Isolasi Bakteri Proteolitik Dari Pencernaaan Ikan Nila Galur Gift (Oreochromis Niloticus (Linnaeus) Trewavas) Dan Karakterisasi Protease Ekstraselulernya

ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK
DARI PENCERNAAAN IKAN NILA GALUR GIFT
(Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas)
DAN KARAKTERISASI PROTEASE EKSTRASELULERNYA

Oleh:
Irma Fatimah
G34101026

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2005

ABSTRAK

IRMA FATIMAH. Isolasi Bakteri Proteolitik dari Pencernaan Ikan Nila Galur GIFT
(Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) dan Karakterisasi Protease
Ekstraselulernya. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan DINAMELLA
WAHJUNINGRUM.
Bakteri proteolitik yang berhasil diisolasi dari pencernaan ikan nila GIFT (Genetic

Improvement of Farm Tilapias) berjumlah 31 isolat, namun hanya dua isolat yang dikarakterisasi
protease ekstraselulernya dan diidentifikasi sebagai Aeromonas sp. galur NU8 dan Enterobacter
sp. galur NU5. Aeromonas hydrophila yang bersifat patogen digunakan sebagai pembanding.
Protease yang dihasilkan oleh Aeromonas sp. galur NU8 merupakan metaloprotease dengan suhu
optimum 70°C dan pH optimum 7, aktivitas protease sedikit meningkat dengan penambahan 5 mM
K+, dan aktivitas protease menurun dengan penambahan 5 mM EDTA. Aktivitas protease
Aeromonas sp. galur NU8 tidak stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya,
namun stabil pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. Protease
yang dihasilkan oleh Enterobacter sp. galur NU5 merupakan metaloprotease dengan suhu
optimum 50°C dan pH optimum 7, aktivitas protease meningkat dengan penambahan 5 mM Co2+,
dan aktivitas protease menurun dengan penambahan 5 mM EDTA. Aktivitas protease
Enterobacter sp. galur NU5 tidak stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya,
namun stabil pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. A.
hydrophila yang bersifat patogen sebagai pembanding menghasilkan protease dengan suhu
optimum 70°C dan pH optimum 8, aktivitas protease meningkat dengan penambahan 5 mM Cu2+,
dan penambahan 5 mM EDTA tidak mempengaruhi aktivitas proteasenya. Aktivitas protease A.
hydrophila cenderung stabil jika diinkubasi selama 120 menit pada suhu optimumnya dan stabil
juga pada setiap perlakuan pH setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4ºC. Aeromonas sp.
galur NU8 mempunyai aktivitas spesifik protease yang lebih tinggi dibandingkan dengan A.
hydrophila yang patogen dan Enterobacter sp. galur NU5.

ABSTRACT

Isolation of Proteolytic Bacteria from Digestive Tract of Tilapias
Strain GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) and Characterization
of Its Extracellular Protease. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK dan

IRMA FATIMAH.

DINAMELLA WAHJUNINGRUM.
At least 31 isolates of proteolytic bacteria were isolated from digestive tract of Tilapias
strain GIFT (Genetic Improvement of Farm Tilapias), but only 2 isolates that can be used for the
protease characterization. The result showed that both of them are Aeromonas sp. strain NU8 and
Enterobacter sp. strain NU5. They were compared by the pathogenic Aeromonas hydrophila.
Protease of Aeromonas sp. strain NU8 was metaloprotease, the optimum temperature and pH were
70ºC and 7, the protease activity increases by adding 5 mM K+, and decrease by adding 5 mM
EDTA. The protease activity of Aeromonas sp. strain NU8 was unstable when incubated for 120
minutes at the optimum temperature, but stable at all ranges pH after incubated for 1 hour at 4ºC.
Protease of Enterobacter sp. strain NU5 was metaloprotease, the optimum temperature and pH
were 50ºC and 7, the protease activity increases by adding 5 mM Co2+, and decrease by adding 5

mM EDTA. The protease activity of Enterobacter sp. strain NU5 was unstable after incubating for
120 minutes at the optimum temperature, but it is stable at all ranges pH after incubated for 1 hour
at 4ºC. Protease of A. hydrophla was metaloprotease, the optimum temperature and pH were 70ºC
and 8, the protease activity increases by adding 5 mM Cu2+, and there was no effect by adding 5
mM EDTA. The protease activity of A. hydrophila was stable approximately when incubated for
120 minutes at the optimum temperature and it was stable at all ranges pH after incubated for 1
hour at 4ºC. The spesific protease activity of Aeromonas sp. strain NU8 was higher than A.
hydrophila and Enterobacter sp. strain NU5.

ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK
DARI PENCERNAAAN IKAN NILA GALUR GIFT
(Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas)
DAN KARAKTERISASI PROTEASE EKSTRASELULERNYA

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Oleh:
Irma Fatimah
G34101026

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2005

Judul

: ISOLASI BAKTERI PROTEOLITIK DARI SALURAN PENCERNAAN IKAN NILA
GALUR GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) DAN KARAKTERISASI
PROTEASE EKSTRASELULERNYA

Nama

: Irma Fatimah

NIM

: G34101026

Menyetujui,

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP. 1320455531

Dr. Dinamella Wahjuningrum, M.Si.
NIP. 132234940

Mengetahui,
Dekan Fakultas MIPA

Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.
NIP. 131473999

Tanggal Lulus

:................................

PRAKATA
Bismillahirahmanirrahim
Alhamdulillah, segala puji bagi Allah yang selalu memberikan rahmat bagi makhluk-Nya.
Atas ridho serta segala rahmat dan kenikmatan dari Allah SWT, karya ilmiah ini dapat
diselesaikan. Penyusunan karya ilmiah ini berdasarkan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi,
Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik, MSi. dan Dr.
Dinamella Wahjuningrum, MSi. yang telah membimbing penulis selama penelitian dan penulisan
karya ilmiah ini. Demikian pula ucapan terima kasih disampaikan kepada Drs. Tri Atmowidi, Msi.
atas saran dan masukan dalam penulisan skripsi ini. Penelitian ini menggunakan bahan kimia yang
didanai dari penelitian QUE-Biologi tahun 2002-2003.
Ucapan terima kasih terdalam penulis haturkan untuk orang-orang yang sangat
kusayangi: Ayah, Ibu, dan kakakku Evi terima kasih untuk kasih sayang, doa, perhatian, dan
semua dukungannya selama ini. Terima kasih untuk teman-teman Biologi 38 it’s fun to be with
you, khususnya buat Cynthia Marbun, Ambar, Deri, Trio, dan Andini terima kasih kalian selalu

menemani dan mendukung setiap langkah dalam penelitianku. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada seluruh staf laboratorium mikrobiologi yang telah membantuku selama penelitian
dan kepada semua kakak kelas yang telah membantu kelancaran penelitian. Tidak lupa kepada
M’20: M’Atin sekeluarga, M’Yayu, Atiek, Yayan, Dita, Teh Imas, Ika, Geril, M’Eva, Kak Ulie,
dan Neni terima kasih untuk canda tawanya selama ini.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Oktober 2005

Irma Fatimah

RIWAYAT HIDUP

Penulis yang bernama Irma Fatimah lahir pada tanggal 23 April 1983 di kota Ciamis dari
pasangan Ridwan Hidajat, S. P. dan Nani Dhiani, S. Pd. sebagai anak kedua dari dua bersaudara.
Penulis lulus dari SMUN 1 Majalengka pada tahun 2001 dan berhasil masuk ke Institut Pertanian
Bogor (IPB) pada tahun yang sama melalui jalur USMI. Penulis memilih Departemen Biologi.
Organisasi yang pernah penulis ikuti, yaitu: Gebyar Beasiswa BEM FMIPA tahun 2003 sebagai
bendahara, panitia seminar Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia (PERMI) tanggal 29 Maret 2005
sebagai anggota, seminar PERMI Bogor tanggal 7 Juli 2005 sebagai anggota,

dan asisten

praktikum mata kuliah Mikrobiologi Dasar tahun 2005. Penulis mengikuti Praktik Lapangan di
Balai Besar Pengawasan Obat dan Makanan di Bandung dengan judul Pengujian Sterilitas ProdukProduk yang Berlabel Steril pada tahun 2004.

