Isolation, cloning, and expression analysis of gene coding copper zinc superoxide dismutase (CuZn SOD) from Melastoma malabathricum L
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN ANALISIS EKSPRESI GEN
PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE
(CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L.
SALEHA HANNUM
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Isolasi,
Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide
Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum L” adalah karya bersama
saya dan pembimbing yang belum pernah diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
Bogor, Januari 2012
Saleha Hannum
NIM G361040041
ABSTRACT
SALEHA HANNUM. Isolation, Cloning, and Expression Analysis of Gene Coding
Copper/Zinc
Superoxide
Dismutase
(CuZn-SOD)
from
Melastoma
malabathricum L. Supervised by SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI
SUHARSONO, and ALEX HARTANA.
Melastoma malabathricum L. is an indigenous plant in tropical Southeast
Asia with exceeding tolerance to aluminum (Al) stress in acid soils. Although
increasing evidence suggests that Al-stress is accompanied by oxidative
damages in plants, little has been described on the antioxidative components in
this tolerant plant. Copper/zinc SOD (CuZn-SOD) is one of aluminum-induced
genes. Analysis of the expression of genes induced by Al in M. malabathricum
requires internal control genes. Actin is belong to housekeeping genes
commonly used as an internal control. This study aimed to isolate and clone the
cDNA fragment of MmACT encoding for actin of M. malabathricum, and isolate,
clone and expression analysis of copper/zinc SOD (CuZn-SOD) from M.
malabathricum L. Total RNA was isolated and used as template for cDNA
synthesis by reverse transcription. Four of cDNAs clones were isolated, and
were called MmACT1, MmACT2, MmACT3, and MmACT4. The size of
MmACT1 and MmACT2 is 617 bp, whereas MmACT3 and MmACT4 is 735 bp.
The sequence of MmACT cDNAs was registered in GenBank / EMBL / DDBJ
database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and
AB500689. Full length cDNA of MmCuZn-SOD had been successfully isolate by
RACE. The size of MmCuZn-SOD is 824 bp that encoded a 152-amino acid
polypeptide with a predicted pI value of 5.77, and showed high homology to other
cytosolic CuZn-SODs from higher plants. Semi-quantitative RT-PCR showed that
MmCuZn-SOD mRNA was highly expressed in the leaf tissues than stem and
root. The Al treatment strongly induced the expression of MmCuZn-SOD both in
the leaf and root tissues. These results suggested the fortification of the antioxidative defense system under Al stress in this acid soil-tolerant wild plant.
Overexpression vectors was successfully constructed and each has been
introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 by triparental mating
(TPM). N.benthamiana and Nicotiana tabacum transgenics had been obtained
by mediated-A. tumefaciens. Analysis of segregation of T1 transgenic plants
based on analysis of Khi-Quadrat (2) showed that the T1 transgenic plants
accordance with 3:1 of Mendelian inheritance pattern. RNAi vector had been
successfully constructed using GATEWAYTM cloning technology and it had been
introduced into M. malabathricum L. mediated by Agrobacterium tumefaciens
LBA 4404. Transgenic plants analyzes to Al stress showed that in the MS
medium containing 1 mM Al (AlCl36H2O), the transgenic plants underwent growth
suppression, whereas non-transgenic plants underwent growth normally. These
results suggested that suppression of MmCuZn-SOD gene expression by RNAi
to M. malabathricum L. caused the plant became sensitive to Al.
Key words : actin gene, aluminum stress, CuZn-SOD gene, Melastoma
malabathricum, RNAi.
RINGKASAN
SALEHA HANNUM. Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi
Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum
L. Dibimbing oleh SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO, dan ALEX
HARTANA.
Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman asli Asia Tenggara
yang toleran terhadap cekaman aluminium (Al) pada tanah asam. Gen-gen yang
ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al.
Gen superoxside dismutase (SOD) merupakan salah satu gen yang ekspresinya
diinduksi Al. SOD diduga memiliki peran dalam ketahanan M. malabathricum.
Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada M. malabathricum L,
informasi housekeeping gene dari tumbuhan tersebut juga sangat dibutuhkan
sebagai kontrol internal. Salah satu housekeeping gene yang populer dijadikan
sebagai internal kontrol adalah gen aktin. Penelitian ini bertujuan mengisolasi
dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari M. malabathricum L, selanjutnya
melakukan isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi copper/zinc
superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum L, dan mempelajari
ekspresi gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi ekspresi berlebih (overekspresi)
di tanaman model Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan
pembungkaman gen MmCuZn-SOD melalui RNAi di M. malabathricum L. RNA
total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA
total melalui transkripsi balik. Empat fragment cDNA yang menyandi aktin dari
M. malabathricum telah berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid
pGEM-T Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT1,
MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan
bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen
MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb. Antar keempat fragmen cDNA
MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam
amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan
asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1% MmACT1, MmACT2,
MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha, sementara
MmACT4 mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium
hirsutum, dan kedua kelompok ini terpisah dengan aktin dari tumbuhan
monokotil. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data
GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688,
and AB500689. Selanjutnya fragmen cDNA yang menyandi CuZn-SOD dari M.
malabathricum juga telah berhasil diisolasi. Gen utuh MmCuZn-SOD yang
berhasil diisolasi dengan metode RACE berukuran 824 pb, terdiri dari 459 pb
open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino dengan prediksi nilai
pI 5.77. Analisis filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan
bahwa MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol
tanaman tingkat tinggi.
Berdasarkan analisis semi-kuantitatif RT-PCR
menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, batang dan
akar. Perlakuan Al menginduksi ekspresi MmCuZn-SOD baik dalam jaringan
daun maupun akar.
Untuk mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD, vektor ekspresi telah
berhasil dikonstruksi yaitu pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD, dan
masing-masing telah diintroduksikan ke Agrobacterium tumefaciens LBA 4044
melalui metode triparental mating (TPM). Tanaman transgenik N. benthamiana
dan N. tabacum yang mengandung gen MmCuZn-SOD telah diperoleh melalui A.
tumefaciens. Analisis segregasi pada tanaman N. benthamiana dan N. tabacum
transgenik generasi T1 berdasarkan analisis Khi-Kuadrat (2) menunjukkan
bahwa tanaman transgenik T1 yang diuji sesuai dengan pola pewarisan Mendel
3 : 1. Konstruksi pembungkaman gen MmCuZn-SOD juga telah berhasil
dilakukan melalui RNAi. Vektor RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M.
malabathricum L. melalui Agrobacterium tumefaciens LBA4404 untuk
mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD dalam detoksifikasi cekaman Al. Uji
toleransi tanaman transgenik terhadap cekaman Al menunjukkan bahwa pada
media MS yang mengandung 1 mM Al (AlCl36H2O), tanaman transgenik
mengalami hambatan pertumbuhan sampai mati, sementara non-transgenik tidak
mengalami hambatan. Hal ini menunjukkan bahwa penghambatan ekspresi gen
MmCuZn-SOD dengan RNAi pada tanaman M. malabathricum L. menyebabkan
tanaman menjadi sensitive terhadap Al. Hal ini menjelaskan bahwa gen
MmCuZN-SOD diduga berperan penting dalam detoksifikasi Al pada M.
malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen
merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini isolasi fragmen gen
penyandi aktin dari M. malabathricum L, isolasi, pengklonan, dan analisis
ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.
malabathricum L, dan mempelajari ekspresi gen MmCuZn-SOD melalui
konstruksi ekspresi berlebih (overexpression) di tanaman model Nicotiana
benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen MmCuZn-SOD
melalui RNAi pada M. malabathricum L merupakan penelitian yang belum pernah
dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, keempat topik penelitian di
atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini.
Kata kunci : cekaman aluminium, gen CuZn-SOD, gen aktin,
malabathricum, RNAi.
Melastoma
©Hak Cipta milik IPB, Tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN ANALISIS EKSPRESI GEN
PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE
(CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L.
SALEHA HANNUM
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup, 19 Desember 2011:
1. Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc
2. Dr. Ir. Miftahudin, M.Si
Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka 3 Januari 2012:
1. Dr. Ir. Satoto, M.S
2. Dr. Sintho W. Ardie
Judul Disertasi
Nama Mahasiswa
Nomor Pokok
: Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi
Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari
Melastoma malabathricum L.
: Saleha Hannum
: G361040041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua
Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si
Anggota
Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dr.Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr.
Tanggal Ujian Terbuka : 3 Januari 2012
Tanggal lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji hanya untuk Allah SWT yang telah memberikan
kemudahan dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian
dan penulisan disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang
dilakukan di Laboratorium
Biotechnology Research
Indonesia-The
Netherland (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) IPB dan Laboratorium Plant Differentiation and Morphogenesis, Nara
Institute Science and Technology (NAIST) Japan. Disertasi ini memuat hasil
penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi
copper/zinc superoxide dismutase dari tanaman Melastoma malabathricum L.
Shalawat dan salam disampaikan kepada Rasulullah Muhammad SAW atas
keteladanannya.
Selama penelitian ini penulis telah banyak mendapat bantuan dan
bimbingan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan
penghargaan yang tinggi dan ucapan terima kasih kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA selaku ketua komisi pembimbing, Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti
Suharsono, M.Si. dan Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc selaku anggota
komisi pembimbing atas segala bantuan, arahan, dan bimbingan yang telah
diberikan kepada penulis mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan, hingga
penulisan disertasi ini. Demikian juga penulis menyampaikan terimakasih dan
penghargaan yang tinggi kepada Prof. Dr. Akiho Yokota dan Dr. Kinya Akashi
yang telah memberikan arahan, bimbingan, dan fasilitas laboratorium di Nara
Institute Sciences and Technology (NAIST) Japan.
Kepada Tim Beasiswa
Pendidikan Pascasarjana (BPPS), Rektor Universitas Sumatera Utara (USU)
Medan, Program Sandwich dan Hibah Pascasarjana dari Ditjen Dikti Depdiknas,
dan Hibah Kompetensi dengan judul:”Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka
perakitan tanaman yang toleran terhadap cekaman asam dan aluminium an.
Dr.Suharsono,DEA dengan nomor kontrak 039/HIKOM/DP2M/2008/ tanggal 13
agustus 2008, 219/SP2H/PP/DP2M/V/2009 tanggal 30 Mei 2009, dan 224/
SP2H/PP/DP2M/III/2010 tanggal 1 Maret 2010, terimakasih atas bantuannya
dalam menyediakan biaya pendidikan dan penelitian.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Rektor, Dekan Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), dan Ketua Jurusan Biologi
Universitas Sumatera Utara Medan, atas izin yang diberikan kepada penulis
untuk melanjutkan pendidikan di SPs IPB; Rektor IPB, Dekan Sekolah
Pascasarjana (SPs) IPB, dan Ketua Program Studi Biologi SPs IPB, atas
kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di SPs
IPB Bogor. Kepada seluruh staf pengajar dan administrasi Sps IPB, penulis
menyampaikan banyak terimakasih atas ilmu dan kelancaran adminstrasi selama
penulis menjadi mahasiswa di SPs IPB. Penulis juga menyampaikan terimakasih
kepada staf PPSHB IPB atas bantuannya dalam kelancaran pelaksanaan
penelitian di laboratorium.
Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan mahasiswa
seperjuangan di Laboratorium BIORIN, yaitu Bu Srilis, Bu Yohana, Pak Ulung,
Bu Ratna, Pak Radit, Bu Ifa, Pak Asri, Muchdar, Anita, Nurul, Ophie, Delih,
Nikson, Ila, Iin, Lian, dan Mia, serta yang telah lulus, yaitu Pak Muzuni, Firdaus,
Agustina, Pak Hadi, Yasinta, Niken, Ulfa, Yassir, Jaya, Zahro, Lulu, Go To, Fajri,
Indah, dan Lita; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan di Program Studi Biologi,
yaitu Bu Iin, Bu Dorly, Bu Nursahara, Bu Sri, dan Bu Ida atas dorongan dan
kerjasamanya. Terimakasih juga disampaikan kepada Pak Mulya, Mbak Pepi,
Pak Adi, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, Bu Dewi, Bu Ika, Bu Emi, Bu Eni,
dan Pak Iri atas bantuan dan kerjasamanya.
Ucapan terima kasih yang tulus ikhlas juga penulis sampaikan kepada
kedua orang tua penulis ayahanda dan ibunda (almarhum) yang senantiasa
mencurahkan cinta dan kasih sayangnya, dan selalu memanjatkan doa demi
kesuksesan penulis, serta dorongan moril sehingga penulis dapat menyelesaikan
pendidikan S3.
Semoga Allah swt menyayangi mereka seperti menyayangi
penulis. Kepada kakak, abang, adek, dan keponakan penulis, terimakasih atas
segala perhatian, kasih sayang, pengorbanan, pengertian, dorongan moril, serta
doa yang diberikan kepada penulis selama ini.
Sebagai penutup, semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan dapat
memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan di Indonesia.
Bogor, Januari 2012
Saleha Hannum
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pidoli Dolok pada tanggal 31 Agustus 1971, sebagai
anak ketiga dari enam orang bersaudara pasangan ayahanda H. Muhammad
Saleh Nasution, BA dan ibunda Hj. Masdewa Harahap (alm).
