Isolation and Cloning of P5CS (pyrrolin-5-carboxylate synthetase) Gene from Rubber Plant

ISOLASI DAN KLONING GEN P5CS
(PIROLIN-5-KARBOKSILAT SINTETASE)
DARI TANAMAN KARET

YOSHITA KHURUN AIN

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
i

ABSTRAK
YOSHITA KHURUN AIN. Isolasi dan Kloning Gen P5CS (pirolin-5-karboksilat
sintetase) dari Tanaman Karet. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan
TETTY CHAIDAMSARI.
Karet (Hevea brasiliensis) merupakan salah satu tanaman perkebunan yang
memegang peranan penting bagi Indonesia. Teknik molekuler dengan
memanfaatkan gen P5CS sebagai penanda molekuler merupakan metode seleksi
yang tepat dan akurat untuk menghasilkan klon karet yang sesuai dibudidayakan

di lahan marjinal. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengklon gen P5CS,
yang merupakan salah satu gen penanda sifat resisten kekeringan. Tahapan
penelitian yang dilaksanakan yaitu isolasi DNA genom tanaman karet, isolasi gen
P5CS dari tanaman karet dengan primer P5CS CS forward-P5CS CS reverse dan
P5CS start-P5CS stop, kloning ke dalam plasmid pGEM-T easy, isolasi DNA
plasmid, sekuensing, dan analisis hasil sekuensing. Isolasi DNA genom dari daun
tanaman karet berhasil dilakukan. Isolasi gen P5CS tanaman karet dengan primer
P5CS CS forward-P5CS CS reverse belum berhasil dilakukan, sedangkan isolasi
gen dengan primer P5CS start-P5CS stop berhasil dilakukan dengan
menghasilkan amplikon berukuran 2250 pb. Konfirmasi hasil kloning gen P5CS
melalui teknik PCR dengan primer M13 forward-M13 reverse menghasilkan
DNA berukuran 2450 pb. Isolasi DNA plasmid menghasilkan DNA berukuran
5450 pb. Analisis hasil sekuensing dengan BLASTX menunjukkan bahwa
amplikon yang telah diisolasi dan dikloning bukan gen P5CS, namun masih
mempunyai homologi yang tinggi (68%) dengan gen penanda kekeringan.

ii

ABSTRACT
YOSHITA KHURUN AIN. Isolation and Cloning of P5CS (pyrrolin-5carboxylate synthetase) Gene from Rubber Plant. Under direction of LAKSMI

AMBARSARI and TETTY CHAIDAMSARI.
Rubber plant (Hevea brasiliensis) is one of the plantations that has
important role in Indonesia. Molecular technique by using P5CS gene as
molecular marker is selection method that faster and more accurate for producing
rubber plant that compatible for marginal land. The aim of this research is to
isolate and clone P5CS gene as a marker gene of drought resistant. Steps of this
research are isolation of rubber plant DNA genome, isolation of P5CS gene from
rubber plant by P5CS CS forward-P5CS CS reverse and P5CS start-P5CS stop
primers, cloning into pGEM-T easy plasmid, isolation of plasmid DNA,
sequencing, and analyzing DNA sequence. Isolation of rubber plant DNA genome
is successfully proceed. Isolation of P5CS gene by using P5CS CS forward-P5CS
CS reverse primer is not been successfully proceed, while isolation gene by using
P5CS start-P5CS stop primer produce amplicon that has 2250 bp length. The
confirmation of P5CS gene cloning by PCR technique using M13 forward-M13
reverse primer produce DNA that has 2450 bp length. The length of plasmid DNA
that has been isolated is 5450 bp. The result of DNA sequence analysis by
BLASTX shows that amplicon which has been isolated is not P5CS gene, but it
has high homology (68%) with drought resistant gene.

iii

ISOLASI DAN KLONING GEN P5CS
(PIROLIN-5-KARBOKSILAT SINTETASE)
DARI TANAMAN KARET

YOSHITA KHURUN AIN

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
iv

Judul Skripsi : Isolasi dan Kloning Gen P5CS (pirolin-5-karboksilat sintetase)

dari Tanaman Karet
Nama
: Yoshita Khurun Ain
NRP
: G84070080

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si
Anggota

Dr. Laksmi Ambarsari, M.S
Ketua

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal lulus:

v

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT karena atas limpahan
hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya tulis yang berjudul “Isolasi dan
Kloning Gen P5CS dari Tanaman Karet”. Shalawat serta salam semoga senantiasa
tercurah kepada Rasulullah SAW. Karya tulis ini disusun berdasarkan kegiatan
penelitian yang dilaksanakan dari bulan Januari sampai Mei 2011, di
Laboratorium Rekayasa Genetika dan Biologi Molekuler, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Jalan Taman Kencana No.1 Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Laksmi Ambarsari, M.S dan
Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si atas bimbingan dan motivasi yang diberikan selama
penyusunan karya tulis ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada
teknisi yang sudah menularkan pengalaman berharganya, Nina Yuniar, Herti
Sugiarti, Aan Sriyani, dan Dini Nopayanti. Penulis menyampaikan terima kasih
kepada kedua orang tua, ketiga kakak: Hendy, Robby, dan Oki, serta keluarga
yang tak pernah lelah mendukung, menasehati, memberikan semangat dan
motivasi, serta mendoakan penulis sehingga dapat menyelesaikan karya tulis ini

dengan baik. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada A. Heriyanto,
Rezky, Agnes, dan Sylvania atas semangat yang ditularkan; Endah, Dewi, Riska,
Ekky, Ismi, Dhaniar, Tiara, teman-teman Biokimia Angkatan 44, teman kosan:
Maulina, Syifa, Dina, Rizqi, Astry, Ashna, Wika, dan Fitri yang rela berbagi suka
dan duka, serta semua pihak yang mendukung penyusunan karya tulis ini.
Penulis berharap semoga karya tulis ini bermanfaat untuk kemajuan
pendidikan, pengetahuan, dan penelitian.

