Genetic transformation of Nicotiana benthamiana L. and soybean with MaMt2 Gene Encoding Metallothionein Type II from Melastoma malabathricum L

1

TRANSFORMASI GENETIK Nicotiana benthamiana L.
DAN KEDELAI DENGAN GEN MaMt2
PENYANDI METALLOTHIONEIN TIPE II
DARI Melastoma malabathricum L.

YUSTINUS ULUNG ANGGRAITO

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

2

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Transformasi Genetik Nicotiana
benthamiana L. dan Kedelai dengan gen MaMt2 Penyandi Metallothionein Tipe II

dari Melastoma malabathricum L. adalah karya saya bersama komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan, maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor,

Januari 2012

Yustinus Ulung Anggraito
NIM G361060071

3

ABSTRACT
YUSTINUS ULUNG ANGGRAITO. Genetic Transformation of Nicotiana
benthamiana L. and Soybean with MaMt2 Gene Encoding Metallothionein Type
II from Melastoma malabathricum L. Supervised by SUHARSONO, SAPTOWO
J. PARDAL, and DIDY SOPANDIE.
The low pH and high concentration of aluminum (Al) are major limiting

factors for crops production. The capability of crops to cope those stresses can be
improved by expressing genes controlling adaptation to low pH and high
concentration of Al. One of these genes was MaMt2 encoding for metallothionein
type II which isolated from Melastoma malabathricum. The objectives of the
research were 1) to construct overexpression vector of MaMt2 gene with pIG6
plasmid, 2) to transform Nicotiana benthamiana and soybean with MaMt2 gene,
and to analyze the transgenic plants. The MaMt2 gene were successfully fused
with the strong promoter pUbiquitin in the pIG6 plasmid, and the recombinant
plasmid was introduced into Escherichia coli DH5α by electroporation method.
The pIG6-MaMt2 recombinant vector was successfully introduced into A.
tumefaciens LBA4404 by triparental mating method (TPM). Genetic
transformation was performed by co-cultivating A. tumefaciens LBA4404-pIG6MaMt2 with N. benthamiana leaf explants and half seed explants of soybean cv.
Lumut. The T0 and T1 generations of transgenic plants were already obtained.
The integration of MaMt2 transgene into the genom of T0 transgenic plants was
confirmed by PCR. Segregation analysis in the T1 generation of N. benthamiana
showed that hpt gene was inherited to the offspring in Mendelian pattern and all
samples of transgenic plants were heterozygote containing one functional hpt
gene. Transformation of cv. Lumut half seed explants with MaMt2 gene was
succesful, based on PCR by UbiF and NosTR primer combination. PCR analysis
of T1 generation of transgenic soybean showed that MaMt2 gene was transmitted

into the offspring indicating that this transgene is integrated in the genome of
transgenic soybean plants.
Keywords: transformation, MaMt2 gene, metallothionein, Nicotiana benthamiana,
soybean

4

RINGKASAN
YUSTINUS ULUNG ANGGRAITO. Transformasi Genetik Nicotiana
benthamiana L. dan Kedelai dengan Gen MaMt2 Penyandi Metallothionein Tipe
II dari Melastoma malabathricum L. Dibimbing oleh SUHARSONO, SAPTOWO
J. PARDAL, dan DIDY SOPANDIE.
Cekaman pH rendah dan kandungan aluminium yang tinggi pada tanah
masam, khususnya tanah Ultisol, merupakan faktor-faktor pembatas produksi dan
kualitas tanaman pangan. Kemampuan beberapa tanaman pangan penting dalam
mengatasi toksisitas logam dapat ditingkatkan dengan cara mengekspresikan gengen yang terkait dengan toleransi pH rendah dan aluminium (Al) tinggi.
Melastoma malabathricum merupakan salah satu tanaman yang mampu hidup di
tanah ber- pH rendah dan kelarutan Al tinggi. Sejumlah gen yang ekspresinya
diinduksi oleh cekaman pH rendah dan aluminium tinggi pada M. malabathricum
sebagian sudah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi. Salah satu gen tersebut