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR GAMBAR....................................................................................................

vi

DAFTAR LAMPIRAN...…………………………………………….........................

vii

PENDAHULUAN........................................................................................................

1

BAHAN DAN METODE.............................................................................................

2

Waktu dan Tempat Penelitian............................................................................
Bahan............................................................................................ ....................
Metode Penelitian..............................................................................................
Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri...................................................
Penapisan Bakteri Penghasil Protease........................................................
Identifikasi Isolat........................................................................................
Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease...............................................
Pengujian Aktivitas Protease dan Pengukuran Kadar Protein....................
Karakterisasi Protease................................................................................
Penentuan pH Optimum......................................................................
Penentuan Suhu Optimum...................................................................
Pengaruh Penambahan Senyawa Penghambat dan Kation.................
Pengujian Ketahanan Enzim terhadap Panas dan pH........................

2

2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3

HASIL..........................................................................................................................

3

Isolasi Bakteri Penghasil Protease.....................................................................
Identifikasi Isolat...............................................................................................
Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Protease......................................................

Karakterisasi Protease.......................................................................................

3
3
4
4

PEMBAHASAN...........................................................................................................

6

SIMPULAN..................................................................................................................

7

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................................

8

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

Pembentukkan zona bening: A. Enterobacter sp. galur NU5, B. Aeromonas
sp. galur NU8, dan C. A. hydrophila pada cawan agar nutrien...........................

2

Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur
NU5 selama 24 jam pada suhu ruang (25-27º C).................................................

3

5

Aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5,
dan Aeromonas hydrophila pada berbagai senyawa............................................

7

5

Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan
Enterobacter sp. galur NU5pada berbagai pH....................................................

6

4

Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan
Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu................................................

5

4

Pertumbuhan dan kurva aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8
selama 27 jam pada suhu ruang (25-27º C)..........................................................

4

4

5

Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp.
galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada suhu optimumnya masingmasing..................................................................................................................

8

5

Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp.
galur NU5, dan Aeromonas hydrophila terhadap pH..........................................

6

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1

Taksonomi ikan nila galur GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus)
Trewavas) dan ciri-cirinya...................................................................................

11

2

Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)............................................

11

3

Metode pengukuran kadar protein mikroasai (Hammond et al. 1988)................

11

4

Ciri-ciri morfologi dan indeks proteolitik (IP) isolat yang berasal dari saluran
pencernaan ikan nila galur GIFT.........................................................................

5

Pertumbuhan dan aktivitas spesifik protease Enterobacter sp. galur NU5
selama 24 jam pada suhu ruang (25-27°C)..........................................................

6

15

Aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp. galur NU5,
dan Aeromonas hydrophila pada berbagai senyawa............................................

10

15

Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan
Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai pH...................................................

9

15

Aktivitas protease Aeromonas hydrophila, Aeromonas sp. galur NU8, dan
Enterobacter sp. galur NU5 pada berbagai suhu.................................................

8

13

Pertumbuhan dan aktivitas spesifik protease Aeromonas sp. galur NU8 selama
27 jam pada suhu ruang (25-27°C)......................................................................

7

12

16

Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp.
galur NU5, dan Aeromonas hydrophila pada suhu optimumnya masingmasing..................................................................................................................

11

16

Kestabilan aktivitas protease Aeromonas sp. galur NU8, Enterobacter sp.
galur NU5, dan Aeromonas hydrophila terhadap pH..........................................

16

PENDAHULUAN
Ikan nila galur GIFT (Genetic
Improvement of Farmed Tilapias) atau
Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas
merupakan salah satu anggota Famili
Serranidae yang bernilai ekonomis tinggi
bagi Indonesia (Lampiran 1). Di Indonesia
nilai ekspor ikan ini ± 10 ton/tahun setelah
Thailand (Suria 2003 dalam Nur 2004).
Ikan nila galur GIFT mempunyai
keuntungan lain, yaitu: pemeliharaannya
mudah, harga murah, dan lebih disukai oleh
pasar. Ikan nila galur GIFT masuk dari
Filipina ke Indonesia pada tahun 1994
dengan
alasan
untuk
meningkatkan
keanekaragaman jenis ikan di Indonesia.
Menurut Widiyati et al. 1995 dalam Brojo
(1999) ikan nila galur GIFT mempunyai
pola pertumbuhan dan daya adaptasi yang
lebih baik jika berada di daerah dengan
iklim seperti di Indonesia, sehingga dapat
dengan mudah beradaptasi.
Ikan nila tergolong ke dalam ikan
herbivora
pemakan
plankton
yang
mengkonsumsi bahan protein yang lebih
sedikit dibandingkan ikan predator. Pada
umumnya usus ikan herbivora lebih panjang
daripada usus ikan karnivora. Oleh karena
itu, kemungkinan ditemukannya mikrob
flora normal lebih besar (UT 2004). Flora
normal dapat berfungsi sebagai probiotik,
karena dapat membantu proses metabolisme
inang tanpa merusak jaringan inang. Bakteri
probiotik dapat menghasilkan enzim
hidrolitik, seperti protease (Verschuere et al.
2000), amilase (Moriarty 1999), dan lipase
(Janice & Felix 2002).
Menurut Verschuere (2000), probiotik
merupakan mikrob hidup yang ditambahkan
dan memiliki pengaruh menguntungkan
inang dengan cara mengubah hubungan
saling menguntungkan antara inang-mikrob
dan antar komunitas mikrob menjadi lebih
baik, meningkatkan kecernaan pakan pada
inang atau nilai nutrisi dari pakan tersebut,
meningkatkan respon inang terhadap
penyakit, atau dapat juga dengan
meningkatkan kualitas air. Moriarty (1999)
mendefinisikan probiotik sebagai kultur
tunggal atau campuran mikroorganisme
hidup yang digunakan pada hewan dan
manusia, bersifat menguntungkan bagi inang
dengan cara meningkatkan kemampuan
mikroflora asli, sedangkan probiotik untuk
akuakultur adalah kultur tunggal atau
campuran mikroorganisme hidup yang
digunakan untuk memperbaiki habitat inang

