Isolasi Dan Pemurnian Laktoferin Dari Kolostrum Kambing Peranakan Etawa Sebagai Antivirus Human Papillomavirus.

ISOLASI DAN PEMURNIAN LAKTOFERIN DARI
KOLOSTRUM KAMBING PERANAKAN ETAWA SEBAGAI
ANTIVIRUS Human Papillomavirus

ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Pemurnian
Laktoferin dari Kolostrum Kambing Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human
Papillomavirus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, September 2015
Anggraeni Ramadhaleta Yugis
NRP G451130031

RINGKASAN
ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS. Isolasi dan Pemurnian Laktoferin dari
Kolostrum Kambing Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human Papillomavirus.
Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan JOKO PAMUNGKAS.
Kanker serviks (leher rahim) merupakan kanker tertinggi kedua prevalensi
pada wanita. Data World Health Organization pada tahun 2013 menyatakan
bahwa setiap tahunnya sekitar 270 000 wanita meninggal diakibatkan kanker
serviks dan lebih dari 85% terjadi di negara berkembang. Kanker serviks ini
disebabkan oleh infeksi Human Papillomavirus (HPV). Untuk mencegah
terjadinya kanker dapat dilakukan dengan cara mengonsumsi sumber pangan
seperti susu. Salah satu protein yang terkandung di dalam susu dan kolostrum
adalah laktoferin (Lf). Lf dengan konsentrasi tertinggi terdapat pada kolostrum.
Bobot molekul Lf sekitar 80 kDa dan memiliki muatan positif. Lf memiliki peran
penting dalam sistem imun nonspesifik yang bertindak sebagai antivirus, bakteri
dan jamur. Kemampuan Lf yang paling utama untuk berperan sebagai pertahanan

atau yang bersifat antivirus adalah mencegah virus memasuki sel inang sehingga
infeksi dapat dicegah pada tahap awal dan pemblokan pada reseptor heparan sulfat
yang merupakan reseptor. Lf dapat dimurnikan dari kolostrum dan susu melalui
beberapa metode seperti kromatografi penukar ion, filtrasi gel dan kromatografi
afinitas. Tujuan penelitian ini adalah isolasi dan pemurnian Lf dari kolostrum
kambing peranakan etawa yang merupakan kambing endemik Indonesia dan
menentukan aktivitas antivirus terhadap HPV.
Protein Lf dimurnikan melalui metode kromatografi penukar kation dengan
menggunakan resin karboksimetil (CM) Sephadex C-50 dan melalui kromatografi
dua dimensi dengan metode kromatografi penukar kation (CM Sephadex C-50)
dan kromatografi filtrasi gel (Sephadex G-75). Metode kromatografi penukar ion
dielusi dengan menggunakan kenaikan konsentrasi larutan NaCl 0.0-0.5 N dan
kromatografi dua dimensi pada tahapan filtrasi gel dielusi dengan larutan dapar
PBS. Resin penukar ion CM Sephadex C-50 merupakan resin penukar kation
lemah yang mampu memisahkan biomolekul yang memiliki muatan positif
dengan rentang bobot molekul antara 4-100 kDa. Resin Sephadex G-75 memiliki
kemampuan untuk memisahkan biomolekul dengan rentang 3-80 kDa. Kedua
resin ini cocok untuk memisahkan Lf yang memiliki muatan dan bobot molekul
dengan kisaran 80 kDa. Profil pemisahan dan pemurnian Lf diperiksa dengan
menggunakan sodium deodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) dibandingkan dengan Lf murni dari sapi (bLf). Konsentrasi Lf ditentukan

dengan metode bicinchoninic acid assay (BCA). Lf murni yang telah diperoleh
dievaluasi aktivitas antivirus terhadap HPV secara in vitro dengan pada sel HeLa.
Teknik Real time PCR digunakan untuk menentukan kemampuan Lf kambing
(gLf) menghambat replikasi HPV.
Hasil yang diperoleh bahwa pemurnian dengan metode kromatografi
penukar ion belum dapat memurnikan Lf secara maksimum, tetapi metode
kromatografi dua dimensi menghasilkan gLf murni. Bobot molekul Lf murni,
yaitu 82 kDa dengan konsentrasi 379 μg/mL. Adanya penghambatan replikasi
HPV ditandai dengan kenaikan nilai cycle treshold (Ct) atau ambang siklus. Pada
hari pertama setelah inkubasi dengan Lf belum terjadi kenaikan nilai Ct atau

belum terjadi penghambatan replikasi HPV. Pada hari ke-2 dan ke-3 setelah
inkubasi terjadi peningkatan nilai Ct yang berarti bahwa terjadi penghambatan
replikasi HPV oleh laktoferin. Laktoferin memiliki kemampuan penghambatan
replikasi DNA virus HPV dengan konsentrasi gLf 100 μg/mL setelah tiga hari
inkubasi dalam sel HeLa. Hal ini mengindikasikan bahwa laktoferin memiliki
aktivitas sebagai antiHPV.
Kata kunci: Laktoferin kambing, isolasi, pemurnian, kromatografi filtrasi gel,
kromatografi penukar ion

SUMMARY
ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS. Isolation and Purification Lactoferrin
from Etawa Goat as Antiviral Human papilomavirus. Supervised by IRMA
HERAWATI SUPARTO and JOKO PAMUNGKAS.
Cervical cancer is the second most common cancer in women worldwide.
Evidence from World Health Organization (2013), every year mortality due to
cervical cancer were more than 270 000 women, more than 85% of these death
were from low and middle income countries. Infection of human papillomavirus
(HPV) can cause cervical cancer in women’s reproduction system. Efforts to find
cure or prevention continues including the search of the use of natural products
such as milk. One of the compound proteins in milk is lactoferrin (Lf). The
highest concentration of Lf can be found in colostrum. The concentration of Lf in
colostrum and milk varies widely from one species to another. Lf is an 80 kDa
iron-binding protein that has an important role in the non-specific immune system
such as in the defense mechanisms against virus, bacteria and fungi. The antiviral
activity of Lf act in the early phase of the viral infection thus preventing entry of
virus into the host cell, either by blocking cellular receptors or by direct binding to
virus particles. The most probable mechanism preventing virus entry by
interacting with the viral attachment receptor heparan sulfate. Lf can be purified
from colostrum and milk by several methods such as ion exchange

chromatography, gel filtration and affinity chromatography. The aims of this
study were to focus on the isolation and purification of Lf from Indonesian local
goat colostrums and observing its activities as antiviral Human Papillomavirus
(HPV).
Lf was purified by cation exchange chromatography on carboxymethyl
Sephadex C-50 resin eluted by increasing stepwise the molarity of NaCl 0-0.5 M
in the PBS and by two-dimension chromatography with cation exchange
chromatography (CM Sephadex C-50) - gel filtration chromatography (Sephadex
G-75). CM Sephadex C-50 resins is weak cation exchange that has the ability to
separate the positive charge of biomolecule with molecular range 4-100 kDa and
Sephadex G-75 have the ability to separate the biomolecule with molecular weight
range 3-80 kDa. Both resins were compatible to separate and purified the Lf.
Purity of Lf was analyzed by sodium deodecyl sulphate-poliacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) and compared with commercial bLf.
The
concentration of gLf determined by bicinchoninic acid assay (BCA) kit. The pure
gLf was further evaluated for its in vitro antiviral activity to HPV on HeLa cell
line. Real time PCR was used to examine the ability of goat lactoferrin (gLf) to
inhibit the replication of HPV.
The result showed that chromatography by ion exchange not yet purified the