adalah gen MaMt2 yang menyandi metallothionein tipe II. Protein ini banyak
mengandung sistein yang mampu mengikat berbagai macam logam. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkonstruksi vektor ekspresi berlebih gen MaMt2
menggunakan plasmid pIG6, mentransformasi tanaman Nicotiana benthamiana
dan kedelai dengan gen MaMt2, dan menganalisis tanaman transgenik secara
molekular.
Gen MaMt2 diisolasi dari plasmid pGEMT-Easy yang mengandung sisipan
gen MaMt2 dengan teknik PCR. Gen MaMt2 kemudian dipotong dengan enzim
restriksi BamH1 dan Spe1, kemudian diligasikan ke dalam situs pengklonan ganda
pada plasmid pIG6 yang sudah dipotong dengan enzim restriksi yang sama.
Plasmid rekombinan pIG6-MaMt2 selanjutnya dimasukkan ke dalam bakteri
Escherichia coli DH5α dengan metode elektroporasi. Vektor rekombinan pIG6MaMt2 diintroduksikan ke dalam A. tumefaciens LBA4404 menggunakan metode
triparental mating (TPM), dengan bantuan E. coli DH1 yang membawa plasmid
pembantu pRK2013. Transformasi genetik N. benthamiana dan kedelai dilakukan
dengan kokultivasi menggunakan eksplan potongan daun untuk N. benthamiana
dan eksplan setengah biji untuk kedelai. Keberhasilan setiap tahap penelitian
diperiksa melalui PCR. Keberadaan gen hptII, diperiksa dengan menggunakan
primer-primer spesifik hptIIF dan hptIIR, sedangkan keberadaan gen MaMt2
diperiksa dengan menggunakan kombinasi primer spesifik UbiF-SM2UR dan
UbiF-NosTR.

Gen MaMt2 telah berhasil difusikan dengan promoter Ubiquitin dengan
penyisipan ke dalam situs BamHI-SpeI dari pIG6 yang kemudian disebut dengan
pIG6-MaMt2. Plasmid rekombinan ini telah berhasil dimasukkan ke dalam E.
coli DH5α. Keberhasilan penyisipan gen MaMt2 dibuktikan dengan hasil PCR
terhadap hasil ligasi antara plasmid pIG6 dengan gen MaMt2 yang ada di dalam
E. coli DH5α menggunakan kombinasi primer UbiF-SMt2UR dan menghasilkan
fragmen berukuran 960 pb. PCR dengan kombinasi primer UbiF-NosT
menghasilkan fragmen berukuran 1160 pb.
Introduksi plasmid pIG6-MaMt2 ke dalam A. tumefaciens LBA4404 telah
berhasil dilakukan berdasarkan hasil amplifikasi PCR pada plasmid yang diisolasi
dari A. tumefaciens hasil transformasi. PCR dengan kombinasi primer spesifik

5

UbiF- SMt2UR dan UbiF-NosTR, masing-masing menghasilkan fragmen DNA
berukuran 960 pb dan 1160 pb. Ukuran fragmen-fragmen ini sama dengan ukuran
sisipan di dalam vektor rekombinan pIG6-MaMt2 yang ada dalam E. coli DH5α.
Efisiensi transformasi N. benthamiana berdasarkan jumlah eksplan yang mampu
menghasilkan menghasilkan tunas pada pada medium seleksi II sebesar 79.03%.
Uji integrasi gen MaMt2 pada genom N. benthamiana generasi T0 dengan PCR