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 12 Kota Padang
Sidimpuan pada tahun 1984, pendidikan menengah dan lanjut di Madrasah
Tsanawiyah dan Madarasah Aliyah Pondok Pesantren K.H.Ahmad Dahlan
Sipirok, Tapanuli Selatan pada tahun 1987 dan 1990.
Penulis melanjutkan
pendidikan di Universitas Andalas, Padang jurusan Biologi dan lulus 1996. Tahun
1998 melalui program DUE (Dikti) penulis melanjutkan pendidikan Pascasarjana
pada program studi Biologi di Institut Pertanian Bogor dan lulus 2001. Tahun
2000 penulis diangkat menjadi staf pengajar di Universitas Sumatera Utara,
Medan sampai sekarang.
Tahun 2004 penulis mendapat kesempatan untuk
melanjutkan ke jenjang doktor pada program studi Biologi di Institut Pertanian
Bogor. Tahun 2008 penulis mendapat kesempatan melaksanakan penelitian di
Nara Institute Science and Technology (NAIST), Jepang selama 6 bulan melalui
program Sandwich, DIKTI.
BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lahan asam merupakan salah satu lingkungan yang membatasi produksi
pertanian.
Sekitar 50% lebih dari lahan pertanian di dunia adalah lahan asam
(Bot et al. 2000). Sementara Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha tanah
Podsolik Merah Kuning (CSAR 1997) yang bersifat asam dengan kelarutan
aluminium (Al) yang tinggi.
Foy (1988) menjelaskan bahwa kemasaman tanah adalah faktor
cekaman
terbesar
yang
mempengaruhi
pertumbuhan
tanaman
dengan
keberadaan Al merupakan faktor pembatas pertumbuhan pada tanah asam.
Pada pH dibawah 5, Al menjadi terionisasi yang sangat beracun bagi tanaman
(Kinraide & Parker 1990; Kochian et al. 2004; Meriga et al. 2010 ). Aluminium
telah bersifat racun bagi tanaman meskipun konsentrasinya masih sangat
rendah. Walaupun demikian Al yang membentuk ikatan dengan ligand adalah
tidak beracun bagi tanaman seperti aluminium silikat. Bentuk Al yang bersifat
toksik bagi tanaman adalah ion Al3+ yang dominan pada kondisi asam
(Matsumoto 2000; Kochian et al. 2004). Kelarutan Al yang tinggi di dalam tanah
sangat merugikan tanaman karena dapat menghambat pertumbuhan akar
(Delhaize & Ryan 1995; Rout et al. 2001; Kochian et al. 2005).
Tumbuhan yang hidup di tanah asam umumnya adalah tumbuhtumbuhan yang dapat beradaptasi dengan lingkungan tersebut. Salah satu jenis
tumbuhan yang banyak dijumpai pada Tanah Podsolik Merah Kuning adalah
Melastoma
(Tjitrosoedirdjo 1991).
Melastoma merupakan anggota famili
Melastomataceae, tersebar di daerah Tropik Asia dan seluruh Indonesia sebagai
gulma. Salah satu spesiesnya adalah Melastoma malabathricum L. yang banyak
dijumpai di lahan asam.
Pertumbuhan akar M. malabathricum L. tidak
mengalami gangguan pada pH 4.0 dan terganggu pada pH 3.0 (Muhaemin
2008).
Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada tanah asam yang
tumbuhan lain tidak tumbuh sehingga dapat dijadikan sebagai tumbuhan
indikator pada tanah asam.
Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa M.
malabathricum L. mampu mengakumulasi lebih dari 14.4 g Al kg-1 daun tua dan
lebih dari 8 g Al kg-1 daun muda tanpa mengalami keracunan.
Analisis
akumulasi Al pada M. affine D.Don. (sinonim dengan M. malabathricum L.) yang
mendapat cekaman 3.2 mM Al pH 4 pada media cair menunjukkan bahwa
2
M.affine D.Don. mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan
perlakuan (Mutiasari 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman
(Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat
dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya
diinduksi Al (Darko et al. 2004), beberapa diantaranya adalah gen-gen yang
mengkode
enzim
antioksidan,
seperti
glutathione-S-transferase
(GST),
ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide dismutase (SOD)
(Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003; Meriga et al. 2010).
Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis perubahan radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Superoksida merupakan salah satu
radikal bebas turunan (derivate) oksigen reaktif (ROS) yang umumnya terdapat
dalam sel tanaman sebagai hasil samping dari proses metabolisme normal.
Akumulasi radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan makromolekul sel dan
bahkan kematian sel (Bowler et al. 1992; Scandalios 1993). Konsentrasi radikal
bebas di dalam sel tanaman dapat meningkat ketika tanaman merespon
cekaman biotik dan abiotik. Namun tanaman juga memiliki sistem pertahanan
yang dapat mencegah peningkatan radikal bebas ini dengan adanya enzim
antioksidan seperti SOD. Ada tiga tipe enzim SOD sesuai dengan logam yang
berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzimnya, yaitu copper/zinc (CuZnSOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (Mn-SOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol,
kloroplas, dan peroksisom; Mn-SOD di mitokhondria; dan Fe-SOD di kloroplas
(Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992; Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al.
1998).
Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman
abiotik, seperti cahaya tinggi dan suhu rendah (Allen et al. 1997), sulfur dioksida
(Tseng et al. 2008), kekeringan (Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), dan
aluminium (Cakmak & Horst 1991; Basu et al. 2001; Du et al. 2010).
Brassica
napus yang tahan Al mengekspresikan gen SOD secara berlebih (Basu et al.
2001). Aktivitas enzim SOD juga meningkat dengan cekaman Al pada kedelai
(Cakmak & Horst 1991; Du et al. 2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi
3
(Meriga et al. 2010). Cekaman Al dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan
terbentuknya oksigen radikal (ROS) (Panda et al. 2003).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat
(Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002).
Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen
CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3.
CSD1 dan CSD2 terekspresi pada
akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan
kloroplas.
Sementara target potein CSD3
karboksilnya mengandung tripeptida
di peroksisom karena ujung
Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pada M. malabathricum L., beberapa gen yang diduga terlibat dalam
cekaman asam dan Al telah diisolasi seperti multidrug resistance associated
protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono
et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010), dan sitrat sintase
(Mushofa 2011). Namun sampai saat ini belum ada informasi tentang gen CuZnSOD pada
M. malabathricum L. yang diduga juga terlibat dalam toleransi
terhadap cekaman asam dan Al.
Untuk mempelajari ekspresi gen secara
kuantitatif pada M. malabathricum L,
informasi housekeeping gene dari
tumbuhan tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini
informasi tersebut belum ada. Menurut Maroufi et al. (2010) aktin termasuk
salah satu kontrol internal yang paling stabil.
Beberapa metode dapat digunakan untuk mengisolasi gen antara lain
melalui penapisan terhadap pustaka genom dan pustaka cDNA, serta RT-PCR
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). Selain itu ada juga yang
menggunakan metode RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) untuk
memperoleh gen utuh, yaitu sintesis cDNA dengan menggunakan mRNA
sebagai cetakan dan sekuen internal yang sudah diketahui urutan nukleotidanya
serta adapter pada ujung 3’ atau 5’ sebagai primer.
Metode RACE telah
digunakan untuk isolasi gen utuh (full length) mannose-binding lectin dari umbi
Zephyranthes grandiflora (Kai et al. 2006), gen penyandi Gibberellin 20-Oxidase
dari Helianthus annuus (Carzoli et al. 2008), dan gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari M. malabathricum L. (Muzuni et al. 2010).
Peranan suatu gen dalam tanaman dapat dipelajari minimal dengan
pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen dengan mengkonstruksi
vektor over expression
dan pendekatan kedua dengan menghentikan dan
4
menurunkan
ekspresi
atau
pembungkaman
gen
antara
lain
dengan
mengkonstruksi vektor RNAi (RNA interference). RNAi menyebabkan mRNA
terdegradasi sehingga gen menjadi tidak berfungsi.
Teknologi RNAi telah
digunakan untuk mempelajari peranan gen penyandi H+-ATPase pada M.
malabathricum L. (Muzuni et al. 2011), membungkam gen OsGEN-L pada padi
(Moritoh et al. 2005), dan menurunkan ekspresi gen ornithine decarboxylase
pada tanaman Nicotiana tabacum L. (DeBoer et al. 2011).
Pada penelitian ini,
telah dilakukan isolasi dan pengklonan fragmen gen penyandi aktin dari M.
malabathricum L, selanjutnya dilakukan isolasi, pengklonan, dan analisis
ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.
malabathricum L.
Ekspresi gen dilakukan di tanaman model Nicotiana
benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen dilakukan di M.
malabathricum L.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Mengisolasi dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari Melastoma
malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen penyandi copper/zinc
superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.malabathricum L. (MmCuZn-SOD).
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi gen MmCuZn-SOD untuk ekspresi berlebih
pada tanaman Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum.
4. Mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi vektor RNAi untuk
pembungkaman gen pada tanaman M. malabathricum L.
Strategi Penelitian
Strategi yang digunakan untuk mencapai tujuan dengan membagi
penelitian menjadi 4 aspek kajian (Gambar 1), yaitu:
1. Mengisolasi dan mengklon gen penyandi aktin dari M. malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen MmCuZn-SOD pada
M. malabathricum L. yang diberi perlakuan cekaman abiotik.
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi untuk ekspresi berlebih gen MmCuZnSOD
pada tanaman model N. benthamiana dan N. tabacum.
4. Mengkonstruksi vektor ekspresi RNAi untuk pembungkaman gen MmCuZnSOD pada tanaman M. malabathricum L.
5
Gambar 1. Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, analisis ekspresi, analisis
ekspresi berlebih pada tanaman model dan pembungkaman pada
M.malabathricum L. gen penyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum
L. RACE, Rapid Amplification cDNA Ends; RNAi, RNA interference.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Melastoma malabathricum L.
Melastoma adalah salah satu genus dari famili Melastomataceae yang
termasuk dalam ordo Myrtales. Genus ini terdiri dari 22 spesies yang tersebar di
Asia Tenggara, India, Cina Selatan, Jepang dan Australia Utara (Meyer 2001).
Melastoma malabathricum L. merupakan salah satu spesies tumbuhan berkayu
yang tumbuh di tanah asam dengan keasaman yang sangat tinggi dan miskin
unsur hara (seperti N dan P), dan tersebar di daerah tropis Asia, Australia, dan
Polynesia (Osaki et al. 1997). Di Indonesia tumbuhan ini juga banyak ditemukan
tumbuh di tanah asam, khususnya tanah Podsolik Merah Kuning dengan
kelarutan aluminium (Al) yang tinggi yang menjadi faktor pembatas bagi
pertumbuhan tanaman. Ketahanan tanaman M. malabathricum L. pada tanah
asam berhubungan dengan kemampuannya mengakumulasi Al di daun tanpa
menyebabkan gejala keracunan dan bahkan Al memacu pertumbuhannya
(Watanabe et al. 1998), sehingga tanaman ini dikenal juga sebagai akumulator Al
(Watanabe & Osaki 2002; Watanabe et al. 2005).
Menurut Watanabe et al. (1997), M. malabathricum L. yang ditumbuhkan
pada media cair dengan cekaman Al sebesar 0.5 mM selama 6 minggu mampu
mengakumulasi Al lebih dari 10 g kg-1 pada daunnya, sementara pada daun
muda tanaman ini mengakumulasi Al lebih dari 7 g kg-1. Analisis akumulasi Al
pada M. affine D.Don (sinonim dari M. malabathricum L.) yang mendapat
cekaman 3.2 mM Al pada pH 4 di dalam media cair menunjukkan bahwa M.
affine D.Don mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan
perlakuan (Mutiasari 2008). Tanaman akumulator Al yang lain seperti tanaman
teh (Camellia sinensis (L.) Kuntze) dapat mengakumulasi Al hingga 30 g kg-1
pada daun tua dan 0.6 g kg-1 pada daun muda (Matsumoto et al. 1976). Daun
Hydrangea macrophylla dapat mengakumulasi Al sebesar 3 g kg-1 (Ma et al.
1997).
Tanaman mencegah toksisitas Al melalui mekanisme ekslusi dan
mekanisme toleransi internal.
Pada mekanisme ekslusi, Al didetoksifikasi
dengan mengeksudasi senyawa-senyawa organik yang dapat mengikat Al.
Sedangkan dalam mekanisme toleransi internal, Al didetoksifikasi setelah Al
8
diserap tanaman.
Bentuk-bentuk kimia Al pada tanaman toleran telah
diidentifikasi menggunakan spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
Menurut Watanabe et al. (1998) bentuk Al pada daun M. malabathricum L.
adalah Al3+, Al-oksalat, Al(oksalat)2, dan Al-(oksalat)3. Sementara Watanabe &
Osaki (2001) menjelaskan bahwa Al diangkut dari akar ke pucuk tanaman M.
malabathricum dalam bentuk kompleks Al-sitrat.