dengan menambah jumlah bakteri alami
yang membantu hidup inang, karena bakteri
ini dapat mengubah komposisi bakteri di air
dan sedimen.
Kasus penyakit ikan disebabkan oleh
bakteri yang berkaitan erat dengan faktor
ekstraseluler yang dihasilkan, antara lain
enzim
protease.
Beberapa
peneliti
melaporkan jenis protease tertentu berperan
penting dalam kerusakan jaringan ikan,
seperti protease yang dihasilkan oleh
Aeromonas hydrophila Allan & Stevenson
1981; Chabot & Thune 1991), Vibrio
harveyi (Moriarty 1999), V. anguillarum,
Flexibacter columnaris, dan Pseudomonas
aeruginosa (Secades & Guijarro 1999).
Menurut Snieszko dan Axelrod (1971),
toksin dan enzim protease yang dihasilkan
oleh bakteri patogen dapat merusak jaringan
ikan, misalnya pada dinding saluran
pencernaan.
Genus Aeromonas selain mempunyai
kemampuan proteolitik juga mempunyai
kemampuan
hemolitik.
Hemolitik
merupakan kemampuan untuk mendegradasi
hemoglobin dalam darah. Aeromonas
mempunyai kemampuan hemolitik lebih
tinggi dibandingkan dengan proteolitiknya
terutama pada Aeromonas patogen (Cahill
1990 dalam Cipriano et al. 2001).
Aeromonas merusak sel darah merah dan
resisten terhadap serum yang dihasilkan oleh
leukosit. Di samping itu, Aeromonas
mempunyai faktor virulensi yang lain, yaitu:
struktur lipopolisakarida, á-hemolisin, âhemolisin,
siderofor,
hemaglutinin,
enterotoksin, dan protein permukaan
(Cipriano et al. 2001).
Berdasarkan data yang ada di Loka
Riset Perikanan Air Tawar (Loriskanwar)
Sukamandi Subang, Jawa Barat, ikan nila
jarang terserang penyakit, walaupun ikan
jenis lain yang terdapat pada kolam yang
sama terserang penyakit. Oleh karena itu,
diharapkan bakteri pencernaan pada ikan
nila dapat berperan sebagai probiotik bagi
ikan lain. Probiotik dipilih umumnya tidak
menyebabkan resistensi mikrob target
seperti antibiotik. Selain itu, probiotik yang
dipilih bersifat proteolitik dengan tujuan
untuk membuat suatu produk tandingan
yang dapat menghambat faktor virulensi
mikrob patogen.
Menurut Rao et al. (1998) protease
merupakan
enzim
pengurai
yang
mengkatalisis hidrolisis total protein. Enzim
ini dapat dihasilkan secara intraseluler dan
ekstraseluler oleh tanaman, hewan, dan

mikrob, serta mempunyai peranan penting
dalam metabolisme dan regulasi dalam sel
(Ward
1983).
Enzim
ekstraseluler
disekresikan ke luar sel dan mendegradasi
senyawa polimer menjadi senyawa yang
lebih sederhana yang mudah larut dan
diserap melalui dinding sel. Enzim
ekstraseluler banyak digunakan dalam
industri, karena dihasilkan dalam jumlah
besar dan metode ekstraksi cukup mudah
(Stanbury & Whitaker 1984).
Protease terdiri atas empat subkelompok
berdasarkan mekanisme katalitik enzim,
yaitu: protease serin, protease sistein,
protease asam, dan protease logam atau
metaloprotease (Rao et al. 1998). Contoh
metaloprotease yang diaktifkan oleh ion
magnesium dan kalsium ialah berasal dari
Citrobacter sp. galur BKL-1 yang diisolasi
dari bagian lambung ikan kerapu lumpur
(Ariana et al. 2003). Contoh protease serin
adalah protease yang berasal dari Bacillus
sp. galur BKU-10 (Fitri et al. 2005).
Protease serin atau protease yang memiliki
gugus serin pada sisi aktifnya dapat juga
dihasilkan oleh A. hydrophila dan P.
aeruginosa (Rao et al. 1998). Protease serin
dihambat
oleh
senyawa
diisopropil
fluorofosfat (DFP) atau fenilmetilsulfonil
fluorida (PMSF) (Bollag & Edelstein 1991).
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mendapatkan isolat proteolitik yang berasal
dari saluran pencernaan ikan nila GIFT dan
melakukan karakterisasi enzim protease dari
isolat yang terpilih. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi
untuk jenis protease bakteri lainnya dari
saluran pencernaan ikan air tawar.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Januari
sampai Juni 2005 di Laboratorium
Mikrobiologi FMIPA, IPB.
Bahan
Aeromonas hydrophila patogen
koleksi dari Laboratorium Kesehatan
Ikan, Departemen Budidaya Perairan,
Fakultas Perikanan dan Ilmu KelautanIPB. Sebanyak dua sampel ikan nila
GIFT didapat dari Loka Riset Perikanan
Air Tawar (Loriskanwar) Sukamandi
Subang, Jawa Barat dalam keadaan
hidup. Sampel saluran pencernaan ikan
nila galur GIFT (O. niloticus) dewasa
diambil dari 2 bagian, yaitu: lambung

dan usus sepanjang 0-3
lambung.

cm dari

Metode Penelitian
Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri
Ikan dibedah untuk diambil bagian
saluran pencernaannya secara aseptik dan
dalam keadaan dingin (menggunakan es).
Saluran pencernaan ikan dipilah berdasarkan
bagiannya, yaitu: lambung dan usus
sepanjang 0-3 cm dari lambung. Kemudian
masing-masing dimasukkan ke dalam 50 ml
media kaldu nutrien (NB [Difco]; komposisi
per liter: bakto ekstrak sapi 3 g dan bakto
pepton 5 g) yang mengandung susu skim 0.5
%. Setelah itu, sampel diinkubasi pada suhu
25-27º C selama ± 48 jam sambil dikocok
140 rpm di atas mesin pengocok (Lab line,
USA).
Penapisan Bakteri Penghasil Protease
Sebanyak satu ose suspensi bakteri
digores kuadran pada media agar-agar
nutrien yang mengandung susu skim (NAS)
0.5% dan diinkubasi pada suhu 25-27º C
selama ± 24 jam. Koloni yang tumbuh
membentuk zona bening diisolasi dan
diinokulasikan ke media NAS 0.5 % dengan
gores kuadran, serta diinkubasi pada suhu
25-27º C selama ± 24 jam. Setelah
mendapatkan koloni tunggal, dipilih
beberapa isolat yang memiliki Indeks
Proteolitik (IP) terbesar dan morfologi
koloni yang berbeda untuk diidentifikasi dan
diamati
produksi
dan
karakteristik
proteasenya. IP merupakan nisbah antara
diameter zona bening dengan diameter
koloni. Isolat yang telah murni disimpan di
dalam gliserol pada suhu -20º C. Peremajaan
isolat secara rutin dilakukan pada media
NAS 0.5 %.
Identifikasi Isolat
Isolat
terpilih
yang
diseleksi
berdasarkan
indeks
proteolitiknya.
Identifikasi tahap awal meliputi pewarnaan
Gram, pertumbuhan isolat pada media
Salmonella-Shigella agar (SSA) dan eosin
methylene-blue agar (EMBA). Identifikasi
sampai genus berdasarkan Bergey’s of
Determinative Bacteriology (Holt et al.
1994).
Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas
Protease
Sebanyak 2 ose suspensi bakteri
diinokulasi ke dalam 50 ml kaldu nutrien
yang mengandung susu skim (NBS) 0.5 %

