Karakterisasi Α-Amilase dan Glukoamilase Dari Bakteri Proteolitik Asal Pencernaan Ikan Nila Gift

1

KARAKTERISASI α-AMILASE DAN GLUKOAMILASE
DARI BAKTERI PROTEOLITIK ASAL PENCERNAAN
IKAN NILA GIFT

MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

2

ABSTRAK
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Karakterisasi α-Amilase dan
Glukoamilase dari Bakteri Proteolitik Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT.
Dibimbing oleh NISA RACHAMANIA MUBARIK dan ANJA MERYANDINI.
Penggunaan teknologi probiotik telah menjadi salah satu alternatif dalam

usaha meningkatkan produktivitas perikanan. Penelitian ini bertujuan untuk
menapis isolat amilolitik yang memiliki aktivitas α-amilase dan glukoamilase dari
sejumlah bakteri proteolitik yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT
(Genetic Improvement of Farmed Tilapias). Dari 31 isolat bakteri proteolitik,
berhasil ditapis sebanyak 18 isolat amilolitik. Tiga isolat diantaranya
menunjukkan indeks amilolitik (IA) terbesar yaitu NU-1, NU-2, dan NL-15.
Pengukuran aktivitas α-amilase menggunakan metode Bernfeld dan aktivitas
glukoamilase dengan metode Somogyi-Nelson. Kadar protein diukur dengan
metode Bradford. Isolat bakteri NU-2, yang merupakan genus Bacillus, mampu
menghasilkan enzim α-amilase dan glukoamilase. Aktivitas maksimum α-amilase
dan glukoamilase terjadi pada jam ke-15 setelah inkubasi. Hasil karakterisasi
menunjukkan bahwa aktivitas α-amilase optimum pada suhu 37-40 oC, pH 6.0
yang diproduksi pada media pati tapioka, dan pH 6.0-7.0 pada media tepung ikan.
Aktivitas glukoamilase optimum pada suhu 40 oC, pH 6.0 yang diproduksi pada
media pati tapioka, dan pH 5.0-6.0 pada media tepung ikan. Penggunaan media
kaldu nutrien (NB) dengan menggunakan 0.5% (b/v) tepung ikan ternyata
meningkatkan produksi enzim α-amilase dan glukoamilase dari isolat NU-2.
ABSTRACT
MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Characterization of α-Amylase
and Glucoamylase Production from Tilapia Digestive Tract Proteolytic Bacteria.

Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK and ANJA MERYANDINI.
Probiotic technology have became one of the alternative tools to increase
the fishery productivity. The aims of this experiment was to screen amylolitic
isolates that consisted both α-amylase and glucoamylase from proteolytic bacteria
isolated from digestive tract of tilapias strain GIFT (Genetic Improvement of
Farmed Tilapias). From 31 proteolytic bacteria, 18 isolates produced extracellular
amylase, 3 isolates (NU-1, NU-2, NL-15) which showed the biggest amylolytic
index. One isolate, NU-2, produced both α-amylase and glucoamylase. α-Amylase
activity was measured by the method of Bernfeld and glucoamylase activity by
the method of Somogyi-Nelson. Protein was determined by the method of
Bradford. The isolates NU-2 which belonged to Bacillus sp. produced highest
both α-amylase and glucoamylase activity after 15 hours of incubation. Enzymes
characterization showed optimum activity of α-amylase at 37-40 oC, pH 6.0 using
cassava starch as substrate for enzyme production, and pH 6.0-7.0 using fish meal
as substrate. Whereas glucoamylase activity optimum at 40 oC, pH 6.0 using
cassava starch as substrate, and 5.0-6.0 using fish meal as substrate. Production of
NU-2 α-amylase and glucoamylase was increased using nutrient broth containing
0.5% (w/v) fish meal.

3

KARAKTERISASI α-AMILASE DAN GLUKOAMILASE
DARI BAKTERI PROTEOLITIK ASAL PENCERNAAN
IKAN NILA GIFT

MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

4

Judul Skripsi : Karakterisasi α-Amilase dan Glukoamilase dari Bakteri
Proteolitik Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT
Nama
: Muhammad Novianto Bayu Saputro
NIM
: G34103042

Menyetujui:
Pembimbing I,

Pembimbing II,

(Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si)
NIP 132045531

(Dr. Anja Meryandini, M.S)
NIP 131663016

Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

(Dr. Drh. Hasim, DEA)
NIP 131578806

Tanggal Lulus :

5

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT berkat rahmat serta
rizki-Nya, penulis dapat menyelesaikan karya tulis ini. Shalawat serta salam
penulis panjatkan kepada Nabi Muhammad SAW, sang pembawa kebenaran
hakiki.
Penulis ucapkan terima kasih kepada Ibu Nisa Rachmania Mubarik dan
Ibu Anja Meryandini atas saran serta bimbingan dalam penelitian ini. Ucapan
terima kasih kepada Ibu Rita Megia, sebagai Wakil Komisi Pendidikan atas saran
dan diskusi yang diberikan. Rasa terima kasih disampaikan kepada kedua orang
tua dan adikku tersayang atas segala doa, pengorbanan dan kasih sayangnya.
Terima kasih kepada sahabatku Ari dan Taufiq yang telah setia menemani dan

menjadi tempat berbagi cerita dan berkeluh kesah, kepada Mba Heni, Bapak Jaka
dan Bapak Endang atas bantuannya di laboratorium, kepada Oci, Fajri, Eko, Iip,
atas persahabatan dan kebersamaannya, kepada Dendi, Muley, Cicit, Sagita,
Mbem, dan Dian atas motivasi dan dukungannya, kepada teman-teman
laboratorium mikrobiologi, Andri, Irni, Sarah, Mute, Tri, Besty, Wahyu, Ima, Ika,
Ryo, Ai, Mba Rina, Mba Ari, Mba Rika, Mba Dini atas kekompakannya, dan
kepada teman-teman Biologi 40 atas kebersamaannya.
Semoga karya tulis ini dapat bermanfaat di kemudian hari.

Bogor, Januari 2008

Muhammad Novianto Bayu Saputro

6

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Malang pada tanggal 8 November 1985 dari
pasangan Bapak Rahardjo Dwi Prihanggono dan Ibu Sri Widyastati. Penulis
adalah anak pertama dari dua bersaudara.
Setamat dari SMUN 3 Sidoarjo pada tahun 2003, penulis diterima di

Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) di Biologi. Selama mengikuti perkuliahan,
penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Mikrobiologi Dasar dan
Fisiologi Prokariot untuk S1 Biologi. Penulis juga pernah menjabat sebagai
anggota seksi Dana Sosial Paguyuban Mahasiswa Biologi (Pamabi) Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) IPB.
Penghargaan dan pengalaman yang pernah diraih selama menjadi
mahasiswa di Departemen Biologi, yaitu sebagai Tim Penyaji Terbaik ke-2 dan
Penyaji Poster Terbaik ke-3 kategori Program Kreativitas Mahasiswa Bidang
Penelitian (PKMP) pada Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional (Pimnas) ke-20 tahun
2007 di Universitas Lampung. Pada tahun yang sama, penulis juga pernah
menyampaikan presentasi lisan sebagian dari penelitian ini pada seminar
Pertemuan Ilmiah Tahunan (PIT) Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia (Permi) di
Banjarmasin. Penulis melakukan praktik lapangan dengan judul Penentuan
Suspect Anemia Defisiensi Besi di Laboratorium Klinik Prodia Bogor.