Lf, but two-dimension chromatography was successful in purifying gLf. The
molecular weight of purified gLf was 82 kDa and concentration was 364 μg/mL
as measured by BCA assay. A positive inhibition of HPV replication indicated by
the increased value of Ct. On the first day after incubation with Lf, Ct value not
increase that implied the replication of HPV were still not inhibited by Lf, this
could be due to the lack of interaction between gLf and the HPV. However, on

day-2 and day-3 an increase of Ct value that implied that Lf inhibited HPV
replication. The highest inhibition of replication was on the third day after
incubation with gLf 100 μg/mL. This indicated that Lf had ability to inhibit HPV
replication.
Keywords: goat lactoferrin, isolation, purification, gel filtration chromatography,
ion exchange chromatography

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN PEMURNIAN LAKTOFERIN DARI
KOLOSTRUM KAMBING PERANAKAN ETAWA SEBAGAI
ANTIVIRUS Human Papillomavirus

ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Kimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Mohamad Rafi, MSi

Judul Tesis : Isolasi dan Pemurnian Laktoferin dari Kolostrum Kambing
Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human Papillomavirus.
Nama
: Anggraeni Ramadhaleta Yugis
NRP
: G451130031

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr dr Irma Herawati Suparto, MS
Ketua

Dr drh Joko Pamungkas, MSc
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Kimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Dyah Iswantini, MScAgr

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 27 Agustus 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2014 ini ialah isolasi
protein, dengan judul Isolasi dan Pemurnian Laktoferin dari Kolostrum Kambing
Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human Papillomavirus.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr dr Irma Herawati Suparto MS

dan Bapak Dr drh Joko Pamungkas MSc sebagai pembimbing, Prof Dr Dyah
Iswantini MScAgr selaku Ketua Program Studi Kimia, rekan-rekan dari Pusat
Studi Satwa Primata Ibu Dr drh Diah Iskandriati, Bapak Dr Uus Saepuloh
MBiomed, Bapak Agus Saputra, SSi MSi, Ibu Silmi Mariya MS, Ibu Isti
Kartikasari MSi, Ibu Rachmita Noviana, SKH MSi , Kakak Iin Indriawati SSi,
Kakak Tri Fauziani SSi, Kakak Sela Septima Mariya SSi, Kakak Elis Dwi yang
telah banyak memberi bantuan dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih
kepada rekan-rekan mahasiswa Sekolah Pascasarjana Kimia 2013 Novita Rose
Diana SPd, Wahyuning Lestari SPd, Fatan Umbara SSi, Doni Notriawan SSi,
Anom Cahyotomo SPd, Syamsul Hidayat SSi, Muhsinun SSi dan Yuspian Nur
SPd yang banyak memberikan bantuan selama studi. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, seluruh keluarga atas segala doa dan kasih
sayangnya.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jendral
Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dana pendidikan melalui
Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN) dari Tahun 2013
hingga Tahun 2014.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2015

Anggraeni Ramadhaleta Yugis

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Laktoferin
Pemurnian Laktoferin

3
3
5

3 METODE
Waktu dan Tempat penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Kerja
Isolasi dan Pemurnian Laktoferin
Elektroforesis SDS-PAGE
Penentuan Total Protein
Kultur Sel HeLa
Ekspresi Gen dengan Teknik Real Time PCR

7
7
7
7
8
8
8
8
9
9

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Pemurnian Laktoferin
Profil Inhibisi Laktoferin terhadap DNA HPV

9
9
12

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

14
14
14

DAFTAR PUSTAKA

14

LAMPIRAN

19

RIWAYAT HIDUP

21

DAFTAR TABEL
1
2
3
4

Perbedaaan kandungan laktoferin berbagai spesies
Jenis resin dan gugus penukar ion
Jenis gel untuk pemurnian biomolekul pada kromatografi filtrasi gel
Nilai Ct dan persen hambat gLf dan bLf terhadap virus HPV dari pellet
sel lestari HeLa

4
5
6
13

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6

Struktur tiga dimensi laktoferin
Elektroforegram gradien konsentrasi NaCl
Elektroforegram fraksi 1-7 elusi 0.5 N NaCl
Ektroforegram hasil kromatografi dua tahapan fraksi1-7
Elektroforegram purifikasi gLf dengan 2 tahapan kromatografi
Mekanisme aktivitas antivirus laktoferin

3
10
11
11
12
13

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Tabel bobot molekul standar protein
Kurva normalitas bobot molekul standar protein
Tabel konsentrasi standar protein berbanding absorbasi
Kurva normalitas konsentrasi protein standar

19
19
20
20

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker serviks (leher rahim) merupakan kanker dengan prevalensi tertinggi
kedua pada wanita. Data World Health Organization (WHO) pada tahun 2013
menyatakan bahwa setiap tahunnya lebih dari 530 000 kasus dan sekitar 270 000
wanita meninggal diakibatkan kanker serviks dan lebih dari 85% terjadi di negara
berkembang. Kanker serviks ini dapat disebabkan oleh infeksi Human
Papillomavirus (HPV). Virus ini merupakan virus DNA yang tidak memiliki
selubung pelindung dan merupakan anggota dari Papillomaviridae. HPV
menyerang mukosa sel, kulit, dan saluran reproduksi. Jika infeksi HPV ini terjadi
pada mulut rahim wanita, hal inilah yang akan memicu terjadinya kanker serviks
(WHO 2013). Salah satu usaha untuk mencegah terjadinya kanker dapat dilakukan
dengan cara mengonsumsi sumber pangan seperti susu yang mengandung
senyawa-senyawa yang dapat mencegah berkembangnya sel-sel kanker. Davoodi
et al. (2013) menyatakan potensi dan manfaat kesehatan dari mengonsumsi susu
dan produk susu untuk dapat mencegah terjadinya kanker.
Susu mengandung banyak senyawa yang dibutuhkan oleh tubuh (Potocnik
et al. 2011). Khususnya kolostrum atau susu pertama mengandung sangat banyak
protein yang memiliki sifat sebagai komponen bioaktif (Indyk dan Filonzi 2004;
Ebringer et al. 2008; Wu et al. 2010; Wu et al. 2011). Salah satu protein yang
terkandung di dalam susu dan kolostrum adalah laktoferin (Lf) (Campanella et al.
2009) yang memiliki berbagai bioaktivitas yang menguntungkan dalam bidang
medis seperti antibakteri (Conesa et al. 2008; Moradian et al. 2014), antivirus dan
antikanker (Tanaka et al. 1999; Strate et al. 2001; Pietrantoni et al. 2003; Groot et
al. 2005; Mistry et al. 2007; Chen et al. 2008; Chien et al. 2008; Berlutti et al.
2011; El-Fakharany et al. 2012 dan 2013), anti-tumor (Fujita et al. 2004; Yamada
et al. 2007; Florin et al. 2012) dan anti-inflamasi (Florian et al. 2012). Laktoferin
juga diketahui memiliki aktivitas anti-HPV yang telah dilaporkan Mistry et al.
(2007) bahwa Lf murni dari susu manusia (hLf, human lactoferrin) dan susu sapi
(bLF, bovine lactoferrin) memiliki aktivitas antivirus HPV Hasil penelitian yang
dilakukan Mistry et al. (2007) dilaporkan bahwa hLf dan bLf berpotensi untuk
menghambat infeksi yang disebabkan HPV khususnya tipe 5 dan tipe 16.
Laktoferin memiliki kemampuan untuk mengikat DNA ataupun RNA dari suatu
virus tertentu. Kemampuan Lf yang paling utama untuk berperan sebagai
pertahanan atau yang bersifat antivirus adalah adanya pengikatan pada membran
glikosaminoglikan dan pemblokan reseptor yang spesifik pada permukaan sel
target. Dengan cara ini, Lf mencegah virus memasuki sel dan infeksi dapat
dicegah. (Adlerova et al. 2008; Berlutti et al. 2011; El-Loly dan Mahfous 2011).
Laktoferin umumnya ditemukan pada susu mamalia seperti kambing, sapi,
domba, kerbau, gajah, unta dan bahkan pada air susu manusia. Banyak penelitian
yang telah dilakukan untuk menguji aktivitas laktoferin sebagai antivirus, namun
pada beberapa penelitian umumnya memanfaatkan kolostrum yang bersumber
dari susu sapi dan susu manusia sedangkan penelitian yang dilakukan pada
kolostrum ataupun susu kambing peranakan etawa terutama untuk uji antiHPV
belum pernah dilaporkan. Oleh sebab itu penting untuk dilakukan studi mengenai