dan diinkubasi selama 6 jam untuk
Enterobacter sp. galur NU5 pada suhu
ruang. Kemudian sebanyak 109 sel/ml
dimasukkan ke dalam 200 ml media
produksi protease. Sedangkan untuk A.
hydrophila dan Aeromonas sp. galur NU8
diinkubasi selama 4 jam pada suhu ruang.
Kemudian sebanyak 108 sel/ml dimasukkan
ke dalam 200 ml NBS 0.5%. Pembuatan
kurva turbiditas pertumbuhan dilakukan
dengan cara mengukur absorbansi suspensi
biakan pada panjang gelombang 640 nm
setiap selang waktu 3 jam selama 24 jam.
Cara mendapatkan ekstrak kasar enzim
dengan melakukan sentrifugasi (Jouan,
Perancis) suspensi bakteri pada kecepatan
8400 xg selama 5 menit. Aktivitas protease
diukur dengan metode Walter (1984) yang
dimodifikasi pada suhu 37º C dan pH 8.
Pengujian
Aktivitas
Protease
dan
Pengukuran Kadar Protein
Aktivitas protease diukur dengan
metode Walter (1984) yang dimodifikasi.
Sebanyak 0.5 ml larutan kasein 1 %
direaksikan dengan 0.5 ml bufer tris HCl
0.05 M pH 8 dan 0.1 ml ekstrak kasar
enzim, kemudian diinkubasi dalam penangas
air pada suhu 37º C. Reaksi dihentikan
dengan menambahkan 1 ml larutan asam
trikloroasetat (TCA) 10 % (b/v) dan
diinkubasi di dalam lemari es (20º C) selama
10 menit. Hasil reaksi disentrifugasi pada
kecepatan 8400 xg selama 5 menit.
Sebanyak 0.75 ml filtrat ditambahkan
dengan 2.5 ml Na2CO3 0.5 M dan 0.5 ml
Folin Ciocalteu (1:2). Supernatan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 578
nm (Spectronic 20) dengan menggunakan Ltirosin sebagai standar. Satu unit aktivitas
protease setara dengan 1µmol tirosin yang
dihasilkan per menit pada kondisi
pengukuran (Lampiran 2).
Kadar protein sampel diukur dengan
metode Bradford (1976) yang dimodifikasi
oleh Hammond et al. (1988) untuk
mikroasai. Sebanyak 4 ml larutan Bradford
dimasukkan ke dalam tabung yang telah
berisi 0.4 ml enzim. Selanjutnya dikocok
kuat dengan menggunakan vortex dan
diinkubasi selama 15 menit. Absorbansi
larutan diukur pada panjang gelombang 595
nm. Bovine serum albumin (BSA)
digunakan
sebagai
standar
dengan
konsentrasi 0-0.1 mg/ml (Lampiran 3).
Kadar protein sampel ditentukan dari
persamaan regresi kurva standar. Aktivitas

spesifik adalah aktivitas
miligram protein.

protease

per

Karakterisasi Protease
Karakterisasi
bertujuan
untuk
menentukan suhu dan pH optimum aktivitas
enzim, ketahanan terhadap panas dan pH,
serta pengaruh penambahan senyawa kation
dan penghambat.
Penentuan pH Optimum. Penentuan
pH optimum dilakukan dengan cara
mengukur aktivitas protease pada berbagai
pH. Larutan bufer yang digunakan bufer
sitrat 0.05 M (pH 5 dan 6) dan tris-HCl 0.05
M (pH 7, 8, dan 9).
Penentuan Suhu Optimum. Penentuan
suhu optimum dilakukan dengan cara
mengukur aktivitas protease pada berbagai
suhu inkubasi, yaitu: pada kisaran 30º C dan
80º C dengan selang 10º C.
Pengaruh Penambahan Senyawa
Penghambat dan Kation. Ekstrak kasar
enzim direaksikan dengan etilena diamina
tetra asetat (EDTA) dan berbagai kation
monovalen (Na+ dan K+) dan kation bivalen
(Ca2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, dan Zn2+) yang
masing-masing berasal dari garam NaCl,
KCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, CoCl2,
CuCl2, dan ZnCl2, dengan konsentrasi akhir
kation pada eaksi enzim masing-masing 5
mM. Campuran diinkubasi pada suhu dan
pH optimum selama 10 menit.
Pengujian
Ketahanan
Enzim
terhadap Panas dan pH. Kestabilan enzim
terhadap panas diukur dengan menginkubasi
ekstrak kasar enzim tanpa substrat pada suhu
optimum selama 120 menit, kemudian
aktivitas enzim diukur setiap 30 menit pada
suhu dan pH optimumnya. Sedangkan untuk
kestabilan
pH
diketahui
dengan
menginkubasi ekstrak kasar enzim pada
suhu 4º C di dalam lemari es selama 1 jam.
Enzim diencerkan dengan bufer pH 5-9
(perbandingan 1:1), kemudian aktivitas
enzim kemudian diukur pada suhu dan pH
optimum.
HASIL
Isolasi Bakteri Penghasil Protease
Mikrob yang dapat diisolasi dari
lambung dan usus sepanjang 0-3 cm dari
lambung ikan nila GIFT berjumlah 31 isolat
(Lampiran 4).

9
8.8
8.6
8.4
8.2
8
7.8
7.6
7.4
7.2

0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04

Aktivitas spesifi
protease (U/m g)

Identifikasi Isolat
Hanya dua isolat yang digunakan untuk
diidentifikasi dan diamati proteasenya, yaitu:
isolat NU5 dan isolat NU8. Kedua isolat
menghasilkan zona bening media NAS 0.5%
(Gambar 1, Lampiran 4). Hasil identifikasi
menunjukkan bahwa kedua isolat adalah
Enterobacter sp. galur NU5 dan Aeromonas
sp. galur NU8 (Tabel 1).

Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas
Protease
Pertumbuhan sel pada media NBS 0.1%
menunjukkan bahwa galur NU5 memasuki
fase stasioner pada jam ke-18 dan memiliki
aktivitas spesifik protease tertinggi pada jam
ke-24, yaitu: 0.121 U/mg dengan kadar
protein 0.066 mg/ml (Gambar 2, Lampiran
5). Galur NU8 mengalami fase stasioner
pada jam ke-21 dan aktivitas spesifik
protease tertinggi tercapai pada jam ke-24,
yaitu: 0.267 U/mg dengan kadar protein
0.060 mg/ml (Gambar 3, Lampiran 6).

Lo g sel

Isolat ditumbuhkan pada media EMBA
dan SSA bertujuan untuk melihat
kemampuannya mereduksi laktosa. Isolat
yang dapat mereduksi laktosa tumbuh pada
media EMBA dan tidak pada media SSA.
Media EMBA dan SSA dapat pula
digunakan untuk membedakan sifat gram
bakteri. Bakteri gram positif tidak dapat
mereduksi laktosa, sehingga tidak dapat
hidup pada media EMBA.

