empat kelompok garis keturunan (lineage).
Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera
yang daerah persebarannya meliputi daerah
Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C
meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur
Tengah. Pengelompokan yang sama juga dihasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan
DNA mitokondria.
Peternak lebah di dunia banyak mengimpor beberapa subspesies A. mellifera yaitu A.
m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa.
Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983).
Peternakan lebah menjadi terancam sejak
lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari
Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956.
Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan
untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya
baik di daerah tropis. A. m. scutellata mengalami hibridisasi dengan lebah madu Eropa
yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang
menghasilkan Africanized honey bee (AHB)
(Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas,
sengat yang mematikan dan sangat cepat
dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999).
Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil
ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California
(Schneider et al. 2003).
Secara morfologi peternak lebah tidak
dapat membedakan antara lebah AHB dan
lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian
dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan
dengan menggunakan penanda molekuler
mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturunkan secara maternal melalui sitoplasma, tidak
mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi
rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b
pada DNA mitokondria yang dipotong dengan
enzim BglII dapat digunakan untuk mendeteksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991)
enzim BglII mampu untuk memotong gen
sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi
AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b,
enzim dan daerah gen lain dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB.
Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan
cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).
Hingga saat ini belum ada usaha untuk
mendeteksi keberadaan AHB di peternakan
lebah madu di Indonesia khususnya di Balai
Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan
untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. mellifera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b
pada DNA mitokondria.
Bahan dan Metode
Koleksi Lebah
Contoh lebah diperoleh dari hasil
pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005
yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan
Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Sebanyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati
dan Jember disimpan dalam tabung berisi
etanol absolut.
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh
peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin
2006). Secara garis besar tahap persiapan dan
pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai
berikut.
Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah
dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10
mM untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan
adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks
lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml
diletakkan dalam steroform berisi nitrogen
cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi
alkohol (Sambrook et al. 1989).
2
Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera
berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)
Nama Primer
Susunan nukleotida primer (5’-3’)
Sitokrom b Forward
Sitokrom b Reverse
TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC
ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium
bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasukkan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah
digerus untuk melisis membran. Kemudian
ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu
55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran
CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000
rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung steril baru,
kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform
Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan
dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000
rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi
13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).
Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000
rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam
supernatan dipresipitasi dengan menggunakan
600 µl isopropanol selama semalam pada suhu
−4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit.
Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan
pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC.
Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan
dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil
ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan
disimpan pada suhu −4 oC.
Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera
DNA lebah diamplifikasi menggunakan
mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pereaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP,
Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM primer sitokrom b reverse, 10 µM primer sitokrom b forward (Tabel 1) (Crozier et al.
1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA
hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan
tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas
ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing
(penempelan primer) pada 55 ºC selama 1
menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72
º
C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan
selama 30 siklus.
Posisi nukelotida primer
pada mitokondria total
11400-11425
11859-11884
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)
6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam
borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus listrik yang digunakan sebesar 160 V selama 90
menit. Visualisasi DNA dalam gel poli
akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak
(Silver staining) yang dilakukan dalam shaking bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil
elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB
(0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit.
Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali
masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas
lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml
akuades) selama 6 menit.
Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH,
dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemudian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua
kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel
direndam dalam campuran larutan 4 gr
Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml
akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir,
gel direndam dalam larutan asam asetat 1%
dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita
DNA.
Pengukuran pita DNA
Pengukuran pita DNA dilakukan untuk
mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel
akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada
pita penanda DNA dan pada DNA target.
Penentuan ukuran pita DNA target berdasarkan regresi menggunakan program R (the R
Development Core Team Version 1.6.0) (Venables & Ripley 1999).
PCR-RFLP
DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim restriksi BglII.
Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemotong enam basa. Situs pemotongannya adalah
AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong
basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank
L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam
total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil
amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4
µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata
3
steril 1.1 µl. Campuran pereaksi RFLP kemudian disentrifugasi 4500 rpm selama 1 menit,
lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam.
Hasil pemotongan dimigrasikan pada gel
akrilamida 6% dengan arus 120 V selama 90
menit. Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Tegelstrom 1986).
Pengurutan DNA dan Alignment DNA
Pengurutan hasil amplifikasi DNA gen
sitokrom b dilakukan menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Charoen Pockphan
Jakarta, menggunakan mesin ABI 310 Applied
Biosystem. Pengurutan DNA dilakukan dari
ujung 5' dan 3' menggunakan primer sitokrom
b forward dan reverse.
Hasil pengurutan DNA dilakukan analisis
homologi dengan cara alignment DNA.