7

DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR GAMBAR………………………………………………………… viii
DAFTAR TABEL……………………………………………………………. viii
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………….
ix
PENDAHULUAN…………………………………………………………….
1
Waktu dan Tempat………………………………………………………....
1
BAHAN DAN METODE…………………......................................................
1
Bahan………………………………………………………………………
1
Peremajaan Isolat Bakteri………………………………………………….
1
Penapisan Isolat Bakteri Amilolitik………………………………….…….
1
Produksi Enzim……………………………………….……………………
2
Pengukuran Aktivitas α-Amilase………………………….……………….
2

Pengukuran Aktivitas Glukoamilase……………………………….………
2
Pengukuran Kadar Protein…………………………………………………
2
Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel dan Aktivitas Enzim………………...
2
Uji Modifikasi Substrat…………………………………………….………
2
Karakterisasi Suhu dan pH Enzim…………………………………………
3
HASIL…………………………………….…………………………………...
3
PEMBAHASAN……………………………………….……………………...
5
SIMPULAN……………………………………………….…………………..
7
SARAN………………………………………………….…………………….
8
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………
8

8

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Isolat bakteri amilolitik pada agar-agar nutrien yang mengandung 0.5%
3
(b/v) pati tapioka setelah 24 jam inkubasi ………………………...……....
2 Sel isolat NU-2 hasil pewarnaan Gram (perbesaran mikroskop 1000X)....
3
3 Uji patogenitas terhadap isolat bakteri NU- 2 (a) dan supernatannya (b)…. 3
4 Kurva pertumbuhan dan aktivitas amilase isolat NU-2 pada media NB
dengan substrat 5% (b/v) pati tapioka. pH media yaitu 7 dengan suhu
produksi 37 oC………………………………………………………….….. 4
5 Aktivitas α-amilase dan glukoamilase isolat NU-2 yang diproduksi
dengan menggunakan substrat pati tapioka dan tepung ikan (a) dalam
satuan aktivitas unit/ml, (b) dalam satuan aktivitas unit/ml
4
protein………………...................................................................................
6 Aktivitas α-amilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan

pati tapioka pada berbagai suhu. Pengukuran aktivitas pada pH
7.0………………………………………………………………………….
4
7 Aktivitas α-amilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan
pati tapioka pada berbagai pH. Pengukuran aktivitas pada suhu optimum
37 oC……………………………………………………………………….. 5
8 Aktivitas glukoamilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan
pati tapioka pada berbagai suhu. Pengukuran aktivitas pada pH 7.0……....
5
9 Aktivitas glukoamilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan
pati tapioka pada berbagai pH. Pengukuran aktivitas pada suhu optimum
40 oC….......................................................................................................... 5

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil uji aktivitas α-amilase dan glukoamilase dari tiga isolat bakteri
terpilih…………………………………………………………………...... 3
2 Kadar protein dan karbohidrat pada tepung ikan dan pati tapioka
6
(Alamsyah 2005).........................................................................................
3 Kadar kalsium dan fosfor pada tepung ikan dan pati tapioka (Alamsyah
2005)............................................................................................................
6
4 Ciri-ciri α-amilase dan glukoamilase dari sejumlah bakteri……..………..
7

9

DAFTAR LAMPIRAN

1
2
3
4
5

6
7
8

Halaman
Skema metode Bernfeld (1955)................................................................ 11
Skema metode Somogyi-Nelson (Nelson 1944 dalam Breuil & Saddler
1985)......................................................................................................... 12
Skema metode Bradford (1976)................................................................ 13
Hasil penapisan isolat bakteri amilolitik................................................... 14
Aktivitas amilase dari isolat bakteri NU-2 yang diproduksi pada media
NB dengan substrat 0.5% (b/v) pati tapioka dan tepung ikan. Suhu
15
inkubasi enzim yang digunakan yaitu 37 oC dengan pH 7.0…………
Karakterisasi α-amilase dari isolat bakteri NU-2 pada berbagai suhu
dan pH…………………………………………………….…………….. 15
Karakterisasi glukoamilase dari isolat bakteri NU-2 pada berbagai suhu
dan pH…………………………………………………….…………….. 16
Kandungan nutrisi tepung ikan dan pati tapioka (Alamsyah 2005)……. 16

1
PENDAHULUAN
Permintaan dan kebutuhan ikan dunia
terus meningkat dari tahun ke tahun, sebagai
akibat pertambahan penduduk. Oleh sebab itu,
diperlukan adanya peningkatan produktivitas
perikanan untuk mengimbangi jumlah
permintaan yang terus meningkat (DKPRI
2005).
Penggunaan teknologi probiotik telah
menjadi salah satu alternatif dalam usaha
meningkatkan
produktivitas
perikanan.
Probiotik di dalam bidang akuakultur
didefinisikan sebagai suplemen mikrob hidup
yang memberikan efek menguntungkan
terhadap inangnya dengan cara mengubah
struktur komunitas mikrob, meningkatkan
fungsi pemanfaatan pakan atau peningkatan
nilai gizi pakan, meningkatkan ketahanan
inang terhadap penyakit, serta meningkatkan
kualitas lingkungan di sekitar inang
(Verschuere et al. 2000).
Salah
satu
prinsip
dasar
kerja
probiotik ialah memanfaatkan kemampuan
mikroorganisme dalam memecah atau
menguraikan rantai panjang karbohidrat,
protein, dan lemak yang menyusun pakan
yang diberikan. Kemampuan ini diperoleh
karena adanya enzim-enzim khusus yang
dimiliki mikrob untuk memecah ikatan
tersebut (Feliatra et al. 2004). Penelitian
Suyanandana et al. (1998) menunjukkan
bahwa penggunaan bakteri asam laktat galur
E7, E26, dan F10 sebagai suplemen makanan
pada budidaya Tilapia nilotica ternyata
mampu meningkatkan bobot ikan dan
menunjukkan
resisten terhadap serangan
bakteri patogen Aeromonas hydrophila.
Enzim α-amilase dan glukoamilase
merupakan enzim yang memiliki peranan
dalam proses perombakan karbohidrat atau
pati. Enzim α-amilase (EC 3.2.1.1)
mengatalisis pemutusan ikatan glikosidik α1.4 dari dalam molekul pati, sedangkan
glukoamilase atau amiloglukosidase (EC
3.2.1.3) menghidrolisis ikatan glikosidik α-1,4
dan α-1,6 dari bagian ujung gula nonpereduksi
secara berurutan (Fogarty 1983).
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk
mencari kandidat probiotik unggul untuk
budidaya perikanan. Feliatra et al. (2004)
telah
berhasil
mengisolasi
dan
mengidentifikasi bakteri probiotik dari ikan
kerapu macan (Ephinephelus fuscogatus)
dalam upaya efisiensi pakan ikan. Demikian
pula Mubarik et al. (2006) melaporkan telah
berhasil mengisolasi tiga puluh satu isolat
bakteri proteolitik dari pencernaan ikan nila
GIFT (Genetic Improvement of Farmed