0.02
0
0

3

6

9

12 15 18 21 24

W a ktu inkub a si (ja m )
P ertum buhan s el

A k tivitas s pes ifik proteas e

A

Gambar 1 Pembentukkan zona bening:
A. Enterobacter sp. galur NU5,
B. Aeromonas sp. galur NU8, dan
C. A. hydrophila pada cawan agar
nutrien
Tabel 1 Ciri-ciri morfologi dan fisiologi
isolat NU8 dan NU5 yang berumur 24 jam
Ciri-ciri
Isolat NU8
Isolat NU5
Bentuk sel
Batang pendek Batang pendek
Pewarnaan gram
Fermentasi
+
+
karbohidrat
Pembentukan gas
+
+
Merah metil
+
+
Voges-Proskauer
+
+
Oksidase
+
Indol
+
Nitrit
+
+
Hidrolisis urea
+
Hidrolisis pati
+
Sitrat simmons
+
+
Motilitas
Motil
Motil
Sifat
Anaerob
Aerob obligat
fakultatif
Indeks
1.10
4.50
proteolitik (IP)

10.8

0.3

10.6

0.25

10.4
10.2

0.2

10

0.15

9.8

0.1

9.6
0.05

9.4
9.2

Aktivitas spesifik
protease (U/mg)

C

Log sel

B

Gambar 2 Pertumbuhan dan kurva aktivitas
spesifik protease Enterobacter sp.
galur NU5 selama 24 jam pada
suhu ruang (25-27º C).

0
0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

W aktu inkubasi (jam )
P ertum buhan sel

A ktivitas spesifik protease

Gambar 3 Pertumbuhan dan kurva aktivitas
spesifik protease Aeromonas sp.
galur NU8 selama 27 jam
pada suhu ruang (25-27º C).
Karakterisasi Protease
Suhu optimum galur NU8 ialah 70º C
dengan aktivitas protease sebesar 0.079
U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH
optimumnya 7 dengan aktivitas protease
sebesar 0.548 U/mg (Gambar 5, Lampiran
8). Sedangkan suhu optimum galur NU5
50º C dengan aktivitas protease sebesar 0.005
U/mg (Gambar 4, Lampiran 7) dan pH

optimumnya selama 120 menit (Gambar 7,
Lampiran 10).
1.4
sp.

1.2

0.08

1

0.06

0.8

0.04

0.6

APS A erom onas
g alur NU8 (U/m g)

APS A . hydrophila
dan
E nterobacter
sp. g a lur
NU5 (U/m g )

0.1

0.4

0.02

0.2

0

0
30

40

50

60

70

80

S uhu (0 C)
A erom onas hydrophila

E nterobacter sp. galur NU5

A erom onas sp. galur NU8

0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

ASP A ero mo na s sp.
g a lur NU8 (U/m g )

ASP A . hyd ro phila
da n
E ntero b acter sp. g a lur
NU5 (U/m g )

Gambar 4 Aktivitas protease A. hydrophila,
Aeromonas sp. galur NU8, dan
Enterobacter sp. galur NU5 pada
berbagai suhu (APS= aktivitas spesifik
protease).

0
5

6

7

8

9

pH
A erom onas hy drophila

E nterobac ter s p. galur NU 5

A erom onas s p. galur N U 8

0.25

1.4

0.2

1.2
1

0.15

0.8

0.1

0.6

0.05

0.4
0.2

Aeromonas hydrophila

Zn

kontrol

Ca

Co

Cu

K

Mg

Na

0
EDTA

0

ASP A ero m o na s
sp. g a lur NU8
(U/m g )

Gambar 5 Aktivitas protease A. hydrophila,
Aeromonas sp.galur NU8, dan
Enterobactersp. galur NU5 pada
berbagai pH

ASP A . hyd ro p hila
da n
E ntero b a cter
sp. g a lur NU5
(U/m g )

optimumnya 7 dengan aktivitas protease
sebesar 0.005 U/mg (Gambar 5, Lampiran
8).
Penambahan
kation
K+
dengan
konsentrasi akhir 5 mM menaikkan sedikit
aktivitas protease galur NU8 dari 1.258
U/mg menjadi 1.274 U/mg (1.27%), tetapi
penambahan kation Na+ dengan konsentrasi
akhir 5 mM tidak berpengaruh terhadap
aktivitas protease galur NU8. Penambahan
kation Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, dan Zn2+
dengan konsentrasi akhir 5 mM menurunkan
aktivitas protease galur NU8. Aktivitas
protease galur NU5 menurun oleh
penambahan kation K+ sebesar 35.4%.
Penambahan kation Na+, Mg2+, Cu2+, Ca2+,
dan Co2+ meningkatkan aktivitas protease
galur ini (Gambar 6, Lampiran 9). Kenaikan
aktivitas
protease
terbesar
dengan
penambahan kation Co2+, yaitu: dari 0.065
U/mg menjadi 0.225 U/mg (71.1%).
Penambahan senyawa pengkelat logam
EDTA dengan konsentrasi akhir 5 mM
sangat menurunkan aktivitas protease galur
NU8 sebesar 85.9%, sedangkan galur NU5
turun aktivitas proteasenya sebesar 75.4%.
Protease galur NU5 yang diinkubasi
pada suhu 50°C selama 30 menit pertama
mengalami penurunan sebesar 80%,
sedangkan protease galur NU8 mengalami
penurunan sebesar 94%. Protease kedua
galur menunjukkan penurunan aktivitas
selama 120 menit inkubasi pada suhu
optimumnya
masing-masing
dengan
aktivitas tersisa kurang dari
20%
dibandingkan awal inkubasi (Gambar 7,
Lampiran 10). Aktivitas protease kedua
galur relatif menunjukkan kestabilan
terhadap pH 5-9 setelah diinkubasi selama 1
jam pada suhu 4º C (Gambar 8, Lampiran
11).
Aeromonas hydrophila yang digunakan
sebagai pembanding mempunyai suhu
optimum 70ºC dengan aktivitas protease
sebesar 0.008 U/mg (Gambar 4, Lampiran 7)
dan pH optimum 8 dengan aktivitas protease
sebesar 0.007 U/mg (Gambar 5, Lampiran
8). Penambahan EDTA tidak berpengaruh
terhadap aktivitas protease A. hydrophila,
namun
aktivitas
meningkat
dengan
penambahan Cu2+ sebesar 94.6% (Gambar 6,
Lampiran 9). Aktivitas protease A.
hydrophila relatif stabil pada kisaran pH 5-9
setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu
4º C (Gambar 8, Lampiran 11), namun
aktivitas mengalami kenaikan sebesar
433.3% setelah diinkubasi pada suhu

Kation
Enterobacter sp. galur NU5

Aeromonas sp. galur NU8

Gambar 6 Aktivitas protease Aeromonas sp.
galur NU8, Enterobacter sp. galur
NU5, dan A. hydrophila pada
berbagai senyawa

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0.08
0.06
0.04
0.02
0
0

30

60

90

AP S A ero m o na s sp.
ga lur NU8 (U/m g)

AP S A . hyd ro p hila
da n
E ntero b a cter
sp. g alur
NU5 (U/m g)

0.1

120

W ak tu ink ubas i (menit)
A erom onas hy drophila

E nterobacter s p. galur NU5

A erom onas sp. galur NU8

1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
5

6

7

8

ASP A eromonas
g a lur NU8 (U/m g )

ASP A . hydrophila
dan
E nterobacter
sp. NU5
(U/m g )

0.12

sp.