Alignment DNA dilakukan antara gen sitokrom b A. m 19 Pati dengan gen A. mellifera
(Crozier dan Crozier 1993); Acc Number L0 6178 pada GenBank menggunakan program
Clustal X (Thompson 1997). Analisis homologi juga dilakukan antara gen sitokrom b Am
19 Pati, A. mellifera (Crozier dan Crozier
1993) dan AHB haplotipe satu: Genbank Acc
Number EF016646 dan AHB haplotipe dua:
Acc Number EF016647.
HASIL
Amplifikasi DNA
Hasil amplifikasi dan RFLP gen sitokrom
b dilakukan pada seluruh contoh A. mellifera.
Seluruh contoh menghasilkan ukuran PCR
produk yang sama (500 pb) (Gambar 1). Data
gambar PCR produk dan RFLP diperoleh dari
contoh A. mellifera asal Jawa Timur (koloni
61-70, sesuai Lampiran 1). Data gambar
tersebut mewakili data dari seluruh contoh A.
mellifera pada penelitian ini.
pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500
400
300
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen sitokrom b A.
mellifera yang diimpor ke Indonesia M = marker (DNA 100 bp), 110 = nomor contoh A. mellifera
Jawa Timur dengan no. koloni 6170 (lampiran 1).
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi BglII
Seluruh produk sitokrom b A. mellifera
dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil
gel menunjukkan satu mitotipe yang memiliki
dua pita DNA berukuran kurang lebih 200
dan 300 pb. Dengan demikian terdapat satu
situs pemotongan yang monomorfik (seragam) (Gambar 2).
Daerah restriksi gen sitokrom b hasil
pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen
DNA menghasilkan dua fragmen dengan
ukuran 194 pb & 291 pb (Gambar 3). Posisi
BglII dari hasil pengurutan nukleotida DNA
gen sitokrom b A. mellifera terdapat pada basa
ke 291 pb (Gambar 4).
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
300
200
Gambar 2 Hasil pemotongan gen sitokrom b
A. mellifera dengan menggunakan
enzim restriksi BglII M=marker
(DNA 100 bp), 1-10=nomor contoh A. mellifera dengan no koloni
(61-70) (lampiran 1)
Pengurutan DNA A. mellifera
Contoh A. mellifera yang dipilih untuk
dilakukan pengurutan DNA adalah A. mellifera koleksi Pati dengan nomor koloni 19.
Pemilihan nomor koloni Am 19 untuk
pengurutan DNA berdasarkan pada produk
DNA hasil amplifikasi yang baik. Proses
pengurutan DNA menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b. Hasil pengurutan DNA berupa kromatogram (Lampiran 2 &
3) telah diedit secara manual. Hasil edit kemudian dimasukkan ke dalam program Genetyx
(Genetyx Win Versi 4.0) untuk analisis lebih
lanjut. Hasil pengurutan DNA pada nomor
contoh A. mellifera 19 Pati menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse didapatkan 485 pb (Gambar 5).
Alignment DNA
Analisis alignment DNA dilakukan untuk
mengetahui homologi nukleotida. Nomor
contoh A. mellifera 19 Pati dilakukan alignment DNA dengan lebah A. mellifera yang
4
fera hasil dari Crozier dan Crozier (1993) Acc
Number L06178. Hasil alignment DNA
sitokrom b Am 19 Pati dengan AHB dari
GenBank Acc Number EF016647 dan
EF016647 menunjukkan bahwa terdapat
perbedaan urutan nukleotida, yaitu terdapat
sembilan substitusi nukleotida (Gambar 5).
telah diteliti sebelumnya oleh Crozier dan
Crozier (1993) diperoleh dari Gen Bank ACC
Number L06178.