2
isolasi dan pemurnian Lf bersumber dari kolostrum kambing peranakan etawa
yang merupakan kambing endemik di Indonesia (goat lactoferrin, gLF). Kambing
peranakan etawa dipilih karena merupakan kambing penghasil susu dan dikenal
serta dipercaya memiliki banyak manfaat di kalangan masyarakat.
Pemurnian Lf dapat dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi
penukar ion, filtrasi gel, kromatografi afinitas dan metode kromatografi dua
tahapan untuk memaksimalkan hasil pemurnian Lf. Metode kromatografi yang
digunakan pada penelitian ini, yaitu kromatografi penukar ion menggunakan resin
karboksimetil (CM) Sephadex C-50 dan kromatografi dua tahapan menggunakan
metode kromatografi penukar ion (CM Sephadex C-50) serta kromatografi filtrasi
gel (Sephadex G-75). Resin penukar ion CM Sephadex C-50 merupakan resin
penukar kation lemah yang mampu memisahkan biomolekul yang memiliki
muatan positif dengan rentang bobot molekul antara 4-80 kDa (Sivasankar 2014),
resin ini digunakan untuk memurnikan Lf yang memiliki muatan positif dengan
bobot molekul berkisar 80 kDa. Resin Sephadex G-75 memiliki kemampuan
untuk memisahkan biomolekul dengan rentang 3-80 kDa (Sivasankar 2014). Oleh
karena itu, Sephadex G-75 digunakan pada pemisahan dua tahapan kromatografi
untuk memaksimalkan pemurnian Lf. Untuk melihat profil pemisahan Lf yang
diperoleh dari proses kromatografi akan dilakukan elektroforesis SDS-PAGE
(sodium dodecyl sulpfate polyacrylamide gel electrophoresis) dan untuk
menentukan bobot molekulnya dibandingkan dengan penanda bobot molekul
standar dan bLf yang dijual secara komersil. Laktoferin yang diperoleh dari proses
pemurnian ini akan diuji aktivitas anti-HPV secara in vitro terhadap sel HeLa.

Perumusan Masalah
Laktoferin merupakan protein yang diketahui memiliki banyak manfaat
pada bidang kesehatan dan dapat diperoleh dari kolostrum serta susu dari kambing
peranakan etawa. Biokativitas Lf yang bersumber dari manusia dan sapi telah
banyak dilaporkan tetapi untuk aktivitas Lf yang bersumber dari kambing
peranakan etawa sebagai anti-HPV belum ada laporannya. Untuk memperoleh Lf
perlu dilakukan dalam dua metode, yaitu kromatografi penukar ion dan
kromatografi dua dimensi (kromatografi penukar ion dan filtrasi gel). Oleh sebab
itu, penelitian ini diharapkan dapat menjawab pertanyaan mengenai metode yang
tepat untuk memurnikan Lf yang bersumber dari kolostrum kambing peranakan
etawa serta aktivitas sebagai anti-HPV yang dilakukan secara in vitro pada sel
Hela.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan Lf dari kolostrum kambing
peranakan etawa (gLF) serta menguji aktivitasnya sebagai antivirus HPV secara in
vitro pada kultur sel HeLa.
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi kepada masyarakat
bahwa laktoferin yang terkandung pada kolostrum kambing peranakan etawa
memiliki manfaat sebagai antivirus terhadap HPV.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Laktoferin
Laktoferin merupakan suatu protein dengan bobot molekul sekitar 80 kDa
dan mengandung sekitar 700 asam-asam amino yang umumnya hampir sama pada
setiap spesies penghasilnya. Laktoferin merupakan rantai polipeptida yang
sederhana yang dibagi menjadi dua lobus simetris, yaitu lobus karboksil (lobus C)
dan lobus amino (lobus N), yang sangat homolog satu dengan yang lainnya.
Kedua lobus saling terhubung oleh untaian α heliks. Domain menjadi tempat
pengikatan dengan Fe3+ masing-masing untuk setiap lobus. Domain ini disebut
N1, N2, C1, dan C2. Empat residu asam amino yang berperan sangat penting
dalam pengikatan dengan Fe3+, yaitu histidin, asam aspartat dan dua tirosin. Selain
mengikat Fe3+, residual asam amino ini dapat juga mengikat ion-ion lain seperti
Cu2+, Zn2+, Mn3+, Al3+, Ga3+,Co3+, dan logam lainnya (Stejins dan Hooijdonk,
2000; Baker dan Baker 2005; Oztas dan Ozgunes 2005; Adlerova et al. 2008,
Chaves et al. 2009). Visualisasi struktur tiga dimensi laktoferin yang diperlihatkan
seperti pada Gambar 1.

(Sumber: Baker dan Baker 2011)

Gambar 1 Struktur tiga dimensi laktoferin
Laktoferin umumnya ditemukan pada susu mamalia seperti kambing, sapi,
domba, kerbau, gajah, unta, beberapa roden lainnya dan bahkan pada manusia.
Laktoferin paling banyak ditemukan pada kolostrum tetapi pada susu dan cairan
tubuh lainnya seperti saliva, darah, air mata, cairan gastrointestinal, urin, empedu,
cairan sinovial dan plasma seminal juga ditemukan adanyaLf (Neville dan Zhang
2000; Adlerova et al. 2008; Chaves et al. 2008). Kandungan Lf berbeda untuk
setiap spesies. Laktoferin juga merupakan protein yang memiliki kelimpahan
terbanyak kedua setelah kasein (Chaves et al. 2008). Beberapa faktor yang
mempengaruhi perbedaan kandungan Lf dari berbagai spesies, yaitu umur spesies,
nutrisi pangan yang dikonsumsi dan waktu laktasi. Tabel 1 memperlihatkan
persentase perbedaan kandungan laktoferin dari berbagai spesies.

