Potensi bakteri endofit sebagai agens pengendalian hayati terhadap penyakit darah pada tanaman pisang

POTENSI BAKTERI ENDOFIT SEBAGAI AGENS

PENGENDALIAN HAYATI TERHADAP PENYAKIT DARAH

PADA TANAMAN PISANG

HUSDA MARWAN

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudu l “Potensi Bakteri Endofit sebagai Agens Pengendalian Hayati terhadap Penyakit Darah pada Tanaman Pisang” adalah karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka disertasi ini.

Bogor, Januari 2012

Husda Marwan NIM A362070011

ABSTRACT

HUSDA MARWAN. The Potency of Endophytic Bacteria as Biocontrol Agents to Control Blood Disease on Banana. Under direction of MEITY SURADJI SINAGA, GIYANTO and ABDJAD ASIH NAWANGSIH

Blood disease of banana caused by blood disease bacterium (BDB) is an important disease of bananas in Indonesia. The available control techniques have not been able to solve the disease problem effectively. Therefore, the development of more effective control method is needed. Endophytic bacteria have potencies as candidates of biological control agents to blood disease, because the bacteria as reported to be associated with plant resistance to pathogens and plant growth promotion. The aim of the studies were to (1) explore, select and identify endophytic bacteria to control blood disease on banana; (2) determine the mechanisms of endophytic bacteria to control blood disease on banana; (3) evaluate endophytic bacterial colonization on banana plant and their effect on the effectiveness to control blood disease; and (4) analyse the effect of application method of endophytic bacteria to their effectiveness to control blood disease on banana. Ninety isolates of endophytic bacteria have been isolated from the root of banana. The average population densities of the bacteria varied between 6.0 x 103 and 4.2 x 105 cfu/g fresh weight of root. Twenty seven among the ninety isolates positively produced inhibition zone toward blood disease bacterium (BDB). However, only four isolates (EAL15, EKK10, EKK20, EKK22) were able to reduce the incidence of blood disease on banana with ranged from 66.67% to 83.33%. Based on the partial sequence of 16S rRNA, four isolates were identified as Serratia liquefaciens (EAL15), Bacillus megaterium (EKK10), Enterobacter cloacae (EKK20) and Pectobacterium cypripedii (EKK22). The mechanisms of endophytic bacteria to control blood disease on banana were induced resistance, based on their activities in increasing peroxidase, polyphenol oxidase and salicylic acid content. The endophytic bacteria EAL15-Rif colonized within roots and stem tissues of young banana trees at four weeks after inoculation. Histological analysis using Scanning Electron Microscopy showed that EAL15-Rif colonise within the root and stem tissues of banana. The colonization period of endophytic bacteria during the eight months suppressed the blood disease incidence on banana ‘Cavendish’ with ranged from 66.67% to 83.33%. Application of endophytic bacterial community K-AL3 and K-RB1 were able to suppress the blood disease incidence on ‘Kepok kuning’ cultivar as much as 75.00% and 83.33%.

Keyword : endophytic bacteria, blood disease bacterium, banana, induce resistance.

HUSDA MARWAN. Potensi Bakteri Endofit Sebagai Agens Pengendalian Hayati terhadap Penyakit Darah pada Tanaman Pisang. Dibimbing oleh MEITY SURADJI SINAGA, GIYANTO dan ABDJAD ASIH NAWANGSIH

Penyakit darah (blood disease) yang disebabkan oleh Blood Disease Bacterium (BDB) merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman pisang di Indonesia. Infeksi BDB pada tanaman pisang dapat menyebabkan tanaman mati atau menghasilkan buah yang tidak dapat dikonsumsi. Daging buah pisang yang terinfeksi BDB menjadi berlendir yang mengandung massa bakteri. Bakteri endofit berpotensi untuk dikembangkan sebagai agens pengendalian hayati penyakit darah pada tanaman pisang karena mampu menginduksi ketahanan tanaman terhadap patogen dan menstimulasi pertumbuhan tanaman.

Penelitian ini bertujuan untuk : (1) mengeksplorasi, menyeleksi, dan mengidentifikasi isolat bakteri endofit yang berpotensi untuk mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang; (2) menganalisis mekanisme kerja bakteri endofit dalam mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang; (3) mengkaji kemampuan kolonisasi bakteri endofit antagonis di dalam jaringan tanaman pisang dan pengaruh periode kolonisasi bakteri endofit terhadap keefektifan pengendalian penyakit darah; dan (4) menganalisis pengaruh metode aplikasi bakteri endofit terhadap keefektifan pengendalian penyakit darah pada tanaman pisang.

Bakteri endofit diisolasi dari akar tanaman pisang ‘Kepok kuning’, ‘Kepok tanjung’, ‘Raja bulu’, ‘Raja nangka’, ‘Raja uli’ dan ‘Ambon lumut’ yang tumbuh sehat diantara pertanaman pisang yang terserang BDB di daerah Bogor. Seleksi awal terhadap isolat bakteri endofit dilakukan berdasarkan kemampuan antibiosis terhadap BDB secara in vitro dan/atau isolat bakteri endofit yang dominan dalam komunitasnya. Isolat hasil seleksi awal diinokulasikan pada bibit pisang ‘Cavendish’. Bibit pisang yang telah dikolonisasi bakteri endofit selama 8 minggu diamati pertumbuhan dan aktifitas enzim pertahanan (peroksidase dan polifenol oksidase). Bibit pisang kemudian diinokulasi dengan BDB untuk mengetahui kemampuan dari isolat bakteri endofit dalam mengendalikan penyakit darah. Pengamatan dilakukan terhadap periode inkubasi penyakit dan persentase kejadian penyakit darah. Isolat bakteri endofit yang berpotensi untuk mengendalikan penyakit darah, diidentifikasi berdasarkan sekuen parsial 16S rRNA menggunakan primer 27F dan 1492R, serta karakterisasi fisiologis bakteri endofit berdasarkan produksi pigmen fluorescent, siderofor, kitinolitik dan indol acetic acid (IAA).

Mekanisme induksi ketahanan tanaman terhadap penyakit darah dan pemacu pertumbuhan tananam pisang oleh bakteri endofit dianalisis melalui aktivitas peroksidase, polifenol oksidase, kandungan asam salisilat dan auksin pada tanaman. Kemampuan kolonisasi bakteri endofit di rizosfer, permukaan akar, di dalam jaringan akar dan bonggol tanaman pisang dianalisis melalui perkembangan populasi mutan spontan bakteri EAL15 yang tahan terhadap rifampisin (EAL15-Rif). Keberadaan koloni bakteri EAL15-Rif di dalam jaringan akar dan bonggol diamati menggunakan Scanning Electron Microscopy.

darah dievaluasi melalui uji berbagai cara aplikasi bakteri endofit yaitu : perendaman akar bibit pisang (PAB), infestasi bakteri endofit ke media tanam (IMT), dan kombinasi kedua perlakuan (PAB+IMT). Pengujian juga dilakukan dengan mengaplikasikan komunitas bakteri endofit pada tanaman pisang ‘Kepok kuning’ dan ‘Cavendish’.

Sebanyak 90 isolat bakteri endofit diisolasi dari akar beberapa tanaman pisang sehat, yaitu 33 isolat berasal dari pisang ‘Kepok’, 31 isolat dari pisang ‘Raja’, dan 26 isolat dari pisang ‘Ambon’. Kerapatan populasi bakteri endofit berkisar antara 6.0 x 103 – 4.2 x 105

Bakteri endofit yang diinokulasikan ternyata mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman pisang, aktivitas enzim peroksidase dan polifenol oksidase. Berdasarkan uji inokulasi BDB pada tanaman pisang 8 minggu setelah inokulasi bakteri endofit, diketahui 4 isolat bakteri endofit potensial mampu menekan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang yaitu : EAL15, EKK10, EKK20, dan EKK22 dengan tingkat penekanan kejadian penyakit sebesar 83.33%, 66.67%, 66.67% dan 75.00%. Isolat EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22 diidentifikasi sebagai Serratia liquefaciens, Bacillus megaterium, Enterobacter cloacae dan Pectobacterium cypripedii. Berdasarkan analisis aktivitas peroksidase, polifenol oksidase, kandungan asam salisilat dan auksin, bakteri endofit menekan kejadian penyakit darah melalui mekanisme induksi ketahanan. Bakteri endofit EAL15 meningkatkan aktifitas peroksidase (0.395 UEA/mg protein), polifenol oksidase (0.083 UEA/mg protein), serta meningkatkan kandungan asam salisilat (7.78 ppm/gram akar) dan hormon auksin (2.31 ppm/gram akar) pada tanaman pisang; EKK10 meningkatkan aktifitas peroksidase (0.391 UEA/mg protein), polifenol oksidase (0.065 UEA/mg protein), dan meningkatkan kandungan asam salisilat (25.56 ppm/gram akar); EKK20 meningkatkan aktifitas peroksidase (0.345 UEA/mg protein) dan polifenol oksidase (0.071 UEA/mg protein); EKK22 meningkatkan aktifitas peroksidase (0.097 UEA/mg protein). Karakterisasi fisiologi bakteri endofit menunjukkan bahwa isolat EAL15 dan EKK20 bersifat antibiosis terhadap BDB, menghasilkan siderofor dan indol acetic acid (IAA); isolat EKK10 bersifat antibiosis terhadap BDB dan menghasilkan IAA; sedangkan EKK22 hanya menghasilkan IAA.

cfu/g berat basah akar. Sebanyak 30 isolat bakteri endofit (22 isolat mempunyai kemampuan antibiosis terhadap BDB, 4 isolat mempunyai kemampuan antibiosis terhadap BDB serta dominan dalam komunitasnya, dan 4 isolat dominan dalam komunitasnya) diinokulasikan pada bibit pisang ‘Cavendish’ untuk mengetahui kemampuan bakteri endofit dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman dan aktivitas enzim pertahanan tanaman (peroksidase dan polifenol oksidase), serta mengendalikan penyakit darah.