Proses alignment DNA menggunakan
program Clustal X (Thompson 1997). Hasil
alignment DNA menunjukkan bahwa tidak
ada perbedaan urutan nukleotida antara nomor
contoh A. mellifera 19 Pati dengan A. melli-
10
20
30
40
50
60
tatgtactaccatgaggacaaatatcatattgaggtgcaacagttattactaatctttta
70
80
90
100
110
120
tcagcaattccttatattggtgatacaattgtattatgaatttgaggtggattttcaatt
130
140
150
160
170
180
aataatgctacattaaatcgatttttttctttacattttattttaccattattaatttta
190
200
210
220
230
240
tttatagttattcttcatttatttgccttacatttaactggatcatctaatcctcttgga
250
260
270
280
290
300
tcaaattttaataattataaaatttcatttcatccatatttttcaattaaagatctttta
BglII
310
320
330
340
350
360
ggattttatatcatcttatttatctttatattcattaattttcaatttccatatcattta
370
380
390
400
410
420
ggagatccagacaatttcaaaattgcaaatccaataaatactccaactcatattaaacct
430
440
450
460
470
480
gaatgatatttcctatttgcatattcaattttacgagcaattcctaataaattaggaggt
490
gtaat
Gambar 3 Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera. Nukleotida yang digaris
bawah adalah nukleotida tempat situs pemotongan enzim BglII
1
BglII
485
100 pb
Gambar 4 Peta restriksi hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan enzim restriksi
BglII. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen
DNA berukuran 194 pb dan 291 pb
5
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATGAAAAAATTTATAAACTTTTTTAGTTCCAATGAATTTCTAAAAATAATTATATCTACA 60
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTTATTTACCAACTCCAGTAAATATTAATTATATATGAAATTTTGGATCAATTCTTGGA 120
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTTTTTTAATAATTCAAATCATTTCTGGATTTATTTTATCAATACATTATTGTCCAAAT 180
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTGATATTGCTTTCTGATCAATTACTAATATTATAAAAGATATAAATTCAGGATGATTA 240
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTTCGTTTAATTCACATAAATGGAGCATCATTTTATTTTTTAATAATATATATTCATATT 300
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
AGTCGAAATTTATTTTATTGTTCATATAAATTAAATAATGTATGAGGAATTGGAATTATA 360
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTCTTTTAATATCAATAGCAGCTGCATTTATAGGATATGTACTACCATGAGGACAAATA
------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA
------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA
------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA
************************
420
24
24
24
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
TCATATTGAGGTGCAACAGTCATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
******************** ***************************************
1
2 3
4
ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT
ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT
ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT
ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT
***************** ******** ** ***************** ************
480
84
84
84
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
************************************************************
600
204
204
204
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
************************************************************
5
6
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC
***************************** ***************** ************
660
264
264
264
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
540
144
144
144
720
324
324
324
6
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
7
8
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT
*********************************************** ***** ******
780
384
384
384
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
9
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT
*********************************************** ************
840
444
444
444
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAATCGGATTAGTAATATCAATT
TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------*****************************************
900
485
485
485
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
CTTATTCTTTATATTATAATTTTTTATAATAATAAAATAATAAACAATAAATTTAATATA 960
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTAAATAAAATTTATTATTGAATATTTATTAATAACTTCATTTTATTAACATGATTAGGT 1020
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
AAACAATTAATTGAATATCCATTTACTAATATTAATATATTATTTACAACAACATATTTT 1080
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTATATTTTTTCTTAAATTTCTATTTAAGAAAATTATGAGATAATTTAATTTGAAATTCA 1140
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
CCATTAAATTAA 1152
----------------------------------
Gambar 5 Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera . Cyt B = sitokrom b; Cyt B
L06178 berasal dari GenBank Acc Number L06178, Am 19 pt adalah hasil urutan gen
sitokrom b A. mellifera asal Pati. EF016646_1 adalah AHB haplotipe satu, EF016647_2
adalah AHB haplotipe dua berasal dari GenBank. * = kesamaan (homologi) nukleotida.
Angka disamping kanan adalah nomor nukleotida. Nukleotida digarisbawah adalah situs
restriksi BglII. Nukleotida di dalam kotak adalah perbedaan AHB satu dan AHB dua.
=Perbedaan AHB dan bukan AHB. Angka diatas urutan nukleotida menunjukkan
substitusi yang terjadi antara Am 19 Pt dengan AHB haplotipe satu dan AHB haplotipe
dua.
7
PEMBAHASAN
Penelitian dasar untuk mendeteksi AHB
dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler. Salah satu penanda molekuler yang
banyak digunakan adalah DNA mitokondria
karena sifatnya yang diturunkan secara maternal.
Ada beberapa penanda molekuler yang
dapat digunakan untuk membedakan AHB
dan bukan AHB. Crozier et al. (1991) di
Australia telah menggunakan gen sitokrom b
yang dipotong dengan enzim restriksi BglII.
Hasil penelitiannya menghasilkan satu fragmen DNA berukuran 485 pb untuk AHB. Dua
fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb
dihasilkan untuk yang bukan AHB. Penelitian yang sama juga telah dilakukan di
Amerika Serikat oleh Pinto et al. (2003). Gen
sitokrom b/BglII dapat membedakan antara A.
mellifera dari garis
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Oleh:
ANIFA BINTAR RAHMAWATI
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
ABSTRAK
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan
Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24
subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C
(Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A.
mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi
terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m.
ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada
usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di
lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA
mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom
b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b
dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA
berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu
mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data
DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.
ABSTRACT
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on
cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on
morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the
African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O).
Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia
generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become
threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive
Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the
Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research
was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA.
Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by
using restriction site of cyt b/BglII. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse
primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme
revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This
indicated that there were no AHB in Java, so far.
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
Anifa Bintar Rahmawati
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen
Sitokrom B Dari DNA Mitokondria
Nama
: Anifa Bintar Rahmawati
NRP
: G34102010
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi
NIP 131 999 583
Drs. Chandra Widjaja,MM
NIP 080 057 508
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala
rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin,
MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat
besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya
terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan
Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada
seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah,
Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi
mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di
Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian,
Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan
terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang
memberikan semangat didalam hatiku.
Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan
Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta
doanya selama ini.
Bogor, Mei 2007
Anifa Bintar Rahmawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga
bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire.
Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan
menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah
mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan
studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi
dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah
Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan
pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum
Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar
Indonesian Toray Science Fondation pada tahun 2006, sebagai peserta.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL............................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE
Koleksi Lebah .........................................................................................................................
Ekstraksi dan Isolasi DNA ......................................................................................................
Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera .........................................................................
Elektroforesis dan Visualisasi DNA........................................................................................
Pengukuran pita DNA .............................................................................................................
PCR-RFLP ..............................................................................................................................
Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA..........................................
1
1
2
2
2
2
3
HASIL
Amplifikasi DNA ....................................................................................................................
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII.....................
Pengurutan DNA A. mellifera ................................................................................................
Alignment DNA......................................................................................................................
3
3
3
3
PEMBAHASAN .....................................................................................................................
7
KESIMPULAN ...................................................................................................
7
SARAN ...............................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
8
LAMPIRAN........................................................................................................
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera ..........
2
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse
sitokrom b .................................................................................................................................
3
2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII .................
3
3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ..................................................................
4
4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ........................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta,
dan Jawa Barat.......................................................................................................................... 9
2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward
sitokrom b ............................................................................................................................... 11
3. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse
sitokrom b ............................................................................................................................... 12
PENDAHULUAN
Latar belakang
Apis mellifera termasuk kedalam Ordo
Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili
Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera
adalah lebah madu yang dibudidayakan
karena produksi madunya yang tinggi. Lebah
madu ada yang hingga saat ini belum semua
dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah
dapat dibudidayakan adalah dari kelompok
lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan
lebah madu yang belum dapat dibudiyakan
yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreniformis, A. florea dan A. laboriosa.
Lebah A. mellifera merupakan spesies lebah madu yang persebarannya paling luas. A.
mellifera ditemukan di sebagian besar daerah
gurun pasir dan daerah dengan temperatur
yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami
A. mellifera adalah di daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa.
Berdasarkan analisis morfometrika, Ruttner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi
empat kelompok garis keturunan (lineage).
Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera
yang daerah persebarannya meliputi daerah
Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C
meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur
Tengah. Pengelompokan yang sama juga dihasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan
DNA mitokondria.
Peternak lebah di dunia banyak mengimpor beberapa subspesies A. mellifera yaitu A.
m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa.
Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983).
Peternakan lebah menjadi terancam sejak
lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari
Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956.
Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan
untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya
baik di daerah tropis. A. m. scutellata mengalami hibridisasi dengan lebah madu Eropa
yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang
menghasilkan Africanized honey bee (AHB)
(Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas,
sengat yang mematikan dan sangat cepat
dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999).
Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil
ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California
(Schneider et al. 2003).
Secara morfologi peternak lebah tidak
dapat membedakan antara lebah AHB dan
lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian
dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan
dengan menggunakan penanda molekuler
mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturunkan secara maternal melalui sitoplasma, tidak
mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi
rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b
pada DNA mitokondria yang dipotong dengan
enzim BglII dapat digunakan untuk mendeteksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991)
enzim BglII mampu untuk memotong gen
sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi
AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b,
enzim dan daerah gen lain dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB.
Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan
cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).
Hingga saat ini belum ada usaha untuk
mendeteksi keberadaan AHB di peternakan
lebah madu di Indonesia khususnya di Balai
Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan
untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. mellifera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b
pada DNA mitokondria.
Bahan dan Metode
Koleksi Lebah
Contoh lebah diperoleh dari hasil
pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005
yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan
Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Sebanyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati
dan Jember disimpan dalam tabung berisi
etanol absolut.
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh
peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin
2006). Secara garis besar tahap persiapan dan
pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai
berikut.
Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah
dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10
mM untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan
adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks
lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml
diletakkan dalam steroform berisi nitrogen
cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi
alkohol (Sambrook et al. 1989).