Jadi, asam organik dengan
berat molekul kecil memainkan peranan penting dalam detoksifikasi internal pada
jaringan tanaman dan transport Al dari akar ke pucuk melalui pembentukan
kompleks asam organik. Hal yang sama juga ditemukan pada tanaman
akumulator Al lainnya seperti buckwheat (Ma & Hiradate 2000) dan teh (Morita et
al. 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman
(Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat
dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya
diinduksi Al yang telah dilaporkan (Darko et al. 2004). Beberapa diantaranya
adalah gen-gen yang mengkode enzim antioksidan, seperti
glutathione-S-
transferase (GST), ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide
dismutase (SOD) (Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003;
Meriga et al. 2010). Pada M. malabathricum L., gen yang diduga terlibat dalam
toleransi tanaman terhadap cekaman asam dan Al telah diisolasi, yaitu multidrug
resistance associated protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein
type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al.
2010), dan sitrat sintase (Mushofa 2011).
Toksisitas Aluminium
Secara normal, aluminium (Al) berada dalam bentuk oksida dan kompleks
aluminosilikat yang tidak larut dan tidak toksik. Pada pH netral, Al membentuk
kompleks dengan ion hidroksida yang tidak larut, sedangkan pada pH asam, Al
berada dalam bentuk Al3+ yang merupakan bentuk Al yang paling toksik (Kinraide
& Parker 1990; Kinraide et al. 1994; Matsumoto 2000). Pada larutan dengan pH
yang lebih rendah dari 5.0, ion Al berada dalam bentuk oktahedral heksahidrat,
Al(H2O)63+, sering disingkat dengan Al3+. Pada larutan yang keasamannya
9
berkurang, Al(H2O)63+ mengalami deprotonasi menjadi Al(OH)2+ dan Al(OH)2+.
Pada larutan netral menyebabkan Al(OH)3 mengendap dan larut kembali pada
larutan basa dengan membentuk formasi tetrahedral, Al(OH)4- (Delhaize & Ryan,
1995; Marschner, 1995).
Keracunan Al merupakan salah satu kendala dalam produksi tanaman
pada tanah asam. Pada kondisi tersebut umumnya ketersediaan hara dan
kemampuan tanaman untuk menyerap hara sangat terbatas. Dari beberapa
percobaan diketahui bahwa penyerapan P, Ca, Mg, dan K oleh tanaman
berkurang secara nyata. Pada tanaman barley yang ditanam pada media yang
mengandung Al, kandungan Ca2+ dan K+ hanya setengahnya jika dibandingkan
dengan kontrol (Matsumoto et al.1988). Al biasanya meningkatkan kandungan P
pada akar dan menurunkan kandungan P pada pucuk (Liang et al. 2001; Quartin
et al. 2001). Hal ini berhubungan dengan bentuk kompleks antara P dan Al pada
akar yang menghambat transportasi P ke pucuk.
Aluminium dapat mengikat anion anorganik, seperti sulfat, fosfat, fluor,
dan silikat membentuk suatu kompleks yang mempunyai afinitas tinggi terhadap
oksigen atau air (Hodson & Evans 1995). Interaksi antara Al dengan anion
tersebut berpotensi untuk meningkatkan pH perakaran sekaligus dapat membuat
rancu pengaruh toksisitas Al dengan defisiensi unsur tertentu (seperti fosfat)
karena terbentuknya kompleks Al-fosfat (baik di larutan tanah maupun di dalam
sel) yang tidak tersedia bagi tanaman. Kemampuan tanaman untuk dapat
memanfaatkan kandungan P yang rendah secara efisien selalu dihubungkan
dengan sifat toleransi tanaman terhadap cekaman Al. Kation trivalen Al3+
menghambat transport Ca2+ secara efektif ke dalam akar, protoplasma dan
membran vesikel. Hasil studi pada lipid bilayer menunjukkan bahwa Al dapat
memblok Ca2+ dan saluran K+ (Ryan et al. 1997; Jones et al. 1998). Pada akar
barley, perlakuan Al menurunkan kandungan Ca pada membran hingga 50% dan
menyebabkan penurunan aktivitas H+-ATPase dalam menghidrolisis ATP
(Matsumoto & Yamaya 1988).
Pengaruh Aluminium pada Tanaman
Kelebihan konsentrasi Al dalam larutan tanah pada umumnya berakibat
buruk terhadap pertumbuhan tanaman, kecuali beberapa tanaman seperti teh
yang mampu bertahan pada konsentrasi Al tinggi. Gangguan penyerapan hara
10
mineral tanah asam disebabkan dua hal yang sangat berkaitan, yaitu efek
langsung dengan menghambat penyerapan hara secara langsung, dan efek tidak
langsung dengan menghambat pertumbuhan
sehingga secara tidak langsung
menghambat penyerapan hara (Marschner 1995).
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa target utama keracunan Al
adalah jaringan akar tanaman (Delhaize & Ryan 1995; Kochian et al. 2004).
Penelitian pada gandum (Triticum aestivum) menggunakan kultivar yang sensitif
Al (Neepawa) dan toleran Al (PT741) menunjukkan bahwa setelah 3 hari
ditumbuhkan pada media yang mengandung berbagai konsentrasi Al, terlihat
penurunan pertambahan panjang akar pada kultivar sensitif sebanyak 57% pada
konsentrasi Al 25 µM, tetapi pada kultivar resisten Al belum berpengaruh (Basu
et al. 1994).
Aluminium banyak ditemukan pada inti dan dinding sel pada tanaman
yang sensitif. Pada dinding sel, penghambatan terjadi karena Al menggantikan
kedudukan Ca2+ pada lamella tengah. Aluminium berikatan dengan molekul
pektin dinding sel atau komponen dinding sel yang bermuatan negatif pada selsel epidermis dan korteks akar (Delhaize et al. 1993; Marienfeld et al. 2000;
Schmohl & Horst 2000; Schmohl et al. 2000; Rout et al. 2001; Kochian et al.
2005). Gugus karboksil bebas pada molekul pektin yang terdemetilasi mengikat
ion Al toksik.
Menurut Schmohl et al. (2000), perlakuan enzim pectin
methylesterase (PME) pada suspensi sel Zea mays menurunkan
resistensi
terhadap Al, sehingga overekspresi PME pada tanaman kentang transgenik lebih
sensitif terhadap Al daripada non transgenik.
Hal ini menunjukkan bahwa
matriks pektin pada apoplas sel-sel apikal akar berperanan penting dalam
memfasilitasi sinyal stress pada sitoskeleton sel-sel tersebut. Akumulasi Al yang
tinggi dalam apoplas akar merupakan karakteristik sensitifitas Al (Rincon &
Gonzales 1992; Schmohl & Horst 2000). Ikatan Al dengan gugus karboksil akan
menimbulkan ikatan yang kuat sehingga sel tidak dapat membesar (Marschner
1995). Pada inti sel, Al berasosiasi dengan DNA sehingga menghentikan proses
pembelahan sel pada meristem apikal (Matsumoto 1991; Rout et al. 2001).
Aluminium dalam bentuk polimer memiliki muatan positif yang besar serta
memiliki banyak situs pengikatan. Polimer Al ini dapat mengikat fosfat yang ada
pada kedua utas DNA, sehingga menghambat proses replikasi (Matsumoto
11
1991). Sedangkan menurut Silva et al. (2000) bahwa Al dapat terakumulasi
dalam nukleus dengan konsentrasi yang rendah.
Pada membran sel, pengaruh Al lebih banyak disebabkan oleh adanya
perubahan atau kerusakan sifat permeabilitas. Pada membran sel akar barley, Al
ditemukan berasosiasi dengan gugus fosfolipid membran yang menyebabkan
kerusakan struktur membran atau perubahan dalam permeabilitas membran. Hal
ini menyebabkan penyerapan hara yang dikatalisis oleh pompa proton menjadi
terhambat (Matsumoto 1991; Rout et al. 2001). Ion Al yang bermuatan positif
dapat berasosiasi dengan gugus fosfat dari ATP atau fosfolipid pada membran
yang akan mempengaruhi efektivitas transport proton (Kochian et al. 2004).
Toleransi Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Tanaman yang toleran terhadap Al tinggi mengembangkan mekanisme
toleransi melalui berbagai cara. Beberapa tanaman toleran Al mengeluarkan
asam-asam organik sebagai bahan pengkhelat Al pada daerah rizosfer.
Beberapa jenis tanaman diketahui mengeluarkan eksudat berupa asam sitrat,
seperti yang terjadi pada Phaseolus vulgaris (Miyasaka et al. 1991) dan kacang
kedelai (Yang et al. 2000).
Pada tanaman gandum yang toleran Al
mengeluarkan asam malat dari ujung akarnya (Delhaize et al. 1993). Tanaman
talas mengeluarkan eksudat asam oksalat (Ma & Miyasaka, 1998).
Taylor (1991) menyatakan bahwa resistensi Al dimediasi oleh protein
membran yang secara aktif mengeluarkan Al, sebagai enzim yang terlibat dalam
sintesis atau pengeluaran ligan kelator, atau
enzim yang bertanggungjawab
terhadap sintesis komponen seluler yang mempunyai sifat mengubah resistensi
Al. Sopandie et al. (2003), juga mendapatkan tanaman kedelai yang toleran
terhadap Al mengekspresikan suatu protein pada daerah meristem akar.
Beberapa tanaman dapat bertindak sebagai tanaman pengumpul
(akumulator) Al, karena dapat menyerap Al dan mengakumulasinya dalam
jaringan tanaman. Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa tanaman
M. malabathricum L. mampu mengakumulasi Al dalam jaringan mesofil daun
maupun dalam jaringan penyusun akar, terutama pada jaringan epidermis dan
endodermis. Tanaman teh (Camellia sinensis L.) dapat mengakumulasi Al pada
daun tua sebesar 30 g kg-1 (Matsumoto et al. 1976).
Sementara tanaman
Conostegia xalapensis yang mengakumulasi Al dalam jaringan epidermis dan
12
mesofil daunnya dapat mengandung 19.000 mg Al kg-1 bobot kering daun
(Gonzalez-Santana et al. 2011).
Gen-Gen yang Berhubungan dengan Toleransi Aluminium
Taylor (1991) mengungkapkan bahwa respon toleransi tanaman terhadap
Al sangat berkaitan dengan gen-gen yang terlibat di dalamnya. Beberapa gengen telah diketahui baik secara langsung maupun tidak langsung mengendalikan
toleransi terhadap Al. Aniol (1995) menunjukkan bahwa pada lengan panjang
kromosom 2D tanaman gandum terdapat faktor genetik yang mencegah
akumulasi Al pada meristem apikal akar.
bahwa
toleransi Al
Delhaize et al. (1993) menyatakan
pada gandum dikendalikan oleh gen dominan Alt yang
mengendalikan ekspresi malat ketika tanaman tersebut mengalami cekaman Al.
Hal yang sama juga dilaporkan Sasaki et al. (2004), bahwa gen ALMT1 yang
terlibat dalam eksudasi malat dapat meningkatkan toleransi terhadap Al pada sel
tembakau. Eksudasi berbagai asam organik seperti malat, sitrat, dan oksalat
terjadi pada tanaman yang diberi cekaman Al (Delhaize et al. 1993; Kidd et al.
2001; Kochian et al. 2005). Pembungkaman gen penyandi H+-ATPase membran
plasma
melalui
RNAi
pada
tanaman
M.
malabathricum
L.
transgenik
menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi terhadap cekaman 3.2 mM Al dan pH 4
dibandingkan tanaman non transgenik.
Hal ini menunjukkan bahwa gen ini
berperan dalam toleransi M.malabathricum L. terhadap cekaman Al (Muzuni
2011).
Delhaize et al. (2004) melaporkan bahwa ekspresi berlebih Al-inducible
malate transporter (ALMT) meningkatkan toleransi Al pada tanaman Hordeum
vulgare. Overekspresi SbMATE yang menyandi putative citrate transporter dapat
meningkatkan toleransi terhadap cekaman Al pada Arabidopsis dan gandum
(Magalhaes et al. 2007; Liu et al. 2009).
Gen ALS3 yang menyandi ABC
transporter- like protein juga diperlukan dalam toleransi Al pada Arabidopsis dan
dapat berperan untuk mendistribusikan akumulasi Al dari jaringan yang sensitif
untuk melindungi pertumbuhan akar dari keracunan Al (Larsen et al. 2005).
Cekaman Al dapat menyebabkan pembentukan cekaman oksidatif.
Salah satu mekanisme keracunan Al adalah terjadinya peroksidasi lipid yang
merupakan cekaman oksidatif (Gutteridge et al. 1985; Kochian et al. 2004).
Aluminium dapat menginduksi kompleks gen-gen yang terlibat dalam cekaman
13
oksidatif, sehingga meningkatkan aktivitas beberapa enzim cekaman oksidatif
(Ricards et al. 1998; Cakmak & Horst 1991; Foyer & Noctor 2005).
Richards et al. (1998) telah berhasil mengisolasi gen-gen cekaman
oksidatif dari Arabidopsis thaliana yang ekspresinya terinduksi oleh cekaman Al,
yaitu gen-gen penyandi metallothionein-like protein, glutathione-s-transferase
(GST), peroksidase, dan superoxide dismutase (SOD).