4
Tabel 1 Perbedaan kandungan laktoferin berbagai spesies
Sumber Laktoferin
Kadar
Kolostrum manusia
5-7 mg/mL
Susu manusia
1-2 mg/mL
Air mata manusia
2.2 mg/mL
Susu Sapi
8.38 %
Susu Kuda
9.89 %
Air liur
7-10 μg/mL
(Levay dan Viljoen, 1995; Potocnik et al. 2011)

Laktoferin mempunyai banyak aktivitas biologis seperti antibakteri terhadap
Pseudomonas aeruginosa dengan konsentrasi Lf 400 dan 700 μg/mL (Moradian et
al. 2014) dan Eschericia coli dengan konsentrasi hambat minimum (MIC) dan
konsentrasi bunuh minimum (MBC) 0.5-2.0 mg/mL (Conesa et al. 2008).
Aktivitas antitumor dan antikanker Lf dilaporkan beberapa peneliti seperti;
antitumor payudara (Yamada et al. 2007), antitumor usus (Fujita et al. 2004),
antitumor terhadap melanoma (Bezault et al. 1994, Florian et al. 2012). Tanaka et
al. (1999) melaporkan bahwa laktoferin sapi (bLF) dalam jumlah 3.6 g berpotensi
sebagai anti-HCV dan sangat efektif untuk mengobati pasien yang terinfeksi
hepatitis C dengan HCV di dalam serum rendah. van der Strate et al. (2001)
melaporkan bahwa Lf memiliki berbagai aktivitas seperti antivirus terhadap friend
virus complex (FVC), virus polio, respiratory syncytial virus (RSV), human
immunodeficiency virus (HIV), herpes simplex virus tipe 1 dan 2 (HSV-1 dan 2),
dan cytomegalovirus (CMV). Laktoferin juga dilaporkan memiliki aktivitas
antivirus terhadap adenovirus dengan konsentrasi 1 mg/mL (Pietrantoni et al.
2003). Groot et al. (2005) melaporkan bahwa bLf dengan konsentrasi 2 μM dapat
menghambat dendritic cells (DC) sehingga replikasi sel T virus HIV tipe 1.
Mistry et al. (2007) melakukan pengujian aktivitas antivirus HPV dari laktoferin
dengan konsentrasi 1.0 μM dari bLf dan hLf, pada penelitian ini diperoleh hasil
bahwa Lf memiliki aktivitas antivirus HPV tipe 5 dan tipe 16. Chien et al. (2008)
menguji Lf dengan konsentrasi 200 μg/mL dapat menghambat replikasi RNA
pada Japanese encephalitis virus (JEV). El-Fakharany et al. (2012 dan 2013)
melakukan penelitian aktivitas laktoferin pada virus hepatitis C yang memberikan
hasil bahwa laktoferin yang berasal dari susu manusia, unta, sapi dan domba
memiliki aktivitas sebagai antivirus terhadap virus hepatitis C. Laktoferin
rekombinan (rpLF) juga dilaporkan dapat menghambat infeksi yang disebabkan
oleh enterovirus tipe 71 (Chen et al. 2008) dan Lf manusia rekombinan (rphLf)
dapat menurunkan respon sitokin pro-inflamasi dalam metode in vitro inflamasi
serta menghambat proliferasi sel dan progresi dengan metode in vitro melanoma
metastatik atau tumor kulit (Florin et al. 2012).
Laktoferin juga memiliki aktivitas anti-jamur terhadap Candida albicans
(Takakura et al. 2004; Lupetti et al. 2007; Kobayashi et al. 2011). Manzoni et al.
(2012) melaporkan bahwa bLf memiliki aktivitas terhadap beberapa spesies
Candida diantaranya C albicans, C parapsilosis, C glabrata dan C guillermondii.
Selain bersifat antimikroba, antikanker dan antivirus Lf juga dapat bersifat sebagai
anti-parasit Toxoplasma gondii yang pertumbuhannya dapat dihambat oleh hLf

5
dengan konsentrasi ≥100 μg/mL (Dzitko et al. 2007). Ordaz-Pichardo et al.(2013)
dalam ulasannya menyatakan bahwa Lf dapat bersifat sebagai anti-parasit
terhadap Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Plasmodium falciparum,
Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Babesia caballi, Eimeria steidai,
Pneumocystis carinii dan Microsporidia.
Pemurnian Laktoferin
Pemurnian Lf dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode
diantaranya adalah dengan menggunakan kromatografi penukar ion, kromatografi
filtrasi gel, kromatografi afinitas dan kromatografi dua dimensi yang
menggabungkan dua metode kromatografi. Prinsip umum dari kromatografi
penukar ion adalah pertukaran antara gugus fungsi yang memiliki muatan
berlawanan dari muatan biomolekul yang akan dipisahkan (Harvey 2000; Manz et
al. 2004; Miekkelsen dan Corton 2004; Sivasankar 2014). Fase diam merupakan
resin yang umumnya dekstran, agarosa selulosa dan akrilamida yang diimobilisasi
dengan gugus bermuatan, sedangkan fase geraknya adalah larutan garam dengan
peningkatan kekutan ion yang berfungsi untuk mengurangi interaksi biomolekul
yang terikat pada resin (Miekkelsen dan Corton 2004). Muatan resin berlawanan
dengan muatan pada biomolekul yang akan dipisahkan, jika biomolekul
bermuatan positif maka resin yang akan digunakan memiliki muatan negatif
(penukar kation) dan biomolekul bermuatan negatif maka resin yang digunakan
harus bermuatan positif (penukar anion) (Manz et al. 2004). Kromatografi
penukar ion dibagi menjadi empat tipe, yaitu, penukar kation keras, penukar
kation lemah, penukar anion kuat dan penukar anion lemah. Tipe ini berdasarkan
muatan dan kapasitas penukar ion pada pH fase gerak yang digunakan (Manz et al.
2004; Sivasankar 2014). Jenis, tipe resin dan gugus penukar ion ditampilkan pada
Tabel 2.
Tabel 2 Jenis resin dan gugus penukar ion
Tipe
Kation
Anion

Klasifikasi
Kuat
Lemah
Kuat
Intermediet
Lemah

Nama
Sulfopropil (SP)
Karboksimetil (CM)
Trietilaminoetil (TEAE)
Dietilaminoetil (DEAE)
p-Aminobenzil (PAB)

Gugus Fungsi
-OCH2CH2CH2SO3-OCH2COO-OCH2CH2N+(C2H5)3
-OCH2CH2N(C2H5)2
-OCH2(C6H4)NH2

(Miekkelsen dan Corton 2004; Sivasankar 2014)

Beberapa penelitain melakukan pemurnian Lf metode kromatografi penukar
ion menggunakan beberapa jenis resin antara lain resin S-Sepharose dengan
larutan dapar fosfat pH 7.0 konsentrasi NaCl 0.5 M (Hoek et al. 1997), resin SPSepharose dengan fase gerak NaCl 1 M dalam larutan dapar fosfat pH 7.4 dan laju
alir 3 mL/menit (Conesa et al. 2008), resin penukar kation keras Fastline SP
dengan tingkat kemurnian 88.5% (Du et al. 2013). Abdel-Salam et al. (2014) dan
Moradian et al. (2014) melakukan isolasi dan pemurnian Lf dari kolostrum sapi
dengan menggunakan metode kromatografi penukar kation dengan resin penukar
kation yang digunakan, yaitu karboksimetil Sephadex C-50. Resin penukar kation
CM Sephadex C-50 memiliki kemampuan untuk memisahkan protein dengan
rentang bobot molekul 4-100 kDa (Sivasankar 2014). Resin ini cocok digunakan