menunjukkan bahwa 16 tanaman adalah transgenik yang mengandung gen
MaMt2. Uji resistensi tanaman N. benthamiana T1 terhadap higromisin
menunjukkan bahwa gen hpt diwariskan ke generasi berikutnya mengikuti
pewarisan Mendel dengan perbandingan 3 resisten: 1 sensitif. Pola ini
menunjukkan bahwa tanaman transgenik T0 adalah heterozigot dan mengandung
satu gen hpt fungsional.
Transformasi genetik eksplan setengah biji kedelai cv. Lumut dengan gen
MaMt2 diperantarai A. tumefaciens yang membawa plasmid rekombinan pIG6MaMt2 berhasil dilakukan. Regenerasi kedelai pascatransformasi mengalami
penundaan, dari 20.33 hari untuk eksplan yang tidak ditransformasi menjadi 23.76
hari untuk eksplan yang ditransformasi. Jumlah tunas yang terbentuk adalah 3.61
tiap eksplan untuk non-transgenik dan 3.26 tunas per eksplan untuk transgenik
putatif. Persentase eksplan yang mampu membentuk tunas pascatransformasi
masing-masing adalah 76.67% dan 12.5%, untuk eksplan yang tidak
ditransformasi dan yang ditransformasi. Analisis molekular terhadap 14 contoh
tanaman kedelai transgenik putatif generasi T0 berdasarkan PCR menunjukkan
bahwa sembilan tanaman adalah transgenik yang mengandung gen MaMt2.
Analisis PCR terhadap sembilan tanaman generasi T1 yang merupakan keturunan
dari sembilan tanaman T0 transgenik menunjukkan bahwa hanya empat tanaman
T0 yang mewariskan gen MaMt2 ke generasi T1. Hal ini menunjukkan bahwa
MaMt2 terintegrasi di dalam genom T0 dan diwariskan ke generasi berikutnya.

Kata-kata kunci: transformasi, gen MaMt2, metallothionein, Nicotiana benthamiana, kedelai

6

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan
kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7

TRANSFORMASI GENETIK Nicotiana benthamiana L.
DAN KEDELAI DENGAN GEN MaMt2
PENYANDI METALLOTHIONEIN TIPE II
DARI Melastoma malabathricum L.


YUSTINUS ULUNG ANGGRAITO

Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

8

Penguji Luar Komisi Ujian Tertutup: Tanggal 24 Januari 2012
1. Dr. Ir. Miftahudin
2. Dr. Ir. Nurul Khumaida
Penguji Luar Komisi Ujian Terbuka: Tanggal 30 Januari 2012
1. Dr. Ir. Muhamad Yunus, M.Si.

2. Prof. Dr. Ir. Iskandar Siregar, MSc.For.

9

Judul Disertasi: Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana L. dan Kedelai
dengan Gen MaMt2 Penyandi Metallothionein Tipe II dari
Melastoma malabathricum L.
Nama
: Yustinus Ulung Anggraito
NIM
: G361060071

Disetujui
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA.
Ketua

Dr. Saptowo J. Pardal, M.S.
Anggota


Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr.
Anggota
Diketahui

Ketua Program Studi Biologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr.

Tanggal Ujian: 30 Januari 2012

Tanggal Lulus:

10

PRAKATA


Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah yang Maha Pemurah atas segala
karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan April 2008 sampai September 2011 ini ialah cekaman
pH rendah dan aluminium, dengan judul Transformasi Genetik Nicotiana
benthamiana L. dan Kedelai dengan Gen MaMt2 Penyandi Metallothionein Tipe
II dari Melastoma malabathricum L. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap.
Tahap pertama, konstruksi vektor ekspresi dilakukan di Laboratorium Gene
Research Center, College of Agriculture Ibaraki University Japan. Tahap kedua,
transformasi genetik Nicotiana benthamiana dan Kedelai dilakukan di
Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherland (BIORIN) dan
Laboratorium Biologi Molekular dan Selular Tanaman (BMST) Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Bogor.
Penulis telah mendapatkan bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak
dalam melakukan penelitian. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr.
Ir. Suharsono, DEA., sebagai Ketua Komisi Pembimbing, Dr. Saptowo J. Pardal,
M.S. dan Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr. sebagai Anggota Komisi
Pembimbing, atas segala bimbingan dan bantuan pada penulis selama penelitian
dan penyelesaian disertasi ini. Penghargaan juga penulis sampaikan kepada Prof.
Hiroyuki Anzai Ph.D., atas fasilitas yang diberikan selama melakukan konstruksi
vektor ekspresi di Gene Research Center College of Agriculture Ibaraki
University Japan. Kepada Tim Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS),
Program Sandwich-like Ditjen Dikti, Program Hibah Doktor Ditjen Dikti,
Program

KKP3T

Kementan

dengan

judul

„Ekspresi

Gen

Penyandi

Metallothionein di Tumbuhan Harendong (Melastoma) dan Kedelai‟ dengan
Kontrak

No:

748/LB.620/I.1/3.2008

dan

Program

Hibah

Kompetensi

Kemendiknas dengan judul „Isolasi dan Ekspresi Gen dalam Rangka Perakitan
Tanaman yang Toleran terhadap Cekaman Asam dan Aluminium‟ dengan
Kontrak No: 219/PH2H/PP/DP2M/V/2009, atas nama Dr. Ir. Suharsono DEA.
Terima kasih juga saya sampaikan kepada Rektor Universitas Negeri Semarang
atas bantuan biaya pendidikan dan penelitian yang telah diberikan.