Hal yang sama juga
dilakukan oleh Ezaki et al. (1995) yang berhasil mengisolasi gen-gen tembakau
yang menyandikan GST, Peroxidase (PER), dan GDP Dissociation Proteinase
Inhibitors (GDI) yang diinduksi oleh cekaman Al. Pada tanaman kedelai, Anwar
et al. (2000) berhasil mengklon fragmen cDNA dari gen-gen kedelai yang toleran
terhadap cekaman Al, antara lain gmali1 (Glycine max aluminum induced),
gmali14, gmali49, dan gmali50, masing-masing menyandikan H+-ATPase
membran plasma, protein histon H3, NADH-dehidrogenase dan Auxin-induced
protein. Semua gen tersebut di atas terekspresi untuk mempertahankan diri dari
cekaman lingkungan.
Pada Melastoma affine (sinonim M. malabathricum),
Suharsono et al. (2009) telah berhasil mengisolasi gen metallothionein type 2
(MaMt2) yang ekspresinya diinduksi oleh cekaman Al (Trisnaningrum 2009).
Superoxide Dismutase (SOD)
Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2 (Bowler et al. 1992; Fridovich 1995;
Tseng et al. 2008). Pada kondisi normal, radikal superoksida yang merupakan
derivat reactive oxygen species (ROS) terdapat di dalam sel tanaman sebagai
produk
sampingan
menyebabkan
protein,
dari
proses
metabolisme.
Akumulasi
ROS
dapat
kerusakan berbagai fungsi seluler seperti kerusakan DNA,
dan peroksidasi lipid, sehingga enzim ini sangat penting sebagai
antioksidan untuk pertahanan pada hampir semua sel yang terpapar oksigen
(Bowler et al. 1992; Fridovich 1995; Dong et al. 2009). Akumulasi ROS dapat
disebabkan oleh berbagai cekaman lingkungan (Allen et al. 1997: Foyer & Noctor
2005).
SOD merupakan enzim antioksidan yang berada pada garis depan
sebagai pertahanan terhadap radikal superoksida (Fridovich 1995). Ada tiga tipe
SOD sesuai dengan
logam yang berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif
14
enzimnya, yaitu copper-zinc (CuZn-SOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (MnSOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di
mitokhondria dan Fe-SOD di kloroplas (Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992;
Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al. 1998; Dong et al. 2009). Pemberian logam
Mn, Cu, Zn, atau Fe ke dalam media kultur dapat meningkatkan ekspresi dan
aktivitas SOD.
Shi et al. (2005) melaporkan bahwa aktivitas SOD, terutama
aktivitas Mn-SOD meningkat seiring dengan peningkatan Mn pada tanaman
mentimun, sedangkan menurut Fernando and Miguel (2000) aktivitas SOD tidak
dipengaruhi oleh konsentrasi Mn pada padi.
Pada Arabidopsis thaliana yang
ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi Cu2+ yang tinggi mampu
meningkatkan aktivitas total SOD (Maria et al. 2007).
Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman
abiotik, seperti cahaya tinggi (Allen et al. 1997) sulfur dioksida (Tseng et al. 2007;
Tseng et al. 2008), ozon (Pitcher and Zilinskas 1996), kekeringan (Mittler &
Zilinskas 1994; Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), suhu rendah (HernandezNistal et al. 2002; Lee & Lee 2000; Gao et al. 2009), garam ( Sreenivasulu et al.
2000), dan aluminium (Basu et al. 2001; Darko et al. 2004; Du et al. 2010; Meriga
et al. 2010).
Tang et al. (2006) dan Lim et al (2007) melaporkan ekspresi gen
CuZnSOD yang meningkat terhadap berbagai cekaman lingkungan pada
tanaman kentang transgenik.
Basu et al. (2001) melaporkan bahwa Brassica napus yang tahan Al
mengekspresikan gen SOD secara berlebih.
Aktivitas enzim SOD juga
meningkat dengan cekaman Al pada kedelai ( Cakmak & Horst 1991; Du et al.
2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi (Meriga et al. 2010). Menurut Du et
al. (2010) perlakuan Al meningkatkan aktivitas SOD pada akar dan kalus dari 2
genotipe kedelai (Al-tolerant PI 416937 (PI) dan Al-sensitive Young). Aktivitas
SOD pada kedua genotipe tersebut berbeda dalam merespon cekaman Al dan
bergantung pada konsentrasi Al dan lama perlakuan. Aktivitas SOD pada akar
yang tahan (PI) lebih tinggi dibandingkan akar yang rentan (Young) pada lama
perlakuan cekaman Al 36 atau 48 jam. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan
aktivitas enzim antioksidan merupakan salah satu mekanisme toleransi Al. Pada
akar barley, SOD juga terlibat dalam mekanisme detoksifikasi Al pada dosis
sangat beracun dan perlakuan Al yg panjang (Simonovicova et al. 2004).
15
Peixoto et al. (1999) melaporkan bahwa aktivitas SOD pada akar gandum
yang resisten Al lebih tinggi dibandingkan gandum yang tahan Al pada kondisi
tanpa cekaman Al, namun dengan perlakuan cekaman Al, aktivitas SOD
meningkat lebih tinggi pada kultivar gandum yang tahan dibandingkan yang
resisten. Tingginya peningkatan aktivitas SOD pada gandum yang tahan dengan
perlakuan Al kemungkinan adalah hasil dari peningkatan konsentrasi H2O2.
Salah satu mekanisme toksisitas Al adalah menyebabkan peroksidasi lipid
(Gutteridge et al. 1985; Cakmak & Horst 1991).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat
(Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002).
Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen
CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3.
CSD1 dan CSD2 terekspresi pada
akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan
kloroplas.
Sementara target potein CSD3
karboksilnya mengandung tripeptida
di peroksisom karena ujung
Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pengklonan DNA dengan Rekombinasi Situs Spesifik
Teknologi pengklonan DNA sangat penting dalam bidang biologi,
terutama genetika dan biologi molekular. Pengklonan DNA dibutuhkan untuk
analisis fungsional gen dan ekspresi gen.
Saat ini telah berkembang teknik
pengklonan DNA dengan menggunakan prinsip rekombinasi situs spesifik yang
lebih efisien dibandingkan dengan teknik pengklonan yang menggunakan enzim
restriksi (Hartley et al. 2000).
Pengklonan sistem Gateway merupakan salah satu metode pengklonan
dengan rekombinasi situs spesifik secara in vitro yang ditemukan dan
dikomersialisasikan oleh Invitrogen sejak akhir 1990-an.
Metode Gateway
cloning adalah metode biologi molekuler untuk mentransfer fragmen DNA antar
plasmid dengan efisien menggunakan situs rekombinasi, yaitu situs " gateway
att", dan dua enzim campuran, yang disebut LR Clonase dan BP Clonase.
Gateway cloning secara efektif telah menggantikan enzim restriksi dan ligase.
Sistem ini memerlukan awal penyisipan fragmen DNA ke plasmid dengan dua
sekuens rekombinasi pengapit yang disebut "att L1" dan "att L2", untuk
membentuk Gateway clone entry (Magnani et al. 2006; Karimi et al. 2007;
16
Nakagawa et al. 2007). Metode ini sangat efisien, karena keberhasilannya lebih
dari 90% (Patton 2000; Freuler et al. 2008).
Secara umum, teknologi Gateway melibatkan proses dua-langkah. Gen
target pertama diklon ke entry vector melalui suatu reaksi yang disebut reaksi BP
dengan enzim BP clonase, dan menghasilkan entry clone. Ketika membuat entry
clone, maka perlu untuk mengubah urutan ujung gen target agar kompatibel
dengan situs rekombinasi Gateway (situs pengenalan rekombinase), namun
tidak melibatkan enzim restriksi selama proses pengklonan secara keseluruhan.
Selanjutnya, gen target yang ada di dalam entry vector (entry clone) disubklon ke
destination vector (plasmid biner) melalui reaksi LR menggunakan enzim LR
clonase. Jadi, hanya dengan sekali membuat entry clone, maka entry clone
dapat digunakan ke berbagai plasmid biner sesuai dengan tujuan hanya dengan
reaksi LR, dan ini merupakan salah satu keuntungan dari teknologi Gateway
(Invitrogen Co. 2003 ; Katzen 2007; Xu & Li 2008).
Salah satu entry vector yang tersedia saat ini adalah pENTR™/D-TOPO®
kloning kit (Invitrogen), dengan menambahkan 4 nukleotida (CACC) pada primer
5'-PCR (forward) untuk amplifikasi gen, produk PCR yang berujung rata sudah
terarah untuk diklon ke vektor TOPO untuk menghasilkan clone entry (Gambar
2). Dengan demikian, teknologi TOPO dengan mudah menghasilkan klon entry
(Xu and Li 2008). DNA sasaran yang yang telah tersisipi di klon entry akan lebih
mudah masuk ke vektor biner dengan hanya menggunakan reaksi LR (Hartley et
al. 2000; Patton 2000).
Gambar 2. Vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen 2006).
17
Tekhnologi gateway ini telah diaplikasikan untuk konstruksi vektor dalam
analisis ekpresi berlebih (overexpression)
(Karimi et al 2002; Curtis &
Grossniklaus 2003; Earley et al. 2006), antisense (Karimi et al. 2002), RNAi
(Muzuni 2011), analisis promoter (Curtis & Grossniklaus 2003;
Earley et al.
2006; Karimi et al. 2007), analisis ekspresi gen induksi (inducible gene) (Joube`s
et al. 2004; Brand et al. 2006; de Schutter et al. 2007), dan analisis ekspresi
beberapa gen (multisite) (Karimi et al. 2005).
RNA interference (RNAi)
RNA interference (RNAi) merupakan potongan kecil RNA yang dapat
menginduksi penghancuran mRNA tertentu sebelum dapat menyandi protein di
dalam sitoplasma.
Prinsip dasarnya adalah masuknya double-stranded RNA
(dsRNA) ke dalam sitoplasma akan membungkam ekspresi suatu gen di tingkat
post-transkripsi (Fire et al. 1998; Kalantidis et al. 2008). Pada awalnya, proses
gangguan (interference) menggunakan RNA tidak berhasil, karena para peneliti
mengunakan dsRNA dengan panjang lebih dari 30 nukleotida.
Hal ini
menyebabkan supresi dari gen yang tidak seharusnya terbungkam (non-specific
Pada perkembangannya,
suppression gene).
penggunaan dsRNA dengan
nukleotida yang lebih pendek, 21-23 nukleotida, berhasil membungkam ekspresi
gen yang dikehendaki pada sel mamalia, yang dikenal dengan small interfering
RNA (siRNA) (Fire et al. 1998; Waterhouse et al. 2001; Hannon 2002; Pickford &
Cogoni 2003)
Penghambatan
ekspresi
gen
dengan
memasukkan
dsRNA
ini,
sebenarnya ditemukan secara tidak sengaja oleh Napoli et al (1990) ketika
bermaksud meningkatkan ekspresi warna bunga Petunia.
Namun hasil yang
mereka peroleh dengan memasukkan dsRNA yang komplementer dengan gen
yang berperan dalam biosintesia warna bunga tidak seperti yang mereka
harapkan. Ekspresi warna bunga yang diharapkan adalah menjadi ungu tua
sebagaimana umumnya warna bunga Petunia, namun mereka mendapatkan
sebaliknya,
yaitu
bunga
Petunia
yang
berwarna
Penemuan ini merangsang berbagai kelompok peneliti
ungu
keputih-putihan
mengikutinya dengan
tujuan untuk mempelajari efek tertekannya (supp
PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE
(CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L.
SALEHA HANNUM
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Isolasi,
Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Copper/Zinc Superoxide
Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum L” adalah karya bersama
saya dan pembimbing yang belum pernah diajukan dalam bentuk apapun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
Bogor, Januari 2012
Saleha Hannum
NIM G361040041
ABSTRACT
SALEHA HANNUM. Isolation, Cloning, and Expression Analysis of Gene Coding
Copper/Zinc
Superoxide
Dismutase
(CuZn-SOD)
from
Melastoma
malabathricum L. Supervised by SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI
SUHARSONO, and ALEX HARTANA.
Melastoma malabathricum L. is an indigenous plant in tropical Southeast
Asia with exceeding tolerance to aluminum (Al) stress in acid soils. Although
increasing evidence suggests that Al-stress is accompanied by oxidative
damages in plants, little has been described on the antioxidative components in
this tolerant plant. Copper/zinc SOD (CuZn-SOD) is one of aluminum-induced
genes. Analysis of the expression of genes induced by Al in M. malabathricum
requires internal control genes. Actin is belong to housekeeping genes
commonly used as an internal control. This study aimed to isolate and clone the
cDNA fragment of MmACT encoding for actin of M. malabathricum, and isolate,
clone and expression analysis of copper/zinc SOD (CuZn-SOD) from M.
malabathricum L. Total RNA was isolated and used as template for cDNA
synthesis by reverse transcription. Four of cDNAs clones were isolated, and
were called MmACT1, MmACT2, MmACT3, and MmACT4. The size of
MmACT1 and MmACT2 is 617 bp, whereas MmACT3 and MmACT4 is 735 bp.