Tilapias) dan beberapa isolat terpilih (NU-5
dan NU-8) dari penelitian tersebut telah
dikarakterisasi
aktivitas
proteasenya.
Enterobacter sp. galur NU-5 menghasilkan
metaloprotease yang optimum pada suhu
50 oC, pH 7.0, dan aktivitasnya meningkat
dengan penambahan Co2+. Aeromonas sp.
galur NU-8 juga menghasilkan metaloprotease
dengan aktivitas optimum pada suhu 70 oC,
pH 7.0, dan aktivitasnya meningkat dengan
penambahan K+.
Sehubungan dengan upaya menggali
kemampuan isolat-isolat proteolitik yang
memiliki potensi menghasilkan enzim amilase
ekstraseluler, maka penelitian ini bertujuan
untuk menapis isolat-isolat
proteolitik
tersebut yang memiliki aktivitas enzim αamilase dan glukoamilase serta melakukan
karakterisasi kedua enzim amilase tersebut
berdasarkan pH dan suhu yang diproduksi
dengan menggunakan substrat yang berbeda.
Dari hasil penelitian ini diharapkan diperoleh
isolat-isolat yang dapat diaplikasikan sebagai
agen probiotik dalam budidaya perikanan air
tawar.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Februari sampai Nopember 2007 di
Laboratorium Bagian Mikrobiologi FMIPA,
IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan ialah 31
isolat bakteri proteolitik asal ikan nila koleksi
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, IPB, media agar-agar nutrien (NA),
media kaldu nutrien (NB), pati tapioka
(tepung tapioka), tepung ikan, pereaksipereaksi: Bernfeld (1955), Somogyi-Nelson
(Nelson 1944 dalam Breuil & Saddler 1985),
dan Bradford (1976). Peralatan yang
digunakan ialah peralatan yang umum
digunakan di laboratorium mikrobiologi.
Peremajaan Isolat Bakteri
Tiga puluh satu isolat proteolitik asal
pencernaan ikan nila yang telah diperoleh dari
penelitian sebelumnya (Mubarik et al. 2006)
diremajakan pada kaldu nutrien (NB) yang
mengandung 0.5% pati tapioka (b/v). Kultur
diinkubasi pada suhu ruang (25-27 oC) selama
±24 jam dan digoyang dengan kecepatan 140
rpm.
Penapisan Isolat Bakteri Amilolitik
Tiga puluh satu isolat bakteri proteolitik
hasil peremajaan digores pada media cawan

2
agar-agar nutrien (NA) yang mengandung
0.5% pati tapioka. Isolat bakteri diinkubasi
selama 24 jam pada suhu ruang, lalu diamati
zona bening yang terbentuk. Isolat bakteri lalu
dipilih berdasarkan indeks amilolitiknya (IA),
yaitu nisbah antara selisih diameter zona
bening dengan diameter koloninya. Tiga
isolat bakteri dengan indeks amilolitik
terbesar diuji aktivitas α-amilase dan
glukoamilasenya. Satu isolat bakteri penghasil
aktivitas α-amilase dan glukoamilase terbesar
dipilih untuk dilakukan identifikasi dengan
pewarnaan Gram dan ditentukan kondisi
optimum pertumbuhannya.
Isolat bakteri terpilih diuji patogenitasnya
dengan digores pada media agar-agar darah.
Hal yang sama juga dilakukan pada
supernatannya, yaitu dengan meneteskan 15
μl supernatan di atas filtrate paper pada media
agar-agar darah. Biakan diinkubasi selama 24
jam lalu diamati ada tidaknya zona bening
yang terbentuk.
Produksi Enzim
Tiga isolat bakteri penghasil IA terbesar
ditumbuhkan pada media kaldu nutrien (NB)
yang mengandung 0.5% pati tapioka (b/v) lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 25 oC dan
digoyang dengan kecepatan 140 rpm. Enzim
amilase ekstrak kasar ekstraseluler diperoleh
dengan cara mensentrifugasi kultur pada 8400
g selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan
mengandung enzim amilase lalu dipisahkan
dari endapan dan diukur aktivitasnya.
Pengukuran Aktivitas α-Amilase
Metode yang digunakan ialah metode
Bernfeld (1955). Sebanyak 1 ml larutan pati
1% (dalam 0.05M bufer Tris-HCl pH 7)
direaksikan dengan 1 ml enzim ekstrak kasar,
lalu diinkubasi pada suhu 37 dan 50 oC selama
20 menit. Campuran direaksikan dengan 2 ml
pereaksi dinitrosalisilat (DNS) dan didihkan
selama 5 menit. Absorbansi diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
550 nm. Satu unit (U) aktivitas α-amilase
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
menghasilkan produk setara 1 µmol maltosa
per menit pada kondisi pengukuran. Sebagai
standar, digunakan larutan maltosa pada
konsentrasi 100-500 ppm dengan selang
konsentrasi 100 ppm (Lampiran 1). Pengujian
aktivitas α-amilase pada sampel, kontrol, dan
blanko diulang sebanyak dua kali.
Pengukuran Aktivitas Glukoamilase
Aktivitas enzim glukoamilase diukur
dengan metode Somogyi-Nelson (Nelson
dalam Breuil & Saddler 1985). Sebanyak 0.5

ml larutan pati 0.5%, 0.4 ml bufer Tris-HCl
0.05 M pH 7 dan 0.1 ml larutan enzim
direaksikan di dalam tabung reaksi dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 dan
50 oC. Pada akhir inkubasi ditambahkan 1 ml
pereaksi A. Sebanyak 1 ml campuran tersebut
diambil dan direaksikan dengan pereaksi D
dalam tabung reaksi yang lain lalu didihkan
selama 20 menit. Campuran didinginkan pada
air mengalir selama 5 menit, direaksikan
dengan pereaksi C kemudian dikocok kuat
sampai tidak ada gelembung Setelah itu,
campuran diencerkan dengan akuades hingga
volume akhir 25 ml. Absorbansi diukur pada
panjang gelombang 520 nm. Satu unit (U)
aktivitas glukoamilase setara dengan 1 µmol
glukosa yang dihasilkan per menit pada
kondisi
pengukuran.
Sebagai
standar
digunakan glukosa pada konsentrasi 100-500
ppm dengan selang konsentrasi 100 ppm
(Lampiran
2).
Pengujian
aktivitas
glukoamilase pada sampel, kontrol, dan
blanko diulang sebanyak dua kali.
Pengukuran Kadar Protein
Kadar protein diukur dengan metode
Bradford (1976). Sebanyak 0.1 ml enzim
ekstrak kasar direaksikan dengan 5 ml
pereaksi Bradford lalu diinkubasi selama 5
menit. Absorbansi diukur pada panjang
gelombang 595 nm. Sebagai standar
digunakan larutan bovine serum albumin
(BSA) berkonsentrasi 100-500 ppm dengan
selang konsentrasi 100 ppm (Lampiran 3).
Pengujian kadar protein pada sampel dan
blanko diulang sebanyak dua kali.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan Sel dan
Aktivitas Enzim
Sebanyak ±108 sel/ml isolat terpilih
ditumbuhkan pada media NB yang
mengandung 0.5% pati tapioka. Kultur
diinkubasi dan digoyang dengan kecepatan 92
rpm selama 36 jam pada suhu 37 oC. Setelah
itu, diukur pertumbuhan sel, aktivitas αamilase, dan glukoamilase setiap 3 jam
selama 36 jam. Pengujian aktivitas α-amilase,
glukoamilase, dan jumlah sel diulang
sebanyak dua kali.
Uji Modifikasi Substrat
Isolat bakteri terpilih dibiakkan pada
media NB yang mengandung 0.5% (b/v)
tepung ikan, sebagai pembanding digunakan
media NB yang mengandung 0.5% (b/v) pati
tapioka, dan sebagai kontrol digunakan media
tanpa enzim. Biakan diinkubasi selama 15 jam
dalam keadaan digoyang. Setelah 15 jam,
supernatan diambil dengan disentrifugasi

3
8400 g 15 menit dan diukur aktivitas
α-amilase dan glukoamilasenya. Uji aktivitas
kedua enzim pada masing-masing perlakuan
diulang sebanyak dua kali.
Karakterisasi Suhu dan pH Enzim
Karakterisasi aktivitas enzim dilakukan
untuk mengetahui kondisi optimum kedua
enzim pada berbagai suhu dan pH. Rentang
suhu yang digunakan yaitu 30, 37, 40, 50, dan
60 oC. Rentang pH yang digunakan yaitu 4.0
hingga 9.0. Bufer yang digunakan yaitu bufer
sitrat (pH 4.0, 5.0, dan 6.0), bufer tris-HCl
(pH 7.0 dan 8.0), dan bufer glisin-NaOH (pH
9.0) masing-masing dengan konsentrasi
0.05 M.
HASIL
Sebanyak 18 isolat bakteri proteolitik
yang diujikan mampu membentuk zona
bening di sekitar koloni pada media NA yang
mengandung 0.5% pati tapioka pada suhu
ruang setelah disiram dengan larutan Iodin
(Lampiran 4 & Gambar 1).