Bogor, Juli 2011

Yoshita Khurun Ain

vi

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Nganjuk, Jawa Timur, 02 Juni 1988 dari pasangan
Syamsudin dan Srikanah. Bungsu dari empat bersaudara ini menempuh
pendidikan formal di SMAN 1 Kertosono (2004-2007), Nganjuk, Jawa Timur.
Penulis mengikuti program Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada
tahun 2007 untuk melanjutkan pendidikannya di Departemen Biokimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Organisasi mahasiswa yang pernah diikuti oleh penulis yaitu Himpunan
Profesi Departemen Biokimia, Community Research and Education of
Biochemistry Student (CREBs) pada tahun 2008-2009 sebagai staf divisi Biologi
Molekuler. Penulis juga aktif dalam organisasi mahasiswa daerah, Ikatan
Mahasiswa Jawa Timur (IMAJATIM) pada tahun 2008-2009. Selain aktif
berorganisasi, penulis juga tergabung pada beberapa kepanitian di Institut
Pertanian Bogor, di antaranya Seminar Keselamatan dan Kesehatan Kerja (2009),
Seminar Kanker (2009), IPB Art Contest 2009, dan Lomba Karya Ilmiah Populer
Nasional (2009).
Penulis menjadi staf pengajar Kimia di bimbingan belajar Student
Improvement Programme (STIMP) pada tahun 2009-2011. Penulis juga menjadi
pengajar privat pelajaran matematika SMA (2008-2010). Penulis menjadi asisten
praktikum mata kuliah Pengantar Penelitian Biokimia pada tahun 2011.
Ketertarikan penulis terhadap karya tulis mengantarkan penulis untuk
menorehkan prestasi selama menempuh pendidikan di Institut Pertanian Bogor.
Prestasi-prestasi yang diperoleh penulis di antaranya Peraih Hibah Dikti Program
Kreativitas Mahasiswa Bidang Gagasan Tertulis, Juara II Kompetisi Karya Tulis
Mahasiswa Nasional INDEX 2010, dan Juara II Lomba Karya Tulis Ilmiah Al
Qur’an Nasional 2010.

vii

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix
DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... x
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA
Karet (Hevea brasiliensis) ............................................................................. 1
Respon Tanaman terhadap Cekaman Kekeringan ......................................... 2
Plasmid sebagai Vektor Kloning ................................................................... 3
Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................... 5
BAHAN DAN METODE
Bahan ............................................................................................................. 5
Metode ........................................................................................................... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Genom dari Daun Tanaman Karet .................................. 8
Amplikon Gen P5CS Tanaman Karet ........................................................... 9

Hasil Ekstraksi dan Purifikasi Gen P5CS .................................................... 10
Koloni Rekombinan Hasil Kloning ............................................................. 10
Hasil PCR Koloni ........................................................................................ 11
DNA plasmid Rekombinan ......................................................................... 11
Hasil Urutan Basa Gen Hasil Kloning......................................................... 12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ...................................................................................................... 13
Saran ............................................................................................................ 13
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 13
LAMPIRAN .......................................................................................................... 16

viii

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Tanaman Karet ................................................................................................... 2
2 Tahapan kloning................................................................................................. 4
3 Elektroforegram DNA hasil isolasi (Castillo 1994) ........................................... 9
4 Elektroforegram hasil PCR optimasi suhu annealing ........................................ 9
5 Elektroforegram hasil PCR suhu annealing 40ºC............................................ 10

6 Konfirmasi ekstraksi dan purifikasi fragmen gen P5CS .................................. 10
7 Koloni biru putih hasil kloning fragmen gen P5CS ......................................... 11
8 Elektroforegram PCR koloni ........................................................................... 11
9 Elektroforegram isolasi DNA plasmid............................................................. 12
10 Urutan basa DNA yang disekuen dengan primer M13 forward ...................... 12
11 Urutan basa DNA yang disekuen dengan primer M13 reverse ....................... 12

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kuantitas dan Kemurnian DNA Hasil Isolasi ..................................................... 8
2 Primer spesifik fragmen gen P5CS ................................................................... 10
3 Hasil analisis BLASTX fragmen gen P5CS ..................................................... 12

ix

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Diagram alir penelitian...................................................................................... 17
2 Komposisi larutan yang digunakan dalam penelitian ....................................... 18
3 Pembuatan gel agarosa 0.8 % dan 1.0 % .......................................................... 19

4 Pembuatan media .............................................................................................. 20
5 Peta restriksi plasmid pGEM-T easy ................................................................ 21
6 Elektroferogram fragmen gen P5CS ................................................................. 22
7 Hasil sekuen DNA hasil kloning ...................................................................... 24
8 Hasil analisis BLASTX..................................................................................... 25

x

1

PENDAHULUAN
Karet merupakan salah satu komoditi
perkebunan penting bagi Indonesia, baik
sebagai sumber pendapatan, kesempatan kerja
dan devisa, pendorong pertumbuhan ekonomi,
serta pelestarian lingkungan dan sumberdaya
hayati. Hasil devisa yang diperoleh dari karet
cukup besar, mencapai US$ 4,868.75 juta
pada tahun 2007 (BPS 2009).
Produktivitas karet alam Indonesia
mengalami peningkatan sebesar 5.9% dari
tahun 1998-2007 (BPS 2009). Peningkatan
produktivitas karet harus terus dilakukan
karena permintaan produk karet sebagai bahan
baku industri juga mengalami peningkatan.
Salah satu upaya untuk meningkatkan
produksi karet alam yaitu memperluas areal
perkebunan karet. Namun, usaha perluasan
areal perkebunan karet dihadapkan pada satu
permasalahan, yaitu terbatasnya lahan yang
sesuai untuk budidaya karet. Permasalahan ini
dapat diatasi dengan cara memberdayakan
lahan-lahan marjinal yang ada di Indonesia.
Lahan marjinal dapat diartikan sebagai lahan
yang memiliki mutu rendah karena memiliki
beberapa faktor pembatas jika digunakan
untuk suatu keperluan tertentu (Yuwono
2009). Salah satu lahan marjinal yang dapat
dimanfaatkan yaitu lahan kering. Luas lahan
kering yang ada di Indonesia mencapai 140
juta ha (Hidayat & Mulyani 2002), yang
berpotensi digunakan untuk perluasan wilayah
perkebunan karet.
Faktor pembatas pengusahaan lahan
kering berkaitan dengan sifat fisik dan kimia
tanah yang kurang baik, solum dangkal, curah
hujan rendah, dan distribusi hujan yang tidak
merata. Lahan kering mempunyai struktur
tanah padat dan lapisan tanah atas (top soil)
serta lapisan bawah (sub soil) memiliki
kelembaban yang rendah. Sirkulasi udara pada
lahan kering agak terhambat dan kemampuan
menyimpan air relatif rendah (Rukmana
1995).
Adanya faktor pembatas di lahan kering
mengharuskan pembudidaya karet melakukan
seleksi terhadap klon-klon karet yang tahan
kekeringan. Waktu yang dibutuhkan untuk
melakukan seleksi relatif lama, antara 15-25
tahun, oleh karena itu diperlukan suatu
metode seleksi yang lebih cepat dan akurat.
Proses seleksi terhadap cekaman kekeringan
dapat dilakukan dengan teknik molekuler dan
dipadukan
dengan
data
morfologi.
Penggabungan teknik ini biasa dikenal dengan
marker assisted selection (MAS). Keuntungan
penggunaan marka molekuler yaitu stabil,