6
untuk memurnikan Lf yang memiliki muatan positif dan bobot molekul sekitar 80
kDa, bobot molekul Lf berada pada rentang bobot molekul resin ini.
Metode kromatografi filtrasi gel juga umum digunakan dalam pemisahan
dan pemurnian Lf. Metode kromatografi filtrasi gel memiliki nama lain, yaitu
kromatografi ukuran molekul dan kromatografi permeasi gel. Prinsip umum
pemisahan dengan metode kromatografi filtrasi gel ini adalah kemampuan
biomolekul untuk tereksklusi dari gel. Biomolekul yang memiliki ukuran kecil
kan tertahan pada gel dan biomolekul yang memiliki ukuran besar akan
tereksklusi pertama (Miekkelsen dan Corton 2004). Matriks penyusun gel pada
kromatografi filtrasi gel umumnya adalah taut-silang dextran, agarosa, dan
poliakrilamida. Derajat taut silang merupakan faktor penting pada batas rentang
ukuran molekul hasil fraksinasi (Sivasankar 2014). Kemampuan resin dalam
memisahkan biomolekul berdasarkan ukuran dan bobot molekulnya diperlihatkan
pada Tabel 3.
Tabel 3 Jenis gel untuk pemurnian biomolekul pada kromatografi filtrasi gel
Jenis gel
Sephadex G-10
Sephadex G-15
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-75
Sephadex G-100
Sephadex G-200
Sepharose 2B
Sepharose 4B
Sepharose 6B
Sephacryl S-100
Sephacryl S-200
Sephacryl S-300
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-150
Bio-Gel P-200

Rentang bobot molekul (Dalton)
700
1500
1000-5000
1500-3000
3000-80 000
4000-150 000
5000-600 000
70 000-40 000 000
60 000- 20 000 000
10 000-4 000 000
1000- 75 000
3000- 160 000
5000- 1 000 000
5000-1 000 000
15 000-150 000
30 000- 200 000

(Miekkelsen dan Corton 2004; Sivasankar 2014)

El-Hatmi et al. (2006) melakukan pemurnian dengan metode kromatografi
filtrasi gel menggunakan kolom Sephadex G-100 di dalam larutan dapar Tris-HCl
0.02 M dengan pH 8.6. Pemurnian Lf dapat juga dilakukan dengan metode
kromatografi dua dimensi. Wu dan Xu (2009) yang melakukan kromatografi
penukar kation dengan menggunakan resin CM Sepharose dan dilanjutkan dengan
kromatografi penukar anion dengan menggunakan resin DEAE Sepharose
memperoleh tingkat kemurnian Lf 95.0%, El-Fakharany et al. (2013) melakukan
kromatografi penukar ion memakai resin Mono S 5/50 dan kromatografi filtrasi
gel dengan fase diam resin Superdex 200 5/150.
Metode lain yang dapat digunakan untuk pemurnian Lf adalah kromatografi
afinitas. Hodgkinson et al. (2008) melakukan pemurnian Lf dengan metode
kromatografi afinitas memakai resin Heparin Sepharose 6 Fast Flow yang dielusi
pada larutan dapar sodium fosfat 0.01 M dengan pH 7.4, laju alir 120 mL/jam dan
gradien bertingkat NaCl 0.7-0.9 M . Le Parc et al. (2014) melakukan pemurnian

7
Lf yang berasal dari susu kambing dengan menggunakan metode kromatografi
afinitas memakai resin heparin Sepharose. Nam et al. (1999) melakukan
pemurnian dan karakterisasi Lf yang berasal dari kambing asli korea dengan
menggabungkan metode kromatografi penukar ion dan kromatografi afinitas
menggunakan resin CM-Toyopearl 650 dan AF-Heparin Toyoperal 650M. Dari
hasil penelitian ini diperoleh bahwa bobot molekul Lf yang diisolasi dari kambing
asli Korea adalah 82 kDa.

3 METODE
Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2014 sampai Juni 2015 di Pusat
Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat
Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB).
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kolostrum kambing
peranakan etawa yang dikoleksi 2-4 hari setelah melahirkan dan sumber
kolostrum diambil dari peternakan komersil di daerah Cibinong Bogor. Bahan
untuk kultur sel adalah sel HeLa (American Type Culture Collection CCl2-HPV).
Bahan media kultur sel yang digunakan antara lain media Dulbecco’s Modified
Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), larutan dapar fosfat pH 7.4,
tripsin. Bahan lain yang digunakan, yaitu resin CM Sephadex C-50, resin
Sephadex G-75, HCl 3N, NaOH 3N, NaCl, Kaleidoscop Standard Molecular
Weight (Biorad), kit bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Pierce, USA),
pewarna Coomassie blue, pewarna Evans blue, reagen Bradford, bovine serum
albumin (BSA), polietilenglikol (PEG), membran dialisis (MWCO 12-14000),
QiaAmp Blood deoxyribonucleic acid (DNA) mini kit (Qiagen), primer
MY09/MY11, SSofast Evagreen master mix.
Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kolom kromatografi dengan
diameter 9 mm, inkubator CO2 (Binder, Tuttlingen, DE), bench-top centrifuge
(Flexplin, Tokyo, JP), micro centrifuge (Thermo Scientific, Osterode, DE),
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Reader (Biorad, Palo Alto, US),
safety cabinet (NuAire, Minnesota, US) iQ5 Real Time Polymerase Chain
Reaction (PCR) (BioRad, Palo Alto, US) dan peralatan kaca lainnya yang umum
digunakan.