The sequence of MmACT cDNAs was registered in GenBank / EMBL / DDBJ
database with accession numbers AB500686, AB500687, AB500688, and
AB500689. Full length cDNA of MmCuZn-SOD had been successfully isolate by
RACE. The size of MmCuZn-SOD is 824 bp that encoded a 152-amino acid
polypeptide with a predicted pI value of 5.77, and showed high homology to other
cytosolic CuZn-SODs from higher plants. Semi-quantitative RT-PCR showed that
MmCuZn-SOD mRNA was highly expressed in the leaf tissues than stem and
root. The Al treatment strongly induced the expression of MmCuZn-SOD both in
the leaf and root tissues. These results suggested the fortification of the antioxidative defense system under Al stress in this acid soil-tolerant wild plant.
Overexpression vectors was successfully constructed and each has been
introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 by triparental mating
(TPM). N.benthamiana and Nicotiana tabacum transgenics had been obtained
by mediated-A. tumefaciens. Analysis of segregation of T1 transgenic plants
based on analysis of Khi-Quadrat (2) showed that the T1 transgenic plants
accordance with 3:1 of Mendelian inheritance pattern. RNAi vector had been
successfully constructed using GATEWAYTM cloning technology and it had been
introduced into M. malabathricum L. mediated by Agrobacterium tumefaciens
LBA 4404. Transgenic plants analyzes to Al stress showed that in the MS
medium containing 1 mM Al (AlCl36H2O), the transgenic plants underwent growth
suppression, whereas non-transgenic plants underwent growth normally. These
results suggested that suppression of MmCuZn-SOD gene expression by RNAi
to M. malabathricum L. caused the plant became sensitive to Al.
Key words : actin gene, aluminum stress, CuZn-SOD gene, Melastoma
malabathricum, RNAi.
RINGKASAN
SALEHA HANNUM. Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi
Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma malabathricum
L. Dibimbing oleh SUHARSONO, UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO, dan ALEX
HARTANA.
Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman asli Asia Tenggara
yang toleran terhadap cekaman aluminium (Al) pada tanah asam. Gen-gen yang
ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al.
Gen superoxside dismutase (SOD) merupakan salah satu gen yang ekspresinya
diinduksi Al. SOD diduga memiliki peran dalam ketahanan M. malabathricum.
Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada M. malabathricum L,
informasi housekeeping gene dari tumbuhan tersebut juga sangat dibutuhkan
sebagai kontrol internal. Salah satu housekeeping gene yang populer dijadikan
sebagai internal kontrol adalah gen aktin. Penelitian ini bertujuan mengisolasi
dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari M. malabathricum L, selanjutnya
melakukan isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi copper/zinc
superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum L, dan mempelajari
ekspresi gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi ekspresi berlebih (overekspresi)
di tanaman model Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan
pembungkaman gen MmCuZn-SOD melalui RNAi di M. malabathricum L. RNA
total telah berhasil diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA
total melalui transkripsi balik. Empat fragment cDNA yang menyandi aktin dari
M. malabathricum telah berhasil diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid
pGEM-T Easy. Keempat fragmen ini selanjutnya dinamakan fragmen MmACT1,
MmACT2, MmACT3, dan MmACT4. Analisis urutan nukleotida menunjukkan
bahwa fragmen MmACT1 dan MmACT2 berukuran 617 pb, dan fragmen
MmACT3 dan MmACT4 berukuran 735 pb. Antar keempat fragmen cDNA
MmACT ini memiliki kemiripan nukleotida sekitar 78%-99%, dan kemiripan asam
amino sekitar 98% - 100%. Analisis hubungan filogenetik berdasarkan urutan
asam amino menunjukkan bahwa pada ketidakmiripan 1% MmACT1, MmACT2,
MmACT3 mengelompok dengan ACT5 Populus trichocarpha, sementara
MmACT4 mengelompok dengan ACT9 P. trichocarpa dan ACT1 Gossypium
hirsutum, dan kedua kelompok ini terpisah dengan aktin dari tumbuhan
monokotil. Keempat fragmen MmACT ini telah didaftarkan di bank data
GenBank/EMBL/DDBJ dengan nomor aksesi AB500686, AB500687, AB500688,
and AB500689. Selanjutnya fragmen cDNA yang menyandi CuZn-SOD dari M.
malabathricum juga telah berhasil diisolasi. Gen utuh MmCuZn-SOD yang
berhasil diisolasi dengan metode RACE berukuran 824 pb, terdiri dari 459 pb
open reading frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino dengan prediksi nilai
pI 5.77. Analisis filogenetik berdasarkan urutan asam amino menunjukkan
bahwa MmCuZn-SOD memiliki kemiripan yang tinggi dengan CuZn-SOD sitosol
tanaman tingkat tinggi.
Berdasarkan analisis semi-kuantitatif RT-PCR
menunjukkan bahwa MmCuZn-SOD terekspresi pada jaringan daun, batang dan
akar. Perlakuan Al menginduksi ekspresi MmCuZn-SOD baik dalam jaringan
daun maupun akar.
Untuk mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD, vektor ekspresi telah
berhasil dikonstruksi yaitu pMSH-MmCuZn-SOD dan pGWB-MmCuZn-SOD, dan
masing-masing telah diintroduksikan ke Agrobacterium tumefaciens LBA 4044
melalui metode triparental mating (TPM). Tanaman transgenik N. benthamiana
dan N. tabacum yang mengandung gen MmCuZn-SOD telah diperoleh melalui A.
tumefaciens. Analisis segregasi pada tanaman N. benthamiana dan N. tabacum
transgenik generasi T1 berdasarkan analisis Khi-Kuadrat (2) menunjukkan
bahwa tanaman transgenik T1 yang diuji sesuai dengan pola pewarisan Mendel
3 : 1. Konstruksi pembungkaman gen MmCuZn-SOD juga telah berhasil
dilakukan melalui RNAi. Vektor RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M.
malabathricum L. melalui Agrobacterium tumefaciens LBA4404 untuk
mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD dalam detoksifikasi cekaman Al. Uji
toleransi tanaman transgenik terhadap cekaman Al menunjukkan bahwa pada
media MS yang mengandung 1 mM Al (AlCl36H2O), tanaman transgenik
mengalami hambatan pertumbuhan sampai mati, sementara non-transgenik tidak
mengalami hambatan. Hal ini menunjukkan bahwa penghambatan ekspresi gen
MmCuZn-SOD dengan RNAi pada tanaman M. malabathricum L. menyebabkan
tanaman menjadi sensitive terhadap Al. Hal ini menjelaskan bahwa gen
MmCuZN-SOD diduga berperan penting dalam detoksifikasi Al pada M.
malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen
merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini isolasi fragmen gen
penyandi aktin dari M. malabathricum L, isolasi, pengklonan, dan analisis
ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.
malabathricum L, dan mempelajari ekspresi gen MmCuZn-SOD melalui
konstruksi ekspresi berlebih (overexpression) di tanaman model Nicotiana
benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen MmCuZn-SOD
melalui RNAi pada M. malabathricum L merupakan penelitian yang belum pernah
dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, keempat topik penelitian di
atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini.
Kata kunci : cekaman aluminium, gen CuZn-SOD, gen aktin,
malabathricum, RNAi.
Melastoma
©Hak Cipta milik IPB, Tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN ANALISIS EKSPRESI GEN
PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE
(CuZn-SOD) DARI Melastoma malabathricum L.
SALEHA HANNUM
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup, 19 Desember 2011:
1. Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc
2. Dr. Ir. Miftahudin, M.Si
Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka 3 Januari 2012:
1. Dr. Ir. Satoto, M.S
2. Dr. Sintho W. Ardie
Judul Disertasi
Nama Mahasiswa
Nomor Pokok
: Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi
Copper/Zinc Superoxide Dismutase (CuZn-SOD) dari
Melastoma malabathricum L.
: Saleha Hannum
: G361040041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua
Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si
Anggota
Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
Dr.Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr.
Tanggal Ujian Terbuka : 3 Januari 2012
Tanggal lulus:
PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji hanya untuk Allah SWT yang telah memberikan
kemudahan dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian
dan penulisan disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil penelitian
yang
dilakukan di Laboratorium
Biotechnology Research
Indonesia-The
Netherland (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) IPB dan Laboratorium Plant Differentiation and Morphogenesis, Nara
Institute Science and Technology (NAIST) Japan. Disertasi ini memuat hasil
penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi
copper/zinc superoxide dismutase dari tanaman Melastoma malabathricum L.
Shalawat dan salam disampaikan kepada Rasulullah Muhammad SAW atas
keteladanannya.
Selama penelitian ini penulis telah banyak mendapat bantuan dan
bimbingan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan
penghargaan yang tinggi dan ucapan terima kasih kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Suharsono, DEA selaku ketua komisi pembimbing, Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti
Suharsono, M.Si. dan Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana, M.Sc selaku anggota
komisi pembimbing atas segala bantuan, arahan, dan bimbingan yang telah
diberikan kepada penulis mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan, hingga
penulisan disertasi ini. Demikian juga penulis menyampaikan terimakasih dan
penghargaan yang tinggi kepada Prof. Dr. Akiho Yokota dan Dr. Kinya Akashi
yang telah memberikan arahan, bimbingan, dan fasilitas laboratorium di Nara
Institute Sciences and Technology (NAIST) Japan.
Kepada Tim Beasiswa
Pendidikan Pascasarjana (BPPS), Rektor Universitas Sumatera Utara (USU)
Medan, Program Sandwich dan Hibah Pascasarjana dari Ditjen Dikti Depdiknas,
dan Hibah Kompetensi dengan judul:”Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka
perakitan tanaman yang toleran terhadap cekaman asam dan aluminium an.
Dr.Suharsono,DEA dengan nomor kontrak 039/HIKOM/DP2M/2008/ tanggal 13
agustus 2008, 219/SP2H/PP/DP2M/V/2009 tanggal 30 Mei 2009, dan 224/
SP2H/PP/DP2M/III/2010 tanggal 1 Maret 2010, terimakasih atas bantuannya
dalam menyediakan biaya pendidikan dan penelitian.
Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Rektor, Dekan Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), dan Ketua Jurusan Biologi
Universitas Sumatera Utara Medan, atas izin yang diberikan kepada penulis
untuk melanjutkan pendidikan di SPs IPB; Rektor IPB, Dekan Sekolah
Pascasarjana (SPs) IPB, dan Ketua Program Studi Biologi SPs IPB, atas
kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di SPs
IPB Bogor. Kepada seluruh staf pengajar dan administrasi Sps IPB, penulis
menyampaikan banyak terimakasih atas ilmu dan kelancaran adminstrasi selama
penulis menjadi mahasiswa di SPs IPB. Penulis juga menyampaikan terimakasih
kepada staf PPSHB IPB atas bantuannya dalam kelancaran pelaksanaan
penelitian di laboratorium.
Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan mahasiswa
seperjuangan di Laboratorium BIORIN, yaitu Bu Srilis, Bu Yohana, Pak Ulung,
Bu Ratna, Pak Radit, Bu Ifa, Pak Asri, Muchdar, Anita, Nurul, Ophie, Delih,
Nikson, Ila, Iin, Lian, dan Mia, serta yang telah lulus, yaitu Pak Muzuni, Firdaus,
Agustina, Pak Hadi, Yasinta, Niken, Ulfa, Yassir, Jaya, Zahro, Lulu, Go To, Fajri,
Indah, dan Lita; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan di Program Studi Biologi,
yaitu Bu Iin, Bu Dorly, Bu Nursahara, Bu Sri, dan Bu Ida atas dorongan dan
kerjasamanya. Terimakasih juga disampaikan kepada Pak Mulya, Mbak Pepi,
Pak Adi, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, Bu Dewi, Bu Ika, Bu Emi, Bu Eni,
dan Pak Iri atas bantuan dan kerjasamanya.
Ucapan terima kasih yang tulus ikhlas juga penulis sampaikan kepada
kedua orang tua penulis ayahanda dan ibunda (almarhum) yang senantiasa
mencurahkan cinta dan kasih sayangnya, dan selalu memanjatkan doa demi
kesuksesan penulis, serta dorongan moril sehingga penulis dapat menyelesaikan
pendidikan S3.
Semoga Allah swt menyayangi mereka seperti menyayangi
penulis. Kepada kakak, abang, adek, dan keponakan penulis, terimakasih atas
segala perhatian, kasih sayang, pengorbanan, pengertian, dorongan moril, serta
doa yang diberikan kepada penulis selama ini.
Sebagai penutup, semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan dapat
memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan di Indonesia.
Bogor, Januari 2012
Saleha Hannum
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pidoli Dolok pada tanggal 31 Agustus 1971, sebagai
anak ketiga dari enam orang bersaudara pasangan ayahanda H. Muhammad
Saleh Nasution, BA dan ibunda Hj. Masdewa Harahap (alm).
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN 12 Kota Padang
Sidimpuan pada tahun 1984, pendidikan menengah dan lanjut di Madrasah
Tsanawiyah dan Madarasah Aliyah Pondok Pesantren K.H.Ahmad Dahlan
Sipirok, Tapanuli Selatan pada tahun 1987 dan 1990.