tidak dipengaruhi oleh lingkungan, dan relatif
mudah (Meksem & Kahl 2005).
Toleransi tanaman terhadap cekaman
kekeringan secara fisiologis berkaitan dengan
perubahan aktivitas metabolisme yang antara
lain ditunjukkan oleh perubahan akumulasi
prolina pada daun (Bates et al. 1973). Prolina
diduga terlibat dalam osmoregulasi, menjaga
kelarutan protein, kestabilan membran
fosfolipid dan juga sebagai sumber cadangan
karbon, nitrogen dan energi (Walton et al.
1998).
Marka molekuler yang diperlukan untuk
seleksi tanaman karet resisten kekeringan
dapat diperoleh dengan cara mengisolasi gen
P5CS (pirolin-5-karboksilat sintetase). Gen
P5CS adalah gen yang menyandi enzim Δ1pirolin-5-karboksilat sintetase. Enzim ini
berperan pada proses konversi glutamat
menjadi
Δ1-pirolin-5-karboksilat
yang
kemudian direduksi menjadi prolina. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa gen P5CS
merupakan penyandi enzim yang menjadi
faktor pembatas dalam biosintesis prolina
pada tanaman tingkat tinggi (Hu et al. 1992).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi gen
P5CS, yang merupakan kandidat gen penanda
sifat resisten kekeringan sehingga dapat
digunakan sebagai dasar untuk mendapatkan
marka molekuler. Hipotesis penelitian ini
yaitu gen P5CS dapat diisolasi dari tanaman
karet dengan menggunakan primer spesifik.
Gen yang dihasilkan dapat digunakan sebagai
kandidat marka molekuler yang dapat
dimanfaatkan untuk melakukan seleksi klon
karet yang tahan kekeringan dengan waktu
yang relatif singkat.

TINJAUAN PUSTAKA
Karet (Hevea brasiliensis)
Karet dikenal di Indonesia sejak zaman
penjajahan Belanda dan hanya digunakan
sebagai tanaman koleksi di Kebun Raya
Bogor. Karet mulai diusahakan sebagai
tanaman perkebunan pada tahun 1864. Usaha
perkebunan karet pertama dilakukan di daerah
Pamanukan dan Ciasem, Jawa Barat, dengan
karet rambung (Ficus elastica) sebagai
komoditasnya.
Jenis
Hevea
(Hevea
brasiliensis) mulai digunakan sebagai
tanaman perkebunan pada tahun 1902. Tinggi
pohon karet mencapai 15-25 meter, batang
tanaman tumbuh lurus dan punya percabangan
yang tinggi di bagian atas (Tim Penulis PS
2008), seperti terlihat pada Gambar 1. Berikut
ini merupakan taksonomi tanaman karet:

2

Divisi
Subdivisi
Kelas
Ordo
Famili
Genus
Spesies

: Spermatophyta
: Angiospermae
: Dicotyledonae
: Euphorbiales
: Euphorbiaceae
: Hevea
: Hevea brasiliensis

Gambar 1 Tanaman karet.
Daun karet berwarna hijau dan terdiri atas
tangkai daun utama dan tangkai anak daun.
Tangkai daun utama mempunyai panjang 3-20
cm, sedangkan tangkai anak daun mempunyai
panjang 3-10 cm. Daun karet mempunyai tiga
anak daun pada setiap helainya. Bunga karet
terdiri atas bunga jantan dan bunga betina
yang terdapat dalam malai payung tambahan.
Pangkal tenda bunga berbentuk lonceng
dengan panjang tenda antara 4 dan 8 mm
(Webster & Baulkwill 1989).
Pertumbuhan karet dipengaruhi oleh
lingkungan
yang
digunakan
untuk
membudidayakan tanaman ini. Karet sangat
baik diusahakan di zona antara 15° LS dan
15° LU. Curah hujan optimum agar karet
mempunyai produktivitas yang tinggi yaitu
2500-4000 mm per tahun dengan 100-150 hari
hujan. Dataran rendah yang mempuyai
ketinggian sampai 200 m di atas permukaan
laut dengan suhu 25-35°C merupakan daerah
yang cocok untuk budi daya karet
(Setyamidjaja 1993).
Tanaman karet mempunyai struktur
anatomi seperti tanaman dikotil yang lain.
Secara umum jaringan kulit karet tersusun
oleh sel-sel parenkimatis yang di antaranya
terdapat jaringan pengangkut xilem dan floem
yang dipisahkan oleh kambium. Batang dan
kulit merupakan wadah dari produksi tanaman
karet, tempat segala proses asimilasi yang
terjadi di daun ditransfer ke dalam tubuh
pohon
untuk
memproduksi
lateks.
Terbentuknya lateks di dalam batang
berhubungan dengan besarnya pertumbuhan
pohon (Indraty 1987). Penampang melintang
batang pohon karet memperlihatkan bagian
tengah sampai lapisan terluar terdiri atas

