SV disentrifus dalam mikrosentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Minikolom SV dipindahkan dari rakitan kolom putar dan cairan
dikeluarkan dari tabung koleksi. Minikolom dalam tabung koleksi dicuci dengan menambahkan 700 µl larutan pencuci membran yang sebelumnya dilarutkan
dengan etanol 95. Cairan dalam rakitan minikolom SV disentrifus dengan kecepatan 14.000
rpm selama 1 menit. Pencucian diulangi dengan 500 µl larutan pencuci membran dan disentrifusi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Rakitan minikolom
SV dari sentrifus dipindahkan secara hati-hati. Tabung koleksi dikosongkan dan dilakukan sentrifus ulang dari kolom rakitan selama 1 menit dengan
mikrosentrifus yang tutupnya terbuka agar residu etanol terevaporasi sebanyak- banyaknya. Selanjutnya minikolom SV dipindahkan secara hati-hati ke tabung
mikrosentrifus 1,5 ml. Air bebas ion-nuklease sebanyak 50 µl ditambahkan pada minikolom SV secara langsung ke tengah kolom tanpa menyentuh membran
dengan ujung pipet dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Minikolom SV tersebut disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit dan tabung
mikrosentrifus yang mengandung DNA disimpan pada suhu 4°C atau -20°C. Pengecekan hasil purifikasi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan
agarose 1 dengan daya 65 volt selama 1 jam. Hasil elektroforesis diamati
menggunakan lampu UV.
Sekuensing DNA Hasil pemurnian disekuen dengan metode Sanger menggunakan alat ABI
3730XL Sambrook et al. 1989. Data yang diperoleh digunakan untuk analisis bioinformatika BLAST berdasarkan aksesi data base dari Bank Gen http:
www.ncbi.nlm.nih.gov [10 Juli 2011].
4. Perlakuan Media Tumbuh
4.1. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan percobaan faktorial dengan dua faktor yaitu
faktor pertama komposisi air untuk media yang terdiri dari lima taraf yaitu aquades:SAP dengan perbandingan 1:0, 0:1, 1:1, 2:1, dan 1:2 vv. Faktor kedua
konsentrasi P yang terdiri dari tiga taraf yaitu 40, 80 dan 120 ppm. Masing- masingkombinasi perlakuan dilakukan tiga ulangan, sehingga secara keseluruhan
ada 45 satuan percobaan. Percobaan disusun berdasarkan rancangan acak kelompok RAK.
4.2. Persiapan Media Tumbuh Isolat mikroalga ditumbuhkan pada media BG 11 Lampiran 1 yang
mengandung berbagai macam hara makro dan hara mikro yang dibutuhkan oleh mikroalga. Pembuatan stok bahan berupa K
2
HPO
4
, NaNO
3
,MgSO
4
.7H
2
O, CaCl
2
.2H
2
O,Citric Acid,Fe- Amonium Citrat, Na
2
EDTA,Na
2
CO
3
, trace element untuk pembuatan media BG11 komposisi pada Lampiran 1 disiapkan dengan
menggunakan botol yang berbeda untuk masing-masing bahan dalam keadaan steril. Persiapan media untuk perlakuan harus dilakukan dalam keadaan segar
dibuat segera sebelum dipakai. Tahapan perlakuan untuk unsur P menggunakan K
2
HPO
4
sebagai sumber P dari media BG 11 diberikan bervariasi dengan konsentrasi P 40, 80 dan 120 ppm sesuai dengan perlakuan yang akan diberikan
sebanyak 1 ml untuk 1 liter air media. 4.3. Pelaksanaan Penelitian
Botol media ukuran 500 ml yang steril diisi dengan air media yang berbeda sesuai dengan perlakuan air media yang akan diberikan dengan
perbandingan secara berurutan air media: media BG11, yaitu 346,4 ml: 3,6 mldan dilakukan dalam ruang laminar. Masing-masing botol media diberi media BG 11
yang sudah disiapkan dalam keadaan segar sebanyak 1 ml dalam 1 l air media untuk setiap stok bahan. Media BG 11 yang dipakai mengandung N 0,5 M dan
konsentrasi P 40, 80 dan 120 ppm. Botol media yang telah siap segera diisi dengan isolat mikroalga yang telah memiliki Optical density OD 1 sebanyak
50 ml dan ditutup dengan penutup botol yang telah dimodifikasi dalam kondisi steril, lalu diberi selang aerator dan lubang pengeluaran udara.
Penempatan botol dilakukan dalam rak yang dilengkapi lampu TL yang mempunyai intensitas cahaya 70 µmol foton m
2 -1
detik
-1
5000 lux dengan rentangan suhu 24-28°C, penyinaran dilakukan selama 24 jam hari
-1
, dan rak
ditutup dengan kain hitam untuk mengurangi pengaruh dari lingkungan luar Gambar 3. Pengamatan dilakukan selama 16 hari.