2
Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera
berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)
Nama Primer
Susunan nukleotida primer (5’-3’)
Sitokrom b Forward
Sitokrom b Reverse
TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC
ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium
bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasukkan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah
digerus untuk melisis membran. Kemudian
ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu
55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran
CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000
rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung steril baru,
kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform
Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan
dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000
rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi
13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).
Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000
rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam
supernatan dipresipitasi dengan menggunakan
600 µl isopropanol selama semalam pada suhu
−4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit.
Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan
pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC.
Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan
dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil
ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan
disimpan pada suhu −4 oC.
Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera
DNA lebah diamplifikasi menggunakan
mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pereaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP,
Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM primer sitokrom b reverse, 10 µM primer sitokrom b forward (Tabel 1) (Crozier et al.
1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA
hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan
tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas
ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing
(penempelan primer) pada 55 ºC selama 1
menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72
º
C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan
selama 30 siklus.
Posisi nukelotida primer
pada mitokondria total
11400-11425
11859-11884
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)
6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam
borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus listrik yang digunakan sebesar 160 V selama 90
menit. Visualisasi DNA dalam gel poli
akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak
(Silver staining) yang dilakukan dalam shaking bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil
elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB
(0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit.
Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali
masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas
lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml
akuades) selama 6 menit.
Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH,
dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemudian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua
kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel
direndam dalam campuran larutan 4 gr
Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml
akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir,
gel direndam dalam larutan asam asetat 1%
dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita
DNA.
Pengukuran pita DNA
Pengukuran pita DNA dilakukan untuk
mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel
akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada
pita penanda DNA dan pada DNA target.
Penentuan ukuran pita DNA target berdasarkan regresi menggunakan program R (the R
Development Core Team Version 1.6.0) (Venables & Ripley 1999).
PCR-RFLP
DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim restriksi BglII.
Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemotong enam basa. Situs pemotongannya adalah
AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong
basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank
L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam
total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil
amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4
µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Oleh:
ANIFA BINTAR RAHMAWATI
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
ABSTRAK
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan
Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24
subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C
(Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A.
mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi
terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m.
ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada
usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di
lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA
mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom
b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b
dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA
berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu
mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data
DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.
ABSTRACT
ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on
cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA
WIDJAJA.
Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on
morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the
African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O).
Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia
generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become
threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive
Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the
Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research
was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA.
Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by
using restriction site of cyt b/BglII. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse
primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme
revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This
indicated that there were no AHB in Java, so far.
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN
SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
Anifa Bintar Rahmawati
G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen
Sitokrom B Dari DNA Mitokondria
Nama
: Anifa Bintar Rahmawati
NRP
: G34102010
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi
NIP 131 999 583
Drs. Chandra Widjaja,MM
NIP 080 057 508
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala
rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin,
MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat
besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya
terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan
Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada
seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah,
Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi
mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di
Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian,
Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan
terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang
memberikan semangat didalam hatiku.
Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan
Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta
doanya selama ini.
Bogor, Mei 2007
Anifa Bintar Rahmawati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga
bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire.
Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan
menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah
mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan
studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi
dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah
Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan
pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum
Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar
Indonesian Toray Science Fondation pada tahun 2006, sebagai peserta.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL............................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE
Koleksi Lebah .........................................................................................................................
Ekstraksi dan Isolasi DNA ......................................................................................................
Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera .........................................................................
Elektroforesis dan Visualisasi DNA........................................................................................
Pengukuran pita DNA .............................................................................................................
PCR-RFLP ..............................................................................................................................
Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA..........................................
1
1
2
2
2
2
3
HASIL
Amplifikasi DNA ....................................................................................................................
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII.....................
Pengurutan DNA A. mellifera ................................................................................................
Alignment DNA......................................................................................................................
3
3
3
3
PEMBAHASAN .....................................................................................................................
7
KESIMPULAN ...................................................................................................
7
SARAN ...............................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
8
LAMPIRAN........................................................................................................
9
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera ..........
2
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse
sitokrom b .................................................................................................................................
3
2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII .................
3
3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ..................................................................
4
4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ........................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta,
dan Jawa Barat.......................................................................................................................... 9
2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward
sitokrom b ............................................................................................................................... 11
3. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse
sitokrom b ............................................................................................................................... 12
PENDAHULUAN
Latar belakang
Apis mellifera termasuk kedalam Ordo
Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili
Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera
adalah lebah madu yang dibudidayakan
karena produksi madunya yang tinggi. Lebah
madu ada yang hingga saat ini belum semua
dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah
dapat dibudidayakan adalah dari kelompok
lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan
lebah madu yang belum dapat dibudiyakan
yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreniformis, A. florea dan A. laboriosa.