bagian kayu, kambium, kulit lunak, kulit
keras, dan akhirnya lapisan gabus. Kulit lunak
mempunyai suatu deretan pembuluh tapis
yang vertikal yang mengandung karbohidrat
hasil fotosintesis (Ginting 1983).
Jumlah pembuluh lateks akan semakin
banyak pada daerah yang mendekati
kambium. Sistem pembuluh lateks merupakan
suatu bejana berbentuk pipa-pipa kapiler
(anastomisis), yang saling berhubungan di
dalam keseluruhan pohon atau tubuh tanaman
(Setyamidjaja 1983). Jumlah dan susunan
pembuluh lateks bervariasi di antara klon,
bahkan dari pohon ke pohon. Hal ini
dipengaruhi oleh umur tanaman, posisi kulit,
tebal kulit, jenis pohon dan pertumbuhan
batang tanaman (Lukman 1984).
Karet sebagai tanaman penghasil getah
karet terus dikembangkan untuk menghasilkan
klon-klon unggul. Klon adalah tanaman yang
diperoleh dari hasil perbanyakan secara
vegetatif atau aseksual (Tim Penulis PS
2008). Kelebihan tanaman klon yaitu lebih
seragam, umur produksi lebih cepat, dan
jumlah lateks yang dihasilkan lebih banyak.
Tanaman klon juga memiliki kekurangan, di
antaranya daya tahan klon terhadap suatu
penyakit berbeda-beda, bergantung pada jenis
klon. Pertumbuhan tanaman klon sangat
dipengaruhi oleh lingkungan, sehingga klon
tertentu hanya dapat ditanam pada tempat
yang tertentu juga (Tim Penulis PS 2008).
Respon Tanaman terhadap Cekaman
Kekeringan
Cekaman kekeringan merupakan keadaan
lingkungan yang menyebabkan kekurangan
air bagi tanaman. Peristiwa ini dapat terjadi
akibat kekurangan air di daerah perakaran
atau akibat laju evaporasi lebih tinggi
dibandingkan dengan laju absorbsi air (Sinaga
2007).
Cekaman
kekeringan
dapat
mengakibatkan penurunan yang nyata pada
pertumbuhan dan karakter vegetatif tanaman
yang berada dalam masa pertumbuhan aktif.
Selain itu, cekaman kekeringan juga dapat
berakibat pada penurunan daya serap tanaman
terhadap unsur hara, yaitu nitrogen, fosfor,
kalium,
kalsium,
dan
magnesium
(Widyatmoko 2005), penurunan protein pada
daun (Mathius et al. 2004) dan bobot kering
total tanaman (Hamim et al. 1996). Secara
fisiologis, tanaman yang tumbuh pada kondisi
cekaman kekeringan akan mengurangi jumlah
stomata sehingga laju fotosintesis mengalami
penurunan (Sasli 2004).
Respon tanaman terhadap kekeringan
dimulai dengan diterimanya signal-signal stres

3

yang mampu menginisiasi siklus-siklus
transduksi dalam tanaman yang menyebabkan
berbagai perubahan fisiologi. Pada saat
kekeringan,
akan
terjadi
perubahan
metabolisme dalam akar tanaman yang
menghasilkan signal-signal biokimia pada
tunas. Salah satu mekanisme alami yang
melindungi sel-sel tanaman dari ancaman
kekeringan, salinitas, suhu rendah dan faktor
stres lainnya adalah akumulasi asam amino
dan amida, serta gula yang berperan dalam
meningkatkan tekanan osmotik sel (Bohnert et
al. 1995). Beberapa penelitian menunjukkan
ketahanan terhadap cekaman kekeringan
berhubungan dengan peningkatan kandungan
prolina yang berperan penting dalam menjaga
pertumbuhan akar pada potensial osmotik air
yang rendah.
Prolina merupakan salah satu senyawa
osmotik yang disintesis dan diakumulasi pada
berbagai jaringan tanaman yang dicekam
kekeringan, terutama pada bagian daun (Yang
& Kao 1999). Prolina diduga terlibat dalam
osmoregulasi, menjaga kelarutan protein,
kestabilan membran fosfolipid, dan juga
sebagai sumber cadangan karbon, nitrogen
dan energi (Walton et al. 1998). Prolina juga
berperan menetralisir pengaruh toksik NH,
yang merupakan hasil hidrolisis protein
sebagai sumber energi dan sumber N bagi
pemulihan proses tanaman pasca cekaman
kekeringan (Levitt 1980). Delauney dan
Verna (1993) menyatakan bahwa ditemukan
indikasi korelasi positif antara akumulasi
prolina dan adaptasi tanaman terhadap
cekaman kekeringan dan garam positif.
Sejumlah peneliti menyatakan bahwa prolina
dapat dipertimbangkan
sebagai indikator
seleksi menyangkut adaptasi tanaman
terhadap cekaman lingkungan, terutama
cekaman kekeringan dan salinitas (Kuznetsov
& Shevyakova 1997; Yoshiba et al. 1997).
Salah satu gen yang berperan dalam stres
kekeringan
yaitu
pirolin-5-karboksilat
sintetase (P5CS). Ekspresi berlebihan gen Δ1pirolin-5-karboksilat sintetase (P5CS) dari
Vigna aconitifolia meningkatkan ketahanan
terhadap stres osmotik pada tembakau (Kavi
et al. 1995; Hong et al. 2000 dalam Jaiwal &
Singh 2003). Zhu et al. (1998) memasukkan
cDNA
Δ1-pirolin-5-karboksilat
sintetase
(P5CS) dari mothbean ke dalam sel padi
dengan menggunakan metode biolistik. Padi
yang dihasilkan menunjukkan adanya
peningkatan produk gen P5CS, yaitu enzim
P5CS dan akumulasi prolina.
Prolina dianggap sebagai senyawa yang
menyebabkan tanaman tahan terhadap