Hasil uji kolonisasi bakteri endofit pada tanaman pisang menunjukkan bahwa bakteri endofit EAL15-Rif telah mengko lonisasi bagian dalam jaringan akar pisang ‘Cavendish’ pada 3 hari setelah inokulasi (hsi) dan di dalam bonggol pisang pada 4 minggu setelah inokulasi (msi). Populasi bakteri di rizosfer dan permukaan akar tanaman pisang cenderung menurun mulai 2 msi sampai 8 msi, sedangkan populasi bakteri di dalam jaringan akar meningkat mulai 3 hsi (1.3 x 101 cfu/g akar) sampai 3 msi (2.4 x 104 cfu/g akar) dan cenderung stabil sampai 8 msi (6.7 x 104 cfu/g akar). Pengamatan menggunakan Scanning Electron Microscopy pada akar dan bonggol tanaman pisang yang diinokulasi dengan bakteri endofit EAL15-Rif selama 8 minggu membukt ikan adanya koloni bakteri

kolonisasi bakteri endofit selama 8 minggu menunjukkan persentase penekanan penyakit darah sebesar 83.33%, 75%, 66.67% dan 75% dengan perlakuan isolat bakteri EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22.

Hasil penelitian pengaruh cara aplikasi bakteri endofit terhadap keefektifan pengendalian penyakit darah menunjukkan bahwa perlakuan bakteri endofit melalui perendaman akar bibit pisang (PAB), infestasi bakteri endofit ke media tanam (IMT) dan kombinasi kedua perlakuan (PAB+IMT) berpengaruh terhadap pertumbuhan tanaman pisang, tetapi tidak berpengaruh terhadap periode inkubasi dan persentase kejadian penyakit darah. Cara aplikasi bakteri endofit dengan perendaman akar bibit pisang lebih efektif dalam menekan kejadian penyakit paling tinggi. Cara aplikasi ini menunjukkan penekanan kejadian penyakit sebesar 91.67% dengan isolat EAL15 dan 66.67% dengan isolat EKK10 dan EKK20. Aplikasi komunitas bakteri endofit tidak berpengaruh terhadap pertambahan tinggi, jumlah daun pada tanaman pisang ‘Kepok kuning’ dan ‘Cavendish’. Aplikasi komunitas bakteri endofit K-AL3 dan K-RB1 mampu penekanan kejadian penyakit darah sebesar 75% dan 83.33% pada tanaman pisang ‘Kepok kuning’.

Berdasarkan hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22 berpotensi dikembangkan sebagai agens pengendalian hayati terhadap penyakit darah. Isolat-isolat tersebut menekan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang melalui mekanisme induksi ketahanan dengan meningkatkan aktifitas peroksidase, polifenol oksidase, kandungan asam salisilat dan hormon auksin pada tanaman pisang. Kemampuan isolat bakteri endofit dalam menekan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang dapat dipengaruhi oleh periode kolonisasi dan cara aplikasi bakteri.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012

Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumbernya

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya

POTENSI BAKTERI ENDOFIT SEBAGAI AGENS

PENGENDALIAN HAYATI TERHADAP PENYAKIT DARAH

PADA TANAMAN PISANG

HUSDA MARWAN

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Penguji pada Ujian Tertutup : 1. Dr. Ir. Supriadi, M.Sc 2. Dr. Dewi Sukma, SP., M.Si Penguji pada Ujian Terbuka : 1. Dr. Ir. Ika Djatnika, MS

Hayati terhadap Penyakit Darah pada Tanaman Pisang

Nama : Husda Marwan

NRP : A362070011

Disetujui : Komisi Pembimbing

Ketua

Prof. Dr. Meity Suradji Sinaga, M.Sc

Dr. Ir. Giyanto, M.Si

Anggota Anggota

Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si

Mengetahui

Ketua Program Studi Fitopatologi Dekan Sekolah Pascasarjana Sekolah Pascasarjana IPB Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya sehingga disertasi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam disertasi ini adalah pengendalian hayati penyakit tanaman, dengan judul Potensi Bakteri Endofit sebagai Agens Pengendalian Hayati Terhadap Penyakit Darah pada Tanaman Pisang.

Bagian Bab I dari Disertasi ini diterbitkan di Jurnal Hama dan Penyakit Tumbuhan Tropika, Volume 11 Nomor 2 September 2011 yang berjudul Isolasi dan Seleksi Bakteri Endofit untuk Pengendalian Penyakit Darah pada Tanaman Pisang.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Meity Suradji Sinaga, M.Sc., Dr. Ir. Giyanto, M.Si, dan Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih atas bimbingan, arahan, kritik, saran dan dukungan moril yang sangat bermanfaat sejak penyusunan rencana dan pelaksanaan penelitian sampai penyusunan disertasi ini.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Ir. M. Rahmad Suhartanto, M.Sc sebagai Penguji Luar Komisi pada ujian Prakualifikasi Lisan. Dr. Ir. Supriadi, M.Sc dan Dr. Dewi Sukma, SP., M.Si sebagai Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup Program Doktor atas kritik dan saran yang telah diberikan. Dr. Ir. Ika Djatnika, MS dan Dr. Ir. Abdul Munif, M.Sc.Agr

Terima kasih penulis ucapkan kepada Direktorat Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan Nasional Republik Indonesia atas bantuan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan biaya penelitian melalui program penelitian Hibah Bersaing tahun 2009-2010. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Pemerintah Daerah Provinsi Jambi melalui Dinas Pendidikan Provinsi Jambi yang telah memberikan bantuan biaya penelitian dan Program Magister Agribisnis Universitas Jambi atas bantuan biaya penyusunan disertasi ini.

sebagai Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup Program Doktor atas segala kritik dan sarannya untuk perbaikan Disertasi ini. Terima kasih kepada Ketua Program Studi/Mayor Fitopatologi yang telah memberikan saran dan kritik sejak penyusunan rencana penelitian sampai penyusunan disertasi ini.

Bakteriologi Tanaman, Departemen Proteksi Tanaman IPB dan mahasiswa Sekolah Pascasarjana Program Studi Fitopatologi IPB atas bantuan dan kerjasama selama ini. Terima kasih penulis sampaikan kepada Kepala Rumah Kaca Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumbardaya Genetik Bogor (BB-BIOGEN) beserta staf yang telah memberikan bantuan dan kerjasama selama pengujian di rumah kaca.

Rasa hormat yang setinggi-tingginya kepada kedua orang tua tercinta Bapak Husin (Almarhum) dan Ibu Hj. Nurbaida serta mertua Bapak Drs. Joernalis Norman dan Ibu Yusnaniar yang telah mencurahkan kasih sayang, bimbingan, dan doanya selama ini, semoga Allah SWT memberikan rahmat dan kurniaNya.

Ucapan terima kasih teristimewa untuk istriku tercinta Reni Yustien, SE., MSi.Ak dan anak-anakku tersayang Alfiyya Rifqa Luqyana, Tadzkia Rahma Azzahra dan Syifa Na’ilah Maulida yang telah memberikan kebahagian, pengertian, kasih sayang dan doa yang selalu dipanjatkan untuk kesuksesan penulis.

Terima kasih yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan disertasi ini, semoga Allah SWT membalas semua kebaikan Bapak/Ibu dan teman-teman.

Semoga hasil penelitian ini bermanfaat untuk perkembangan ilmu dan teknologi, khususnya dalam bidang pengendalian hayati penyakit tanaman.

Bogor, Januari 2012 Husda Marwan

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Duku (Padang) pada tanggal 21 Maret 1971 dari Bapak Husin dan Ibu Hj. Nurbaida. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara.

Penulis menyelesaikan pendidikan sarjana Strata 1 di Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuan, Fakultas Pertanian Universitas Andalas Padang pada tahun 1995 dan sarjana Strata 2 di Program Pascasarjana Universitas Andalas Padang pada tahun 1999. Semenjak tahun 2007 penulis terdaftar sebagai mahasiswa Program Doktor (S3) pada Program Studi Fitopatologi, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 2000 sampai sekarang penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Fakultas Pertanian Universitas Jambi.