Lebah A. mellifera merupakan spesies lebah madu yang persebarannya paling luas. A.
mellifera ditemukan di sebagian besar daerah
gurun pasir dan daerah dengan temperatur
yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami
A. mellifera adalah di daerah Mediterania,
Afrika, dan Eropa.
Berdasarkan analisis morfometrika, Ruttner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi
empat kelompok garis keturunan (lineage).
Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera
yang daerah persebarannya meliputi daerah
Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C
meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur
Tengah. Pengelompokan yang sama juga dihasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan
DNA mitokondria.
Peternak lebah di dunia banyak mengimpor beberapa subspesies A. mellifera yaitu A.
m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa.
Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983).
Peternakan lebah menjadi terancam sejak
lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari
Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956.
Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan
untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya
baik di daerah tropis. A. m. scutellata mengalami hibridisasi dengan lebah madu Eropa
yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang
menghasilkan Africanized honey bee (AHB)
(Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas,
sengat yang mematikan dan sangat cepat
dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999).
Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil
ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California
(Schneider et al. 2003).
Secara morfologi peternak lebah tidak
dapat membedakan antara lebah AHB dan
lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian
dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan
dengan menggunakan penanda molekuler
mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturunkan secara maternal melalui sitoplasma, tidak
mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi
rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b
pada DNA mitokondria yang dipotong dengan
enzim BglII dapat digunakan untuk mendeteksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991)
enzim BglII mampu untuk memotong gen
sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi
AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b,
enzim dan daerah gen lain dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB.
Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan
cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).
Hingga saat ini belum ada usaha untuk
mendeteksi keberadaan AHB di peternakan
lebah madu di Indonesia khususnya di Balai
Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan
untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. mellifera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b
pada DNA mitokondria.
Bahan dan Metode
Koleksi Lebah
Contoh lebah diperoleh dari hasil
pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005
yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan
Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Sebanyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati
dan Jember disimpan dalam tabung berisi
etanol absolut.
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh
peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin
2006). Secara garis besar tahap persiapan dan
pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai
berikut.
Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah
dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10
mM untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan
adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks
lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml
diletakkan dalam steroform berisi nitrogen
cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi
alkohol (Sambrook et al. 1989).
2
Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera
berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)
Nama Primer
Susunan nukleotida primer (5’-3’)
Sitokrom b Forward
Sitokrom b Reverse
TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC
ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium
bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasukkan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah
digerus untuk melisis membran. Kemudian
ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu
55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran
CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000
rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung steril baru,
kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform
Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan
dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000
rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi
13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).
Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000
rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam
supernatan dipresipitasi dengan menggunakan
600 µl isopropanol selama semalam pada suhu
−4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit.
Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan
pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC.
Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan
dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil
ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan
disimpan pada suhu −4 oC.
Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera
DNA lebah diamplifikasi menggunakan
mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pereaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP,
Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM primer sitokrom b reverse, 10 µM primer sitokrom b forward (Tabel 1) (Crozier et al.
1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA
hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan
tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas
ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing
(penempelan primer) pada 55 ºC selama 1
menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72
º
C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan
selama 30 siklus.
Posisi nukelotida primer
pada mitokondria total
11400-11425
11859-11884
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)
6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam
borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus listrik yang digunakan sebesar 160 V selama 90
menit. Visualisasi DNA dalam gel poli
akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak
(Silver staining) yang dilakukan dalam shaking bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil
elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB
(0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit.
Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali
masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas
lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml
akuades) selama 6 menit.
Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH,
dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemudian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua
kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel
direndam dalam campuran larutan 4 gr
Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml
akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir,
gel direndam dalam larutan asam asetat 1%
dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita
DNA.
Pengukuran pita DNA
Pengukuran pita DNA dilakukan untuk
mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel
akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada
pita penanda DNA dan pada DNA target.
Penentuan ukuran pita DNA target berdasarkan regresi menggunakan program R (the R
Development Core Team Version 1.6.0) (Venables & Ripley 1999).
PCR-RFLP
DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim restriksi BglII.
Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemotong enam basa. Situs pemotongannya adalah
AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong
basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank
L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam
total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil
amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4
µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata
3
steril 1.1 µl. Campuran pereaksi RFLP kemudian disentrifugasi 4500 rpm selama 1 menit,
lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam.
Hasil pemotongan dimigrasikan pada gel
akrilamida 6% dengan arus 120 V selama 90
menit. Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Tegelstrom 1986).
Pengurutan DNA dan Alignment DNA
Pengurutan hasil amplifikasi DNA gen
sitokrom b dilakukan menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Charoen Pockphan
Jakarta, menggunakan mesin ABI 310 Applied
Biosystem. Pengurutan DNA dilakukan dari
ujung 5' dan 3' menggunakan primer sitokrom
b forward dan reverse.