kekeringan. Prolina akan terakumulasi di
dalam jaringan tanaman apabila tanaman
tersebut mengalami cekaman kekeringan atau
pada keadaan cekaman salinitas tinggi.
Menurut Widyasari & Sugiyarta (1997),
dalam keadaan normal prolina yang
dihasilkan bersifat umpan balik dan karena
kehadiran air, prolina akan dioksidasi kembali
menjadi asam glutamat. Konsentrasi prolina
akan selalu rendah dalam kondisi normal.
Pada kondisi kekeringan oksidasi prolina akan
dihambat sehingga produksi prolina akan
bertambah dan dengan adanya gen P5CS
produksi prolina semakin meningkat karena
enzim P5CS memicu katalisis glutamat
menjadi prolina. Akumulasi prolina dapat
menjadi indikator tanaman yang toleran
terhadap kekeringan dan salinitas tinggi.
Plasmid sebagai Vektor Kloning
Kloning bertujuan memperbanyak dan
mengisolasi DNA yang disisipkan pada DNA
vektor. DNA disambungkan pada DNA
plasmid
dan
molekul
kimeriknya
ditransformasikan ke dalam inang, seperti
E.coli. Plasmid melakukan replikasi dalam
inang sewaktu inang tumbuh dan membelah,
dan potongan DNA yang diinginkan
terklonkan (Russel 1980, diacu dalam
Sardjoko 1991). Kloning gen untuk
mendapatkan klon tertentu dalam jumlah
banyak pada prinsipnya berguna untuk
mempermudah pengujian, modifikasi dan
pemanfaatan gen tersebut.
Tahapan kloning (Gambar 2) diawali
dengan cara mempersiapkan DNA target
melalui proses pemotongan dengan enzim
endonuklease restriksi. Fragmen untai tunggal
yang pendek pada ujung yang dihasilkan dari
pemotongan enzim restriksi diligasi ke dalam
vektor yang mengandung situs ORI (origin of
replication). DNA rekombinan kemudian
ditransfer ke dalam sel inang (bakteri atau
khamir). DNA ini mampu bereplikasi tanpa
bergantung pada DNA genom bakteri atau
khamir.
Sel
inang
yang
berhasil
ditransformasi kemudian ditumbuhkan ke
dalam media selektif (Passarge 2007).
Plasmid adalah molekul DNA utas ganda
sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil
yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan
replikasi
secara
autonom
(Suharsono & Widyastuti 2006). Plasmid
berukuran hingga lebih dari 500 pb. Plasmid
mempunyai kemampuan untuk melakukan
transfer plasmid dengan cara konjugasi
(plasmid F), menyandi ketahanan terhadap
antibiotik (plasmid R), atau membawa satu set

4

gen yang menyandikan metabolit sekunder
yang tidak biasa (plasmid degradatif) (Glick
& Pasternak 2003).
Plasmid yang berupa DNA berutas ganda
dan berbentuk sirkular merupakan DNA
ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri.
Plasmid memiliki dua sifat istimewa yang
bermanfaat dalam manipulasi genetik.
Plasmid pada umumnya tidak diperlukan
dalam pertumbuhan sel sehingga pada
keadaan tertentu dapat keluar masuk tanpa
membahayakan sel tersebut. Gen asing dapat
bersatu dengan plasmid secara mudah dan
diangkut ke dalam E.coli dan menjadi bagian
genom sel inang (Lehninger 1994).
Semua plasmid memiliki paling sedikit
satu urutan (rangkaian) DNA yang dapat
bertindak sebagai asal replikasi sehingga
plasmid itu dapat memperbanyak diri di dalam
sel tanpa bergantung pada kromosom bakteri
(Brown 1991). Secara umum plasmid yang
baik untuk digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan yaitu mempunyai berat molekul
rendah,
mempunyai
kemampuan
mengekspresikan gen yang dibawanya dari
inang, hanya mempunyai sisi pemotong
tunggal untuk kebanyakan endonuklease
restriksi dan mempunyai dua atau lebih
penanda (marker) (Primose & Old 1989).

Marka seleki yang umum digunakan
adalah gen resistensi terhadap ampisilin dan
tetrasiklin. Gen resistensi ampisilin menyandi
enzim beta laktamase yang dapat memecah
molekul ampisilin sehingga sel inang yang
membawa plasmid dapat tumbuh dalam media
yang mengandung ampisilin. Gen resistensi
tetrasiklin menyandi protein yang memompa
molekul tetrasiklin sehingga meniadakan efek
toksik tetrasiklin (Brown 1991).
Plasmid pGEM-T easy merupakan vektor
yang biasa dimanfaatkan untuk kloning
produk PCR. Plasmid pGEM-T easy
mengandung
gen
resistensi
terhadap
antibiotika ampisilin. Vektor pGEM-T easy
mengandung gen lacZ yang menyandi βgalaktosidase yang akan mengubah X-Gal (5bromo-4- kloro-3- indolil-β- D-galaktosidase)
dari tidak berwarna menjadi biru. Gen lacZ
yang diinduksi oleh molekul DNA lain maka
lacZ ini tidak dapat mengubah X-Gal menjadi
berwarna biru. Plasmid pGEM-T easy
berukuran 3015 pb dan mengandung MCS
(multiple cloning sites). Daerah restriksi ini
memungkinkan lepasnya insert/sisipan DNA
melalui digesti dengan enzim restriksi
tunggal, misalnya EcoRI, BstZI, dan NotI.

DNA asing
fragmen yang akan disisipkan

gen
penyandi
antibiotik

EcoRI

EcoRI
EcoRI

EcoRI

EcoRI

ujung
lengket

hibridisasi + DNA ligase

DNA rekombinan
DNA tersisip

kromosom

sel bakteri

bakteri dalam media + antibiotik

kloning
hanya bakteri yang mengandung
DNA rekombinan
kultur
pemurnian
DNA

klon

Gambar 2 Tahapan kloning.