Penulis melanjutkan
pendidikan di Universitas Andalas, Padang jurusan Biologi dan lulus 1996. Tahun
1998 melalui program DUE (Dikti) penulis melanjutkan pendidikan Pascasarjana
pada program studi Biologi di Institut Pertanian Bogor dan lulus 2001. Tahun
2000 penulis diangkat menjadi staf pengajar di Universitas Sumatera Utara,
Medan sampai sekarang.
Tahun 2004 penulis mendapat kesempatan untuk
melanjutkan ke jenjang doktor pada program studi Biologi di Institut Pertanian
Bogor. Tahun 2008 penulis mendapat kesempatan melaksanakan penelitian di
Nara Institute Science and Technology (NAIST), Jepang selama 6 bulan melalui
program Sandwich, DIKTI.
BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lahan asam merupakan salah satu lingkungan yang membatasi produksi
pertanian.
Sekitar 50% lebih dari lahan pertanian di dunia adalah lahan asam
(Bot et al. 2000). Sementara Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha tanah
Podsolik Merah Kuning (CSAR 1997) yang bersifat asam dengan kelarutan
aluminium (Al) yang tinggi.
Foy (1988) menjelaskan bahwa kemasaman tanah adalah faktor
cekaman
terbesar
yang
mempengaruhi
pertumbuhan
tanaman
dengan
keberadaan Al merupakan faktor pembatas pertumbuhan pada tanah asam.
Pada pH dibawah 5, Al menjadi terionisasi yang sangat beracun bagi tanaman
(Kinraide & Parker 1990; Kochian et al. 2004; Meriga et al. 2010 ). Aluminium
telah bersifat racun bagi tanaman meskipun konsentrasinya masih sangat
rendah. Walaupun demikian Al yang membentuk ikatan dengan ligand adalah
tidak beracun bagi tanaman seperti aluminium silikat. Bentuk Al yang bersifat
toksik bagi tanaman adalah ion Al3+ yang dominan pada kondisi asam
(Matsumoto 2000; Kochian et al. 2004). Kelarutan Al yang tinggi di dalam tanah
sangat merugikan tanaman karena dapat menghambat pertumbuhan akar
(Delhaize & Ryan 1995; Rout et al. 2001; Kochian et al. 2005).
Tumbuhan yang hidup di tanah asam umumnya adalah tumbuhtumbuhan yang dapat beradaptasi dengan lingkungan tersebut. Salah satu jenis
tumbuhan yang banyak dijumpai pada Tanah Podsolik Merah Kuning adalah
Melastoma
(Tjitrosoedirdjo 1991).
Melastoma merupakan anggota famili
Melastomataceae, tersebar di daerah Tropik Asia dan seluruh Indonesia sebagai
gulma. Salah satu spesiesnya adalah Melastoma malabathricum L. yang banyak
dijumpai di lahan asam.
Pertumbuhan akar M. malabathricum L. tidak
mengalami gangguan pada pH 4.0 dan terganggu pada pH 3.0 (Muhaemin
2008).
Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada tanah asam yang
tumbuhan lain tidak tumbuh sehingga dapat dijadikan sebagai tumbuhan
indikator pada tanah asam.
Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa M.
malabathricum L. mampu mengakumulasi lebih dari 14.4 g Al kg-1 daun tua dan
lebih dari 8 g Al kg-1 daun muda tanpa mengalami keracunan.
Analisis
akumulasi Al pada M. affine D.Don. (sinonim dengan M. malabathricum L.) yang
mendapat cekaman 3.2 mM Al pH 4 pada media cair menunjukkan bahwa
2
M.affine D.Don. mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan
perlakuan (Mutiasari 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman
(Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat
dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya
diinduksi Al (Darko et al. 2004), beberapa diantaranya adalah gen-gen yang
mengkode
enzim
antioksidan,
seperti
glutathione-S-transferase
(GST),
ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide dismutase (SOD)
(Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003; Meriga et al. 2010).
Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis perubahan radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2. Superoksida merupakan salah satu
radikal bebas turunan (derivate) oksigen reaktif (ROS) yang umumnya terdapat
dalam sel tanaman sebagai hasil samping dari proses metabolisme normal.
Akumulasi radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan makromolekul sel dan
bahkan kematian sel (Bowler et al. 1992; Scandalios 1993). Konsentrasi radikal
bebas di dalam sel tanaman dapat meningkat ketika tanaman merespon
cekaman biotik dan abiotik. Namun tanaman juga memiliki sistem pertahanan
yang dapat mencegah peningkatan radikal bebas ini dengan adanya enzim
antioksidan seperti SOD. Ada tiga tipe enzim SOD sesuai dengan logam yang
berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzimnya, yaitu copper/zinc (CuZnSOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (Mn-SOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol,
kloroplas, dan peroksisom; Mn-SOD di mitokhondria; dan Fe-SOD di kloroplas
(Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992; Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al.
1998).
Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman
abiotik, seperti cahaya tinggi dan suhu rendah (Allen et al. 1997), sulfur dioksida
(Tseng et al. 2008), kekeringan (Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), dan
aluminium (Cakmak & Horst 1991; Basu et al. 2001; Du et al. 2010).
Brassica
napus yang tahan Al mengekspresikan gen SOD secara berlebih (Basu et al.
2001). Aktivitas enzim SOD juga meningkat dengan cekaman Al pada kedelai
(Cakmak & Horst 1991; Du et al. 2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi
3
(Meriga et al. 2010). Cekaman Al dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan
terbentuknya oksigen radikal (ROS) (Panda et al. 2003).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat
(Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002).
Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen
CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3.
CSD1 dan CSD2 terekspresi pada
akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan
kloroplas.
Sementara target potein CSD3
karboksilnya mengandung tripeptida
di peroksisom karena ujung
Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pada M. malabathricum L., beberapa gen yang diduga terlibat dalam
cekaman asam dan Al telah diisolasi seperti multidrug resistance associated
protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein type 2 (Mt2) (Suharsono
et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al. 2010), dan sitrat sintase
(Mushofa 2011). Namun sampai saat ini belum ada informasi tentang gen CuZnSOD pada
M. malabathricum L. yang diduga juga terlibat dalam toleransi
terhadap cekaman asam dan Al.
Untuk mempelajari ekspresi gen secara
kuantitatif pada M. malabathricum L,
informasi housekeeping gene dari
tumbuhan tersebut sangat dibutuhkan sebagai kontrol internal. Sampai saat ini
informasi tersebut belum ada. Menurut Maroufi et al. (2010) aktin termasuk
salah satu kontrol internal yang paling stabil.
Beberapa metode dapat digunakan untuk mengisolasi gen antara lain
melalui penapisan terhadap pustaka genom dan pustaka cDNA, serta RT-PCR
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction). Selain itu ada juga yang
menggunakan metode RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) untuk
memperoleh gen utuh, yaitu sintesis cDNA dengan menggunakan mRNA
sebagai cetakan dan sekuen internal yang sudah diketahui urutan nukleotidanya
serta adapter pada ujung 3’ atau 5’ sebagai primer.
Metode RACE telah
digunakan untuk isolasi gen utuh (full length) mannose-binding lectin dari umbi
Zephyranthes grandiflora (Kai et al. 2006), gen penyandi Gibberellin 20-Oxidase
dari Helianthus annuus (Carzoli et al. 2008), dan gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari M. malabathricum L. (Muzuni et al. 2010).
Peranan suatu gen dalam tanaman dapat dipelajari minimal dengan
pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen dengan mengkonstruksi
vektor over expression
dan pendekatan kedua dengan menghentikan dan
4
menurunkan
ekspresi
atau
pembungkaman
gen
antara
lain
dengan
mengkonstruksi vektor RNAi (RNA interference). RNAi menyebabkan mRNA
terdegradasi sehingga gen menjadi tidak berfungsi.
Teknologi RNAi telah
digunakan untuk mempelajari peranan gen penyandi H+-ATPase pada M.
malabathricum L. (Muzuni et al. 2011), membungkam gen OsGEN-L pada padi
(Moritoh et al. 2005), dan menurunkan ekspresi gen ornithine decarboxylase
pada tanaman Nicotiana tabacum L. (DeBoer et al. 2011).
Pada penelitian ini,
telah dilakukan isolasi dan pengklonan fragmen gen penyandi aktin dari M.
malabathricum L, selanjutnya dilakukan isolasi, pengklonan, dan analisis
ekspresi gen penyandi copper/zinc-superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.
malabathricum L.
Ekspresi gen dilakukan di tanaman model Nicotiana
benthamiana dan Nicotiana tabacum, dan pembungkaman gen dilakukan di M.
malabathricum L.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Mengisolasi dan mengklon fragmen gen penyandi aktin dari Melastoma
malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen penyandi copper/zinc
superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari M.malabathricum L. (MmCuZn-SOD).
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi gen MmCuZn-SOD untuk ekspresi berlebih
pada tanaman Nicotiana benthamiana dan Nicotiana tabacum.
4. Mempelajari peranan gen MmCuZn-SOD melalui konstruksi vektor RNAi untuk
pembungkaman gen pada tanaman M. malabathricum L.
Strategi Penelitian
Strategi yang digunakan untuk mencapai tujuan dengan membagi
penelitian menjadi 4 aspek kajian (Gambar 1), yaitu:
1. Mengisolasi dan mengklon gen penyandi aktin dari M. malabathricum L.
2. Mengisolasi, mengklon, dan menganalisis ekspresi gen MmCuZn-SOD pada
M. malabathricum L. yang diberi perlakuan cekaman abiotik.
3. Mengkonstruksi vektor ekspresi untuk ekspresi berlebih gen MmCuZnSOD
pada tanaman model N. benthamiana dan N. tabacum.
4. Mengkonstruksi vektor ekspresi RNAi untuk pembungkaman gen MmCuZnSOD pada tanaman M. malabathricum L.
5
Gambar 1. Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, analisis ekspresi, analisis
ekspresi berlebih pada tanaman model dan pembungkaman pada
M.malabathricum L. gen penyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum
L. RACE, Rapid Amplification cDNA Ends; RNAi, RNA interference.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Melastoma malabathricum L.
Melastoma adalah salah satu genus dari famili Melastomataceae yang
termasuk dalam ordo Myrtales. Genus ini terdiri dari 22 spesies yang tersebar di
Asia Tenggara, India, Cina Selatan, Jepang dan Australia Utara (Meyer 2001).
Melastoma malabathricum L. merupakan salah satu spesies tumbuhan berkayu
yang tumbuh di tanah asam dengan keasaman yang sangat tinggi dan miskin
unsur hara (seperti N dan P), dan tersebar di daerah tropis Asia, Australia, dan
Polynesia (Osaki et al. 1997). Di Indonesia tumbuhan ini juga banyak ditemukan
tumbuh di tanah asam, khususnya tanah Podsolik Merah Kuning dengan
kelarutan aluminium (Al) yang tinggi yang menjadi faktor pembatas bagi
pertumbuhan tanaman. Ketahanan tanaman M. malabathricum L. pada tanah
asam berhubungan dengan kemampuannya mengakumulasi Al di daun tanpa
menyebabkan gejala keracunan dan bahkan Al memacu pertumbuhannya
(Watanabe et al. 1998), sehingga tanaman ini dikenal juga sebagai akumulator Al
(Watanabe & Osaki 2002; Watanabe et al. 2005).
Menurut Watanabe et al. (1997), M. malabathricum L. yang ditumbuhkan
pada media cair dengan cekaman Al sebesar 0.5 mM selama 6 minggu mampu
mengakumulasi Al lebih dari 10 g kg-1 pada daunnya, sementara pada daun
muda tanaman ini mengakumulasi Al lebih dari 7 g kg-1. Analisis akumulasi Al
pada M. affine D.Don (sinonim dari M. malabathricum L.) yang mendapat
cekaman 3.2 mM Al pada pH 4 di dalam media cair menunjukkan bahwa M.
affine D.Don mampu mengakumulasi 8.81 g Al kg-1 daun tua setelah 2 bulan
perlakuan (Mutiasari 2008). Tanaman akumulator Al yang lain seperti tanaman
teh (Camellia sinensis (L.) Kuntze) dapat mengakumulasi Al hingga 30 g kg-1
pada daun tua dan 0.6 g kg-1 pada daun muda (Matsumoto et al. 1976). Daun
Hydrangea macrophylla dapat mengakumulasi Al sebesar 3 g kg-1 (Ma et al.
1997).
Tanaman mencegah toksisitas Al melalui mekanisme ekslusi dan
mekanisme toleransi internal.
Pada mekanisme ekslusi, Al didetoksifikasi
dengan mengeksudasi senyawa-senyawa organik yang dapat mengikat Al.
Sedangkan dalam mekanisme toleransi internal, Al didetoksifikasi setelah Al
8
diserap tanaman.
Bentuk-bentuk kimia Al pada tanaman toleran telah
diidentifikasi menggunakan spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
Menurut Watanabe et al. (1998) bentuk Al pada daun M. malabathricum L.
adalah Al3+, Al-oksalat, Al(oksalat)2, dan Al-(oksalat)3. Sementara Watanabe &
Osaki (2001) menjelaskan bahwa Al diangkut dari akar ke pucuk tanaman M.
malabathricum dalam bentuk kompleks Al-sitrat.