Tabel 1

Kode
isolat

NU-1
NU-2
NL-15

Hasil uji aktivitas α-amilase dan
glukoamilase dari tiga isolat
bakteri terpilih
Aktivitas
spesifik
α-amilase
(Unit/mg
protein)
Suhu inkubasi
enzim
37 oC
50 oC
0.085
0.363
-

Aktivitas
spesifik
glukoamilase
(Unit/mg
protein)
Suhu inkubasi
enzim
37 oC
50 oC
0.143
0.865
-

Hasil identifikasi menunjukkan bahwa
isolat bakteri NU-2 tergolong ke dalam genus
Bacillus yang memiliki ciri-ciri yaitu bentuk
sel batang berantai, bersifat Gram positif, dan
memiliki endospora pada bagian sentral sel
(Gambar 2).

endospora
Gambar 2 Sel isolat NU-2 hasil pewarnaan
Gram (perbesaran mikroskop
1000X).
Gambar 1 Isolat bakteri amilolitik pada agaragar nutrien yang mengandung
0.5% (b/v) pati tapioka setelah 24
jam inkubasi.
Ada tiga isolat dari 18 isolat amilolitik
yang memiliki nilai IA paling besar dari ratarata dua ulangan yaitu isolat bakteri NU-1
(1.22), NU-2 (0.94), dan NL-15 (0.76)
(Lampiran 4). Hasil pengukuran aktivitas
enzim
α-amilase
dan
glukoamilase
menunjukkan bahwa isolat bakteri NU-1
memiliki aktivitas spesifik glukoamilase pada
suhu inkubasi enzim 50 oC, yaitu sebesar
0.143 unit/mg protein. Isolat bakteri NL-15
memiliki aktivitas spesifik α-amilase pada
suhu inkubasi enzim 37 oC, yaitu sebesar
0.363 unit/mg protein. Di antara ketiga isolat
penghasil IA terbesar hanya isolat bakteri NU2 yang memiliki aktivitas α-amilase pada
suhu 50 oC dan glukoamilase pada suhu 37 oC.
Nilai aktivitas α-amilase spesifik sebesar
0.085 unit/mg protein dan glukoamilase
spesifik sebesar 0.865 unit/mg protein (Tabel
1).

Sebagai analisis tambahan dari penelitian
ini dilakukan uji patogenitas. Bakteri NU-2
mampu membentuk zona bening pada media
agar-agar darah, sebaliknya uji supernatan
yang bebas sel tidak menunjukkan adanya
zona bening (Gambar 3).

a
b
Gambar 3

Uji patogenitas terhadap isolat
bakteri
NU-2
(a)
dan
supernatannya (b).

Pengukuran turbiditas sel yang dilakukan
setiap tiga jam selama 36 jam menunjukkan
bahwa bakteri NU-2 mengalami fase lag pada
jam ke-0 hingga jam ke-9, fase eksponensial
pada jam ke-9 hingga jam ke-12, dan

4
memasuki fase stasioner pada jam ke-15
setelah inkubasi (Gambar 4).
Hasil pengukuran aktivitas enzim αamilase isolat bakteri NU-2 menunjukkan
bahwa aktivitas spesifik maksimum α-amilase
terjadi pada jam ke-3 (0.163 unit/mg protein)
dan ke-15 (0.1 unit/mg protein). Aktivitas
spesifik glukoamilase maksimum terjadi pada
jam ke-6 (0.947 unit/mg protein) dan jam ke15 (0.903 unit/mg protein) (Gambar 4).

6.0 untuk yang diproduksi pada media pati
tapioka dan pH 5.0-6.0 pada media tepung
ikan (Lampiran 7, Gambar 8 & 9).

(a)

α
Gambar 4 Kurva pertumbuhan dan aktivitas
amilase isolat NU-2 pada media
NB dengan substrat 5% (b/v) pati
tapioka. pH media yaitu 7 dengan
suhu produksi 37 oC.

(b)
Gambar

Pertumbuhan sel untuk produksi amilase
pada substrat yang dimodifikasi menunjukkan
bahwa aktivitas kedua enzim ternyata relatif
lebih tinggi pada media NB yang mengandung
0.5% tepung ikan dengan nilai aktivitas αamilase yaitu 0.051 unit/ml dan glukoamilase
yaitu 0.204 unit/ml (Lampiran 5 & Gambar
5a). Meskipun demikian, aktivitas spesifik
ternyata menunjukkan perbedaan hasil, yaitu
nilai aktivitas α-amilase ternyata lebih tinggi
pada media pati tapioka, sedangkan aktivitas
spesifik glukoamilasenya tidak jauh berbeda
antara media pati tapioka dan media tepung
ikan (Lampiran 5 & Gambar 5b). Hasil
pengukuran kadar protein media kontrol tanpa
inokulasi menunjukkan kadar protein pada
media tepung ikan memang lebih tinggi yaitu
0.546 mg/ml, sedangkan pati tapioka yaitu
0.441 mg/ml.
Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa
aktivitas α-amilase isolat NU-2 optimum pada
suhu 37-40 oC dan pH 6.0 untuk yang
diproduksi pada media pati tapioka dan 6.07.0 pada media tepung ikan (Lampiran 6,
Gambar 6 & 7). Aktivitas optimum
glukoamilase terjadi pada suhu 40 oC dan pH

5

Aktivitas
α-amilase dan
glukoamilase isolat NU-2 yang
diproduksi dengan menggunakan substrat pati tapioka dan
tepung ikan (a) dalam satuan
aktivitas unit/ml, (b) dalam
satuan
aktivitas
unit/mg
protein.

Gambar 6 Aktivitas α-amilase isolat NU-2
yang diproduksi pada tepung ikan
dan pati tapioka pada berbagai
suhu. Pengukuran aktivitas pada
pH 7.0.

5
PEMBAHASAN

Gambar 7 Aktivitas α-amilase isolat NU-2
yang diproduksi pada tepung ikan
dan pati tapioka pada berbagai
pH. Pengukuran aktivitas pada
suhu optimum 37 oC.

Gambar 8 Aktivitas glukoamilase isolat NU-2
yang diproduksi pada tepung ikan
dan pati tapioka pada berbagai
suhu. Pengukuran aktivitas pada
pH 7.0.

Gambar 9 Aktivitas glukoamilase isolat NU-2
yang diproduksi pada tepung ikan
dan pati tapioka pada berbagai pH.
Pengukuran aktivitas pada suhu
optimum 40 oC.