5

Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaksi rantai polimerase merupakan
metode untuk memperbanyak fragmen DNA
yang menjadi sasaran secara in vitro
menggunakan instrumen PCR. Teknik PCR
merupakan sarana yang sensitif, selektif, dan
sangat cepat untuk memperbanyak fragmen
DNA yang diinginkan. Spesifisitas reaksi ini
berdasarkan pada penggunaan dua primer
oligonukleotida yang berhibridisasi menjadi
rangkaian komplementer pada untai DNA
yang berlawanan dan mengapit rangkaian
sasaran (Murray et al. 2003).
Komponen yang diperlukan dalam proses
PCR yaitu DNA cetakan (template), primer,
enzim Taq polimerase, dan deoksinukleotida
trifosfat (dNTPs). Sampel target yang
digunakan adalah DNA cetakan dari suatu
organisme yang akan diamplifikasi melalui
teknik PCR. Molekul DNA cetakan yang akan
diamplifikasi
tidak
harus
mempunyai
konsentrasi tinggi karena jumlah yang
dibutuhkan dalam proses PCR sangat sedikit,
antara 10-100 ng untuk setiap reaksinya (Innis
& Gelfand 1990). DNA cetakan tersebut harus
mengandung daerah dan fragmen DNA yang
akan diamplifikasi.
Primer adalah untai DNA pendek yang
terdiri atas beberapa nukleotida, umumnya 1025 nukleotida (oligonukleotida). Primer
berperan sebagai pemula pada proses sintesis
menggunakan PCR. Primer akan menempel
pada DNA target dan membentuk rangkaian
komplementer pada untai DNA yang
berlawanan serta mengapit rangkaian sasaran
(DNA cetakan). Konsentrasi primer untuk
proses PCR menurut William et al. (1990)
berkisar antara 0.1-0.5 μM.
Deoksinukleotida
trifosfat
(dNTPs)
merupakan suatu nukleotida yang diperlukan
dalam proses PCR agar enzim Taq polimerase
dapat membentuk kompleks rantai baru (Innis
& Gellfand 1990). Kandungan dNTPs adalah
deoksiadenosin
trifosfat
(dATP),
deoksisistidin trifosfat (dCTP), deoksiguanin
trifosfat (dGTP), dan deoksitimidin trifosfat
(dTTP). Deoksinukleotida trifosfat (dNTPs)
akan dihubungkan terhadap primer melalui
ikatan kovalen, yaitu gugus hidroksil bebas
(OH) dari primer berikatan dengan gugus
fosfat dari dNTPs.
Enzim Taq polimerase berperan dalam
proses polimerisasi atau pemanjangan utas
DNA baru. Enzim ini bersifat termostabil dan
diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.
Aktivitas polimerisasi DNAnya dimulai dari
ujung 5’ hingga ujung 3’ dan aktivitas
enzimatiknya memiliki waktu paruh sekitar 40

menit pada suhu 95ºC. Konsentrasi Taq DNA
polimerase yang digunakan biasanya berkisar
antara 0.5-2.5 unit untuk setiap reaksinya
(Innis & Gelfand 1990).
Aktivitas
enzim
Taq
polimerase
dipengaruhi oleh nilai pH. Nilai pH optimum
dari enzim ini adalah 8.3. Kondisi optimum
Taq polimerase dapat dicapai dengan
menggunakan bufer yang sesuai. Aktivitas
enzim Taq polimerase juga ditentukan oleh
konsentrasi ion Mg2+ karena ion ini
merupakan kofaktor bagi Taq polimerase dan
biasanya terdapat dalam larutan bufer pada
beberapa jenis kit. Ion Mg2+ yang optimum
untuk PCR adalah 1.5 mM. Konsentrasi Mg2+
yang lebih tinggi dari 2.0 mM akan menjadi
inhibitor dan menyebabkan penempelan
primer terganggu serta akan menghasilkan
pita-pita yang kompleks dalam elektroforesis
(William et al. 2003).
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen
DNA dimulai dengan melakukan denaturasi
DNA template (cetakan) sehingga DNA yang
beruntai ganda akan terpisah menjadi rantai
tunggal. Denaturasi DNA dilakukan dengan
menggunakan panas (95ºC) selama 1-2 menit,
kemudian suhu diturunkan menjadi 55ºC
sehingga primer akan menempel (annealing)
pada cetakan yang telah terpisah menjadi
rantai tunggal. Primer akan membentuk ikatan
hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen
yang komplementer dengan sekuen primer.
Setelah dilakukan annealing oligonukleotida
primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi
dinaikkan menjadi 72ºC selama 1.5 menit.
Pada suhu ini DNA polimerase akan
melakukan proses polimerasi rantai DNA
yang baru berdasarkan informasi yang ada
pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi,
rantai DNA yang baru akan membentuk
jembatan hidrogen dengan DNA cetakan.
DNA yang terbentuk akan didenaturasi lagi
dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi
95ºC. Rantai DNA yang baru tersebut
selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan
bagi reaksi polimerasi berikutnya (Yuwono
2006).

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi
DNA yaitu sampel daun tanaman karet,
polivinil-pirolidon (PVP), nitrogen cair, βmerkaptoetanol,
N-cetyl-N,N,N-trimetilamonium bromida (CTAB) 10%, bufer TrisHCl 1 M pH 8, ethylenediamine tetraasetate
acid (EDTA) 0.5 M pH 8, CH3COONa 3 M