Hasil pengurutan DNA dilakukan analisis
homologi dengan cara alignment DNA.
Alignment DNA dilakukan antara gen sitokrom b A. m 19 Pati dengan gen A. mellifera
(Crozier dan Crozier 1993); Acc Number L0 6178 pada GenBank menggunakan program
Clustal X (Thompson 1997). Analisis homologi juga dilakukan antara gen sitokrom b Am
19 Pati, A. mellifera (Crozier dan Crozier
1993) dan AHB haplotipe satu: Genbank Acc
Number EF016646 dan AHB haplotipe dua:
Acc Number EF016647.
HASIL
Amplifikasi DNA
Hasil amplifikasi dan RFLP gen sitokrom
b dilakukan pada seluruh contoh A. mellifera.
Seluruh contoh menghasilkan ukuran PCR
produk yang sama (500 pb) (Gambar 1). Data
gambar PCR produk dan RFLP diperoleh dari
contoh A. mellifera asal Jawa Timur (koloni
61-70, sesuai Lampiran 1). Data gambar
tersebut mewakili data dari seluruh contoh A.
mellifera pada penelitian ini.
pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500
400
300
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen sitokrom b A.
mellifera yang diimpor ke Indonesia M = marker (DNA 100 bp), 110 = nomor contoh A. mellifera
Jawa Timur dengan no. koloni 6170 (lampiran 1).
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi BglII
Seluruh produk sitokrom b A. mellifera
dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil
gel menunjukkan satu mitotipe yang memiliki
dua pita DNA berukuran kurang lebih 200
dan 300 pb. Dengan demikian terdapat satu
situs pemotongan yang monomorfik (seragam) (Gambar 2).
Daerah restriksi gen sitokrom b hasil
pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen
DNA menghasilkan dua fragmen dengan
ukuran 194 pb & 291 pb (Gambar 3). Posisi
BglII dari hasil pengurutan nukleotida DNA
gen sitokrom b A. mellifera terdapat pada basa
ke 291 pb (Gambar 4).
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
300
200
Gambar 2 Hasil pemotongan gen sitokrom b
A. mellifera dengan menggunakan
enzim restriksi BglII M=marker
(DNA 100 bp), 1-10=nomor contoh A. mellifera dengan no koloni
(61-70) (lampiran 1)
Pengurutan DNA A. mellifera
Contoh A. mellifera yang dipilih untuk
dilakukan pengurutan DNA adalah A. mellifera koleksi Pati dengan nomor koloni 19.
Pemilihan nomor koloni Am 19 untuk
pengurutan DNA berdasarkan pada produk
DNA hasil amplifikasi yang baik. Proses
pengurutan DNA menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b. Hasil pengurutan DNA berupa kromatogram (Lampiran 2 &
3) telah diedit secara manual. Hasil edit kemudian dimasukkan ke dalam program Genetyx
(Genetyx Win Versi 4.0) untuk analisis lebih
lanjut. Hasil pengurutan DNA pada nomor
contoh A. mellifera 19 Pati menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse didapatkan 485 pb (Gambar 5).
Alignment DNA
Analisis alignment DNA dilakukan untuk
mengetahui homologi nukleotida. Nomor
contoh A. mellifera 19 Pati dilakukan alignment DNA dengan lebah A. mellifera yang
4
fera hasil dari Crozier dan Crozier (1993) Acc
Number L06178. Hasil alignment DNA
sitokrom b Am 19 Pati dengan AHB dari
GenBank Acc Number EF016647 dan
EF016647 menunjukkan bahwa terdapat
perbedaan urutan nukleotida, yaitu terdapat
sembilan substitusi nukleotida (Gambar 5).
telah diteliti sebelumnya oleh Crozier dan
Crozier (1993) diperoleh dari Gen Bank ACC
Number L06178.