Ikan nila galur GIFT (Genetic
Improvement of Farmed Tilapias) atau
Oreochromis niloticus (Linnaeus) Trewavas
merupakan ikan nila unggul hasil seleksi dan
persilangan dari delapan galur ikan nila yang
dikumpulkan dari delapan negara yaitu Mesir,
Ghana, Senegal, Kenya, Israel, Singapura,
Thailand, dan Taiwan. Ikan nila GIFT
memiliki beberapa keunggulan dibandingkan
varietas lokalnya, diantaranya yaitu tingkat
pertumbuhan
yang
cepat,
fekunditas
(kesuburan) yang tinggi, serta ketahanannya
terhadap penyakit (Usni 2000). Penelitian
Rachmadi (2008) juga menunjukkan bahwa
beberapa bakteri proteolitik yang diisolasi dari
saluran pencernaan ikan nila GIFT ternyata
mampu mengambat pertumbuhan Microcystis
aeruginosa yang bersifat toksik bagi ikan lain.
Oleh sebab itu, potensi diperolehnya kandidat
isolat-isolat probiotik dari saluran pencernaan
ikan nila GIFT cukup besar.
Terkait
dengan
fungsinya
dalam
meningkatkan efisiensi pakan, isolat-isolat
probiotik diharapkan mampu menghasilkan
enzim-enzim yang bersifat digestif. Enzimenzim ini dapat memecah makromolekul
(protein, karbohidrat, lemak) yang terdapat di
dalam pakan ikan sehingga membuat
penyerapan makanan menjadi lebih efektif
dan efisien. Hasil penelitian Mubarik et al.
(2006) menunjukkan bahwa isolat NU-2
merupakan bakteri proteolitik dengan nilai
Indeks Proteolitik (IP) sebesar 1.89. Meskipun
protease ekstraseluler dari isolat NU-2 belum
dikarakterisasi, akan tetapi isolat bakteri ini
berpotensi untuk dijadikan probiotik karena
mampu menghasilkan baik protease, αamilase, dan glukoamilase ekstraseluler.
Pembentukan zona bening di sekitar
koloni pada agar-agar nutrien setelah disiram
larutan iodin menunjukkan bahwa bakteri
mampu
menghasilkan
enzim
amilase
ekstraseluler yang dapat menghidrolisis pati
(amilosa dan amilopektin) yang terkandung
dalam media. Dari 18 bakteri amilolitik yang
diamati nilai indeks amilolitiknya (IA)
bervariasi. Perbedaan nilai IA antara isolat
amilolitik disebabkan oleh kemampuan difusi
enzim amilase ekstrakseluler yang tidak selalu
sama. Oleh sebab itu, uji hidrolisis pati hanya
bersifat kualitatif. Penapisan isolat proteolitik
yang mampu menghasilkan baik α-amilase
dan glukoamilase dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim pada supernatan. Pengujian
aktivitas enzim pada supernatan dilakukan
pada dua suhu yaitu 37 oC, yang merupakan
suhu pertumbuhan bakteri koliform penghuni

6
saluran pencernaan dan 50 oC, yang
merupakan suhu rata-rata aktivitas optimum
amilase (Fogarty 1983).
Berdasarkan pengamatan morfologi sel
dengan teknik pewarnaan Gram, isolat bakteri
NU2 termasuk ke dalam genus Bacillus yang
memiliki morfologi berbentuk batang
berantai, bersifat Gram positif, dan memiliki
endospora pada bagian sentral sel (Gambar 2).
Selain itu, berdasarkan kebutuhannya
terhadap oksigen, bakteri NU-2 tergolong
sebagai bakteri aerob atau anaerobik fakultatif
yang merupakan salah satu ciri fisiologi
bakteri genus Bacillus (Holt et al. 1994).
Bacillus merupakan genus bakteri penghasil
enzim
amilase
ekstraseluler
terbesar.
Beberapa spesies genus ini, seperti B. subtilis,
B. stearothermophilus, B. licheniformis, B.
amiloquefaciens seringkali digunakan untuk
memproduksi enzim amilase secara komersial
untuk berbagai keperluan (Sivaramakrishnan
et al. 2006).
Hasil pengukuran kurva aktivitas
menunjukkan bahwa aktivitas maksimum αamilase terjadi pada jam ke-3 ketika sel
berada pada fase lag dan jam ke-15 ketika sel
berada
pada
fase
stasioner.
Untuk
glukoamilase aktivitas maksimumnya terjadi
pada saat jam ke-6 (fase lag) dan jam ke-15
(fase stasioner) setelah inkubasi. Hasil ini
memang sedikit berbeda dari hasil penelitian
lainnya yang melaporkan bahwa enzim
amilase diproduksi pada saat fase log atau
pada saat sel mengalami fase stasioner.
Ashger et al. (2007) melaporkan bahwa
aktivitas α-amilase B. subtilis JS-2004 terjadi
pada jam ke-48 setelah inkubasi atau pada
saat sel mengalami fase stasioner. Oleh sebab
itu, tingginya aktivitas α-amilase pada jam ke3 dan glukoamilase pada jam ke-6 setelah
inkubasi diduga disebabkan oleh pengaruh
inokulum. Ray et al. (2007) menyatakan
bahwa kondisi inokulum seperti keadaan sel
dan jumlah optimum sel di dalam inokulum
berpengaruh terhadap proses fermentasi.
Di dalam memenuhi kebutuhan akan
nutrisinya,
beberapa
bakteri
mampu
memproduksi enzim-enzim ekstraseluler.
Enzim-enzim ekstraseluler seperti amilase dan
protease, dihasilkan dengan tujuan untuk
merombak molekul kompleks di luar sel
menjadi lebih sederhana, sehingga molekulmolekul yang sederhana tersebut mampu
masuk ke dalam sel. Enzim-enzim
ekstraseluler ini bersifat induktif dan
dipengaruhi oleh substrat yang tersedia di
lingkungan (Whitaker 1994).
Menurut Murtidjo (2001), tepung ikan
merupakan bahan makanan pokok ikan yang

digunakan sebagai sumber protein hewani dan
mineral. Sebagai komponen utama penyusun
pakan ikan, tepung ikan memiliki kadar
protein yang jauh lebih tinggi dibandingkan
dengan pati tapioka. Sebaliknya, pati tapioka
memiliki kandungan karbohidrat yang jauh
lebih tinggi jika dibandingkan dengan tepung
ikan (Tabel 2). Hasil pengukuran kadar
protein dari media kontrol tanpa inokulasi
menunjukkan nilai yang lebih tinggi pada
media tepung ikan sebesar 0.546 mg/ml,
dibandingkan pati tapioka sebesar 0.441
mg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa isolat
bakteri NU-2 tumbuh lebih optimum dengan
menggunakan protein sebagai sumber energi
untuk pertumbuhan selnya.
Tabel 2 Kadar protein dan karbohidrat pada
tepung ikan dan pati tapioka
(Alamsyah 2005)
Jenis tepung
Kadar
Kadar
protein
karbohidrat
(%)
(%)
Tepung ikan
55.7
2.9
Pati tapioka
2.6
65.84
Selain mengandung kadar protein tinggi,
tepung ikan juga mengandung kadar mineral
yang cukup tinggi, terutama kalsium (Ca) dan
fosfor (P) (Tabel 3 dan Lampiran 8).
Tabel 3

Kadar kalsium dan fosfor pada
tepung ikan dan pati tapioka
(Alamsyah 2005)
Jenis tepung
Kadar
Kadar fosfor
kalsium (%)
(%)
Tepung ikan
4.75
2.45
Pati tapioka
0.17
0.19
Di antara berbagai ion logam lainnya, ion
kalsium seringkali dilaporkan mampu
meningkatkan baik produksi maupun aktivitas
amilase (Srivastava & Baruah 1986;
Sivaramakrishnan et al. 2006). Namun
demikian, perlu dilakukan pengujian lebih
lanjut mengenai pengaruh kation terutama
kalsium dalam meningkatkan produksi dan
aktivitas amilase dari isolat bakteri NU-2.
Enzim merupakan senyawa biomolekul
yang memiliki struktur dasar berupa protein.
Sebagai suatu protein, suatu enzim
mempunyai kondisi tertentu untuk bekerja
secara
optimal.
Faktor-faktor
yang
mempengaruhi kondisi tersebut antara lain
suhu dan pH. Hasil karakterisasi menunjukkan
bahwa enzim α-amilase tergolong sebagai
enzim netral yaitu enzim yang aktivitas
optimumnya berada pada kisaran pH normal
(6.0-7.0) sedangkan glukoamilase tergolong