6

pH 5.2, NaCl 5 M, etanol 70%, isopropanol,
etanol absolut, kloroform: isoamilalkohol
(24:1), natrium asetat 3 M pH 5.2, dan ddH2O.
Amplifikasi gen membutuhkan primer P5CS
CS forward, primer P5CS CS reverse, primer
P5CS start, primer P5CS stop, bufer PCR,
deoksinukleotida (dNTPs), Taq polimerase,
dan air molekuler (MW). Ekstraksi dan
pemurnian DNA menggunakan Extraction
and Purification Kit (Invitrogen). Bahanbahan yang diperlukan untuk ligasi dan
transformasi yaitu vektor pGEM-T Easy
(Promega), T4 DNA ligase, bufer ligasi, sel
kompeten E.coli XL-1 Blue, media LB
(Lurian Bertani) (Lampiran 4), ampisilin
50,000 ppm, IPTG 0.1 M, dan X-Gal 40,000
ppm. Elektroforesis memerlukan bahan-bahan
sebagai berikut: agarosa, bufer TBE 0.5×,
etidium bromida, dan marker 1 kb plus DNA
ladder (Invitrogen). Isolasi DNA plasmid
menggunakan High Pure Plamid Isolation Kit
(Fermentas).
Alat-alat yang digunakan pada penelitian
ini adalah mortar, lemari asam, sentrifus
Beckman Allegra 64R, PCR ESCO, tabung
Eppendorf, penangas air, tabung sentrifus,
tabung mikro, pipet Mohr, pipet mikro,
spektrofotometer UV-VIS Beckman CoulterDU 530, sisir dan cetakan agar, bak
elektroforsis, adaptor, gel doc, DNA speed
vacuum 110 savant, inkubator bergoyang,
laminar, autoklaf, pH meter, cawan Petri,
gelas piala, labu Erlenmeyer, dan gelas ukur.
Metode
Isolasi DNA Genom dari Daun Karet
(Castillo 1994)
Isolasi DNA dari daun tanaman karet
dilakukan dengan menggunakan metode
Castillo (1994). DNA diisolasi dari tiga belas
klon karet, yaitu IRR104, IRR105, IRR107,
IRR109, IRR110, IRR111, IRR112, IRR118,
IRR119, IRR131, IRR132, IRR134, dan
IRR136. Sebanyak 1 gram daun tanaman
karet yang sudah dicuci bersih dimasukkan ke
dalam mortar dingin kemudian ditambahkan
sekitar 0.1 gram PVP dan nitrogen cair.
Setelah itu, daun karet digerus hingga halus.
Serbuk halus yang dihasilkan selanjutnya
dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang
berisi 5 mL bufer ekstraksi (CTAB 10%,
EDTA 0.5 M pH 8.0, Tris HCl 1 M pH 8.0,
NaCl 5 M, dan akuades steril) yang telah
dipanaskan
dan
ditambahkan
βmerkaptoetanol. Campuran ekstraksi lalu
diinkubasi pada suhu 65ºC selama 30 menit
selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang

selama 5 menit. Campuran kemudian
ditambah 5
mL larutan
kloroform:
isoamilalkohol (24:1) lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 11,000 rpm selama 10
menit. Supernatan yang dihasilkan diambil
kemudian diekstraksi kembali dengan 5 mL
larutan kloroform: isoamilalkohol (24:1) lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 11,000 rpm
selama 10 menit. Supernatan diambil dan
ditambah isopropanol dingin sebanyak 1
volume kemudian diinkubasi pada suhu 4ºC
selama 30 menit. Campuran supernatan dan
isopropanol selanjutnya disentrifugasi pada
kondisi yang sama dengan sebelumnya.
Pelet yang dihasilkan dikeringanginkan
lalu dilarutkan dalam CH3COONa 3 M pH 5.2
sebanyak 1/10 volume dan etanol absolut 2.5
mL kemudian diinkubasi pada suhu -20ºC
selama 30 menit atau semalam. Setelah
diinkubasi campuran disentrifugasi pada suhu
4ºC dengan kecepatan 12,000 rpm selama 10
menit. Pelet dicuci dengan larutan etanol 70%
lalu dikeringkan. Pelet DNA selanjutnya
dilarutkan dalam 30 µL bufer TE (Tris HCl 1
M pH 8.0, EDTA 0.5 M pH 8.0, dan ddH 2O)
kemudian disimpan di dalam freezer.
Uji Kualitatif dan Kuantitatif DNA
DNA yang telah diisolasi kemudian
dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif. Uji
kualitatif DNA dilakukan melalui metode
elektroforesis. DNA dielektroforesis dalam
gel agarosa 0.8% (Lampiran 3) pada tegangan
listrik 75 volt selama 1.5 jam. Analisis
kuantitatif DNA memanfaatkan teknik
spektrofotometri. DNA dilarutkan ke dalam
air molekuler kemudian diukur nilai
serapannya pada panjang gelombang 260 nm
untuk mengetahui konsentrasi DNA sampel.
Kemurnian
DNA
ditentukan
dengan
melakukan
pengukuran
pada
panjang
gelombang 230 nm dan 280 nm kemudian
dibandingkan dengan nilai serapan pada
panjang gelombang 260 nm.
Isolasi Gen P5CS dengan Metode PCR
Gen P5CS diisolasi dan diamplifikasi
menggunakan DNA cetakan yang diperoleh
dari hasil isolasi. Proses isolasi dan
amplifikasi menggunakan kit dari Fermentas.
Sebanyak 18.0 µL MW dimasukkan ke dalam
tabung mikro, kemudian ditambahkan 2.5 µL
bufer, 1.0 µL dNTPs, 1.0 µL DNA hasil
isolasi DNA daun tanaman karet, 1.0 µL
primer 1, 1.0 µL primer 2, dan 0.5 µL Taq
polimerase. Larutan tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam mesin PCR. Primer
PCR yang digunakan yaitu P5CS CS forward-

7

P5CS CS reverse dan P5CS start-P5CS stop.
Program termal untuk setiap PCR diatur
sebagai berikut: predenaturasi pada 94ºC
selama 45 detik, annealing pada 40ºC selama
45 detik, dan ekstensi pada 72ºC selama 2
menit. Amplifikasi gen P5CS dilakukan
sebanyak 35 siklus. Hasil PCR kemudian
dielektroforesis dalam gel agarosa 1%
(Lampiran 3) dengan tegangan listrik 75 volt
selama 1.5 jam.
Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Ekstraksi dan purifikasi DNA hasil PCR
dilakukan
dengan
menggunakan
kit
Invitrogen. Pita yang terang pada gel agarosa
dipotong di bawah transluminator UV. Gel
ditambah dengan bufer pelarut sebanyak 3
kali volume gel. Potongan gel diinkubasi pada
suhu 50oC sampai gel tersebut larut. Setelah
potongan gel larut, larutan dimasukkan ke
dalam kolom ekstraksi dan disentrifugasi
selama 1 menit dengan kecepatan 12,000 rpm.
Sebanyak 500 - 700 µL wash buffer yang
mengandung etanol ditambahkan ke dalam
kolom kemudian disentrifugasi 1 menit
dengan kecepatan 12,000 rpm. Setelah cairan
dibuang, kolom disentrifugasi dalam keadaan
kosong dengan kecepatan 12,000 rpm, 25oC
selama
1
menit.
Kolom
kemudian
dipindahkan ke dalam tabung recovery,
setelah itu ditambahkan bufer elusi sebanyak
30 µL dan diinkubasi selama 1 menit pada
suhu ruang. Larutan tersebut disentrifugasi
kembali pada 12,000 rpm, 25oC selama 2
menit. Hasil ekstraksi dan purifikasi gel
dianalisis dengan teknik elektroforesis gel
agarosa.
Kloning Gen P5CS
Gen yang sudah dipurifikasi diligasi ke
dalam vektor pGEM-T Easy (Promega).
Campuran ligasi 10 µL dibuat dengan
komposisi 5 µL bufer ligasi, 3.5 µL gen hasil
purifikasi, 0.5 µL vektor pGEM-T easy, dan 1
µL T4 ligase. Ligasi dilakukan dengan
menginkubasi campuran ligasi pada suhu 4°C
selama satu malam atau pada suhu 25ºC
selama 1 jam. Sebanyak 10 µL hasil ligasi
ditransformasikan ke dalam 200 µL sel
kompeten E.coli XL-1 Blue dan dikocok
perlahan hingga tercampur rata kemudian
diinkubasi di dalam es selama 30 menit.
Larutan hasil ligasi dan sel kompeten diberi
kejut panas (heat shock) pada suhu 42oC
selama 50 detik yang selanjutnya segera
dimasukkan ke dalam es selama 10 menit. Ke
dalam larutan hasil rekombinasi dan sel
kompeten ditambahkan 800 µL Luria Bertani