11

Kepada Rektor, Dekan FMIPA, Ketua Jurusan Biologi Universitas Negeri
Semarang, atas izin tugas belajar yang diberikan kepada penulis untuk
melanjutkan studi di Sekolah Pascasarjana IPB Bogor; Rektor, Dekan Sekolah
Pascasarjana, Dekan FMIPA, Ketua Departemen Biologi, Ketua Program Biologi
SPs IPB Bogor penulis mengucapkan terima kasih atas kesempatan yang
diberikan untuk mengikuti pendidikan di SPs IPB Bogor. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf pengajar dan administrasi SPs IPB
dan Departemen Biologi atas ilmu dan bantuan administrasi yang diberikan.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan di Lab.
BIORIN, Lab. BMST, dan semua staf PPSHB IPB Bogor atas segala bantuan,
dukungan semangat dan doa, serta persahabatan selama penulis melakukan
penelitian. Masih banyak pihak yang telah membantu kelancaran penelitian,
namun tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, untuk itu penulis juga
mengucapkan terima kasih.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada istriku Vita dan anak-anakku
(Aga, Asti, dan Abi), serta seluruh keluarga besar Y. Soetiarto dan Y. Soemadi
Soerowiyoto atas segala doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2012
Yustinus Ulung Anggraito

12

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Brebes pada tanggal 27 April 1964 sebagai anak ke-4
dari pasangan Johanes Soetiarto dan Yustina Sutini. Pendidikan sarjana ditempuh
di Jurusan Pendidikan Biologi IKIP Semarang, lulus pada tahun 1988. Pada tahun
1998 penulis menamatkan studi S2 di Program Studi Biologi Sekolah
Pascasarjana UGM Yogyakarta. Pada tahun 2006 mendapatkan beasiswa BPPS
dari Departemen Pendidikan Republik Indonesia untuk melanjutkan studi S3 di
Program Studi Biologi Program Pascasarjana IPB Bogor.
Penulis bekerja sebagai pengajar di Jurusan Biologi Universitas Negeri
Semarang sejak tahun 1990 hingga sekarang. Mata kuliah yang menjadi tanggung
jawab penulis adalah Genetika Dasar dan Biologi Molekular.
Selama mengikuti program S3, penulis berkesempatan mengikuti program
Sandwich-like dari Depertemen Pendidikan Nasional selama empat bulan di Gene
Research Center Ibaraki University Japan.

13

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL …………………………………………………………..
xiii
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………….

xiv

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………..

xv

PENDAHULUAN
Latar Belakang …………………………………………………………
Tujuan Penelitian ………………………………………………………
Manfaat Penelitian ……………………………………………………..

1
4
5

TINJAUAN PUSTAKA
Toksisitas Tanah Asam ………………………………………………...
Toksisitas Aluminium terhadap Tanaman……………………………...
Gen-Gen yang Ekspresinya Diinduksi oleh Cekaman Aluminium ……
Cekaman Logam dan Metallothionein ………………………………...
Metallothionein pada Tumbuhan, Yeast, dan Bakteri…………………..
Metallothionein pada Hewan dan Manusia ……………………………
Transformasi Diperantarai Agrobacterium ……………..……………….
Mekanisme Transfer DNA-T ke Sel Tanaman ………………………...
Seleksi terhadap Sel Tanaman Transgenik …………………………….
Transformasi Kedelai Diperantarai Agrobacterium tumefaciens………
Rekayasa Genetik Kedelai ……………………………………………..