8
Prosedur Kerja
Isolasi dan Pemurnian Laktoferin (Modifikasi Moradian et al. 2014)
Kolostrum kambing peranakan etawa diambil sebanyak 30 mL, disentrifugasi
selama 20 menit dengan kecepatan 10000 xG pada suhu 4 °C sehingga menjadi
susu skim. Kasein dihilangkan dari susu skim ini dengan cara menambahkan HCl
3N diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. pH dinetralkan sampai 6.8
dengan cara menambahkan NaOH 3N. Sisa protein diendapkan dengan
menggunakan (NH4)2SO4 48 %, selanjutnya dilakukan pemisahan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 10000 xG selama 30 menit dengan suhu 4 °C
(modifikasi pada suhu inkubasi, konsentrasi HCL dan NaOH, pemekatan protein
dan pemisahan dengan kromatagrfi dua dimensi). Protein dipekatkan dengan
menggunakan membran dialisis yang dibenamkan dalam PEG. Laktoferin akan
dimurnikan dengan menggunakan kromatografi 2 metode, yaitu kromatografi
penukar ion yang menggunakan resin CM Sephadex C-50 dan kromatografi
filtrasi gel menggunakan resin Sephadex G-75. Untuk tahapan pada kromatografi
penukar ion dilakukan elusi gradien dilakukan secara stepwise dengan
menggunakan larutan NaCl 0-0.5 N yang dilarutkan dalam PBS pH 7.4 dengan
panjang kolom 15-17 cm dan lebar 9 mm, laju alir 1 mL/menit. Fraksi yang
terbaik pemisahan protein dengan kromatografi ion dilanjutkan untuk pemisahan
dengan kromatografi filtrasi gel. Elusi pada kromatografi filtrasi gel ini
menggunakan PBS sebagai fase gerak dengan panjang kolom 15-17 cm dan lebar
9 mm. Selanjutnya fraksi protein dikumpulkan sebanyak 10-15 mL lalu
dipekatkan dengan menggunakan membran dialisis dan akan dianalisis
pemisahannya dengan elektroforesis SDS-PAGE.
Elektroforesis SDS-PAGE
Fraksi protein yang telah diperoleh dari proses pemurnian dianalisis dengan
elektroforesis SDS-PAGE. Sebanyak 15 μL sampel Lf ditambahkan dengan 15 μL
sampel larutan dapar kemudian dipanaskan pada suhu 100 oC di atas penangas air
selama 2 menit. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 125 Volt selama 1 jam.
Sebagai penanda berat molekul protein digunakan Kaleidoscop Standard
Molecular Weight (Biorad). Gel hasil elektroforesis diwarnai (staining)
menggunakan coomassie blue untuk mendapatkan kisaran berat molekul gLf dan
sebagai pembanding digunakan bLf komersil.
Penentuan Total Protein
Penghitungan total protein gLF dilakukan dengan menggunakan kit BCA
protein assay (Pierce, USA) yang mengandung reagen A dan reagen B. Larutan
reagen A merupakan larutan yang mengandung reagen BCA dan reagen B
merupakan larutan CuSO4. Reagen A dicampur dengan reagen B dengan
perbandingan 50:1 sehingga didapatkan Working Reagent (WR). Masing-masing
10 μL standar protein dengan konsentrasi 0, 250, 500, 750, 1000, dan 1500 μg/mL
dan gLF dipipet ke sumur plat ELISA. Sebanyak 200 μL WR ditambahkan pada
semua sumur yang berisi standar protein dan sampel gLF, selanjutnyadiinkubasi
selama 30 menit pada suhu 37 °C. Pembacaan densitas optik dilakukan

9
menggunakan ELISA Reader (Biorad) pada panjang gelombang 595 nm. Kurva
standar dari protein dapat digunakan untuk menentukan besarnya konsentrasi total
protein gLF pada kolostrum susu kambing peranakan etawa.
Kultur Sel HeLa
Sel HeLa yang ditumbuhkan dalam media penumbuh DMEM yang
mengandung FBS 10% dan antibiotik (penisilin dan streptomisin). Sel
ditumbuhkan dalam plat kultur 48 sumur dengan konsentrasi sel 105 untuk setiap
sumurnya. Sel diinkubasi selama 24 jam, ditambahkan gLF kambing peranakan
etawa dan pembandingnya bLf dengan variasi konsentrasi 50, 100, dan 200
μg/mL serta kontrol negatif yang merupakan sel HeLa tanpa sampel. Pellet dari
masing-masing sumur dan kontrol negatif dipanen dalam rentang waktu 24, 48,
dan 72 jam setelah diinkubasi dengan sampel. Pellet dibilas dengan PBS steril dan
ditambahkan 200 μL PBS steril, kemudian disimpan dalam lemari pendingin.
Ekspresi Gen dengan Teknik Real Time PCR
Pellet dari masing-masing sampel tersebut selanjutnya dilakukan ekstraksi
DNA nya menggunakan QiaAmp Blood DNA mini kit (Qiagen). DNA masingmasing sampel selanjutnya diamplifikasi dengan teknik real time PCR (iQ5 Real
Time PCR, BioRad), primer yang digunakan, yaitu MY09 dan MY1. Pola
penghambatan replikasi DNA virus HPV menggunakan EvaGreen (BioRad).
Analisis yang dilakukan bersifat kuantitatif relatif dengan melihat pola
penghambatan replikasi berdasarkan pergeseran nilai Ct (cycle threshold) pada
sampel dan dibandingkan dengan kontrol negatif. Analisis data dilakukan
menggunakan iQ5 optical system software (BioRad). Analisis secara kualitatif
menggunakan teknik PCR konvensional untuk mendeskripsikan penghambatan
berdasarkan ketebalan pita yang dihasilkan.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Pemurnian Laktoferin
Profil pemurnian protein yang telah diisolasi ditampilkan pada SDS-PAGE.
Dari 100 mL kolostrum kambing peranakan etawa hanya menghasilkan sekitar
1% Lf murni. Fraksi protein yang dipisahkan dengan menggunakan kromatografi
penukar ion dengan gradien elusi NaCl 0-1.5 N ditunjukkan pada Gambar 2. Hasil
SDS-PAGE memeperlihatkan bahwa pita yang sejajar dengan standar bLf dan
penanda protein yang bobotnya 86 kDa adalah Lf dan semakin tinggi konsentrasi
NaCl yang digunakan pita Lf terlihat semakin tebal. Hal ini mengindikasikan
bahwa pada Lf sudah terlepas dari resin CM Sephadex C-50. Hasil penelitian ini
berbeda dengan Moradian et al. (2014) yang berhasil memurnikan Lf yang berasal
dari kolostrum sapi hanya dengan satu tahapan kromatografi menggunakan resin
CM Sephadex C-50, monitoring dengan alat UV sehingga memudahkan dalam
proses pemurnian. Pada penelitian ini dilakukan pemurnian dengan manual dan
sulit untuk menentukan kemurnian Lf tanpa bantuan visualisasi.

10

Gambar 2 Elektroforegram gradien konsentrasi NaCl (M: penanda berat molekul,
0.0-0.5: konsentrasi NaCl untuk elusi, bLf: laktoferin sapi komersil)
Pemurnian Lf dilakukan dengan menggunakan resin penukar kation CM
sephadex-C50 dengan gradien elusi 0.5 N NaCl dan hasil SDS-PAGE ditunjukkan
pada Gambar 3. Fraksi 1 hingga fraksi ke 7 memperlihatkan bahwa Lf tertahan
pada fraksi kedua sampai fraksi kelima. Pemurnian dengan satu tahapan
kromatografi menggunakan metode kromatografi ion belum berhasil untuk
memurnikan Lf, hanya mampu memisahkan Lf dengan protein lainnya. Untuk
memaksimalkan kemurnian Lf maka dilakukan kromatografi dua dimensi, yaitu
kromatografi penukaran ion dengan menggunakan resin CM Sephadex-C50 lalu
dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel dengan resin Sephadex-G75.

Gambar 3 Elektroforegram fraksi 1-7 elusi 0.5 N NaCl

11
Pemisahan protein yang dilakukan dengan dua tahapan kromatografi
memperlihatkan bahwa pemisahan lebih baik jika dibandingkan dengan
pemisahan Lf dari protein lainnya jika hanya menggunakan kromatografi penukar
ion saja. Hasil SDS-PAGE pada Gambar 4 memperlihatkan fraksi 1 terlihat
adanya pita tunggal yang sejajar dengan standar bLf tetapi pita ini tipis, diduga
konsentrasi Lf pada fraksi ini sangat kecil. Fraksi 3 hingga fraksi 7
memperlihatkan adanya pita protein yang sejajar dengan pita bLf yang diduga
adalah Lf yang lebih konsentrat jika dibandingkan dengan pita Lf pada fraksi 1
hanya saja pada fraksi 3-7 terdapat protein-protein lain yang juga tereksklusi.