(LB) + glukosa 20 mM kemudian diinkubasi
ke dalam shaker incubator selama 1.5 jam
pada suhu 37oC dengan kecepatan 150 rpm.
Setelah proses inkubasi, suspensi sel
transforman ditransfer pada media seleksi
(media LA + Ampisilin 100 ppm + IPTG 0.1
mM + X-Gal 40 ppm) lalu diinkubasi pada
suhu 37ºC selama semalam. Seleksi
transforman dilakukan dengan pengamatan
terhadap koloni yang terbentuk. Koloni
berwarna putih yang tumbuh selanjutnya
diambil untuk duplikasi dan PCR koloni.
Konfirmasi Koloni Transforman dengan
Teknik PCR Koloni
Konfirmasi koloni transforman dilakukan
dengan teknik PCR koloni. PCR koloni
dilakukan dengan membuat komponen mix
yang terdiri atas, MW, buffer complete,
dNTPs, primer M13-F, primer M13-R, dan
Taq polymerase. Tahap pertama PCR adalah
program lisis 96oC selama 5 menit, 50oC
selama 1 menit 30 detik, 96oC selama 1 menit
30 detik, 45oC selama 1 menit 30 detik, 96oC
selama 1 menit, 40oC selama 1 menit.
Program
dihentikan
sejenak
untuk
penambahan sebanyak 5 µL komponen mix
ke dalam masing-masing tabung. Kemudian
program PCR dilanjutkan kembali dengan
program PCR berikut: predenaturasi 94oC
selama 30 detik, annealing 55oC selama 1
menit, ekstensi 72oC selama 2 menit. Hasil
PCR koloni diverifikasi dengan gel agarosa 1
%. Koloni terpilih dikultur ke dalam media
LB cair yang telah ditambah ampisilin 100
ppm kemudian diinkubasi di inkubator
bergoyang pada suhu 37ºC dengan kecepatan
150 rpm.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan
menggunakan kit dari Invitrogen. Kultur
bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 8,000
rpm selama 3 menit. Pelet yang diperoleh
diresuspensi dengan 250 µL larutan
resuspensi
yang
mengandung RNase.
Sebanyak 250 µL larutan lisis ditambahkan ke
dalam tabung dan dibolak-balik sebanyak 6
kali kemudian diinkubasi pada suhu ruang
selama 5 menit (tidak boleh lebih dari 5
menit). Bufer presipitasi sebanyak 350 µL
dimasukkan ke dalam tabung kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 12,000 rpm
selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke
dalam kolom spin kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 12,000 rpm selama 1 menit.
Cairan yang tertampung di dalam tabung
dibuang.

8

Bufer pencuci (W10) yang mengandung
etanol ditambahkan sebanyak 500 µL ke
dalam kolom kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 1 menit dan disentrifugasi
dengan kecepatan 12,000 rpm selama 1 menit.
Cairan di dalam tabung dibuang. Ke dalam
tabung ditambahkan bufer pencuci (W9) yang
mengandung etanol kemudian disentrifugasi
dengan kondisi yang sama. Setelah itu, kolom
kembali disentrifugasi dengan keadaan
kosong. Sebanyak 30 µL bufer elusi
ditambahkan ke dalam kolom kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit.
Setelah diinkubasi, tabung disentrifugasi
dengan kecepatan 12,000 rpm selama 2 menit.
Larutan tersebut kemudian diverifikasi dengan
elektroforesis gel agarosa 1%.
Sekuensing dan Analisis Hasil Sekuensing
Gen P5CS
DNA plamid yang sudah dimurnikan
ditentukan urutan basanya melalui metode
sekuensing dengan primer M13 forward dan
M13 reverse. Pengurutan basa (sekuensing)
gen terklon dilakukan di Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong,
Bogor. Hasil sekuen gen terklon selanjutnya
dianalisis lebih lanjut dengan program
bioinformatika.
Sebelum dilakukan analisis terhadap hasil
sekuen
gen P5CS, perlu dilakukan
penghilangan sekuen vektor. Setelah sekuen
vektor dihilangkan, dicari sekuen primer
forward dan reverse. Hasil sekuen selanjutnya
dianalisis dengan program Bioedit untuk
menentukan reverse complement sekuen gen
yang dihasilkan dari primer M13 reverse.
Setelah diperoleh reverse complement,
ditentukan daerah yang overlap antara sekuen
M13 forward dan reverse complement M13
reverse.
Urutan basa hasil sekuensing dianalisis
dengan program BLASTX (www.ncbi.
nlm.nih.gov). Program BLASTX mentranslasi
sekuen nukleotida menjadi protein, kemudian
membandingkannya dengan protein yang
terdapat pada pangkalan data (database).
Homologi yang tinggi ditunjukkan dengan
nilai skor bits yang semakin besar (>150) dan
E value yang kecil (