7
enzim asam (pH optimum < 6.0). Masingmasing dengan suhu optimum untuk αamilase yaitu 37-40 oC dan 40 oC untuk
glukoamilase. Sivaramakrishnan et al. (2006)
melaporkan bahwa suhu optimum produksi
enzim amilase yang dihasilkan oleh suatu
organisme memiliki keterkaitan dengan suhu
optimum pertumbuhan selnya. Pada umumnya
bakteri mesofilik memiliki aktivitas enzim
amilase pada kisaran 40-60 oC. Meskipun
demikian, beberapa spesies Bacillus, seperti
B. subtilis, B. stearothermophilus, B.
licheniformis, B. amiloliquefaciens dilaporkan
mampu memproduksi amilase dengan kisaran
suhu yang lebih luas yaitu 37-60 oC
(Sivaramakrishnan et al. 2006). Sementara itu,
Fogarty (1983) menyatakan bahwa suhu
optimum untuk aktivitas glukoamilase berada
pada kisaran 40-60 oC, sedangkan pH
optimumnya pada kisaran 4.5-5.0. Hasil
perbandingan dengan referensi menunjukkan
bahwa karakter setiap enzim tidaklah selalu
sama (Tabel 4). Perbedaan karakter suhu dan
pH yang dimiliki oleh enzim menunjukkan
bahwa enzim bersifat khusus, tergantung
spesies yang menghasilkannya.
Jika enzim akan diaplikasikan untuk
pemakaian industri atau aplikasi praktis sudah
selayaknya dilakukan pengujian keamanan
apakah mengandung bahan yang toksik yang
tidak diharapkan ada di dalam enzim tersebut.
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini
sehubungan dengan hal tersebut yaitu menguji
kemampuan melisis darah. Bakteri penghasil
hemolisin akan mampu melisis sel darah
merah. Beberapa anggota dalam genus

Bacillus diketahui bersifat patogen dan
memiliki kemampuan dalam menghidrolisis
darah, salah satunya yaitu B. cereus. B. cereus
diketahui mampu memproduksi beberapa
enterotoksin, antara lain protease, fosfolipase,
dan hemolisin (Drobniewski 1993). Meskipun
demikian, penggunaan B. cereus sebagai agen
probiotik telah dilaporkan oleh Duc et al.
(2004). Duc et al. (2004) menyatakan bahwa
bakteri tidak selalu memproduksi enterotoksin. Faktor-faktor lingkungan mikro,
seperti faktor adhesi dan kompetisi terhadap
bakteri komensal lainnya, perolehan nutrisi,
dan pH di dalam saluran gastrointestinal
berpengaruh terhadap produksi enterotoksin.
Bakteri NU-2 ternyata dapat melisis sel darah
merah, namun ekstrak kasar enzim amilase
yang dihasilkannya tidak dapat melisis sel
darah merah. Dengan demikian apabila enzim
akan diaplikasikan harus terbebas dari sel
bakteri penghasilnya.
SIMPULAN
Isolat bakteri NU-2, yang merupakan
genus Bacillus, mampu menghasilkan baik
enzim α-amilase dan glukoamilase. Produksi
optimum α-amilase dan glukoamilase terjadi
pada saat jam ke-15 setelah inkubasi.
Penggunaan media NB yang menggunakan
0.5% tepung ikan mampu meningkatkan
produksi kedua enzim. Aktivitas α-amilase
optimum pada suhu 37-40 oC, pH 6.0 yang
diproduksi pada media pati tapioka, dan pH
6.0-7.0 pada media tepung ikan. Aktivitas

Tabel 4 Ciri-ciri α-amilase dan glukoamilase dari sejumlah bakteri
Enzim

Bakteri

Suhu
Optimum (oC)

pH
Optimum

α-amilase

B. acidocaldaricus

75

3.5

α-amilase

Clostridium acetobutylicum
ATCC 824

45

5.6

α-amilase

Streptomyces rimosus

35-50

6.0-6.7

α-amilase

B. subtilis JS-2004

70

8.0

α-amilase

Bacillus sp. TS-23

70

9.0

α-amilase

Bacillus sp. IMD370

40

10.0

Glukoamilase

C. thermohydrosulfuricum

75

4.0-6.0

Glukoamilase

Bacillus sp. Termofil

70

5.0

Glukoamilase

Streptomyces rimosus

35-50

6.0-6.7

Glukoamilase

Sulfolobus solfataricus

90

5.5-6.0

Referensi
Buonocore et al.
(1976)
Paquet et al.
(1991)
Yang & Wang
(1999)
Ashger et al.
(2007)
Lin et al. (1998)
Mc Tigue et al.
(1995)
Hyun & Zeikus
(1985)
Gill & Kaur
(2004)
Yang & Wang
(1999)
Kim et al. (2004)

8
glukoamilase optimum pada suhu 40 oC, pH
6.0 yang diproduksi pada media pati tapioka,
dan pH 5.0-6.0 pada media tepung ikan. Sel
bakteri
NU-2
mampu
menghasilkan
hemolisin, akan tetapi supernatan yang
mengandung enzim amilase ekstrak kasar
tidak.
SARAN
Perlu dikaji lebih lanjut mengenai
pengaruh inokulum dan komposisi media
berdasarkan rasio C/N dalam produksi αamilase dan glukoamilase.
DAFTAR PUSTAKA
Alamsyah R. 2005. Pengolahan Pakan Ayam
dan Ikan Secara Modern. Depok:
Penebar Swadaya.
Ashger M, Asad MJ, Rahman SU, Legge RL.
2007. A thermostable α-amylase from
moderately thremophilic Bacillus subtilis
strain for starch processing. J Food Eng
79:950-955.
Bernfeld P. 1955. Amylases α and β: Methods
in Enzymol I. New York: Academic Pr.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of
micrograms quantitaties of protein in
utilizing the principle of protein-dye
binding. Anal Biochem 72:248-254.
Breuil C, Saddler JN. 1985. Comparison of
the 3.5-dinitrosalicylic acid and NelsonSomogyi methods of assaying for
reducing
sugars
and
determining
cellulose activity. Enzyme Microbiol
Technol 7:331.
Buonocore V, Caporale C, Rosa MD,
Gambacorta A. 1976. Stable, inducible
thermophilic α-amylase from Bacillus
acidocaldaricus. J Bacteriol 128: 515521.
[DKPRI]. 2005. Pemberdayaan Industri
Perikanan Nasional Melalui Pengembangan Budidaya Laut dan Pantai
[terhubung berkala]. http: www.dkp.go.id
[25 Nov 2006].
Drobniewski FA. 1993. Bacillus cereus and
related species. J Clin Microbiol Rev
6(4):324-338.
Duc et al. 2004. Characterization of Bacillus
probiotic available for human use. Appl
Environ Microbiol 70(4):2161-2171.
Feliatra, Efendi I, Suryadi E. 2004. Isolasi dan
identifikasi bakteri probiotik dari ikan
kerapu macan (Ephinephelus fuscogatus)
dalam upaya efisiensi pakan ikan. J Natur
Indones 6:75-80.