Proses alignment DNA menggunakan
program Clustal X (Thompson 1997). Hasil
alignment DNA menunjukkan bahwa tidak
ada perbedaan urutan nukleotida antara nomor
contoh A. mellifera 19 Pati dengan A. melli-
10
20
30
40
50
60
tatgtactaccatgaggacaaatatcatattgaggtgcaacagttattactaatctttta
70
80
90
100
110
120
tcagcaattccttatattggtgatacaattgtattatgaatttgaggtggattttcaatt
130
140
150
160
170
180
aataatgctacattaaatcgatttttttctttacattttattttaccattattaatttta
190
200
210
220
230
240
tttatagttattcttcatttatttgccttacatttaactggatcatctaatcctcttgga
250
260
270
280
290
300
tcaaattttaataattataaaatttcatttcatccatatttttcaattaaagatctttta
BglII
310
320
330
340
350
360
ggattttatatcatcttatttatctttatattcattaattttcaatttccatatcattta
370
380
390
400
410
420
ggagatccagacaatttcaaaattgcaaatccaataaatactccaactcatattaaacct
430
440
450
460
470
480
gaatgatatttcctatttgcatattcaattttacgagcaattcctaataaattaggaggt
490
gtaat
Gambar 3 Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera. Nukleotida yang digaris
bawah adalah nukleotida tempat situs pemotongan enzim BglII
1
BglII
485
100 pb
Gambar 4 Peta restriksi hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan enzim restriksi
BglII. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen
DNA berukuran 194 pb dan 291 pb
5
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATGAAAAAATTTATAAACTTTTTTAGTTCCAATGAATTTCTAAAAATAATTATATCTACA 60
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTTATTTACCAACTCCAGTAAATATTAATTATATATGAAATTTTGGATCAATTCTTGGA 120
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTTTTTTAATAATTCAAATCATTTCTGGATTTATTTTATCAATACATTATTGTCCAAAT 180
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTGATATTGCTTTCTGATCAATTACTAATATTATAAAAGATATAAATTCAGGATGATTA 240
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTTCGTTTAATTCACATAAATGGAGCATCATTTTATTTTTTAATAATATATATTCATATT 300
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
AGTCGAAATTTATTTTATTGTTCATATAAATTAAATAATGTATGAGGAATTGGAATTATA 360
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
ATTCTTTTAATATCAATAGCAGCTGCATTTATAGGATATGTACTACCATGAGGACAAATA
------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA
------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA
------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA
************************
420
24
24
24
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
TCATATTGAGGTGCAACAGTCATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT
******************** ***************************************
1
2 3
4
ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT
ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT
ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT
ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT
***************** ******** ** ***************** ************
480
84
84
84
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT
************************************************************
600
204
204
204
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT
************************************************************
5
6
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC
TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC
***************************** ***************** ************
660
264
264
264
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
540
144
144
144
720
324
324
324
6
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
7
8
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT
TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT
*********************************************** ***** ******
780
384
384
384
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
9
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT
GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT
*********************************************** ************
840
444
444
444
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAATCGGATTAGTAATATCAATT
TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------*****************************************
900
485
485
485
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
CTTATTCTTTATATTATAATTTTTTATAATAATAAAATAATAAACAATAAATTTAATATA 960
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTAAATAAAATTTATTATTGAATATTTATTAATAACTTCATTTTATTAACATGATTAGGT 1020
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
AAACAATTAATTGAATATCCATTTACTAATATTAATATATTATTTACAACAACATATTTT 1080
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
TTATATTTTTTCTTAAATTTCTATTTAAGAAAATTATGAGATAATTTAATTTGAAATTCA 1140
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178
AM19PT
EF016646_1
EF016647_2
CCATTAAATTAA 1152
----------------------------------
Gambar 5 Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera . Cyt B = sitokrom b; Cyt B
L06178 berasal dari GenBank Acc Number L06178, Am 19 pt adalah hasil urutan gen
sitokrom b A. mellifera asal Pati. EF016646_1 adalah AHB haplotipe satu, EF016647_2
adalah AHB haplotipe dua berasal dari GenBank. * = kesamaan (homologi) nukleotida.
Angka disamping kanan adalah nomor nukleotida. Nukleotida digarisbawah adalah situs
restriksi BglII. Nukleotida di dalam kotak adalah perbedaan AHB satu dan AHB dua.
=Perbedaan AHB dan bukan AHB. Angka diatas urutan nukleotida menunjukkan
substitusi yang terjadi antara Am 19 Pt dengan AHB haplotipe satu dan AHB haplotipe
dua.
7
PEMBAHASAN
Penelitian dasar untuk mendeteksi AHB
dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler. Salah satu penanda molekuler yang
banyak digunakan adalah DNA mitokondria
karena sifatnya yang diturunkan secara maternal.
Ada beberapa penanda molekuler yang
dapat digunakan untuk membedakan AHB
dan bukan AHB. Crozier et al. (1991) di
Australia telah menggunakan gen sitokrom b
yang dipotong dengan enzim restriksi BglII.
Hasil penelitiannya menghasilkan satu fragmen DNA berukuran 485 pb untuk AHB. Dua
fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb
dihasilkan untuk yang bukan AHB. Penelitian yang sama juga telah dilakukan di
Amerika Serikat oleh Pinto et al. (2003). Gen
sitokrom b/BglII dapat membedakan antara A.
mellifera dari garis