Gambar 7 Kestabilan aktivitas protease
Aeromonas sp. galur NU8,
Enterobacter sp. galur NU5, dan
A. hydrophila pada suhu
optimumnya masing-masing.

9

pH
Aerom onas hydrophila

Enterobacter sp. galur NU5

Aerom onas sp. galur NU8

Gambar 8 Kestabilan aktivitas protease
Aeromonas sp. galur NU8,
Enterobacter sp. galur NU5, dan
A. hydrophila terhadap pH.
PEMBAHASAN
Tiga puluh satu isolat yang diperoleh
tidak digunakan seluruhnya, namun hanya
dua isolat. Enterobacter sp. galur NU5
dipilih karena isolat ini menghasilkan zona
bening dengan IP terbesar (4.5), sedangkan
Aeromonas sp. galur NU8 membentuk zona
bening dengan IP yang lebih kecil (1.1).
Perbedaan IP terjadi karena kemampuan
difusi protease pada media NAS 0.5% untuk
setiap isolat tidak sama. Isolat yang
mempunyai IP besar merupakan isolat yang
menghasilkan protease dengan kemampuan
difusi lebih besar dibandingkan dengan
isolat lain. Oleh karena itu, IP yang besar
tidak dapat mencerminkan aktivitas protease
yang besar pula. Aeromonas sp. galur NU8
mempunyai aktivitas protease jauh lebih

besar, yaitu: 0.267 U/mg dibandingkan
Enterobacter sp. galur NU5, yaitu: 0.121
U/mg dengan waktu inkubasi dan kadar
protein yang sama, yaitu: 24 jam dan 0.066
mg/ml.
Aktivitas protease Enterobacter sp.
galur NU5 tertinggi sebelum memasuki fase
stasioner terdapat pada jam ke-9 sebesar
0.115 U/mg yaitu ketika sel dalam fase
pertumbuhan eksponensial. Protease yang
dihasilkan sebagian besar digunakan untuk
kebutuhan pertumbuhan dan metabolisme
sel.
Pada jam ke-24 Enterobacter sp. galur
NU5 sudah masuk fase stasioner dan
menghasilkan aktivitas proteolitik tertinggi.
Pada fase ini sel mengeluarkan metabolit
yang sebagian besar digunakan untuk
mempertahankan diri (Pelczar & Chan
1986). Protease yang dihasilkan lebih
banyak dan difungsikan untuk bersifat
antagonis dengan organisme lain (Moriarty
1999). Umumnya protease jenis netral dan
alkali
diproduksi
pada
akhir
fase
pertumbuhan eksponensial dan stasioner,
seperti yang dihasilkan oleh Bacillus sp.
galur BBU-32 (Sukma 2003) dan B.
stearothermophillus (Kubo et al. 1988).
Aeromonas sp. galur NU8 yang
diperoleh dari ikan sehat dibandingkan
dengan Aeromonas hydrophila patogen
dalam hal protease ekstraselulernya. Hal ini
bertujuan untuk melihat adakah perbedaan
ciri-ciri biokimia aktivitas protease yang
dihasilkan.
Aktivitas
spesifik
protease
A.
hydrophila sebesar 0.007 U/mg jauh lebih
rendah dibandingkan dengan aktivitas
spesifik Aeromonas sp. galur NU8 sebesar
0.548 U/mg yang diukur pada suhu 70º C,
pH 7. Protease yang dihasilkan oleh A.
hydrophila aktivitasnya tidak berubah pada
penambahan pengkelat logam EDTA.
Protease yang dihasilkan oleh Aeromonas
sp. galur NU8 merupakan metaloprotease,
karena aktivitas protease spesifiknya
mengalami penurunan sebesar 85.9% pada
saat dilakukan penambahan EDTA. Menurut
hasil penelitian Chabot & Thune (1991),
kompleks A. hydrophila yang digunakan
dalam penelitiannya menghasilkan protease
jenis P1 yang tidak dihambat oleh EDTA,
tetapi meningkat dengan penambahan Mg2+.
Kation Cu2+ dapat meningkatkan
aktivitas protease yang dihasilkan oleh
Aeromonas hydrophila sebesar 94.6%, tetapi
sebaliknya bagi aktivitas protease yang turun
sebesar 94.8%. Di sisi lain, kation Na+ dan

K+ dapat meningkatkan protease yang
dihasilkan oleh kedua isolat. Hal ini
diperkirakan bahwa beberapa kation divalen
yang digunakan berikatan dengan sisi
alosterik enzim dan mengubah sisi aktif
enzim, namun pengikatan kation ini tidak
mampu meningkatkan aktivitas katalitik
protease Aeromonas sp. galur NU8,
sedangkan Mo2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+,
Mn2+, Se2+ dan Zn2+ merupakan unsur
mikro essensial dari berbagai jenis enzim
yang berfungsi sebagai kofaktor yang dapat
membantu meningkatkan aktivitas katalitik
enzim (Lehninger 1982). Beberapa logam
pada enzim tertentu dapat meningkatkan
aktivitas katalitiknya (Whitaker 1994). Hal
yang sama terjadi pada protease yang
dihasilkan Citrobacter sp. galur BKL-1
aktivitasnya menurun dengan penambahan
Cu2+. Penelitian Artika (2005) menunjukkan
bahwa protease yang dihasilkan Serratia
marcescens BKU-31 aktivitasnya menurun
dengan penambahan Mg2+, Cu2+, Fe2+, Co2+,
Ca2+, dan Zn2+ dan meningkat dengan
penambahan Na+ dan K+. Sukma (2003)
melaporkan bahwa Bacillus sp. galur BBU32 menghasilkan protease yang menurun
dengan penambahan Mg2+, Cu2+, Mn2+,
Co2+, Ca2+, dan Zn2+ dan meningkat dengan
penambahan Na+ dan K+.
Walaupun Enterobacter sp. galur NU5
tidak dibandingkan dengan bakteri patogen
dengan genus yang sama, tetapi tidak
menutup kemungkinan bersifat patogen.
Bakteri komensal pada ikan dapat menjadi
patogen sekunder jika kondisi inang sedang
stress atau menurun (Brojo 1999).
Enterobacter sp. galur NU5 menghasilkan
protease dengan suhu optimum 50°C, seperti
halnya protease yang dihasilkan oleh
Bacillus sp. galur BKU 10 mempunyai suhu
optimum 50°C (Fitri et al. 2005). Protease
yang dihasilkan oleh Enterobacter sp. galur
NU5 merupakan metaloprotease, karena
aktivitas protease mengalami penurunan
sebesar 75% dengan penambahan pengkelat
logam EDTA. Aktivitas protease yang
paling besar terjadi dengan penambahan
Co2+, yaitu: sebesar 71.1%. Hal ini
menunjukkan bahwa protease Enterobacter
sp. galur NU5 memerlukan adanya ion Co2+
untuk
mengoptimalkan
aktivitasnya.
Penelitian
Kusumawardhani
(2004)
menunjukkan
bahwa
protease
yang
dihasilkan isolat H2 aktivitasnya mengalami
peningkatan
paling
tinggi
dengan
penambahan Co2+. Kation berperan sebagai
komponen penting pada sisi aktif enzim,