Fogarty WM. 1983. Microbial amylases. Di
dalam: Fogarty WM, editor. Microbial
Enzymes and Biotechnology. London:
Applied Science. hlm 1-92.
Gill RK, Kaur J. 2004. A thermostable
glucoamylase from a thermophilic
Bacillus sp.: characterization and
thermostability. J Industrial Microbiol
Biotechnol 31:1 [terhubung berkala].
http://www.springerlink.com [20 Desember 2007).
Holt et al. 1994. Determinative Bacteriology.
Ed ke-9. NSA: Lippincot William &
Wilkins.
Hyun HH, Zeikus JG. 1985. General
biochemical characterization of thermostable pullulanase and glucoamylase from
Clostridium thermohydrosulfuricum. Appl
Environ Microbiol 49:1168-1173.
Kim et al. 2004. Properties of a novel
thermostable glucoamylase from the
hyperthermophilic archaeon Sulfolobus
solfataricus. Appl Environ Microbiol
70:3933-3940.
Lin LL, Chyau CC, Hsu WH. 1998.
Production and properties of a rawstarch-degrading amylase from the
thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp.
TS-23. Biotechnol Appl Biochem 28:6168.
Mc Tigue MA, Kelly CT, Doyle EM, Fogarty
WM. 1995. The alkaline amylase of the
alkalophilic Bacillus sp. IMD 370.
Enzymes Microbiol Technol 17:570-573.
Mubarik NR, Fatimah I, Wahjuningrum D.
2006. Isolation of proteolytic bacteria
from digestive tract of tilapias strain
GIFT (Oreochromis niloticus (Linnaeus)
Trewavas) and characterization of its
extracellular
protease.
Di
dalam:
Enzymes: Industrial and Medical
Prospects. Proceeding of ASEAN
Biochemistry Seminar; Surabaya, 6-7 Feb
2006. Surabaya: Universitas Airlangga.
hlm 1-6.
Murtidjo BA. 2001. Pedoman Meramu Pakan
Ikan. Yogjakarta: Kanisius.
Paquet V, Croux C, Goma G, Soucaille P.
1991. Purification and characterization of
the
extracellular
α-amylase
from
Clostridium acetobutylicum ATCC 824.
Appl Environ Microbiol 57:212-218.
Rachmadi AT. 2008. Peranan bakteri asal
pencernaan ikan nila GIFT dalam
menghambat pertumbuhan Microcystis
aeruginosa BT-02 [skripsi]. Bogor:
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.

9
Ray AK, Bairagi A, Ghosh KS, Sen SK. 2007.
Optimization of fermentation condition
for cellulase production by Bacillus
subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3
isolated from fish gut. Acta Ichthyol
Piscat 37(1):47-53.
Sivaramakrishnan et al. 2006. α-Amylase
from microbial sources-an overview on
recent developments. Food Technol
Biotechnol 44:173-184.
Srivastava RAK, Baruah JN. 1986. Culture
conditions for production of thermostable
amylase by Bacillus stearothermophilus.
Appl Environ Microbiol 52:179-184.
Suyanandana et al. 1998. New probiotic
lactobacilli and enterococci from fish
intestine and their effect on fish
production. Di dalam: ASIAN Network on
Microbial Researches. Proceeding of
International Researches, Yogjakarta, 2325 Feb 1998.
Usni A. 2000. Pembenihan dan Pembesaran
Ikan Nila GIFT. Jakarta: Penebar
Swadaya. hlm. 1-10.
Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P,
Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as
biological control agents in aquaqulture.
Microbiol Mol Biol Rev 64:655-671.
Whitaker JR. 1994. Principles of Enzymology
for the Food Sciences. Ed ke-2. New
York: Marcel Dekker.
Yang SS, Wang JY. 1999. Protease and
amylase production of Streptomyces
rimosus in submerged and solid state
cultivations. Bot Bull Acad Sin 40:259265.

10

LAMPIRAN

11
Lampiran 1 Skema metode Bernfeld (1955)
1 ml enzim + 1 ml larutan pati 1% (dalam bufer)
Diinkubasi (suhu optimum, 15 menit)
+ 2 ml DNS
Dididihkan 5 menit
Didinginkan 5 menit
Absorbansi diukur pada λ 550 nm
Blanko: enzim diganti dengan akuades steril.
Kontrol: penambahan enzim dilakukan setelah ditambah DNS, sebelum
dididihkan.
Standar: larutan standar maltosa 100-500 ppm, dengan selang konsentrasi 100
ppm.

Perasamaan aktivitas α-amilase (Unit/ml):

[maltosa] x Fp
BM maltosa x V x t

Persamaan aktivitas spesifik α-amilase (Unit/mg protein):
aktivitas α-amilase (Unit/ml)
kadar protein (mg/ml)
Keterangan:
[maltosa]: konsentrasi maltosa (ppm)
Fp: faktor pengenceran
BM: bobot molekul maltosa (360.31 dalton)
V: volume enzim yang digunakan (1 ml)
t: waktu inkubasi (20 menit)

12
Lampiran 2 Skema metode Somogyi-Nelson (Nelson 1944 dalam Breuil &
Saddler 1985)
0.1 ml enzim + 0.5 ml larutan pati + 0.4 ml bufer
Diinkubasi (suhu optimum, 30 menit)
+ 1 ml Pereaksi A*
Diambil 1 ml + 1 ml Pereaksi D*
Dididihkan 20 menit
Didinginkan 5 menit
+ 1 ml Pereaksi C*,
Dikocok hingga tidak ada gelembung
Diencerkan hingga 25 ml
Absorbansi diukur pada λ 520 nm
Blanko: enzim diganti dengan akuades steril.
Kontrol: penambahan enzim dilakukan setelah ditambah pereaksi A, sebelum
dididihkan.
Standar: larutan standar glukosa 100-500 ppm, dengan selang konsentrasi 100
ppm.

Persamaan aktivitas glukoamilase (Unit/ml):

[glukosa] x Fp
BM maltosa x V x t

13
Persamaan aktivitas spesifik glukoamilase (Unit/mg protein):
aktivitas glukoamilase (Unit/ml)
kadar protein (mg/ml)
Keterangan:
[glukosa]: konsentrasi glukosa (ppm)
Fp: faktor pengenceran
BM: bobot molekul maltosa (180.16 dalton)
V: volume enzim yang digunakan (1 ml)
t: waktu inkubasi (20 menit)
*) Cara membuat:
• Pereaksi A: 2.5 g Na2CO3 + 2.5 g NaKtartrat + 2 g NaHCO3 + 20 g, keempat
bahan dicampur dalam 50 ml akuades steril, lalu diencerkan hingga
100 ml.
• Pereaksi B: 30 g CuSO4.5H2O dilarutkan dalam 200 ml akuades steril yang
mengandung 4 tetes asam sulfat pekat.
• Pereaksi C: 5 g amonium molibdat dilarutkan dalam 50 ml akuades yang
mengandung 4.2 ml H2SO4. Campuran lain disiapkan dengan
melarutkan 0.6 g Na2HAsO4.7H2O dalam 5 ml akuades. Kedua
campuran disatukan lalu diencerkan hingga 100 ml. Inkubasi
semalam pada suhu 37-40 oC, dimasukkan ke dalam botol gelap
dan disimpan pada suhu rendah.
• Pereaksi D: 25 ml pereaksi A + 1 ml pereaksi B
Lampiran 3 Skema metode Bradford (1976)
0.1 ml sampel + 5 ml pereaksi Bradford (Coomasie)*
Diinkubasi (±5 menit, < 1 jam)
Absorbansi diukur pada λ 595 nm
Standar: bovin serum albumin 0.1 – 0.5 mg/ml
Blanko: akuades steril pengganti sampel

*) Cara membuat pereaksi Bradford (Coomasie):

14
•
•
•

0.01 g Coomasie Brilian Blue (CBB) G-250 dilarutkan dalam 5 ml etanol
95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v).
Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas
saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah.
Stok pereaksi Bradford harus diencerkan lima kali sebelum digunakan.