Halaman

DAFTAR TABEL ... xvi

DAFTAR GAMBAR ... xviii

DAFTAR LAMPIRAN ... xix

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 4

TINJAUAN PUSTAKA ... 6

Penyakit Darah pada Tanaman Pisang ... 6

Potensi Bakteri Endofit Sebagai Agens Pengendalian Hayati ... 11

ISOLASI, SELEKSI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT SEBAGAI AGENS PENGENDALIAN HAYATI TERHADAP PENYAKIT DARAH PADA TANAMAN PISANG Abstrak ... 15

Pendahuluan ... 15

Bahan dan Metode ... 17

Hasil dan Pembahasan ... 25

Simpulan ... 38

Daftar Pustaka ... 39

MEKANISME BAKTERI ENDOFIT DALAM MENGENDALIKAN PENYAKIT DARAH PADA TANAMAN PISANG Abstrak ... 43

Pendahuluan ... 43

Bahan dan Metode ... 45

Hasil dan Pembahasan ... 48

Simpulan ... 55

Daftar Pustaka ... 56

KEMAMPUAN KOLONISASI BAKTERI ENDOFIT PADA TANAMAN PISANG DAN PENGARUHNYA TERHADAP KEEFEKTIFAN PENGENDALIAN PENYAKIT DARAH Abstrak ... 59

Bahan dan Metode ... 60

Hasil dan Pembahasan ... 64

Simpulan ... 70

Daftar Pustaka ... 70

PENGARUH METODE APLIKASI DAN KOMUNITAS BAKTERI ENDOFIT TERHADAP KEEFEKTIFAN PENGENDALIAN PENYAKIT DARAH PADA TANAMAN PISANG Abstrak ... 73

Pendahuluan ... 73

Bahan dan Metode ... 75

Hasil dan Pembahasan ... 78

Simpulan ... 88

Daftar Pustaka ... 89

PEMBAHASAN UMUM ... 91

SIMPULAN DAN SARAN UMUM ... 99

DAFTAR PUSTAKA ... 101

Halaman 1 Kerapatan populasi dan jumlah isolat bakteri endofit dari akar

beberapa jenis tanaman pisang ... 26 2 Pengaruh bakteri endofit terhadap pertambahan tinggi dan

jumlah daun tanaman pisang ‘Cavendish’ 8 minggu setelah inokulasi bakteri endofit ... 30 3 Pengaruh bakteri endofit terhadap aktivitas peroksidase (POD)

dan polifenol oksidase (PPO) pada akar tanaman pisang ‘Cavendish’ 8 minggu setelah inokulasi bakteri ... 31 4 Pengaruh perlakuan bakteri endofit dan metode inokulasi BDB

terhadap periode inkubasi, persentase kejadian penyakit dan persentase penekanan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang ‘Cavendish’ ... 34 5 Karakter fisiologis bakteri endofit ... 37 6 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap perkembangan

penyakit darah pada tanaman pisang ‘Cavendish’ 2 minggu setelah inokulasi BDB ... 48 7 Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman

pisang ‘Cavendish’ 8 minggu setelah perlakuan ... 54 8 Perkembangan populasi bakteri endofit EAL15-Rif pada rizosfer,

permukaan dan bagian dalam jaringan akar serta bonggol tanaman pisang ‘Cavendish’ pada beberapa waktu setelah inokulasi ... 64 9 Pengaruh bakteri endofit dan periode kolonisasi bakteri endofit

terhadap periode inkubasi dan kejadian penyakit darah pada pisang ‘Cavendish’ ... 68 10 Pengaruh cara aplikasi tunggal bakteri endofit terhadap jumlah

daun dan tinggi tanaman pisang ‘Cavendish’ pada 8 minggu setelah perlakuan ... 79 11 Pengaruh cara aplikasi isolat tunggal bakteri endofit terhadap

periode inkubasi dan kejadian penyakit darah pada pisang

‘Cavendish’ 4 minggu setelah inokulasi BDB ... 81 12 Pengaruh aplikasi komunitas bakteri endofit terhadap pertambahan

tinggi dan jumlah daun tanaman pisang 8 minggu setelah perlakuan .... 83 13 Pengaruh aplikasi komunitas bakteri endofit terhadap periode

inkubasi dan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang ... 85 xvi

14 Pengaruh aplikasi komunitas bakteri endofit terhadap penekanan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang ... 86 15 Pengaruh aplikasi komunitas bakteri endofit terhadap aktivitas

peroksidase pada tanaman pisang 2 minggu setelah

inokulasi BDB ... 87

Halaman

1 Diagram alir penelitian “Potensi Bakteri Endofit sebagai Agens Pengendalian Hayati terhadap Penyakit Darah

pada Tanaman Pisang” ... 5 2 Karakteristik marfologi koloni BDB yang diisolasi dari tandan buah

pisang ‘Kepok kuning’ pada media SPA yang mengandung polymixin

β sulfat dan TZC (A) dan media SPA (B) ... 27 3 Perkembangan gejala penyakit darah pada pisang ‘Cavendish’ :

daun tanaman pisang melemah (A), daun tanaman pisang layu (B), daun tanaman pisang menguning (C), daun tanaman pisang

nekrosis (D) ... 28 4 Aktivitas peroksidase (A) dan polifenol oksidase (B) pada akar tanaman

pisang ‘Cavendish’ yang diberi perlakuan isolat bakteri endofit EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22 sebelum inokulasi BDB (0 hsi) dan 14 hari setelah inokulasi BDB (14 hsi) ... 50 5 Kandungan asam salisilat pada akar tanaman pisang ‘Cavendish’

yang diberi perlakuan bakteri endofit EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22 pada 14 hari setelah inokulasi BDB ... 52 6 Kandungan auksin pada akar tanaman pisang ‘Cavendish’ yang diberi

perlakuan bakteri endofit EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22 pada 14 hari setelah inokulasi BDB ... 55 7 Populasi bakteri endofit EAL15-Rif pada rizosfer tanaman (A),

permukaan akar tanaman (B), bagian dalam akar tanaman (C) dan bagian dalam bonggol tanaman pisang ‘Cavendish’ (D) pada beberapa periode kolonisasi ... 66 8 Sel bakteri endofit EAL15-Rif pada : jaringan akar yang diinokulasi

dengan bakteri EAL15-Rif (A), jaringan akar yang tidak diinokulasi dengan bakteri EAL15-Rif (B), jaringan bonggol yang diinokulasi dengan bakteri EAL15-Rif (C). Tanda panah warna putih menunjukkan sel bakteri EAL15-Rif dalam jaringan tanaman ... 67 9 Pengaruh periode kolonisasi (0, 4, 8 minggu) bakteri endofit

(isolat EAL15, EKK10, EKK20, EKK22) terhadap penekanan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang ... 69 10 Pengaruh cara aplikasi isolat bakteri endofit EAL15, EKK10, EKK20 dan

EKK22 terhadap penekanan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang ‘Cavendish’ 4 minggu setelah inokulasi BDB ... 82

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Data isolat bakteri endofit dari akar beberapa jenis tanaman

pisang : Jumlah koloni, frekuensi kemunculan isolat, zone hambatan

terhadap BDB, dan ciri-ciri morfologi isolat ... 109 2 Perbandingan sekuens parsial 16S rRNA dari isolat bakteri endofit

EAL15 dengan Serratia liquefaciens strain AIMST 3 (Gene Bank : HQ683839.1) ... 111 3 Perbandingan sekuens parsial 16S rRNA dari isolat bakteri endofit

EKK10 dengan Bacillus megaterium strain WIF34 (Gene Bank : HM480315.1) ... 112 4 Perbandingan sekuens parsial 16S rRNA dari isolat bakteri endofit

EKK20 dengan Enterobacter cloacae strain Fm50 (Gene Bank : GU954429.1) ... 113 5 Perbandingan sekuens parsial 16S rRNA dari isolat bakteri endofit

EKK22 dengan Pectobacterium cypripedii strain gx-104 (Gene Bank : FJ823047.1) ... 115

Latar Belakang

Penyakit darah (blood disease) merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman pisang di Indonesia (Supriadi 2005). Penyakit ini pertama kali dilaporkan pada tahun 1920-an oleh Ernst Gaumann di Pulau Selayar (Sulawesi Selatan) yang menyebabkan kerugian sangat besar dalam perdagangan pisang (Eden-Green 1994). Penyakit darah telah menyebar ke berbagai daerah pertanaman pisang di Sumatera, Jawa, Bali, Kalimantan, Sulawesi, Maluku, dan juga terdapat di hampir semua negara produsen pisang (Direktorat Perlindungan Hortikultura 2011).

Penyakit darah disebabkan oleh Blood Disease Bacterium (BDB) yang sebelumnya dikenal dengan nama Pseudomonas solanacearum atau Ralstonia

solanacearum (E.F. Smith) Yabuuchi et al. Ras 2 yang menyebabkan penyakit

layu bakteri, tetapi karena adanya perbedaan kultur dan reaksi biokimia antara BDB dan R. solanacearum, maka nama BDB lebih tepat digunakan untuk penyebab penyakit pada tanaman pisang yang menunjukkan gejala penyakit darah (Crop Protection Compendium 2005). Koloni BDB pada medium yang mengandung Tetrazolium Chloride berukuran kecil (diameter <1 mm), agak lengket, merah di tengah dan putih di bagian pinggirnya. BDB tidak mampu mengoksidasi glukosa, sukrosa, manosa, dan ribosa, tetapi mampu mengoksidasi galaktosa, dan gliserol (Eden-Green 1994; Eden-Green et al. 1998). BDB masuk dalam kompleks spesies R. solanacearum anggota divisi 2,

phylotype IV, dan sequevar 10 (Fegan & Prior 2005).

Kejadian penyakit darah dan penyebarannya di lapangan sangat tinggi. Hal ini disebabkan oleh belum adanya tanaman pisang yang tahan terhadap penyakit ini dan tingginya potensi penularan patogen (Sequeira 1998). Penularan penyakit darah terutama dilakukan oleh serangga vektor (Buddenhagen 1961; Sulyo 1992; Leiwakabessy 1999), tetapi cara penularan lain seperti melalui luka-luka yang terdapat pada akar tanaman pisang, baik luka-luka mekanis maupun luka-luka yang disebabkan oleh nematoda juga berperan dalam penyebaran lokal (Gaumann 1923, diacu dalam Semangun 2000).