6
7
10
11
12
17
20
23
25
26
27

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ………………………………………….
Bahan Penelitian ……………………………………………………….
Metode Penelitian………………………………………………………

29
29
30

HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Vektor Ekspresi pIG6-MaMt2……………………………...
Introduksi vektor ekspresi ke dalam A. tumefaciens LBA4404 …..
Perakitan N. benthamiana dan Kedelai Transgenik ……………………
Transformasi genetik N. benthamiana dengan gen MaMt2………
Transformasi genetik kedelai dengan gen MaMt2…... ……………
Analisis Tanaman Transgenik …………………………………………
Uji integrasi transgen MaMt2 di dalam N. benthamiana T0….…..
Uji segregasi tanaman N. benthamiana T1………………………..
Uji integrasi transgen MaMt2 di dalam kedelai T0 dan T1
transgenik ………………………………………………………….
PEMBAHASAN UMUM …………………………………………………..

38
39
40
40
42
44
44
47
48
50

14

SIMPULAN DAN SARAN ..……………………………………………….

55

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………

57

LAMPIRAN ………………………………………………………………..

71

15

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Perkembangan jumlah eksplan N. benthamiana pascatransformasi pada
generasi T0 ………………………………………………………………… 41
2 Respon regenerasi kedelai cv. Lumut pascatransformasi pada generasi T0.. 42
3 Hasil uji keturunan T1 N. benthamiana dalam media seleksi MS-50 mg/l
higromisin ………………………………………………………………….. 47

16

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1 Peta fisik plasmid Ti helper dan vektor biner …………………………...

22

2 Tahapan proses transfer DNA-T dari Agrobacterium ke sel tanaman

24

3 Peta fisik plasmid pIG6 sebagai vektor ekspresi ………………………

30

4 Alur kerja perakitan N. benthamiana dan kedelai transgenik …………… 30
5 Hasil PCR terhadap plasmid rekombinan pIG6-MaMt2 dari E. coli
DH5α menggunakan primer UbiF dan SMt2UR, serta UbiF dan NosT..

38

6 Hasil PCR terhadap plasmid yang dibawa A. tumefaciens LBA4404
setelah proses TPM………………… ………………………………….

39

7 Perkembangan N. benthamiana pascatransformasi dengan gen MaMt2..

41

8 Regenerasi kedelai pasca transformasi kedelai cv. Lumut……………..

43

9 Hasil PCR terhadap tanaman N. benthamiana transgenik T0 dengan
primer UbiF dan NosTR. ……..……………………………………......

45

10 Uji resistensi N.benthamiana generasi T1 terhadap higromisin…….....

46

11 Analisis molekular tanaman kedelai generasi T0 dengan gen MaMt2.. .

48

12 Analisis molekular tanaman kedelai generasi T1 dengan gen MaMt2…

49

17

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Media pertumbuhan bakteri........………………………………………...

72

2 Media transformasi N. benthamiana ……………………………………

72

3 Media transformasi kedelai …………………… . ………………………

73

18

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jumlah penduduk dan kesadaran tentang pentingnya gizi yang meningkat,
menyebabkan meningkatnya kebutuhan pangan. Peningkatan kebutuhan pangan
ini harus diantisipasi dengan peningkatan produksi tanaman pangan, melalui dua
pendekatan, yaitu ekstensifikasi dan intensifikasi pertanian. Pendekatan pertama,
dihadapkan pada kendala semakin meningkatnya konversi tanah pertanian yang
subur menjadi kawasan perumahan, perkantoran, maupun industri. Tanah marjinal
memiliki potensi sebagai salah satu alternatif pelaksanaan ekstensifikasi pertanian.
Namun sebagian besar tanah marjinal di Indonesia berupa tanah dengan pH
rendah dan kelarutan aluminium (Al) tinggi, padahal keduanya merupakan faktor
pembatas produksi tanaman. Mulyani et al. (2003) memperkirakan ada sekitar
18.2 juta ha tanah dengan kemiringan Cu > Cd > Zn > Co =
Ni (Bremner & Beattie 1990).
Protein metallothionein berperan penting dalam memetabolisme logamlogam penting untuk pertumbuhan dan perkembangan pada organisme (Philcox et
al. 1994). MT merupakan cadangan ion-ion Zn dan Cu, protein ini mampu
memulihkan kemampuannya ketika didedah dengan Cd, jika diinkubasi dengan
metallothionein-zinc (ZnMT).