Gambar 3
Denah percobaan dalam penempatan botol perlakuan berupa komposisiair media A1 aquades: SAP 1:0vv,
A2 Aquades:SAP 0:1vv A3 aquades:SAP 1:1vv, A4 aquades:SAP 1:2vv, A5 aquades:SAP 2:1vv
dan P1 konsentrasi P 40 ppm, P2 konsentrasi P 80 ppm, P3 konsentrasi P 120 ppm.
4.4 Peubah yang diamati
Pertumbuhan Pengukuran pertumbuhan sel mikroalga dilakukan dengan mengukur OD
kultur mikroalga yang dilakukan setiap 2 hari sekali selama 16 hari pengamatan. OD diukur dengan cara sampel tiap perlakuan diambil sebanyak 8 ml dan
dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 680 nm Lee et al. 1998.
Biomassa Pengukuran bobot basah dan bobot kering dilakukan pada hari ke-16.
Pengukuran dilakukan dengan cara mengambil 100 ml kultur mikroalga, kemudian disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil
peletnya sebagai bobot basah. Selanjutnya pelet di oven pada suhu 80°C selama 24 jam. Biomassa yang telah kering kemudian ditimbang sebagai bobot kering.
Kandungan Lipid Pengukuran kandungan lipid dilakukan pada hari ke-16 dengan proses
ekstraksi. Lipid mikroalga diukur dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh
Bligh dan Dyer 1959 yang telah dimodifikasi dalam hal kecepatan sentrifus diubah menjadi 3000 rpm selama 10 menit. Metode ini menggunakan pelarut
metanol dan kloroform. Pengujian kandungan lipid mikroalga dilakukan dengan cara biomassa mikroalga yang telah kering ditambah dengan 2 ml air murni, 5 ml
metanol dan 2,5 ml kloroform, selanjutnya digoyang dengan shaker selama 1 malam. Setelah selesai ditambah kembali dengan 2,5 ml air murni dan 2,5 ml
kloroform. Tahap berikutnya larutan disentrifus kembali pada kecepatan 3000 rpm
selama 10 menit dan diambil endapan lipid pelet dan diletakkan di dalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan pada waterbath suhu 200°C untuk menghilangkan
campuran larutan kimia yang ditambahkan sebelumnya. Kandungan lipid mikroalga yang sudah ditumbuhkan pada medium yang sesuai dianalisa dengan
rumus yang digunakan oleh Weldy dan Huesemann 2007 sehingga didapatkan berat lipid. Perhitungan total lipid mikroalga adalah:
Keterangan : Lw = Bobot lipid g Bw = Bobot kering mikroalga g
Produktivitas lipid mikroalga dihitung menggunakan rumus
Kandungan Pati Kandungan pati diukur berdasarkan kandungan gula total mengikuti
metode Cleg-Anthrone Apriyantono et al. 1989 dengan cara 1 g sampel kering atau 2,5 g sampel basah ditambahkan 10 ml air dan dilarutkan dengan 13 ml asam
perklorat 52. Hasil yang diperoleh diencerkan menjadi 100 ml lalu dilakukan penyaringan. Ekstrak yang dihasilkan diencerkan lagi sampai volume 250 ml.
Ekstrak tadi diambil 10 ml dan diencerkan dengan air menjadi volume 100 ml
larutan. Sebanyak 1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing
tabung reaksi dan ditambah 5 ml pereaksi Anthrone dengan cepat. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air 100°C selama 12 menit. Pengukuran
absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm. Hasilnya dibandingkan dengan larutan standar glukosa pada konsentrasi 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm.
Kandungan pati dapat dihitung dengan rumus dari Goni et al. 1997 sebagai berikut
Kandungan pati = kandungan gula 0,9
Kandungan Protein Metode yang digunakan untuk menetapkan kandungan protein adalah
metode Biuret Apriyantono et al. 1989 yang telah dimodifikasi. Pengujian ini dilakukan dengan cara menyiapkan sampel dengan volume total masing-masing 1
ml pada tabung corning ukuran 15 ml. Ke dalam masing-masing tabung corning tersebut ditambahkan 1 ml Trichloro-acetic acid TCA 10 sehingga protein
akan terdenaturasi. Selanjutnya tabung disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap dan supernatan
dibuang dengan cara dekantasi. Ke dalam endapan ditambah dengan 2 ml etil eter dan dicampur merata lalu disentrifus kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama
10 menit untuk menghilangkan residu TCA. Sampel yang sudah siap dibiarkan kering pada suhu kamar dalam ruang
asam. Ke dalam endapan kering ditambahkan 4 ml air dan dicampur merata. Pada saat dilakukan pengukuran protein ditambahkan 6 ml pereaksi biuret. Setelah itu
diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Hasil absorbansinya dibandingkan dengan nilai absorban dengan larutan BSA
pada konsentrasi 0, 20, 40, 60, 80, 100 ppm.
4. Analisis data