2 Infeksi BDB pada tanaman pisang dapat menyebabkan tanaman mati atau menghasilkan buah yang tidak dapat dikonsumsi. Kejadian penyakit darah pada pisang dilaporkan sangat berat di beberapa provinsi di Indonesia, misalnya di Bondowoso Jawa Timur mencapai rata-rata 97,7% (Mulyadi & Hernusa 2002) dan Lombok Nusa Tenggara Barat 86,8% (Supeno 2002). Kehilangan hasil karena serangan BDB tidak hanya terjadi di pertanaman tradisional yang merupakan tanaman campuran, tetapi juga di pertanaman komersial yang monokultur. Rahardi (2004) melaporkan bahwa serangan penyakit darah pada pertanaman pisang di PT. Nusantara Tropical Fruits (NTF) Lampung Tengah menyebabkan kehilangan hasil 20% dari kapasitas produksi.

Pengendalian terhadap penyakit darah yang saat ini direkomendasikan ditujukan untuk menghindari patogen. Teknik pengendalian dilakukan melalui eradikasi lahan secara rutin dengan membongkar sisa-sisa akar dari rumpun tanaman yang sakit, tidak menanam pisang pada areal bekas tanaman sakit selama 2 tahun, menanam bibit yang diambil pada tanaman induk yang sehat, pemeliharaan drainase untuk mencegah penyebaran patogen melalui air, dan desinfektan alat-alat yang digunakan untuk bercocok tanam (Semangun 2000). Pembungkusan tandan bunga juga dilakukan untuk mencegah infeksi melalui serangga pengunjung bunga (Direktorat Perlindungan Hortikultura 2011).

Bakteri endofit merupakan agens pengendalian hayati yang banyak dikembangkan saat ini untuk pengendalian berbagai penyakit tanaman. Bakteri endofit dilaporkan menghasilkan antibiotik dan enzim pendegradasi yang dapat menghambat perkembangan patogen secara in vitro (Hallmann 2001; Long et al. 2003; Sessitsch et al. 2004), meningkatkan ketahanan tanaman terhadap patogen dengan menginduksi reaksi ketahanan tanaman (Benhamou et al. 1996; Kloepper & Ryu 2006; Kavino et al. 2007; Harish et al. 2008), dan memacu pertumbuhan tanaman (Sturz et al. 1997; Sessitsch et al. 2004; Compant et al. 2005).

Long et al. (2004) melaporkan bahwa bakteri endofit Pseudomonas sp.,

Chryseomonas luteola, Bacillus pumilus, Enterobacter cloacae, Pantoea sp.,

Staphylococcus auricularis yang diisolasi dari tanaman Solanum sp.

menunjukkan kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri patogen Ralstonia

melindungi tanaman tembakau dari penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh

R. solanacearum.

Penelitian tentang bakteri endofit pada tanaman pisang dan peranannya dalam penyakit tanaman telah dilakukan oleh beberapa peneliti. Martinez et al.

(2003) melaporkan bakteri endofit kelompok α Proteobacteria dan Rhizobium

mampu meningkatkan pertumbuhan bibit pisang. Nawangsih (2007) juga telah menyeleksi dua isolat bakteri endofit (isolat CA8 dan PK5) dari genus Bacillus

dan Pseudomonas dari beberapa sampel tanaman pisang dari Jawa Barat

(Indonesia). Adeline et al. (2008) melaporkan bahwa isolat bakteri endofit

Serratia UPM39B3 dan cendawan endofit F. oxysporum UPM31P1 mampu

meningkatkan pertumbuhan bibit pisang ‘Barangan’ kultivar Intan.

Studi mengenai bakteri endofit pada tanaman pisang diperlukan untuk mengetahui potensi dari bakteri tersebut terutama sebagai agens pengendalian hayati terhadap penyakit-penyakit tanaman pisang. Belum banyak diteliti apakah pengaruh menguntungkan dari bakteri endofit terhadap tanaman inangnya disebabkan oleh adanya interaksi satu spesies bakteri endofit dengan tanaman inangnya atau interaksi beberapa spesies dalam komunitas bakteri endofit dengan tanaman inangnya. Sturz et al. (1999) menyatakan bahwa komunitas bakteri endofit dalam umbi kentang mempengaruhi ketahanan umbi kentang terhadap penyakit busuk lunak. Komponen komunitas endofit dari suatu metapopulasi bakteri (dalam tanaman inang) dapat berinteraksi dengan inangnya dan dengan komponen lainnya, dimana interaksi tersebut bersifat positif (komensalisme, mutualisme, sinergisme).

Infeksi patogen pada tanaman inang dapat mempengaruhi komunitas bakteri endofit. Lian et al. (2008) melaporkan bahwa keragaman komunitas bakteri endofit pada plantlet tanaman pisang yang diinfeksi oleh Fusarium

oxysporum f.sp cubense lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol.

Hadiwiyono (2010) juga melaporkan adanya perbedaan pola fragmen DNA bakteri endofit pada tanaman pisang terinfeksi BDB yang bergejala penyakit darah dengan tanaman pisang yang tidak bergejala penyakit darah. Hal ini menunjukkan bahwa komunitas bakteri endofit pada tanaman pisang terinfeksi

4 BDB yang bergejala penyakit darah berbeda dengan tanaman pisang yang tidak bergejala penyakit darah.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk : (1) mengisolasi, menyeleksi, dan mengidentifikasi bakteri endofit dari tanaman pisang yang berpotensi untuk mengendalikan penyakit darah; (2) mengkaji mekanisme kerja isolat bakteri endofit dalam mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang; (3) menganalisis kemampuan kolonisasi bakteri endofit pada jaringan tanaman pisang dan pengaruh periode kolonisasi bakteri endofit terhadap keefektifan pengendalian penyakit darah; dan (4) menganalisis pengaruh cara aplikasi dan komunitas bakteri endofit terhadap keefektifan pengendalian penyakit darah pada tanaman pisang. Tahap-tahap pelaksanaan penelitian ini dapat dilihat pada diagram alir penelitian (Gambar 1).

Gambar 1. Diagram alir penelitian ”Potensi Bakteri Endofit sebagai Agens Pengendalian Hayati terhadap Penyakit Darah pada Tanaman Pisang”.

Isolasi bakteri endofit dari akar tanaman pisang

Uji kemampuan penghambatan bakteri endofit terhadap BDB (in vitro)

Analisis frekuensi kemunculan isolat bakteri endofit dalam satu komunitas

Seleksi isolat bakteri endofit untuk pengendalian penyakit darah pada tanaman pisang

Pengaruh periode kolonisasi bakteri endofit terhadap penyakit darah Mekanisme pengendalian bakteri endofit terhadap

penyakit darah

Pengaruh cara aplikasi bakteri endofit terhadap penyakit

darah

Pengaruh aplikasi komunitas bakteri endofit terhadap penekanan penyakit

darah Kolonisasi bakteri

endofit EAL15-Rif pada rizosfer dan jaringan

tanaman pisang Indentifikasi dan

karakterisasi isolat bakteri

Kolonisasi EAL15-Rif di dalam jaringan tanaman

pisang

Luaran : Isolat bakteri endofit

Luaran : Isolat bersifat antibiosis, tidak

dominan

Luaran : Isolat bersifat

antibiosis dan dominan

Luaran : Isolat dominan,

tidak bersifat antibiosis

Luaran :

Isolat bakteri endofit potensial untuk pengendalian penyakit darah pada tanaman pisang

TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Darah pada Tanaman Pisang

Penyakit darah (blood disease) merupakan salah satu masalah utama yang dihadapi dalam budidaya pisang saat ini. Penyakit ini tidak kalah pentingnya dengan penyakit lain pada pisang, seperti layu Fusarium yang disebabkan oleh Fusarium oxysporum f.sp. cubense dan penyakit sigatoka yang disebabkan oleh

Mycosphaerella fijiensis (Sequeira 1998). Hal ini merupakan tantangan bagi

pengembang pisang karena hampir semua jenis tanaman pisang yang dibudidayakan rentan terhadap patogen ini. Selain itu, penularan patogen akan sangat tinggi bila ada nematoda parasit akar dalam tanah (Gaumann 1923, diacu dalam Semangun 2000) maupun serangga vektor atau pembawa yang tertarik pada bunga pisang (Sulyo 1992). Dengan demikian biaya pengendalian menjadi sangat tinggi karena belum diketahui cara pengendalian yang tepat.

Patogen penyakit darah dapat menyerang berbagai jenis pisang baik yang langsung dikonsumsi seperti pisang ‘Ambon’, pisang ‘Nangka’, dan pisang ‘Mas’, ataupun pisang lain yang dikomersilkan seperti pisang ‘Raja’ dan pisang ‘Kepok’ (Eden-Green & Sastraatmadja 1990). Baharuddin (1994) menyatakan bahwa patogen ini mampu menimbulkan gejala penyakit pada Heliconia collinsiena, H. revolata, Strelizia reginae, Canna indica, Solanum nigrum, dan Asclepias

currasiva, tetapi tidak mampu menimbulkan gejala pada beberapa tanaman yang

merupakan inang utama bagi R. solanacearum (penyebab penyakit layu bakteri) seperti tomat,buncis, tembakau, cabai, kacang tanah, kentang dan terung.