atau bagian dari kofaktor yang dapat
menjaga konformasi enzim Whitaker (1994).
Di samping itu, ion mempunyai beberapa
fungsi dalam mekanisme kerja enzim, yaitu:
menciptakan bagian yang utuh pada sisi
aktif enzim, membentuk ikatan antara enzim
dengan substrat, mengubah konstanta
keseimbangan pada reaksi, mengubah
muatan permukaan pada protein enzim,
menghilangkan hambatan reaksi, mengganti
ion logam yang tidak efektif dari sisi enzim
atau substrat, dan mengubah keseimbangan
konformasi dari kurang aktif menjadi lebih
aktif (Rhichardson & Hyslop 1985).
Kestabilan
panas
enzim
diukur
berdasarkan
nilai
T50.
Nilai
T50
menunjukkan
suhu
inkubasi
yang
menyebabkan aktivitas sisa suatu enzim
tinggal 50% setelah inkubasi 30 menit
(Eijsink et al. 1993). Suatu enzim akan
dikatakan stabil terhadap panas, apabila nilai
T50-nya besar dan turunnya aktivitas enzim
tersebut kurang dari 50%, tetap, atau
meningkat setelah inkubasi selama 30 menit
pada suhu optimumnya. Kestabilan protease
Enterobacter sp. galur NU5 (50°C) dan
Aeromonas sp. galur NU8 (70°C) menurun
pada 30 menit inkubasi masing-masing
sebesar 80% dan 94%. Aktivitas protease A.
hydrophila (70°C) cenderung stabil bahkan
aktivitasnya meningkat sebesar 433.3%
selama 120 menit inkubasi.
Kestabilan suatu enzim terhadap panas
dipengaruhi oleh interaksi intramolekul,
densitas konformasi protein, penempatan
residu hidrofobik di bagian dalam, dan
pemaparan residu hidrofil ke permukaan
molekul protein (Wahyuntari 2005).
Penelitian Eijsink et al. (1995) membuktikan
bahwa melakukan mutasi pada daerah di
ujung N suatu enzim, dapat meningkatkan
kestabilan enzim tersebut terhadap panas.
Protease yang dihasilkan oleh ketiga
isolat relatif stabil pada kisaran pH 5-9. Hal
yang serupa juga dilaporkan oleh Artika
(2005) bahwa protease yang dihasilkan S.
marcescens sp. galur BKU-31 relatif stabil
pada kisaran pH 6.5-9.0. Kisaran pH yang
relatif lebar ini dapat memberikan nilai lebih
pada enzim tersebut, misalnya saat terjadi
perubahan pH pada kisaran tersebut reaksi
enzim masih dapat menghasilkan produk
dengan optimal.
Kestabilan enzim terhadap pH sering
dipengaruhi oleh ada atau tidaknya kofaktor
atau molekul-molekul kecil lainnya.
Pengaruh pH terhadap enzim ditentukan
oleh beberapa faktor lainnya seperti tipe dan

konsentrasi bufer, ada atau tidaknya substrat,
kekuatan ion dan konstanta dielektrik media,
dan pengaruh pH pada kestabilan kofaktor
dan aktivator (Whitaker 1994). Faktor-faktor
yang mempengaruhi kestabilan pH dan suhu
tergantung pada semua faktor yang
mempengaruhi struktur sekunder, tersier,
dan kuartener dari enzim tersebut
(Lehninger 1982, Whitaker 1994).
SIMPULAN
Sebanyak 31 isolat bakteri proteolitik
berhasil diperoleh dari pencernaan ikan nila
galur
GIFT.
Karakterisasi
protease
dilakukan pada isolat terpilih, yaitu:
Enterobacter sp. galur NU5 dan Aeromonas
sp. galur NU8. Galur NU5 menghasilkan
metaloprotease yang optimum pada suhu
50º C, pH 7, dan aktivitasnya meningkat
dengan penambahan Co2+. Galur NU8 juga
menghasilkan
metaloprotease
dengan
aktivitas optimum pada suhu 70º C, pH 7,
dan
aktivitasnya
meningkat
dengan
penambahan K+. A. hydrophila yang
berfungsi sebagai pembanding dan bersifat
patogen menghasilkan protease yang
aktivitasnya lebih rendah daripada galur
NU5 dan galur NU8 pada suhu 70°C, pH 8.
Penambahan EDTA tidak mempengaruhi
aktivitas proteasenya.
DAFTAR PUSTAKA
Allan

BJ, Stevenson RMW. 1981.
Extracellular virulence factor of
Aeromonas hydrophila in fish
infections. Can J Microbiol 27: 11141122.
Ariana, Mubarik NR, Prawasti TS. 2003.
Produksi dan karakterisasi protease
Citrobacer sp. galur BKL-1 dari
saluran pencernaan ikan kerapu
Lumpur
(Epinephelus
tauvina).
Biosfera 20: 75-84.
Artika W. 2005. Produksi dan karakterisasi
dari isolat bakteri BKL-1 dan BKU31 hasil pengendapan ammonium
sulfat [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of
microgram quantitaties of protein in
utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem 72: 248-254.

Brojo M. 1999. Kariotip dan pola protein
ikan
mujair
(Oreochromis
mossambicus (Peters) Trewavas) dan
ikan nila (Oreochromis niloticus
(Linnaeus) Trewavas). J Ilmu Perair
Perik Indones IV 2: 19-33.
Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein
Methods. New York: Wiley-Liss.
Chabot DJ & Thune RL. 1991. Proteases of
the Aeromonas hydrophila complex:
identification, characterization and
relation to virulence in channel
catfish,
Ictalurus
punctatus
(Rafinesque). J Fish Diseases 14:
171-183.
Cipriano RC, Bullock GL, Pyle SW. 2001.
Aeromonas hydrophila and motile
aeromonad septicaemias of fish.
Washington, D.C.. Rev: Cipriano RC.
1984. Fish disease leflet 68.
http://www.lsc.usgs.gov/FHB/leaflets
/FHB68.pdf [12 Agustus 2004].
Eijsink VGH et al.. 1993. Structural
determinants of the thermostability of
thermolysin-like Bacillus neutral
protease. Di dalam: van den Tweel
WJJ, Harder A, Buitelaar RM, editor.
Proceeding of an International
Symposium:
Stability
and
Stabilization of Enzymes. Maastricht,
22-25 Nov 1992. Maastricht: Elsevier
Science. hlm. 91-99.
Eijsink VGH, Veltman OR, Aukema W,
Vriend G, Venema G. 1995.
Structural determinants of the
stability
of
thermolysin-like
proteinases. Structural Biol 2: 374379.
Fitri SGS, Mubarik NR, Prawasti TS. 2005.
Produksi dan karakterisasi protease
ekstraseluler Bacillus sp. galur BKU
10
dari
saluran
pencernaan
Epinephelus tauvina. J Mikrobiol
Indones 10: 9-13.
Hammond JBW, Kruger NJ. 1988. The
Bradford Method
for Protein
Quantitation. Di dalam: Walker JM,
editor. Methods in Molecular Biology
New Protein Techniques. Volume ke3. Clifton: Human Pr. hlm. 25-32.
Holt JK, Kreig NR, Sneath PHA, Staley JT,
Williams ST. 1994. Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology. Ed ke9. New York: Williams & Wilkins.