Lampiran 4 Hasil penapisan isolat bakteri amilolitik
Kode
isolat
NL 1
NL 2
NL 3
NL 4
NL 6
NL 7
NL 8
NL 9
NL 10
NL 11
NL 12
NL 13
NL 14
NL 15
NL 16
NL 17
NL 18
NU 1
NU 2
NU 3
NU 4
NU 5
NU 6
NU 7
NU 8
NU 9
NU 10
NU 11
NU 12
NU 13

Hasil (24 jam, T = 37oC)
Ulangan 1 (mm)
Ulangan 2 (mm)
Ф koloni
Ф zona
IA
Ф koloni
Ф zona
10
15.5
0.55
8.5
12
14.5
21
0.45
12.5
21
15
21.5
0.43
16.5
22
5
9
0.8
5.5
8.5
19
25
0.32
24
31
13
0.65
0.65
13
21
13
14.5
0.12
11.5
14
22
23.5
0.07
13.5
17
13
19
0.46
8
16.5
7
11
0.57
6
9
10.5
18.5
0.76
8.5
18
5
14
1.8
11
18
13
21.5
0.65
13.5
22.5
6.5
6.5
0
7
7
17
22
0.29
12
19
15.5
26
0.68
15
26.5
17.5
19.5
0.11
21.5
24.5
8
10.5
0.31
9.5
12

Ratarata
IA
0.41
0.68
0.33
0.54
0.29
0.62
0.22
0.26
1.06
0.5
1.12
0.64
0.67
0
0.58
0.77
0.14
0.26

0.48
0.57
0.38
0.67
0.31
0.64
0.17
0.16
0.76
0.54
0.94
1.22
0.66
0
0.44
0.73
0.12
0.29

15
Lampiran 5 Aktivitas amilase dari isolat bakteri NU-2 yang diproduksi pada
media NB dengan substrat 0.5% (b/v) pati tapioka dan tepung ikan.
Suhu inkubasi enzim yang digunakan yaitu 37 oC dengan pH 7.0
Aktivitas (Unit/ml)
Aktivitas spesifik (Unit/mg protein)
glukoamilase
glukoamilase
α-amilase
α-amilase
Pati tapioka
0.051
0.121
0.358
0.785
Stdev
±0.0014
±0.0916
±0.0679
±0.4667
Tepung ikan
0.073
0.204
0.293
0.795
Stdev
±0.0252
±0.0785
±0.1266
±0.2376
Keterangan: Stdev = standar deviasi dari rata-rata dua ulangan.
Jenis
Substrat

Lampiran 6 Karakterisasi α-amilase dari isolat bakteri NU-2 pada berbagai suhu
dan pH
• Aktivitas α-amilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan tepung
pati pada berbagai suhu. Pengukuran aktivitas pada pH 7.0
Aktivitas α-amilase (Unit/ml) pada suhu (oC)
30
37
40
50
60
Pati tapioka
0.044
0.069
0.065
0.05
0.044
Stdev
±0.0105 ±0.00001 ±0.00001 ±0.00003 ±0.000009
Tepung ikan
0.056
0.083
0.077
0.067
0.052
Stdev
±0.0119 ±0.0231
±0.014
±0.0224
±0.0028
Keterangan: Stdev = standar deviasi dari rata-rata dua ulangan.
Jenis Substrat

• Aktivitas α-amilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan pati
tapioka pada berbagai pH. Pengukuran aktivitas pada suhu optimum 37 oC
Aktivitas α-amilase (Unit/ml) pada pH
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
Pati tapioka
0.04
0.045
0.072
0.032
0.06
Stdev
±0.0002 ±0.0003
±0.0003
±0.0056 ±0.0133
Tepung ikan
0.039
0.041
0.063
0.071
0.062
Stdev
±0.0182 ±0.0224
±0.0035
±0.0252 ±0.0287
Keterangan: Stdev = standar deviasi dari rata-rata dua ulangan.
Jenis
Substrat

9.0
0.04
±0.0003
0.063
±0.0042

16

Lampiran 7 Karakterisasi glukoamilase dari isolat bakteri NU-2 pada berbagai
suhu dan pH
• Aktivitas glukoamilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan pati
tapioka pada berbagai suhu. Pengukuran aktivitas pada pH 7.0
Aktivitas glukoamilase (Unit/ml) pada suhu (oC)
30
37
40
50
60
Pati tapioka
0.176
0.093
0.185
0.093
0.074
Stdev
±0.1178 ±0.00001 ±0.0523
±0.0523
±0.000009
Tepung ikan
0.102
0.213
0.296
0.139
0.084
Stdev
±0.0654 ±0.0654 ±0.0523
±0.0393
±0.0131
Keterangan: Stdev = standar deviasi dari rata-rata dua ulangan.
Jenis Substrat

• Aktivitas glukoamilase isolat NU-2 yang diproduksi pada tepung ikan dan pati
tapioka pada berbagai pH. Pengukuran aktivitas pada suhu optimum 40 oC
Aktivitas glukoamilase (Unit/ml) pada pH
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
Pati tapioka
0.121
0.074
0.352
0.056
0.075
Stdev
±0.0131
±0
±0.2237
±0
±0.0262
Tepung ikan
0.111
0.167
0.204
0.158
0.139
Stdev
±0
±0
±0.2093 ±0.1178 ±0.0393
Keterangan: Stdev = standar deviasi dari rata-rata dua ulangan.
Jenis Substrat

9.0
0.084
±0.0131
0.121
±0.0393

Lampiran 8 Kandungan nutrisi tepung ikan dan pati tapioka (Alamsyah 2005)

Jenis tepung

Kadar
protein
(%)

Kadar
karbohidrat
(%)

Kadar
lemak
(%)

Serat
kasar
(%)

Kadar
abu
(%)

Kadar
kalsium
(%)

Kadar
fosfor
(%)

Energi
metabolisme
(ME)
(kkal/kg)

Tepung ikan
Pati tapioka

55.7
2.6

2.9
65.84

8.1
0.7

1.5
5.67

20.3
4.69

4.75
0.17

2.45
0.19

3190
3720

1

KARAKTERISASI α-AMILASE DAN GLUKOAMILASE
DARI BAKTERI PROTEOLITIK ASAL PENCERNAAN
IKAN NILA GIFT

MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

2

ABSTRAK

MUHAMMAD NOVIANTO BAYU SAPUTRO. Karakterisasi Į-Amilase dan
Glukoamilase dari Bakteri Proteolitik Asal Pencernaan Ikan Nila GIFT.
Dibimbing oleh NISA RACHAMANIA MUBARIK dan ANJA MERYANDINI.
Penggunaan teknologi probiotik telah menjadi salah satu alternatif dalam
usaha meningkatkan produktivitas perikanan. Penelitian ini bertujuan untuk
menapis isolat amilolitik yang memiliki aktivitas Į-amilase dan glukoamilase dari
sejumlah bakteri proteolitik yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila GIFT
(Genetic Improvement of Farmed Tilapias). Dari 31 isolat bakteri proteolitik,
berhasil ditapis sebanyak 18 isolat amilolitik. Tiga isolat diantaranya
menunjukkan indeks amilolitik (IA) terbesar yaitu NU-1, NU-2, dan NL-15.
Pengukuran aktivitas Į-amilase menggunakan metode Bernfeld dan aktivitas
glukoamilase dengan metode Somogyi-Nelson. Kadar protein diukur dengan
metode Bradford. Isolat bakteri NU-2, yang merupakan genus Bacillus, mampu
menghasilkan enzim Į-amilase dan glukoamilase. Aktivitas maksimum Į-amilase
dan glukoamilase terjadi pada jam ke-15 setelah inkubasi. Hasil karakterisasi
me