Blood disease dikenal dengan nama penyakit moko atau bacterial wilt (Agrios 2005) dan di Indonesia disebut sebagai penyakit darah (Semangun 2000). Istilah penyakit darah diambil dari penampakan gejala tanaman sakit yang apabila batang atau bonggol pisang dipotong, maka akan keluar lendir (ooze) berwarna kemerahan seperti darah. Di Indonesia, penyakit ini mulai diketahui tahun 1920 di pulau Selayar (Sulawesi Selatan) yang menyebabkan kerugian yang sangat besar (Semangun 2000). Selanjutnya penyakit ini menyebar ke berbagai daerah pertanaman pisang di Indonesia. Penyakit ini juga dilaporkan menyerang areal pertanaman pisang di Malaysia, Filipina, India, dan Amerika Tengah (Crop Protection Compendium 2005).

Tiga penyakit layu pada tanaman pisang yang berhubungan sangat erat, yaitu moko di Amerika Latin dan Filipina, penyakit bugtok di Filipina yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum ras 2, dan penyakit darah di Indonesia. Ketiga penyakit tersebut memiliki gejala yang khas, yaitu busuk pada buah dan layu pada daun yang akhirnya daun patah menggantung (Thwaites et al. 1998).

Gejala Penyakit Darah pada Tanaman Pisang

Gejala penyakit darah pada pisang mirip dengan penyakit Moko di Amerika Latin. Perbedaan stadia pertumbuhan tanaman dan rute infeksi patogen mempengaruhi gejala penyakit yang muncul. Semua daun berubah kuning secara cepat, selanjutnya kehilangan turgor, mengering, dan mati. Pada tanaman berbuah, ibu tulang daun dan tangkai daun menjadi lemah dan tangkai daun patah mendekati batang semu. Daun muda menjadi kuning terang, kemudian nekrotik dan mengering. Infeksi BDB tidak selalu sistemik sehingga anakan yang sehat dari tanaman yang bergejala penyakit darah kadang-kadang dapat menghasilkan buah (Eden-Green, 1994). Gejala luar penyakit darah hampir mirip dengan penyakit layu Fusarium yang disebabkan oleh Fusarium oxysporum, sehingga perlu dilakukan diagnosis gejala di bagian dalam jaringan tanaman untuk memastikan gejala penyakit darah (Semangun 2000).

Gejala dalam penyakit darah dapat diketahui dengan memotong batang atau bonggol tanaman pisang atau bagian dalam buah pisang yang terinfeksi. Pada bagian bonggol atau batang pisang atau buah pisang yang dipotong melintang akan mengeluarkan lendir (ooze) berwarna merah kecoklatan yang mengandung massa bakteri dan busuk pada bagian tengahnya. Pada umumnya permukaan kulit buah pisang yang terinfeksi tidak memperlihatkan gejala dan ukuran buah normal (Satari & Sumarauw 1990; Eden-Green & Sastratmadja 1990).

Penyebab Penyakit Darah

Penyakit darah pertama kali dilaporkan oleh Gaumann pada tahun 1920-an menyer1920-ang pis1920-ang di kepulau1920-an Selayar, Sulawesi Selat1920-an. Gaum1920-ann mengusulkan nama taksonomi penyebab penyakit darah adalah

8 bakteri Pseudomonas solanacearum atau Ralstonia solanacearum (E.F. Smith) Yabuuchi et al. (Semangun 2000; Agrios 2005). Saat ini penyebab penyakit darah dikenal sebagai Blood Disease Bacterium (Fegan & Prior 2005; Supriadi 2005). BDB termasuk kelompok bakteri gram negatif, berbentuk batang, tidak aktif bergerak, berflagel, dan berukuran sekitar 0.5 x 1.0-1.5 µm. Pada medium King’s B, bakteri ini tidak mengeluarkan pigmen fluorescens dan menunjukkan reaksi hipersensitif pada tanaman tembakau (Baharuddin 1994). BDB masuk dalam kompleks spesies R. solanacearum anggota devisi 2, phylotype IV, dan sequevar 10 (Fegan & Prior 2005).

Secara morfologi, BDB hampir mirip dengan R. solanacearum (umumnya penyebab layu bakteri), tetapi terdapat perbedaan dalam hal ketidakmampuan patogen penyakit darah dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit dan menghidrolisis gelatin (Baharuddin 1994), serta kemampuan BDB dalam menimbulkan reaksi lisogeni pada pengujian bakteriofage (Supriadi 2003). Kultur dan reaksi biokimia BDB juga berbeda dengan R. solanacearum. Perbedaanya antara lain koloni BDB berukuran kecil dan tidak berfluida pada medium Tetrazolium

Cloride (TZC). Koloni BDB pada medium yang mengandung TZC berukuran

kecil, agak lengket, merah di tengah dan putih di bagian pinggirnya. Sel BDB selalu nonmotil. BDB tidak mampu mengoksidasi glukosa, sukrosa, manosa, dan ribosa, tetapi mampu mengoksidasi galaktosa, dan gliserol (Eden-Green 1994; Eden-Green et al. 1998). Thwaites et al. (1998) menyatakan bahwa BDB pada pisang berbeda dengan R. solanacearum, tetapi berkerabat dekat dengan

Pseudomonas syzygii penyebab penyakit pada tanaman cengkeh.

Sumber Inokulum BDB dan Penularan Penyakit Darah

Tanaman sakit merupakan sumber inokulum utama pada proses infeksi dan epidemik penyakit yang disebabkan oleh kebanyakan bakteri fitopatogen (Agrios 2005). Menurut Baharuddin (1994), semua kultivar pisang rentan terhadap BDB melalui inokulasi buatan. Eden-Green (1994) melaporkan bahwa BDB dapat menginfeksi pisang hias (Heliconia spp.) dengan tingkat virulensi yang lemah. Isolat BDB tidak dapat menginfeksi cabai, tomat, tembakau, dan jahe (Masnilah et al. 2002).

Bakteri fitopatogen yang terbebas dari tanaman sakit akan masuk ke dalam tanah, dan tanah menjadi tempat bertahan hidup (Agrios 2005). Menurut Hadiwiyono (2010), semua bagian jaringan individu pisang sakit berpotensi sebagai sumber inokulum. Sisa tanaman sakit dan tanah terinfestasi berpotensi sebagai sumber inokulum BDB, karena dapat berfungsi sebagai tempat bertahan hidup patogen. Inokulum BDB pada sisa tanaman sakit dan tanah terinfestasi masih infeksius setelah 5-6 bulan.

Selain tanaman sakit dan tanah terinfestasi, serangga dapat menjadi sumber inokulum sekaligus sebagai penular BDB. Menurut Leiwakabessy (1999), serangga yang mengunjungi bunga dapat berperan sebagai pembawa patogen yang terkontaminasi pada bagian luar jaringan tubuh serangga dan menjadi salah satu cara penyebaran penyakit. Serangga ordo Diptera (famili Chloropidae,

Platypezidae, dan Drosophilidae) berpotensi sebagai vektor dan pembawa

patogen karena BDB ditemukan di dalam jaringan tubuh serangga, sedangkan serangga lain dari ordo Diptera (famili Tephritidae, Culicidae, Calliphoridae,

Anthomyidae, dan Muscidae), ordo Lepidoptera (famili Coleophoridae), ordo

Hymenoptera (famili Apidae), dan ordo Blattaria (famili Blattidae) ditemukan adanya kontaminasi BDB di luar jaringan tubuh serangga tersebut.

Mekanisme penularan BDB diyakini mirip dengan penyakit Moko di Amerika Latin (Eden-Green 1994). BDB ditularkan oleh serangga pengunjung bunga pisang dan bakteri melakukan penetrasi pada nektartoda dan luka pada lampang bunga pisang yang tidak menjadi buah (Buddenhagen 1961; Buddenhagen & Elssaser 1962). Hasil penelitian Hadiwiyono (2010) menunjukkan bahwa inokulasi suspensi BDB pada bunga pisang dapat menyebabkan gejala penyakit.

BDB dapat menginfeksi tanaman pisang melalui perakaran (Rustam 2007; Hadiwiyono 2010). Bakteri masuk dalam jaringan akar tanaman melalui lubang alami, luka buatan akibat alat pertanian, maupun luka akibat tusukan stilet nematoda. Subandiyah et al. (2005) melaporkan beberapa genus nematoda ditemukan pada pisang yang terinfeksi BDB, seperti Pratylenchus sp. Meloidogyne sp., Haplolaimus sp., dan Rhadopholus sp. Populasi Pratylenchu s sp. yang tinggi berhubungan dengan intensitas BDB yang tinggi.

10

Pengendalian Penyakit Darah

Pengendalian penyakit tanaman pada dasarnya terdiri dari empat prinsip pengendalian, yaitu eksklusi patogen, eradikasi patogen, proteksi tanaman inang yang rentan, dan resistensi tanaman inang. Pada dasarnya pengendalian penyakit tanaman merupakan bagian integral dari usaha pertanian yang dapat dilakukan secara terpadu dan merupakan bagian dari suatu sistem yang disebut pengendalian hama terpadu (PHT) yang pada prinsipnya adalah meminimalkan penggunaan pestisida dengan mengintegrasikan berbagai cara pengendalian yang kompatibel dengan tetap memperhatikan keberlanjutan lingkungan hidup (Sinaga 2006).