Gen Metallothionein pada Tumbuhan, Yeast, dan Bakteri
Tanaman tingkat tinggi memiliki dua tipe utama peptida pengikat logam
kaya sistein, metallothionein (MT) dan fitokelatin (PC). Metallothionein (MT)
merupakan protein dengan masa molekul rendah (4-15 kDa), mengandung 2633% asam amino sistein (Cys) dan tidak mengandung histidin (Binz & Kagi 1999;
Cobbett & Goldsbrough 2002; Zhigang et al. 2006; Zhou et al. 2006;
Thirumoorthy et al. 2007). Menurut Cobbet & Goldsbrough (2002), protein MT
tersusun dengan motif pengikat logam Cys-Cys, Cys-Xaa-Cys, atau Cys-XaaXaa-Cys, yang memberikan ligan-ligan sulfhidril untuk mengkordinasi ion-ion
logam bivalen. Pada angiospermae, MT dapat diklasifikasikan ke dalam empat
tipe berdasarkan posisi residu-residu Cys yang terkonservasi. Tipe I, mengandung
enam motif Cys-Xaa-Cys, tersebar secara merata dalam dua domain. Kedua
domain dipisahkan oleh sekitar 40 asam amino. Tipe II, pasangan pertama Cys
memiliki motif Cys-Cys pada asam amino ke-3 dan 4 dari protein ini. Motif CysGly-Gly-Cys ada di ujung-N domain kaya Cys. Tipe III, hanya terdiri dari empat
asam amino Cys pada ujung-N. Tiga Cys pertama membentuk motif Cys-GlyAsn-Cys-Asp-Cys. Sedangkan Cys ke-4 membentuk motif sendiri yaitu Gln-Cys-

13

X-Lys-Lys-Gly. MT tipe IV memiliki tiga domain kaya Cys, masing-masing
memiliki 5 atau 6 residu Cys yang terkonservasi.
Protein MT terdiri dari dua domain pengikatan (α, β), yang tersusun dari
sekelompok sistein. Bagian ujung-N dari protein ini ditandai sebagai domain-α,
yang memiliki tiga tempat pengikatan untuk ion-ion divalent. Domain-β (bagian
ujung-C) memiliki kemampuan untuk mengikat empat ion-ion divalen logam
berat (Capasso et al. 2006). Dalam kasus ion-ion logam berat monovalen, MT
mampu mengikat dua ion logam. Asam amino sistein berperan penting dalam
mengatasi ion-ion metal toksik dalam konsentrasi tinggi. Menurut Simpkins
(2000), ada tiga proses fundamental yang terkait dengan protein MT, di antaranya:
(1) melepaskan gas perantara seperti radikal hidroksil atau oksida nitrit; (2)
apopotosis; (3) pengikatan dan pertukaran logam berat, seperti Zn, Cd, atau Cu.
MT tipe I, II, dan III diduga berfungsi dalam homeostasis dan toleransi Cu
(Murphy & Taiz 1995; van Hoof et al. 2001; Guo et al. 2003; Roosens et al.
2004; Guo et al. 2008), sedangkan MT tipe 4 berfungsi dalam homeostasis Zn
(Lane et al. 1987; Guo et al. 2008). Meskipun demikian, semuanya dapat
mengikat berbagai ion logam dan metaloid, termasuk ion-ion nonesensial
(Cobbett & Goldsbrough 2002). Data-data tersebut menunjukkan bahwa MT
tumbuhan memiliki fungsi yang terkait dengan detoksifikasi logam-logam
nonsesensial, selain homeostasis logam-logam esensial (Guo et al. 2008).
Protein MT pada tanaman paling banyak dipelajari pada Arabidopsis dan
hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman ini yang memiliki lebih dari satu
famili gen Mt. Menurut Guo et al. (2003), Arabidopsis mengandung famili gen
dengan tujuh gen Mt yang aktif. Pada padi ditemukan ada 11 gen yang
menyandikan OsMt yang masing-masing memiliki urutan dan pola ekspresi
jaringan yang berbeda (Zhou et al. 2006).
Zhou & Goldsbrough (1994) berhasil mengisolasi dua tipe MT (MT1 dan
MT2) dari Arabidopsis yang homolog dengan MT hewan dan jamur. Transkripsi
MT2 meningkat dengan perlakuan CuSO4, ZnSO4, dan CdSO4. Dari ketiga logam
berat tersebut, Cu paling efisien dalam menginduksi ekspresi MT2 yaitu dapat
meningkatkan ekspresi (transkripsi) sebesar 5.5 kali lipat. Arabidopsis yang