Jadi, asam organik dengan
berat molekul kecil memainkan peranan penting dalam detoksifikasi internal pada
jaringan tanaman dan transport Al dari akar ke pucuk melalui pembentukan
kompleks asam organik. Hal yang sama juga ditemukan pada tanaman
akumulator Al lainnya seperti buckwheat (Ma & Hiradate 2000) dan teh (Morita et
al. 2008).
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika tanaman
(Suharsono 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat
dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya ada 30 gen yang ekspresinya
diinduksi Al yang telah dilaporkan (Darko et al. 2004). Beberapa diantaranya
adalah gen-gen yang mengkode enzim antioksidan, seperti
glutathione-S-
transferase (GST), ascorbate peroxidase (APX), catalase (Cat), dan superoxide
dismutase (SOD) (Richards et al. 1998; Ezaki et al. 2000; Boscolo et al. 2003;
Meriga et al. 2010). Pada M. malabathricum L., gen yang diduga terlibat dalam
toleransi tanaman terhadap cekaman asam dan Al telah diisolasi, yaitu multidrug
resistance associated protein (MRP) (Suharsono et al. 2008), metallothionein
type 2 (Mt2) (Suharsono et al. 2009), H+-ATPase membran plasma (Muzuni et al.
2010), dan sitrat sintase (Mushofa 2011).
Toksisitas Aluminium
Secara normal, aluminium (Al) berada dalam bentuk oksida dan kompleks
aluminosilikat yang tidak larut dan tidak toksik. Pada pH netral, Al membentuk
kompleks dengan ion hidroksida yang tidak larut, sedangkan pada pH asam, Al
berada dalam bentuk Al3+ yang merupakan bentuk Al yang paling toksik (Kinraide
& Parker 1990; Kinraide et al. 1994; Matsumoto 2000). Pada larutan dengan pH
yang lebih rendah dari 5.0, ion Al berada dalam bentuk oktahedral heksahidrat,
Al(H2O)63+, sering disingkat dengan Al3+. Pada larutan yang keasamannya
9
berkurang, Al(H2O)63+ mengalami deprotonasi menjadi Al(OH)2+ dan Al(OH)2+.
Pada larutan netral menyebabkan Al(OH)3 mengendap dan larut kembali pada
larutan basa dengan membentuk formasi tetrahedral, Al(OH)4- (Delhaize & Ryan,
1995; Marschner, 1995).
Keracunan Al merupakan salah satu kendala dalam produksi tanaman
pada tanah asam. Pada kondisi tersebut umumnya ketersediaan hara dan
kemampuan tanaman untuk menyerap hara sangat terbatas. Dari beberapa
percobaan diketahui bahwa penyerapan P, Ca, Mg, dan K oleh tanaman
berkurang secara nyata. Pada tanaman barley yang ditanam pada media yang
mengandung Al, kandungan Ca2+ dan K+ hanya setengahnya jika dibandingkan
dengan kontrol (Matsumoto et al.1988). Al biasanya meningkatkan kandungan P
pada akar dan menurunkan kandungan P pada pucuk (Liang et al. 2001; Quartin
et al. 2001). Hal ini berhubungan dengan bentuk kompleks antara P dan Al pada
akar yang menghambat transportasi P ke pucuk.
Aluminium dapat mengikat anion anorganik, seperti sulfat, fosfat, fluor,
dan silikat membentuk suatu kompleks yang mempunyai afinitas tinggi terhadap
oksigen atau air (Hodson & Evans 1995). Interaksi antara Al dengan anion
tersebut berpotensi untuk meningkatkan pH perakaran sekaligus dapat membuat
rancu pengaruh toksisitas Al dengan defisiensi unsur tertentu (seperti fosfat)
karena terbentuknya kompleks Al-fosfat (baik di larutan tanah maupun di dalam
sel) yang tidak tersedia bagi tanaman. Kemampuan tanaman untuk dapat
memanfaatkan kandungan P yang rendah secara efisien selalu dihubungkan
dengan sifat toleransi tanaman terhadap cekaman Al. Kation trivalen Al3+
menghambat transport Ca2+ secara efektif ke dalam akar, protoplasma dan
membran vesikel. Hasil studi pada lipid bilayer menunjukkan bahwa Al dapat
memblok Ca2+ dan saluran K+ (Ryan et al. 1997; Jones et al. 1998). Pada akar
barley, perlakuan Al menurunkan kandungan Ca pada membran hingga 50% dan
menyebabkan penurunan aktivitas H+-ATPase dalam menghidrolisis ATP
(Matsumoto & Yamaya 1988).
Pengaruh Aluminium pada Tanaman
Kelebihan konsentrasi Al dalam larutan tanah pada umumnya berakibat
buruk terhadap pertumbuhan tanaman, kecuali beberapa tanaman seperti teh
yang mampu bertahan pada konsentrasi Al tinggi. Gangguan penyerapan hara
10
mineral tanah asam disebabkan dua hal yang sangat berkaitan, yaitu efek
langsung dengan menghambat penyerapan hara secara langsung, dan efek tidak
langsung dengan menghambat pertumbuhan
sehingga secara tidak langsung
menghambat penyerapan hara (Marschner 1995).
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa target utama keracunan Al
adalah jaringan akar tanaman (Delhaize & Ryan 1995; Kochian et al. 2004).
Penelitian pada gandum (Triticum aestivum) menggunakan kultivar yang sensitif
Al (Neepawa) dan toleran Al (PT741) menunjukkan bahwa setelah 3 hari
ditumbuhkan pada media yang mengandung berbagai konsentrasi Al, terlihat
penurunan pertambahan panjang akar pada kultivar sensitif sebanyak 57% pada
konsentrasi Al 25 µM, tetapi pada kultivar resisten Al belum berpengaruh (Basu
et al. 1994).
Aluminium banyak ditemukan pada inti dan dinding sel pada tanaman
yang sensitif. Pada dinding sel, penghambatan terjadi karena Al menggantikan
kedudukan Ca2+ pada lamella tengah. Aluminium berikatan dengan molekul
pektin dinding sel atau komponen dinding sel yang bermuatan negatif pada selsel epidermis dan korteks akar (Delhaize et al. 1993; Marienfeld et al. 2000;
Schmohl & Horst 2000; Schmohl et al. 2000; Rout et al. 2001; Kochian et al.
2005). Gugus karboksil bebas pada molekul pektin yang terdemetilasi mengikat
ion Al toksik.
Menurut Schmohl et al. (2000), perlakuan enzim pectin
methylesterase (PME) pada suspensi sel Zea mays menurunkan
resistensi
terhadap Al, sehingga overekspresi PME pada tanaman kentang transgenik lebih
sensitif terhadap Al daripada non transgenik.
Hal ini menunjukkan bahwa
matriks pektin pada apoplas sel-sel apikal akar berperanan penting dalam
memfasilitasi sinyal stress pada sitoskeleton sel-sel tersebut. Akumulasi Al yang
tinggi dalam apoplas akar merupakan karakteristik sensitifitas Al (Rincon &
Gonzales 1992; Schmohl & Horst 2000). Ikatan Al dengan gugus karboksil akan
menimbulkan ikatan yang kuat sehingga sel tidak dapat membesar (Marschner
1995). Pada inti sel, Al berasosiasi dengan DNA sehingga menghentikan proses
pembelahan sel pada meristem apikal (Matsumoto 1991; Rout et al. 2001).
Aluminium dalam bentuk polimer memiliki muatan positif yang besar serta
memiliki banyak situs pengikatan. Polimer Al ini dapat mengikat fosfat yang ada
pada kedua utas DNA, sehingga menghambat proses replikasi (Matsumoto
11
1991). Sedangkan menurut Silva et al. (2000) bahwa Al dapat terakumulasi
dalam nukleus dengan konsentrasi yang rendah.
Pada membran sel, pengaruh Al lebih banyak disebabkan oleh adanya
perubahan atau kerusakan sifat permeabilitas. Pada membran sel akar barley, Al
ditemukan berasosiasi dengan gugus fosfolipid membran yang menyebabkan
kerusakan struktur membran atau perubahan dalam permeabilitas membran. Hal
ini menyebabkan penyerapan hara yang dikatalisis oleh pompa proton menjadi
terhambat (Matsumoto 1991; Rout et al. 2001). Ion Al yang bermuatan positif
dapat berasosiasi dengan gugus fosfat dari ATP atau fosfolipid pada membran
yang akan mempengaruhi efektivitas transport proton (Kochian et al. 2004).
Toleransi Tanaman terhadap Cekaman Aluminium
Tanaman yang toleran terhadap Al tinggi mengembangkan mekanisme
toleransi melalui berbagai cara. Beberapa tanaman toleran Al mengeluarkan
asam-asam organik sebagai bahan pengkhelat Al pada daerah rizosfer.
Beberapa jenis tanaman diketahui mengeluarkan eksudat berupa asam sitrat,
seperti yang terjadi pada Phaseolus vulgaris (Miyasaka et al. 1991) dan kacang
kedelai (Yang et al. 2000).
Pada tanaman gandum yang toleran Al
mengeluarkan asam malat dari ujung akarnya (Delhaize et al. 1993). Tanaman
talas mengeluarkan eksudat asam oksalat (Ma & Miyasaka, 1998).
Taylor (1991) menyatakan bahwa resistensi Al dimediasi oleh protein
membran yang secara aktif mengeluarkan Al, sebagai enzim yang terlibat dalam
sintesis atau pengeluaran ligan kelator, atau
enzim yang bertanggungjawab
terhadap sintesis komponen seluler yang mempunyai sifat mengubah resistensi
Al. Sopandie et al. (2003), juga mendapatkan tanaman kedelai yang toleran
terhadap Al mengekspresikan suatu protein pada daerah meristem akar.
Beberapa tanaman dapat bertindak sebagai tanaman pengumpul
(akumulator) Al, karena dapat menyerap Al dan mengakumulasinya dalam
jaringan tanaman. Watanabe et al. (1998) melaporkan bahwa tanaman
M. malabathricum L. mampu mengakumulasi Al dalam jaringan mesofil daun
maupun dalam jaringan penyusun akar, terutama pada jaringan epidermis dan
endodermis. Tanaman teh (Camellia sinensis L.) dapat mengakumulasi Al pada
daun tua sebesar 30 g kg-1 (Matsumoto et al. 1976).
Sementara tanaman
Conostegia xalapensis yang mengakumulasi Al dalam jaringan epidermis dan
12
mesofil daunnya dapat mengandung 19.000 mg Al kg-1 bobot kering daun
(Gonzalez-Santana et al. 2011).
Gen-Gen yang Berhubungan dengan Toleransi Aluminium
Taylor (1991) mengungkapkan bahwa respon toleransi tanaman terhadap
Al sangat berkaitan dengan gen-gen yang terlibat di dalamnya. Beberapa gengen telah diketahui baik secara langsung maupun tidak langsung mengendalikan
toleransi terhadap Al. Aniol (1995) menunjukkan bahwa pada lengan panjang
kromosom 2D tanaman gandum terdapat faktor genetik yang mencegah
akumulasi Al pada meristem apikal akar.
bahwa
toleransi Al
Delhaize et al. (1993) menyatakan
pada gandum dikendalikan oleh gen dominan Alt yang
mengendalikan ekspresi malat ketika tanaman tersebut mengalami cekaman Al.
Hal yang sama juga dilaporkan Sasaki et al. (2004), bahwa gen ALMT1 yang
terlibat dalam eksudasi malat dapat meningkatkan toleransi terhadap Al pada sel
tembakau. Eksudasi berbagai asam organik seperti malat, sitrat, dan oksalat
terjadi pada tanaman yang diberi cekaman Al (Delhaize et al. 1993; Kidd et al.
2001; Kochian et al. 2005). Pembungkaman gen penyandi H+-ATPase membran
plasma
melalui
RNAi
pada
tanaman
M.
malabathricum
L.
transgenik
menunjukkan kepekaan yang lebih tinggi terhadap cekaman 3.2 mM Al dan pH 4
dibandingkan tanaman non transgenik.
Hal ini menunjukkan bahwa gen ini
berperan dalam toleransi M.malabathricum L. terhadap cekaman Al (Muzuni
2011).
Delhaize et al. (2004) melaporkan bahwa ekspresi berlebih Al-inducible
malate transporter (ALMT) meningkatkan toleransi Al pada tanaman Hordeum
vulgare. Overekspresi SbMATE yang menyandi putative citrate transporter dapat
meningkatkan toleransi terhadap cekaman Al pada Arabidopsis dan gandum
(Magalhaes et al. 2007; Liu et al. 2009).
Gen ALS3 yang menyandi ABC
transporter- like protein juga diperlukan dalam toleransi Al pada Arabidopsis dan
dapat berperan untuk mendistribusikan akumulasi Al dari jaringan yang sensitif
untuk melindungi pertumbuhan akar dari keracunan Al (Larsen et al. 2005).
Cekaman Al dapat menyebabkan pembentukan cekaman oksidatif.
Salah satu mekanisme keracunan Al adalah terjadinya peroksidasi lipid yang
merupakan cekaman oksidatif (Gutteridge et al. 1985; Kochian et al. 2004).