Direktorat Perlindungan Hortikultura (2011) memberikan beberapa rekomendasi untuk mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang, yaitu : (1) Eradikasi rumpun terserang dengan membongkar sampai ke akar-akarnya; (2) Injeksi herbisida untuk membunuh tanaman/anakan terserang penyakit darah; (3) Memotong bunga jantan segera setelah sisir terakhir terbentuk untuk menghindari infeksi serangga penular; dan (4) Membungkus bunga pisang yang sudah terbentuk. Teknik pengendalian ini belum efektif menekan penularan penyakit darah karena penerapannya sulit dilakukan dan biaya tambahan yang harus dikeluarkan oleh petani. Strategi jangka panjang dilakukan dengan menghasilkan varietas pisang yang tidak berjantung sehingga mengurangi infeksi BDB melalui bunga.

Pengembangan teknik pengendalian hayati terhadap penyakit darah yang telah diteliti adalah penggunaan agens pengendalian hayati yang diseleksi dari rizosfer tanaman pisang. Rustam (2005) melaporkan bahwa bakteri yang diisolasi dari rizosfir tanaman pisang yaitu isolat Bacillus sp. BRA61 dan Pseudomonas

fluorescens ES32 menunjukkan kemampuan menghambat pertumbuhan BDB

in vitro, tetapi tidak mampu menekan gejala penyakit darah pada kondisi di rumah kaca. Diduga karena agens antagonis tersebut hanya berperan dalam menekan populasi patogen yang berada pada rizosfer sebelum patogen melakukan infeksi pada tanaman. Tidak adanya ketahanan tanaman pisang terhadap patogen BDB menyebabkan penyakit cepat berkembang apabila patogen telah menginfeksi ke dalam jaringan tanaman. Oleh sebab itu, pengembangan pengendalian hayati

terhadap penyakit darah diarahkan untuk mendapat agens pengendalian hayati yang mampu menginduksi ketahanan tanaman pisang terhadap penyakit darah.

Potensi Bakteri Endofit sebagai Agens Pengendalian Hayati

Definisi Bakteri Endofit

Bakteri endofit telah didefinisikan oleh beberapa peneliti dalam bidang penyakit tanaman. Kado (1992) mendefinisikan bakteri endofit sebagai bakteri yang hidup di dalam jaringan tumbuhan tanpa menimbulkan kerugian atau memperoleh manfaat lain dari tanaman inangnya. Menurut Hallmann et al. (1997), bakteri endofit dapat diisolasi dari jaringan tanaman yang telah dilakukan sterilisasi permukaan atau diekstraksi dari dalam tanaman, dan bakteri ini tidak merugikan tanaman.

Kriteria untuk mengenali bakteri endofit juga telah dipublikasikan oleh Reinhold-Hurek & Hurek (1998) yaitu : bakteri endofit diisolasi dari jaringan tanaman yang permukaannya telah disterilisasi dan adanya bukti mikroskopik untuk memvisualisasikan tanda keberadaan bakteri di dalam jaringan tanaman. Bakteri endofit yang tidak dapat divalidasi secara mikroskopis keberadaannya di dalam jaringan tanaman disebut endofit “putative”.

Keanekaragaman dan Populasi Bakteri Endofit

Tanaman merupakan tempat atau relung untuk beragam organisme endofit. Bakteri endofit melalukan adaptasi untuk hidup di dalam jaringan tanaman melalui seleksi alami (Rosenblueth & Esperanza 2006). Bakteri endofit umumnya mempunyai kepadatan populasi lebih rendah dibandingkan dengan bakteri rizosfer atau bakteri patogen (Hallmann et al. 1997; Germida et al. 1998; Rosenblueth & Esperanza 2004). Bakteri endofit dapat beradaptasi terhadap stres biotik dan abiotik dibandingkan dengan bakteri pada rizosfer (Hallmann et al. 1997).

Bakteri endofit dalam satu tanaman inang tidak terbatas pada satu spesies tetapi terdiri dari beberapa genus dan spesies (Rosenblueth & Esperanza 2006). Kepadatan populasi endofit sangat bervariasi tergantung kepada spesies bakteri, genotip inang, stadia perkembangan inang dan kondisi lingkungan (Pillay &

12 Nowak 1997). Long et al. (2004), mengidentifikasi 13 spesies bakteri endofit dari genus Pseudomonas, Serratia, Enterobacter, Pantoea, dan Bacillus pada tanaman Solanum sp.

Bakteri endofit dapat ditemukan di dalam jaringan akar, batang, umbi, daun, benih, dan buah tanaman (Hallmann et al. 1997). Pada banyak tanaman, akar mempunyai jumlah endofit lebih banyak dibandingkan jaringan diatas permukaan (Rosenblueth & Esperanza 2004). Kerapatan populasi bakteri endofit pada akar adalah 105, batang 104, dan daun sekitar 103

Bakteri endofit merupakan faktor penting pada tanaman yang tahan terhadap serangan patogen. McInroy et al. (1997) menemukan bahwa kultivar tanaman kapas yang tahan terhadap berbagai penyakit yang disebabkan oleh cendawan dilindungi oleh banyak bakteri endofit yang bersifat antagonis terhadap

cfu/g (Hallmann et al. 1997). Bakteri endofit umumnya berada dalam ruang interseluler dan pembuluh xilem (Reinhold-Hurek & Hurek 1998). Compant et al. (2005) melaporkan bahwa strain Bulkholderia sp. ditemukan dalam pembuluh xilem dan ruang substomatal pada tanaman Vitis vinifera. Belum diketahui apakah pembuluh xilem hanya sebagai tempat transportasi bakteri endofit ke bagian lain dari jaringan tanaman atau melakukan perbanyakan diri dalam pembuluh xilem (Hallmann et al. 1997).

Manfaat Bakteri Endofit pada Tanaman

Bakteri endofit mempunyai banyak dampak menguntungkan terhadap tanaman inangnya, seperti menstimulasi pertumbuhan tanaman (Sessitsch et al. 2004; Adeline et al. 2008) karena bakteri ini mampu memfiksasi nitrogen (Reinhold-Hurek & Hurek 1998; Bashan & de-Bashan 2005), meningkatkan ketersediaan mineral, menghasilkan fitohormon (Hurek et al. 2002), produksi siderofor (Sessitsch et al. 2004). Selain itu, bakteri endofit juga dapat mengendalikan patogen tanaman melalui kolonisasi pre-emptive pada jaringan tanaman, antagonis secara langsung dengan menghasilkan senyawa metabolit (Hallmann 2001) dan menginduksi ketahanan tanaman terhadap patogen (Benhamou et al. 1996; Kloepper & Ryu 2006; Kavino et al. 2007; Harish et al. 2008).

cendawan yang sama. Kepadatan populasi bakteri endofit pada kultivar kapas yang tahan lebih tinggi dibandingkan kultivar yang rentan.

Bakteri endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman dapat menjadi penginduksi mekanisme pertahanan tanaman sejak bakteri ini menetap di dalam jaringan tanaman sampai dalam jangka waktu yang lama (Hallmann 2001). Permukaan sel bakteri endofit yang mengandung senyawa lipopolisakarida (LPSs) dapat berperan sebagai elicitor untuk menempel pada reseptor permukaan sel tanaman (Reitz et al. 2000). Respon pertahanan tanaman yang terinduksi terjadi melalui peningkatan kekuatan secara fisik dan mekanis dari dinding sel tumbuhan (Ramamoorthy et al. 2001), perubahan pola metabolit yang meliputi akumulasi dari senyawa metabolit (fenolik, flavanoid, caumarins, terpenoid, steroid, dan lainnya), produksi auksin, etilen, peningkatan respirasi, serta pengaktifan enzim peroksidase dan oksidase fenol lainnya (Goodman et al. 1986).

Bakteri endofit dapat berperan sebagai elicitor induksi ketahanan sistemik

(Induced Systemic Resistance, ISR). ISR merupakan ketahanan pada tanaman

yang diinduksi oleh infeksi lokal atau perlakuan dengan komponen-komponen mikroba atau senyawa kimia (Kuc 2000; Ramamoorthy et al. 2001). Interaksi bakteri endofit Burkholderia phytofirmans PsJN dengan tanaman anggur, menunjukkan terjadinya induksi reaksi pertahanan tanaman dengan akumulasi senyawa fenolik dan penguatan dinding sel eksodermis dan permukaan membran sel tanaman (Compant et al. 2005). Kavino et al. (2007) melaporkan bahwa

bakteri endofit Bacillus subtilis strain EPB22 dan kombinasi dengan

P. fluerescens strain Pf1 dan CHO mampu menginduksi ketahanan tanaman

pisang melalui peningkatan aktivitas protein PR dan kandungan fenol, serta menurunkan kejadian penyakit Bunchy Top pada tanaman pisang di lapangan.

Bakteri endofit juga dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman

(Plant growth promoting) seperti kelompok Plant Growth-Promoting

Rhizobacteria (PGPR) yang dapat meningkatkan ketahanan tanaman inang

terhadap serangan hama dan patogen (Ramamoorthy et al. 2001; Ryan et al. 2007). Hal ini dimungkinkan karena beberapa PGPR dapat masuk ke bagian dalam dari akar tanaman dan berasosiasi menjadi bakteri endofit (Kloepper & Ryu 2006).