14

mendapat perlakuan 50 M Cu menunjukkan peningkatan transkripsi MT2
sampai 72 jam perlakuan.
Richards et al. (1998) telah mengisolasi beberapa klon cDNA dari tanaman
Arabidopsis yang diberi nama gen-gen EARLI (early Arabidopsis alumnium
induced). Klon pEARLI menyandikan gen yang termasuk ke dalam kelompok
hidrofobik yang belum diketahui fungsinya dan dihasilkan dari perlakuan Al yang
sangat cepat. Sivaguru et al. (2003) melaporkan bahwa Al menginduksi ekspresi
gen wak1 (cell wall-associated receptor kinase 1) pada organ spesifik. Hasil
analisis RT-PCR membuktikan bahwa ekspresi gen wak1 pada akar diinduksi oleh
Al. Puncak ekspresi terjadi pada 3 jam setelah pemberian cekaman Al, diikuti
dengan penurunan ekspresi pada 6 jam setelah perlakuan dan ekspresinya terus
menurun hingga pada 9 jam setelah pemberian cekaman Al, ekspresi gen tersebut
benar-benar tidak ada. Gen wak1 diduga kspresinya diinduksi oleh Al. Tanaman
transgenik yang mengekspresikan gen tersebut secara berlebihan menunjukkan
peningkatan toleransi terhadap Al.
Berdasarkan penelitian pada sejumlah leguminosa (kedelai, kacang merah,
kidney bean), diketahui bahwa cDNA Mt tipe-1 memiliki ukuran 530-550 pb,
sedangkan cDNA Mt tipe-2 berukuran 540-570 bp. Menurut Sun et al. (2004),
kedua cDNA tersebut memiliki susunan Cys pada setiap ujung-N dan ujung-C
dari masing-masing urutan. Beberapa kandidat cDNA yang ekspresinya diduga
diinduksi oleh cekaman Al telah diisolasi melalui konstruksi pustaka cDNA dari
tanaman kedelai kultivar Lumut yang peka terhadap cekaman Al dan penapisan
diferensial terhadap pustaka genom tersebut (Jusuf et al. 1999; Anwar et al.
2000). Klon kandidat tersebut adalah gmali1 (GenBank No. AF901303) yang
diduga menyandi H+-ATPase membran plasma, gmali4 yang menyandi Histon H3,
gmali20 yang menyandi katalase, gmali49 yang menyandi NADH dehidrogenase,
gmali50 (GenBank No. AF169830) yang menyandi auxin-induced protein. Anwar
(1999) berhasil mengisolasi gen sapali (GenBank No. AF 901304) yang
menyandi aminoasilpeptidase.
Ekspresi gen MT tanaman diregulasi oleh berbagai faktor, termasuk
cekaman yang berbeda-beda misalnya pelukaan (Choi et al. 1996), infeksi
patogen (Choi et al. 1996; Butt et al. 1998), interaksi simbiotik (Laplaze et al.