Aluminium dapat menginduksi kompleks gen-gen yang terlibat dalam cekaman
13
oksidatif, sehingga meningkatkan aktivitas beberapa enzim cekaman oksidatif
(Ricards et al. 1998; Cakmak & Horst 1991; Foyer & Noctor 2005).
Richards et al. (1998) telah berhasil mengisolasi gen-gen cekaman
oksidatif dari Arabidopsis thaliana yang ekspresinya terinduksi oleh cekaman Al,
yaitu gen-gen penyandi metallothionein-like protein, glutathione-s-transferase
(GST), peroksidase, dan superoxide dismutase (SOD).
Hal yang sama juga
dilakukan oleh Ezaki et al. (1995) yang berhasil mengisolasi gen-gen tembakau
yang menyandikan GST, Peroxidase (PER), dan GDP Dissociation Proteinase
Inhibitors (GDI) yang diinduksi oleh cekaman Al. Pada tanaman kedelai, Anwar
et al. (2000) berhasil mengklon fragmen cDNA dari gen-gen kedelai yang toleran
terhadap cekaman Al, antara lain gmali1 (Glycine max aluminum induced),
gmali14, gmali49, dan gmali50, masing-masing menyandikan H+-ATPase
membran plasma, protein histon H3, NADH-dehidrogenase dan Auxin-induced
protein. Semua gen tersebut di atas terekspresi untuk mempertahankan diri dari
cekaman lingkungan.
Pada Melastoma affine (sinonim M. malabathricum),
Suharsono et al. (2009) telah berhasil mengisolasi gen metallothionein type 2
(MaMt2) yang ekspresinya diinduksi oleh cekaman Al (Trisnaningrum 2009).
Superoxide Dismutase (SOD)
Superoxide dismutase (SOD) termasuk kelompok metalloenzim yang
mampu menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis dismutase radikal
superoksida menjadi molekul O2 dan H2O2 (Bowler et al. 1992; Fridovich 1995;
Tseng et al. 2008). Pada kondisi normal, radikal superoksida yang merupakan
derivat reactive oxygen species (ROS) terdapat di dalam sel tanaman sebagai
produk
sampingan
menyebabkan
protein,
dari
proses
metabolisme.
Akumulasi
ROS
dapat
kerusakan berbagai fungsi seluler seperti kerusakan DNA,
dan peroksidasi lipid, sehingga enzim ini sangat penting sebagai
antioksidan untuk pertahanan pada hampir semua sel yang terpapar oksigen
(Bowler et al. 1992; Fridovich 1995; Dong et al. 2009). Akumulasi ROS dapat
disebabkan oleh berbagai cekaman lingkungan (Allen et al. 1997: Foyer & Noctor
2005).
SOD merupakan enzim antioksidan yang berada pada garis depan
sebagai pertahanan terhadap radikal superoksida (Fridovich 1995). Ada tiga tipe
SOD sesuai dengan
logam yang berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif
14
enzimnya, yaitu copper-zinc (CuZn-SOD), besi (Fe-SOD), dan mangan (MnSOD). CuZn-SOD ditemukan di sitosol, kloroplas, dan peroksisom, Mn-SOD di
mitokhondria dan Fe-SOD di kloroplas (Bannister et al. 1987; Bowler et al. 1992;
Bueno et al. 1995; Kliebenstein et al. 1998; Dong et al. 2009). Pemberian logam
Mn, Cu, Zn, atau Fe ke dalam media kultur dapat meningkatkan ekspresi dan
aktivitas SOD.
Shi et al. (2005) melaporkan bahwa aktivitas SOD, terutama
aktivitas Mn-SOD meningkat seiring dengan peningkatan Mn pada tanaman
mentimun, sedangkan menurut Fernando and Miguel (2000) aktivitas SOD tidak
dipengaruhi oleh konsentrasi Mn pada padi.
Pada Arabidopsis thaliana yang
ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi Cu2+ yang tinggi mampu
meningkatkan aktivitas total SOD (Maria et al. 2007).
Aktivitas SOD telah dilaporkan meningkat dengan adanya cekaman
abiotik, seperti cahaya tinggi (Allen et al. 1997) sulfur dioksida (Tseng et al. 2007;
Tseng et al. 2008), ozon (Pitcher and Zilinskas 1996), kekeringan (Mittler &
Zilinskas 1994; Fu & Huang 2001; Bian & Jian; 2009), suhu rendah (HernandezNistal et al. 2002; Lee & Lee 2000; Gao et al. 2009), garam ( Sreenivasulu et al.
2000), dan aluminium (Basu et al. 2001; Darko et al. 2004; Du et al. 2010; Meriga
et al. 2010).
Tang et al. (2006) dan Lim et al (2007) melaporkan ekspresi gen
CuZnSOD yang meningkat terhadap berbagai cekaman lingkungan pada
tanaman kentang transgenik.
Basu et al. (2001) melaporkan bahwa Brassica napus yang tahan Al
mengekspresikan gen SOD secara berlebih.
Aktivitas enzim SOD juga
meningkat dengan cekaman Al pada kedelai ( Cakmak & Horst 1991; Du et al.
2010), gandum (Darko et al. 2004), dan padi (Meriga et al. 2010). Menurut Du et
al. (2010) perlakuan Al meningkatkan aktivitas SOD pada akar dan kalus dari 2
genotipe kedelai (Al-tolerant PI 416937 (PI) dan Al-sensitive Young). Aktivitas
SOD pada kedua genotipe tersebut berbeda dalam merespon cekaman Al dan
bergantung pada konsentrasi Al dan lama perlakuan. Aktivitas SOD pada akar
yang tahan (PI) lebih tinggi dibandingkan akar yang rentan (Young) pada lama
perlakuan cekaman Al 36 atau 48 jam. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan
aktivitas enzim antioksidan merupakan salah satu mekanisme toleransi Al. Pada
akar barley, SOD juga terlibat dalam mekanisme detoksifikasi Al pada dosis
sangat beracun dan perlakuan Al yg panjang (Simonovicova et al. 2004).
15
Peixoto et al. (1999) melaporkan bahwa aktivitas SOD pada akar gandum
yang resisten Al lebih tinggi dibandingkan gandum yang tahan Al pada kondisi
tanpa cekaman Al, namun dengan perlakuan cekaman Al, aktivitas SOD
meningkat lebih tinggi pada kultivar gandum yang tahan dibandingkan yang
resisten. Tingginya peningkatan aktivitas SOD pada gandum yang tahan dengan
perlakuan Al kemungkinan adalah hasil dari peningkatan konsentrasi H2O2.
Salah satu mekanisme toksisitas Al adalah menyebabkan peroksidasi lipid
(Gutteridge et al. 1985; Cakmak & Horst 1991).
Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987), tomat
(Perl-Treves et al. 1988), sawi (Liu et al. 1998), dan Nicotiana plumbaginifolia
(Alscher et al. 2002).
Pada Arabidopsis thaliana, telah diisolasi tiga gen
CuZnSOD, yaitu CSD1, CSD2, dan CSD3.
CSD1 dan CSD2 terekspresi pada
akar, daun, dan batang, dan masing-masing target proteinnya di sitosol dan
kloroplas.
Sementara target potein CSD3
karboksilnya mengandung tripeptida
di peroksisom karena ujung
Ala-Lys-Leu yang merupakan targeting
signal peroksisom (Kliebenstein et al. 1998).
Pengklonan DNA dengan Rekombinasi Situs Spesifik
Teknologi pengklonan DNA sangat penting dalam bidang biologi,
terutama genetika dan biologi molekular. Pengklonan DNA dibutuhkan untuk
analisis fungsional gen dan ekspresi gen.
Saat ini telah berkembang teknik
pengklonan DNA dengan menggunakan prinsip rekombinasi situs spesifik yang
lebih efisien dibandingkan dengan teknik pengklonan yang menggunakan enzim
restriksi (Hartley et al. 2000).
Pengklonan sistem Gateway merupakan salah satu metode pengklonan
dengan rekombinasi situs spesifik secara in vitro yang ditemukan dan
dikomersialisasikan oleh Invitrogen sejak akhir 1990-an.
Metode Gateway
cloning adalah metode biologi molekuler untuk mentransfer fragmen DNA antar
plasmid dengan efisien menggunakan situs rekombinasi, yaitu situs " gateway
att", dan dua enzim campuran, yang disebut LR Clonase dan BP Clonase.
Gateway cloning secara efektif telah menggantikan enzim restriksi dan ligase.
Sistem ini memerlukan awal penyisipan fragmen DNA ke plasmid dengan dua
sekuens rekombinasi pengapit yang disebut "att L1" dan "att L2", untuk
membentuk Gateway clone entry (Magnani et al. 2006; Karimi et al. 2007;
16
Nakagawa et al. 2007). Metode ini sangat efisien, karena keberhasilannya lebih
dari 90% (Patton 2000; Freuler et al. 2008).
Secara umum, teknologi Gateway melibatkan proses dua-langkah. Gen
target pertama diklon ke entry vector melalui suatu reaksi yang disebut reaksi BP
dengan enzim BP clonase, dan menghasilkan entry clone. Ketika membuat entry
clone, maka perlu untuk mengubah urutan ujung gen target agar kompatibel
dengan situs rekombinasi Gateway (situs pengenalan rekombinase), namun
tidak melibatkan enzim restriksi selama proses pengklonan secara keseluruhan.
Selanjutnya, gen target yang ada di dalam entry vector (entry clone) disubklon ke
destination vector (plasmid biner) melalui reaksi LR menggunakan enzim LR
clonase. Jadi, hanya dengan sekali membuat entry clone, maka entry clone
dapat digunakan ke berbagai plasmid biner sesuai dengan tujuan hanya dengan
reaksi LR, dan ini merupakan salah satu keuntungan dari teknologi Gateway
(Invitrogen Co. 2003 ; Katzen 2007; Xu & Li 2008).
Salah satu entry vector yang tersedia saat ini adalah pENTR™/D-TOPO®
kloning kit (Invitrogen), dengan menambahkan 4 nukleotida (CACC) pada primer
5'-PCR (forward) untuk amplifikasi gen, produk PCR yang berujung rata sudah
terarah untuk diklon ke vektor TOPO untuk menghasilkan clone entry (Gambar
2). Dengan demikian, teknologi TOPO dengan mudah menghasilkan klon entry
(Xu and Li 2008). DNA sasaran yang yang telah tersisipi di klon entry akan lebih
mudah masuk ke vektor biner dengan hanya menggunakan reaksi LR (Hartley et
al. 2000; Patton 2000).
Gambar 2. Vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen 2006).
17
Tekhnologi gateway ini telah diaplikasikan untuk konstruksi vektor dalam
analisis ekpresi berlebih (overexpression)
(Karimi et al 2002; Curtis &
Grossniklaus 2003; Earley et al. 2006), antisense (Karimi et al. 2002), RNAi
(Muzuni 2011), analisis promoter (Curtis & Grossniklaus 2003;
Earley et al.
2006; Karimi et al. 2007), analisis ekspresi gen induksi (inducible gene) (Joube`s
et al. 2004; Brand et al. 2006; de Schutter et al. 2007), dan analisis ekspresi
beberapa gen (multisite) (Karimi et al. 2005).
RNA interference (RNAi)
RNA interference (RNAi) merupakan potongan kecil RNA yang dapat
menginduksi penghancuran mRNA tertentu sebelum dapat menyandi protein di
dalam sitoplasma.
Prinsip dasarnya adalah masuknya double-stranded RNA
(dsRNA) ke dalam sitoplasma akan membungkam ekspresi suatu gen di tingkat
post-transkripsi (Fire et al. 1998; Kalantidis et al. 2008). Pada awalnya, proses
gangguan (interference) menggunakan RNA tidak berhasil, karena para peneliti
mengunakan dsRNA dengan panjang lebih dari 30 nukleotida.
Hal ini
menyebabkan supresi dari gen yang tidak seharusnya terbungkam (non-specific
Pada perkembangannya,
suppression gene).
penggunaan dsRNA dengan
nukleotida yang lebih pendek, 21-23 nukleotida, berhasil membungkam ekspresi
gen yang dikehendaki pada sel mamalia, yang dikenal dengan small interfering
RNA (siRNA) (Fire et al. 1998; Waterhouse et al. 2001; Hannon 2002; Pickford &
Cogoni 2003)
Penghambatan
ekspresi
gen
dengan
memasukkan
dsRNA
ini,
sebenarnya ditemukan secara tidak sengaja oleh Napoli et al (1990) ketika
bermaksud meningkatkan ekspresi warna bunga Petunia.
Namun hasil yang
mereka peroleh dengan memasukkan dsRNA yang komplementer dengan gen
yang berperan dalam biosintesia warna bunga tidak seperti yang mereka
harapkan. Ekspresi warna bunga yang diharapkan adalah menjadi ungu tua
sebagaimana umumnya warna bunga Petunia, namun mereka mendapatkan
sebaliknya,
yaitu
bunga
Petunia
yang
berwarna
Penemuan ini merangsang berbagai kelompok peneliti
ungu
keputih-putihan
mengikutinya dengan
tujuan untuk mempelajari efek tertekannya (supp