14 Adeline et al. (2008) melaporkan bahwa isolat bakteri endofit Serratia UPM39B3 dan cendawan endofit F. oxysporum UPM31P1 mampu meningkatkan pertumbuhan bibit pisang ‘Barangan’ kultivar Intan. Kemampuan PGPR untuk menjadi endofit dalam tanaman inangnya menjadi indikasi bahwa secara alami endofit mampu menginduksi respon ketahanan tanaman sama seperti induksi oleh PGPR. Bakteri endofit memacu pertumbuhan tanaman melalui sejumlah mekanisme, yaitu : aktivitas pelarutan posfat, produksi auksin dan produksi siderofor (Verma et al. 2001; Lee et al. 2004; Ryan et al. 2007).

Beberapa bakteri endofit dilaporkan mampu sebagai agens pengendalian hayati penyakit tanaman. Wei et al (1991) melaporkan bahwa Pseudomonas

fluorescens strain 68-4 yang diaplikasikan pada benih mentimun mampu

mengkolonisasi bagian dalam jaringan tanaman dan memicu perlindungan sistemik terhadap penyakit antraknosa. Serratia marcescens 90-166 dilaporkan dapat menghasilkan asam salisilat yang digunakan untuk menginduksi ketahanan secara sistemik pada tanaman tembakau yang diinfeksi oleh Pseudomonas syringae pv. tabaci (Press et al. 1997). Long et al. (2004) menyatakan bahwa bakteri endofit dari tanaman Solanum sp. seperti : Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas sp., Chryseomonas luteola, Bacillus pumilis, Enterobacter

cloaceae, Patoea agglomerans, dan Staphylococcus auricularis menunjukkan

daya hambat terhadap bakteri Ralstonia solanacearum. Nawangsih (2007) telah menyeleksi dua isolat bakteri endofit (isolat CA8 dan PK5) dari genus Bacillus

dan Pseudomonas yang pada beberapa sampel tanaman pisang dari Jawa Barat

yang mampu menekan perkembangan blood disease bacterium secara in vitro. Aplikasi bakteri endofit pada bibit pisang merupakan salah satu cara yang dapat dilakukan untuk meningkatkan ketahanan tanaman pisang terhadap serangan patogen. Hal ini disebab oleh sifat triploid pada pisang sehingga sulit melakukan persilangan untuk mendapatkan jenis pisang yang tahan terhadap patogen (Hirimburegama & Gamage 1997). Kasutjianingati (2004) telah melakukan introduksi bakteri endofit BET-004 dan BET-007 pada bibit pisang ambon kuning, mas, dan kepok kuning hasil perbanyakan melalui kultur jaringan. Introduksi bakteri endofit tersebut dilaporkan mampu menekan gejala penyakit layu Fusarium pada tanaman pisang.

SEBAGAI AGENS PENGENDALIAN HAYATI TERHADAP PENYAKIT DARAH PADA TANAMAN PISANG

Isolation, Selection and Identification of Endophytic Bacteria as Biocontrol Agents to Control Blood Disease on Banana

Husda Marwan, Meity Suradji Sinaga, Giyanto dan Abdjad Asih Nawangsih

Abstrak

Bakteri endofit dapat dimanfaatkan sebagai agens pengendalian hayati penyakit tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi, menyeleksi, dan mengidentifikasi bakteri endofit yang berpotensi untuk mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang. Bakteri endofit diisolasi dari akar beberapa jenis tanaman pisang yang berasal dari Bogor menggunakan metode sterilisasi permukaan. Isolat bakteri endofit yang menunjukkan penghambatan in vitro terhadap BDB dan/atau dominan dalam komunitasnya diinokulasikan ke bibit pisang ‘Cavendish’. Pengamatan dilakukan terhadap variabel pertumbuhan tanaman pisang dan aktivitas enzim peroksidase serta polifenol oksidase. Tanaman yang telah dikolonisasi oleh bakteri endofit diinokulasi dengan BDB dan dilakukan pengamatan terhadap periode inkubasi dan persentase kejadian penyakit darah. Sebanyak 90 isolat bakteri endofit telah berhasil diisolasi dari 15 sampel tanaman pisang (pisang ‘Kepok’, ‘Raja’ dan ‘Ambon’) dengan kerapatan populasi 6.0 x 103 – 4.20 x 105 cfu/g berat basah akar. Isolat bakteri endofit mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman pisang, meningkatkan aktivitas enzim peroksidase dan polifenol oksidase pada akar tanaman pisang. Isolat EAL15, EKK10, EKK20, dan EKK22 mampu menekan kejadian penyakit darah pada tanaman pisang dengan tingkat penekanan kejadian penyakit sebesar 66.67% sampai 83.33%. Hasil analisis sekuen 16S rRNA pada isolat EAL15, EKK10, EKK20 dan EKK22 menunjukkan kemiripan 77%, 73%, 98% dan 99% dengan

Serratia liquefaciens, Bacillus megaterium, Enterobacter cloacae dan

Pectobacterium cypripedii. Isolat EAL15 dan EKK20 bersifat antibiosis terhadap BDB, menghasilkan siderofor dan indol acetic acid (IAA), sedangkan isolat EKK10 dan EKK22 menghasilkan IAA.

Kata kunci : Bakteri endofit, penyakit darah, pisang

Pendahuluan

Penyakit darah pada pisang yang disebabkan oleh Blood Disease Bacterium (BDB) menyebabkan kerugian yang sangat berarti bagi petani. Infeksi BDB pada tanaman pisang menyebabkan tanaman mati atau menghasilkan buah pisang yang tidak dapat dikonsumsi. Beberapa teknik pengendalian yang direkomendasikan selama ini seperti eradikasi tanaman sakit dan

16 membungkus bunga pisang yang sudah terbentuk, belum efektif menekan penyebaran penyakit darah karena pelaksanaannya masih sulit dilakukan oleh petani.

Penelitian tentang penggunaan agens pengendalian hayati untuk mengendalikan penyakit darah telah dilaporkan oleh Rustam (2005). Bakteri

Bacillus sp. BRA61 dan Pseudomonas fluorescens ES32 yang diisolasi dari

rizosfir tanaman pisang menunjukkan kemampuan menghambat pertumbuhan BDB in vitro, tetapi tidak mampu menekan gejala penyakit darah pada kondisi di rumah kaca.

Bakteri endofit saat ini banyak diteliti untuk dikembangkan sebagai agens pengendalian hayati penyakit tanaman. Bakteri endofit dilaporkan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman (plant growth-promoting) dan menginduksi ketahanan tanaman terhadap patogen tanaman. Bakteri endofit yang mengkolonisasi jaringan internal tanaman terlindungi oleh tanaman inangnya dari stress lingkungan dan kompetisi dengan mikroba lain (Hallmann et al. 1997).

Bakteri endofit dapat diisolasi dari bagian bunga, buah, daun, batang, akar, dan benih dari berbagai spesies tanaman. Keragaman populasi dari bakteri endofit dipengaruhi oleh perbedaan jenis tanaman, umur tanaman, tipe jaringan, waktu pengambilan sampel, dan faktor lingkungan (Hallmann 2001; Zinniel et al. 2002). Populasi bakteri endofit lebih banyak pada akar dan menurun pada batang dan daun (Lamb et al. 1996). Kepadatan populasi bakteri endofit bervariasi antara 102-105

Penelitian potensi bakteri endofit untuk mengendalikan penyakit darah yang disebabkan oleh Blood Disease Bacterium (BDB) pada tanaman pisang perlu dilakukan karena penyakit ini merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman pisang di Indonesia (Supriadi 2005). Peranan bakteri endofit pada tanaman sebagai agens pengendalian penyakit telah dilaporkan beberapa peneliti. Chandrashekhara et al. (2007) melaporkan bahwa bakteri endofit Pseudomonas fluorescens ISR 34 dan Bacillus sp. ISR 37 yang diaplikasikan pada benih pearl

millet, meningkatkan ketahanan tanaman tersebut terhadap penyakit embun

tepung yang disebabkan Sclerospora graminicola. Harish et al. (2008) juga

cfu per gram akar tanaman alfalfa, jagung manis, bit gula, kapas, dan kentang (Kobayashi & Palumbo 2000).

melaporkan bahwa bakteri endofit yang diisolasi dari bonggol dan akar tanaman pisang mampu menginduksi ketahanan tanaman pisang terhadap Banana Bunchy Top Virus.

Berdasarkan hal tersebut maka perlu dilakukan eksplorasi dan seleksi bakteri endofit yang potensial untuk mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk : (1) mengeksplorasi bakteri endofit dari tanaman pisang; (2) menyeleksi bakteri endofit yang berpotensi untuk mengendalikan penyakit darah pada tanaman pisang; dan (3) melakukan identifikasi dan karakterisasi terhadap isolat bakteri endofit yang berpotensi untuk mengendalikan penyakit darah.

Bahan dan Metode

Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman IPB, Rumah Kaca Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika (BB-BIOGEN), dan Laboratorium Bioproses PAU IPB. Penelitian berlangsung mulai bulan September 2009 sampai dengan April 2011.

Isolasi Bakteri Endofit dari Akar Tanaman Pisang

Bakteri endofit diisolasi dari akar tanaman pisang ‘Kepok kuning’, ‘Kepok tanjung’, ‘Raja bulu’, ‘Raja nangka’, ‘Raja uli’ dan ‘Ambon lumut’ yang tumbuh sehat diantara pertanaman pisang yang terserang BDB di daerah Bogor. Isolasi bakteri endofit dilakukan dengan metode pengenceran dan pencawanan.