15

2002), senesensi daun (Bhalerao et al. 2003; Andersson et al. 2004), dan logamlogam berat (Usha et al. 2007; Huang et al. 2009; Huang et al. 2010). Hal ini
menunjukkan bahwa MT kemungkinan diekspresikan sebagai tanggap cekaman
umum seperti disebutkan oleh Cobbett & Goldsbrough (2002). Diduga kuat MT
berfungsi sebagai juga sebagai antioksidan dan berperan penting dalam perbaikan
membran plasma (Hall 2002). Selain tanggap terhadap cekaman logam toksik, gen
Mt juga dapat terinduksi oleh cekaman kadar garam. Analisis ekspresi yang
dilakukan oleh Yang et al. (2011) pada tanaman Tamarix hispida, menunjukkan
bahwa mRNA dari ThMT3 diatur meningkat oleh salinitas tinggi dan juga ion-ion
logam berat, dan ThMT3 dominan diekspresikan dalam daun. Yeast transgenik
(Saccharomyces cerevisiae) yang mengekspresikan ThMT3 menunjukkan
peningkatan toleransi terhadap cekaman Cd2+, Zn2+, Cu2+, dan NaCl. Selain itu,
analisis ekspresi yang dilakukan oleh Yang et al. (2009), menunjukkan bahwa
OsMT1a diekspresikan dominan pada akar, dan diinduksi oleh dehidrasi. Ekspresi
OsMT1a juga diinduksi secara spesifik oleh perlakuan Zn2+. Tanaman padi dan
yeast transgenik yang membawa OsMT1a mengakumulasi Zn2+ lebih banyak
dibandingkan kontrol tipe liar, menunjukkan bahwa OsMT1a tampaknya terlibat
dalam homeostasis Zn. Tanaman padi transgenik yang mengekspresikan berlebih
OsMT1a menunjukkan peningkatan toleransi terhadap kekeringan.
Gen-gen Mt tanaman diekspresikan spesifik jaringan (Garcia-Hernandez et
al. 1998; Charbonnel-Campaa et al. 2000; Goldsbrough 2000). Ekspresi MT tipe
1 cenderung lebih tinggi di akar dibandingkan di tajuk, sedangkan MT tipe 2
cenderung dieskpresikan lebih tinggi di tajuk dibandingkan di akar. MT tipe 3
diekspresikan pada aras tinggi di daun dan buah yang matang, sedangkan MT tipe
4 diekspresikan terbatas pada biji yang sedang berkembang (Cobbett &
Goldsbrough 2002). Pada padi, beberapa gen MT Tipe 1 dan Tipe 2 sudah
diidentifikasi pada famili MT padi, dengan ekspresi nyata di akar dan kecambah,
dan satu (ricMT) yang tidak biasa pada batang (Hsieh et al. 1995; Yu et al. 1998;
Zhou et al. 2005). Trisnaningrum (2009), menunjukkan bahwa MT2
diekspresikan lebih tinggi pada akar dibandingkan pada daun M. Affine pada
konsentrasi 3.2 mM Al.

16

Peran berbagai gen Mt juga dipelajari dengan melakukan transformasi,
ekspresi berlebih ataupun dengan melakukan pembungkaman gen pada sejumlah
organisme. Zhigang et al. (200

Dokumen yang terkait

Respon Pertumbuhan Tembakau (Nicotiana tabacum L.) Terhadap Pemberian Debu Vulkanik Gunung Sinabung Dan Dosis Pupuk Kompos

0 32 97

Genetic transformation of rice using rhizobium and agrobacterium and functional analysis of OsHox6 Gene

1 52 130

Isolation, cloning, and expression analysis of gene coding copper zinc superoxide dismutase (CuZn SOD) from Melastoma malabathricum L

0 26 128

Genetic Transformation of Rice (Oryza sativa L.) with Aluminum Tolerant Gene Candidate

0 25 54

Genetic transformation of Nicotiana benthamiana L. and soybean with MaMt2 Gene Encoding Metallothionein Type II from Melastoma malabathricum L.

0 7 167

Isolation, cloning, and expression analysis of gene coding copper/zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) from Melastoma malabathricum L.

1 12 238

Genetic transformation of Jatropha curcas L. by Agrobacterium tumefaciens-mediated with type 2 metallothionein gene from Melastoma malabathricum

0 4 93

Genetic transformation of rice (Oryza sativa L.) with gene encoding Melastoma malabathricum metallothionein type II (MaMt2) using Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer.

0 7 142

Rekayasa genetika padi (oryza sativa l.) Dengan gen penyandi metallothionein tipe ii dari melastoma malabathricum l. (mamt2)

0 2 1

31 Transformasi Genetik Nicotiana benthamiana dengan Gen CP untuk Mendapatkan Ketahanan Tanaman terhadap Peanut Stripe Virus (Genetic Transformation of Nicotiana benthamiana With CP Gen to Obtain Plant Resistance Again Peanut Stripe Virus) Nur YASIN

0 0 7