Janice

LDM,
Felix
CR.
2002.
Characterization of a protease
produced by Trichoderma harzianum
isolate which controls cocoa plant
witches’ broom disease.
BMC
Biochem 3:3.
Kubo M, Murayama K, Seto K, Imanaka T.
1988. Higly thermostable neutral
protease
from
Bacillus
stearothermophilus.
J
Ferment
Technol 66: 13-17.
Kusumawardhani GN. 2004. Karakterisasi
protease ekstraseluler isolate H2 asal
tanah pembuangan limbah kopra
Sumatera Barat [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Lagler KF, Bardach JE, Miller RR, Passino
DRM. 1977. Ichthyology. Ed ke-2.
New York: John Wiley & Sons.
Lehninger A. 1982. Dasar-Dasar Biokimia.
Thenawijdaja
M,
penerjemah;
Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:
Principles of Biochemisrty.
Muriarty DJW. 1999. Disease control in
shrimp aquaculture with probiotic
bacteria. http://www.medical-papers.
com/bacteria+vibrio+species+aquacul
ture+antibiotics.html. [20 Okt 2005].
Nur I. 2004. Ketahanan benih ikan nila
GIFT Oreochromis niloticus dari
hasil induk yang diberi vaksin buatan
Streptococcus
iniae
[disertasi].
Bogor: Program Pasca Sarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Pelczar MJ Jr, Chan ECS. 1986. DasarDasar Mikrobiologi. Volume ke-1.
Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo
SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta:
UI Pr. Terjemahan dari: Elements of
Microbiology.
Rao MB, Tangsale AM, Ghasge MS,
Deshpande VV. 1998. Molecular and
biotechnological aspects of microbial
protease. Microb Mol Biol Rev 62:
597-635.
Rhichardson T, Hyslop DG. 1985. Enzyme.
Di dalam: Fenema OR, editor. Food
Chemistry. New York: Marcel
Dekker. hlm. 371-476.

Secades P, Guijarro JA. 1999. Purification
and
characterization
of
an
extracellular protease from the fish
pathogen Yersinia ruckeri and effect
of culture condition on production.
Appl Environ Microbiol 65: 39693975.
Snieszko SF, Axelrod. 1971. Disease of
Fishes. London: T. H. P. Publication.
Stanbury PF, Whitaker A. 1984. Principles
of Fermentation Technology. Oxford:
Pagamon Pr.
Sukma P. 2003. Produksi dan karakterisasi
protease Bacillus sp. galur BBU-32
asal
saluran
pencernaan
Parastromateus
niger
[skripsi].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
[UT] Universitas Terbuka. 2004. Biologi
Ikan
Air
Tawar.
http://www.ut.ac.id/olsupp/
LUHT4453/biologi.htm [7 Oktober
2004].
Verschuere L, Rombaut G, Sorgelos P,
Verstraete W. 2000. Probiotic
bacteria as biological control agents
in aquaculture. Microb Mol Biol Rev:
655-671.
Wahyuntari B. 2005. Stabilitas protease
logam netral mikrob mirip termolisin
terhadap panas [ulas balik]. J
Mikrobiol Indones 10: 5-8.
Walter H-E. 1984. Proteinases (proteins as
substrates).
Method
with
haemoglobin, casein and azocoll as
substrate. Di dalam Bergmeyer J,
Graβl M, editor. Methods of
Enzymatic Analysis. Edisi ke-3.
Weinheim: Verlag Chemie. hlm 270278.
Ward OP. 1983. Proteinases. Di dalam
Fogarty MW, editor. Microbial and
Enzyme Technology. New York:
Applied Science Publishing. hlm.
251-305.
Whitaker Jr. 1994. Principle of Enzymology
for the Food Science. Ed ke-2. New
York: Oxford University Pr.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Taksonomi ikan nila galur GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas) dan
ciri-cirinya
Nama Indonesia: Ikan Nila galur GIFT

Kedudukan taksonomi:
Kelas
: Osteichthyes
Ordo
: Perciformes
Subordo
: Percoidei
Famili
: Serranidae
Genus
: Oreochromis
Spesies
: Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas
Deskripsi (ciri-ciri):
Ikan air tawar; herbivora; berwarna hitam, badan berbentuk kompres agak membulat; telur
dierami oleh induk betina; jenis kelamin mulai dapat dibedakan pada panjang total badan 811.9 cm, bentuk alat genital ikan jantan menonjol sedangkan betinanya membulat; dagu
sampai dengan sisik di bawah sirip perut ikan jantan berwarna hitam sedangkan betinanya
putih atau kuning; telur dierami oleh jantan (Lagler et al. 1977; Brojo 1999).

Lampiran 2 Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)
Pereaksi
Blanko (µl)
Standar (µl)
Sampel (µl)
Penyangga Tris-HCl (0.05 M) pH 7
500
500
500
Substrat kasein (1 %)
500
500
500
Ekstrak kasar enzim
100
Akuades steril
100
Tirosin standar (5 mM)
100
diinkubasi pada suhu optimum selama 10 menit
Asam trikloroasetat (10 %)
1000
1000
1000
Akuades steril
100
Ekstrak kasar enzim
100
100
diinkubasi pada suhu 20º C selama 10 menit
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit
Filtrat
750
750
750
Na2CO3 (0.5 M)
2500
2500
2500
Folin Ciocalteu (1:2)
500
500
500
didiamkan selama 15 menit kemudian diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm

Aktivitas protease dihitung dengan rumus:
A sampel – A blanko
UA =

x P x 1/T
A standar – A blanko

Keterangan:
UA
: jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk tirosin per menit (U/ml)
A sampel : nilai absorbansi sampel
A standar : nilai absorbansi standar
A blanko : nilai absorbansi blanko
P
: faktor pengenceran
T
: waktu inkubasi

Lampiran 3 Metode pengukuran kadar protein mikroasai (Hammond et al. 1988)
Komposisi pereaksi Bradford (Bradford 1976) lima kali terdiri atas:
Coomasie brilliant blue G-250
25 mg
Ethanol 95%
12.5 ml
Asam ortofosfat 85%
25 ml
Akuades
212.5 ml
Sebelum digunakan untuk mengukur kadar protein, pereaksi diencerkan dengan akuades
(perbandingan 1:4) dan larutan BSA 1 mg/ml diencerkan dengan akuades (perbandingan 1:9).
Kurva standar dibuat dengan menambahkan sebanyak 4 ml pereaksi Bradford ke dalam
0.4 ml larutan BSA (bovine serum albumin) dengan konsentrasi 0.00 mg/ml – 0.10 mg/ml.
Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya
dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Sedangkan blanko dibuat dengan mencampurkan 0.1 ml
akuades dengan 0.5 ml pereaksi Bradford, kemudian dikocok dan diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 595 nm.
Sampel yang akan diukur kadar proteinnya diperlakukan sama. Sebanyak 4 ml pereaksi
Bradford ditambahkan ke dalam 0.4 ml sampel dan diinkuba