Gambar 4 Ektroforegram hasil kromatografi dua tahapan fraksi1-7
Gambar 5 memperlihatkan kemurnian yang diperoleh dari pemisahan Lf
dengan protein lainnya menggunakan metode kromatografi 2 tahapan. Pita yang
dihasilkan sejajar dengan standar bLf yang digunakan. Pita gLf yang dihasilkan
dari SDS-PAGE ini juga sejajar dengan penanda standar protein yaitu BSA
(bovine serum albumin) yang memiliki bobot molekul 82 kDa. Dari hasil SDSPAGE ini dapat dinyatakan bahwa Lf yang dihasilkan dari proses isolasi dan
pemurnian ini memiliki bobot sekitar 80 kDa. Pemurnian Lf dengan dua dimensi
kromatografi ini mendapatkan hasil yang lebih baik dari pemisahan jika hanya
menggunakan kromatografi penukar ion saja. Keuntungan dari kromatografi dua
dimensi ini adalah pemisahannya yang lebih selektif, kromatografi penukar ion
dengan resin CM Sephadex C-50 mampu memisahkan protein berdasarkan
muatan dan kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-75 yang dapat
memisahkan protein dengan bobot molekul sampai 80 kDa. Laktoferin memiliki
bobot molekul yang berkisaran 80 kDa seecara teoritis akan tereksklusi pertama
dari resin dibandingkan dengan protein yang bobot molekulnya lebih kecil. Bobot
molekul Lf murni yang dihasilkan dari proses isolasi dua tahapan ini adalah 82
kDa dan konsentrasi Lf yang ditentukan dengan metode BCA assay adalah 379
μg/mL.

12

Gambar 5

Elektroforegram purifikasi gLf dengan 2 tahapan kromatografi (M:
penanda bobot molekul protein standar (rentang rendah), bLf:
laktoferin sapi dan gLf: laktoferin kambing)

Conesa et al. (2008) memurnikan Lf dari berbagai spesies, yaitu, manusia,
domba, kambing, unta, gajah dan anjing laut abu-abu. El-Fakharani et al. (2013)
juga memurnikan Lf dari manusia, unta, sapi dan domba, dari penelitian ini
dihasilkan pita bobot molekul Lf yang hampir sejajar satu dengan yang lainnya
pada elektroforesis SDS-PAGE.Hal ini mengindikasikan bahwa Lf dari berbagai
spesies memiliki bobot molekul yang hampir sama atau sekitar 80 kDa.
Profil Inhibisi Laktoferin terhadap DNA HPV
Laktoferin memiliki kemampuan untuk mengikat DNA ataupun RNA dari
suatu virus tertentu. Kemampuan Lf untuk bertindak sebagai antivirus
dikarenakan adanya suatu reseptor umum dan reseptor yang spesifik pada
permukaan sel target sebagai tempat menempelnya virus untuk masuk ke dalam
sel inang. Reseptor ini khas untuk setiap jenis sel misalnya pada mukosa sel epitel,
hepatosit, monosit, makrofag, leukosit polimorfonuklear, limfosit, trombosit, dan
fibroblast. Mekanisme yang paling utama bertindak sebagai pertahanan bagi agen
antivirus adalah pengikatan dan pemblokan pada reseptor glikosaminoglikan virus
terutama pada heparan sulfat . Dengan cara ini, Lf mencegah virus memasuki sel
dan infeksi dapat dicegah pada tahapan awal (Pellegrini dan Engels 2005;
Adlerova et al. 2008; Berlutti et al. 2011; El-Loly dan Mahfous, 2011 ).
Kemampuan Lf untuk berinteraksi dengan reseptor pada virus diperlihatkan
melalui Gambar 6.

13

virus
laktoferin
n

heparan sulfat
reseptor spesifik
virus

(Sumber: Chaves et al. 2009)

Gambar 6 Mekanisme aktivitas antivirus laktoferin
Aktivitas gLf sebagai anti-HPV secara in vitro terhadap sel HeLa
memperlihatkan adanya hambatan replikasi DNA virus HPV. Hambatan replikasi
DNA virus HPV ini ditandai dengan adanya peningkatan nilai Ct (cycle threshold)
dari sel HeLa yang diinkubasi dengan gLf. Nilai Ct ditampilkan pada Tabel 4.
Tabel 4 Nilai Ct dan persen hambat gLf dan bLf terhadap virus HPV dari pellet
sel lestari HeLa
Hari
ke1
2
3

Kontrol
negatif
32.97
27
28

Nilai Ct
gLf
bLf
[100 μg/mL]
[100 μg/mL]
32.09
32.49
31.94
28.49
36.73
31.37

Selisih nilai Ct (%)
gLf
-2.67
18.30
31.18

bLf
-1.46
5.52
12.04

Nilai Ct mengindikasikan jumlah siklus yang dibutuhkan oleh DNA untuk
terdeteksi pada detektor instrumen real time PCR. Nilai Ct ini akan berbanding
terbalik dengan konsentrasi DNA virus. Dari hasil uji aktivitas terhadap sel HeLa
terdapat peningkatan nilai Ct setelah diinkubasi dengan Lf. Inkubasi setelah 24
jam belum terjadi penghambatan replikasi DNA virus, hal ini bisa disebabkan Lf
belum terikat pada DNA virus HPV. Pada hari kedua dan hari ketiga terjadi
peningkatan nilai Ct yang mengindikasikan terjadinya penghambatan replikasi
DNA HPV. Penghambatan replikasi DNA HPV tertinggi terjadi pada hari ketiga
setelah inkubasi pada gLf 100 μg/mL dengan selisih nilai Ct dari kontrol negatif
sebesar 31.18 %. Nilai Ct yang dihasilkan dari inkubasi dengan gLf lebih besar
dibandingkan inkubasi dengan bLf. Dari hasil perbedaan nilai Ct sel HeLa yang di
tambah Lf pada sel HeLa yang tidak ditambahkan Lf mengindikasikan bahwa Lf
dapat menghambat replikasi DNA HPV atau dapat dinyatakan bahwa Lf memiliki
aktivitas antivirus terhadap HPV.

14

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Laktoferin diperoleh dengan menggunakan metode pemurnian kromatografi
dua dimensi penukar ion (karboksimetil Sephadex C-50) dan filtrasi gel
(Sephadex G-75). Konsentrasi gLf yang diperoleh, yaitu 379 μg/mL dengan bobot
molekul 82 kDa. Laktoferin memiliki kemampuan penghambatan replikasi DNA
virus HPV dengan konsentrasi gLf 100 μg/mL setelah tiga hari inkubasi dalam sel
HeLa.
Saran
Karakterisasi Lf perlu dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotidanya
dan dibandingkan dengan urutan nukleotida hLf dan bLf yang telah diteliti
sebelumnya .

DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Salam A, Alhabri KB, Magzoub MA, Mousa HM. 2014. Effect of heat
treatment on the chromatographic detection, electrophoretic pattern and
antimocrobial activity purified from camel milk. J Food Agri Environ. 12(2).
20-23.
Adam S, Zitka O, Dolezal P, Zeman L, Horma A, Hubalek J, Sileny J, Krizkova S,
Trnkova L, Kizek R. 2008. Lactoferrin isolation using monolithic column
coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors 8: 464487.
Adlerova L, Bartoskova A, Faldyna M. 2008. Lactoferrin : A review. Vet Med.
53(9): 457-468.
Baker EN, Baker HM. 2005. Molecular structure, binding properties and dynamic
of lactoferrin. Cell Mol Life Sci. 62. 2531-2539. doi:10.1007/s00018-0055368-09.
Berlutti F, Pantanella F, Natalizi T, Frioni A, Paesano R, Polimeni A, Valenti P.
2011. Antiviral properties of lactoferrin-a natural immunity molecule.
Molecules 16: 6992-7018. doi:10.3390/molecules16086992.
Bezault J, Bhimani R, Wiprovnick J, Furmanski P. 1994. Human lactoferrin
inhibits growth of solid tumors and development of experimental metastates
in mice. Cancer Res. 54: 2310-2312
Campanella L, Martini E, Pintore M, Tomassetti M. 2009. Determination of
lactoferrin and immunoglobulin G in animal milk by New Immunosensors.
Sensors 9: 2202-2221. doi:10.3390/s90302202.
Chaves SAG, Gallegos SA, Cruz QR. 2009. Lactoferrin: structure, function and
application.
Int
J
Antimicrob
Agents.
33:301Le1-301Le8.
doi:10.1016/j.ijantimicag.2008.07.020.

15
Chen HL, Wang LC, Chang CH, Yen CC, Cheng WTK, Wu SC, Hung CM, Kuo
MF, Chen CM. 2008. Recombinant porcine lactoferrin express in the milk
of transgenic mice protect neonatal mice from a lethal challange with
enterovirus
type
71.
Vaccine
26:
891-898.
doi:10.1016/j.vaccine.2007.12.013.
Chien YJ, Chen WJ, Hsu WL, Chiou SS. 2008. Bovine lactoferrin inhibits
Japanese enchephalitis virus by binding to heparan sulfate and receptor for
low
density
lipoprotein.
Virol.
379:
143-151.
doi:10.1016/j.virol.2008.06.017.
Conesa C, Sanchez, l, Rota C, Perez MD, Calvo M, Farnaud S, Evans RW. 2008.
Isolation of lactoferrin from milk different species: calorimetric and
antimicrobial studies. Comp Biochem Physiol. Part B 150: 131-139.
doi:10.1016/j.cbpb.2008.02.005.
Davoodi H, Esmaeili S, Mortazavian AM. 2013. Effect of milk and milk products
consumption on cancer: a review. Comp Rev Food Sci Food Safety. 12: 249264. doi:10.1111/1541-4337.12011.
Drackova M, Borkovcova I, janstova B, Naiserova M, Pridalova H, Navratilova P,
Vorlova L. 2009. Determination of lactoferrin in goat milk by HPLC
method. Czech J Food Sci. 27: S102- S104.
Du QY, Lin DQ, Xiong ZS, Yao SJ. 2013. One step purification of lactoferrin
from rude sweet whey using cation-exchange expanded bed adsorption. Ind.
Eng Chem. Res.52:2693-2699. dx.doi.org/10.1021/ie302606z.
Dzitko K, Dziadek B, Dziadek J, Dlugonska. 2007. Toxoplasma gondii: Inhibition
of the intracellular growth by human lactoferrin. Polish J Microbiol. 56(1):
25-32.
Ebringer L, Ferencik M, Krajovic J. 2008. Beneficial health effect of milk and
fermented dairy products-Review. Folia Microbiol. 53 (5): 378-394.
Elagamy EI, Ruppanner R, Ismail A, Champagne CP, Asaaf R. 1994. Purification
and characterization of lactoferrin, lactoperoxidase, lysozym and
immunoglobulins from Camel’s milk. Int Dairy J. 6:129-145.
El-Fakharany EM, Abedelbaky N, Haroun BM, San hez L, Redwan NA, Redwan
EM. 2012. Anti-infectivity of camel polyclonal antibodies againts hepatitis
C virus in Huh dan.5 hepatoma. J Virol. 9 (201): 1-9.
El-Fakharany, Sanchez L, Al-Mehdar HA, Redwan EM. 2013. Effectiveness of
human, camel, bovine and sheep lactoferrin on the hepatitis C virus cellular
infectivity: comparasion study. J Virol. 10(199): 1-10.
El-Hatmi
H, Levieux A, Levieux D. Camel (Camelus dromedarius)
immunoglobulin G, α-lactabumin, serum albumin and lactoferrin in
colostrum and milk during early post partum period. 2006. J Dairy Res. 73:
288-293. doi:10.1017/S0022029906001713.
El-Loly MM, Mahfouz MB. 2011. Lactoferrin in relation to biological functions
and applications: a review. Int J Dairy Sci. 6(2): 79-111.
doi:10.3923/ijdss.2011.79.111.
Florin PE, Moisei M, Trif M, Evans, RW, Roseanu A. 2012. Anti-inflamatory and
anti-tumor activity of human recombinant lactoferrin. Rom J Biochem.
49(2): 163-171.

16
Fujita K, Matsuda E, Sekine K, Iigo m, Tsuda H. 2004. Lactoferrin enhances fas
expression and apoptosis in the colon mucosa of azoxymethane-trated rats.
Carcin. 25(10): 1961-1966. doi:10.1093/carcin/bgh205.
Groot F, Geijtenbeek TBH, Sanders RW, Baldwin CE, Sanches-Hernandez M,
Floris R, van Kooyk Y, de Jong EC, Barkhout B. 2005. Lactoferrin prevents
Dendritic Cell-mediated human immunodeficiency virus type 1 transmission
by blocking the DC_SIGN-gp120 interaction. J Virol. 79(5): 3009-3015.
doi:10.1128/jvi.79.5.3009-3015.2005.
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Boston (US): McGraw-Hill
Higher Education.
Hodgikson AJ, Ross KM, Fahey SN, Prosser CG. 2008. Quantification of
lactoferrin in milk from New Zealand diary goats. Proceedings of the New
Zealand Society of Animal Production. 68 :166-169.
Hoek KS, Milne JM, Grieve PA, Dionysius DA, Smith R. 1997. Antibacterial
activity of bovine lactoferrin-derivated peptides. Antimicrob Agents Chemo.
41(1): 54-59.
Indyk HE, Filonzi EL. 2004. Determination of lactoferrin in bovine milk,
colostrum and infant formulas by optical biosensor analysis. Int Dairy J.
15:429-438.
Kobayashi T, Kakeya H, Miyazaki T, Izumakiwa K, Yanagahira K, Ohno H,
Yamamoto Y, Tashiro T, Kohno S. 2011. Synergistic antifungal effect of
lactoferrin with azole antifungals againts Candida albicans for invasive
candidiasis. Jpn J Infect. Dis. 64: 292-296.
Le Parc A, Dallas DC, Duant S, Leonil J, Martin P, Barile D. 2014.
Characterization of goat milk lactoferrin N-glycans and comparison with the
N-glycomes of human and bovine milk. Electrophoresis. 35(11):