Akar pisang dicuci dengan air mengalir untuk membersihkannya dari partikel lain yang menempel, dikeringkan dengan kertas tisu, dan ditimbang masing-masing sebanyak 5 gram. Akar disterilisasi permukaannya berdasarkan metode Sessitsch et al. (2004) yang dimodifikasi. Sterilisasi permukaan dilakukan secara berurutan dengan merendam bagian tanaman dalam Natrium hipoklorit 5% dan 0.25% Tween 20 selama 5 menit, dicuci sebanyak 4 kali dengan akuades steril dan dilewatkan pada lampu bunsen.

Pengujian keefektifan sterilisasi permukaan dilakukan dengan cara membiakkan 100 µ l akuades bekas pencucian akar yang keempat pada media

18 TSA 50% dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24-96 jam. Sampel akuades pencucian yang menunjukkan adanya pertumbuhan mikroorganisme tidak dapat digunakan sebagai sampel isolat bakteri endofit.

Akar yang sudah steril dihaluskan menggunakan mortar steril. Akar yang sudah halus dimasukkan dalam erlenmeyer yang berisi 45 ml akuades steril, kemudian dilakukan pengenceran secara berseri sampai 10-3. Sebanyak 100 µ l dari pengenceran 10-1 dan 10-3 diinokulasikan pada media Tryptic Soy Agar 50% (TSA) dan dari masing-masing pengenceran diinokulasikan pada tiga cawan petri. Biakan kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 24-96 jam.

Pengamatan terhadap pertumbuhan bakteri endofit dilakukan setelah masa inkubasi 24, 48, dan 96 jam. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah koloni bakteri yang tumbuh dan tipe marfologi koloni (Habazar & Rivai 2004). Tipe marfologi koloni bakteri yang diamati yaitu : Bentuk koloni (bulat, tidak teratur, rizoid, benang), penampang melintang koloni (agak datar, cembung, cembung dan berkerut, agak cembung dengan permukaan datar, setengah lingkaran, bentuk kancing), bentuk permukaan koloni (agak berlendir, berlendir, dan kasar). Masing-masing koloni yang menunjukkan perbedaan marfologi dimurnikan kembali pada media TSA 100%. Isolat yang telah dimurnikan diuji reaksi hipersensitifnya pada daun tembakau. Isolat yang tidak menunjukkan reaksi hipersensitif disimpan dalam akuades steril untuk digunakan dalam pengujian selanjutnya.

Isolat-isolat bakteri endofit dari satu tanaman sampel dikelompokkan ke dalam satu komunitas/sampel, kemudian dihitung frekuensi kemunculan isolat dalam masing-masing komunitas untuk menentukan isolat yang dominan. Frekuensi kemunculan isolat bakteri ditentukan berdasarkan jumlah koloni tunggal isolat bakteri pada media isolasi, yang dihitung menggunakan rumus :

Fi (x) = Frekuensi isolat (i) dalam komunitas (x) ni

N = Jumlah total koloni dalam komunitas (x)

(x) = Jumlah koloni isolat (i) dalam komunitas (x) ni (x)

Fi (x) = N

Isolasi Blood Disease Bacterium dari Tanaman Pisang

Isolat Blood Disease Bacterium (BDB) yang virulen diisolasi dari tandan buah tanaman pisang ‘Kepok’ yang menunjukkan gejala penyakit darah. Tandan pisang yang terinfeksi BDB dipotong dengan ukuran 3 x 3 cm, kemudian direndam dalam Natrium hipoklorit 5% selama 1 menit dan dicuci sebanyak 4 kali dengan akuades steril. Potongan tandan ini diletakkan di dalam cawan petri yang di alas dengan kertas saring steril yang lembab sehingga lendir (ooze) bakteri berwarna putih kusam keluar dari potongan tersebut. Lendir bakteri ini kemudian diambil dengan jarum ose steril dan digoreskan pada media Sucrose Peptone Agar (komposisi : 20 g sucrose, 5 g peptone, 0.5 g K2HPO4, 0.25 g MgSO4.7H2

Uji Kemampuan Penghambatan Isolat Bakteri Endofit Terhadap BDB

O, 15 g agar, 1000 ml akuades) yang mengandung antibiotik polymixin β sulfat 1% dan 2,3,5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1% (Lelliott & Stead 1987) dan diinkubasi selama 3 hari. Koloni bakteri yang menunjukkan karakter marfologi dari BDB dimurnikan dan dilakukan uji gram (berdasarkan reaksi KOH), reaksi hipersensitif pada daun tembakau, dan uji patogenesitas pada bibit pisang. Isolat yang menunjukkan virulensi tinggi pada bibit pisang disimpan dalam akuades steril untuk pengujian selanjutnya.

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan penghambatan berdasarkan mekanisme antibiosis isolat bakteri endofit terhadap BDB secara

in vitro. Pengujian dilakukan pada media Sukrosa Pepton Agar (SPA) dengan

metode Difusi Kertas Cakram Agar (Madigan et al. 1997).

Masing-masing isolat bakteri endofit dibiakkan pada media TSA selama 48 jam, kemudian disuspensikan dalam 10 ml akuades steril dan dihitung populasinya sehingga mencapai 108 - 109 cfu/ml (OD600 = 0.16), sedangkan BDB dibiakkan pada media SPA selama 76 jam, kemudian disuspensikan dalam 10 ml akuades steril dan dihitung populasinya sehingga mencapai 108 - 109 cfu/ml (OD600 = 0.1). Sebanyak 100 µ l suspensi BDB disebarkan pada permukaan media SPA secara merata dan dikeringanginkan. Selanjutnya, 5 potongan kertas saring steril dengan diameter 5 mm diletakkan secara teratur pada permukaan media. Sebanyak 4 potongan kertas saring ditetesi dengan 7.5 µ l suspensi bakteri endofit

20 yang berbeda dan 1 potongan kertas saring ditetesi dengan 7.5 µ l akuades steril sebagai kontrol. Pengamatan dilakukan terhadap lebar zone bening di sekitar kertas saring yang merupakan reaksi penghambatan dari bakteri endofit terhadap BDB.

Uji Kemampuan Bakteri Endofit dalam Menekan Kejadian Penyakit Darah

Percobaan ini bertujuan untuk mendapatkan beberapa isolat tunggal bakteri endofit dari tanaman pisang yang berpotensi menekan kejadian penyakit darah. Percobaan dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap dengan 31 perlakuan dan 3 ulangan, dimana setiap ulangan terdiri dari 4 bibit pisang. Perlakuan dalam percobaan ini adalah isolat bakteri endofit yang menunjukkan kemampuan antibiosis terhadap BDB pada uji in vitro dan/atau isolat bakteri endofit yang dominan dalam satu komunitas berdasarkan frekuensi kemunculan isolat, serta perlakuan akuades steril sebagai kontrol.

Inokulasi bakteri endofit pada bibit pisang. Bibit pisang yang digunakan adalah jenis pisang ‘Cavendish’ berumur 1 bulan setelah aklimatiasi hasil perbanyakan dengan kultur jaringan dari BIOTROP Bogor. Bibit pisang yang digunakan diseleksi untuk mendapatkan bibit dengan ukuran yang seragam. Bibit dibersihkan perakarannya dari kotoran media pembibitan dengan air mengalir dan dikeringanginkan.

Bakteri endofit yang digunakan dalam pengujian ini diperbanyak pada media TSA dalam cawan petri selama 48 jam pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 10 ml akuades steril. Suspensi bakteri kemudian dihitung populasinya sehingga mencapai 108-109 cfu/ml.

Sebanyak 12 bibit yang telah diseleksi direndam akarnya dalam 600 ml suspensi masing-masing isolat bakteri endofit selama 6 jam (modifikasi Kavino

et al. 2007), sedangkan tanaman kontrol direndam dalam akuades steril. Bibit

yang telah diinokulasi dengan bakteri endofit ditanam dalam pot plastik (diameter 20 cm) dengan media tanam berupa campuran tanah humus steril dan sekam bakar (perbandingan 2:1 v/v). Media tanam disiram dengan 40 ml sisa suspensi bakteri endofit hasil perendaman.

Bibit pisang dipelihara selama 8 minggu untuk proses kolonisasi bakteri (Kasutjianingati 2004). Untuk mengetahui pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman dan aktivitas enzim pertahanan tanaman, dilakukan pengamatan terhadap pertambahan tinggi dan jumlah daun tanaman (setiap 4 minggu), serta pengukuran aktivitas peroksidase dan polifenol oksidase dari akar tanaman pisang pada minggu ke-8 sebelum inokulasi BDB.

Inokulasi BDB pada bibit pisang. Inokulasi BDB dilakukan pada tanaman pisang yang telah diintroduksi dengan bakteri endofit selama 8 minggu menggunakan 2 metode (Rustam 2007) yaitu : (1) Penginjeksian suspensi BDB pada bonggol tanaman pisang; dan (2) Pelukaan akar dan penyiraman suspensi BDB.

Metode penginjeksian suspensi BDB pada bonggol pisang dilakukan dengan cara menginjeksikan 2 ml suspensi BDB 108-109 cfu/ml menggunakan jarum injeksi steril (5 ml) ke dalam bonggol tanaman pisang. Metode pelukaan akar dan penyiraman suspensi BDB dilakukan dengan cara melukai akar tanaman pisang dengan pisau skalpel steril, kemudian 25 ml suspensi BDB 108 – 109 cfu/ml disiramkan ke tanah sekitar akar yang dilukai.

Pengamatan dilakukan terhadap periode inkubasi penyakit, persentase kejadian penyakit darah, dan pertumbuhan tanaman (pertambahan tinggi dan jumlah daun tanaman). Persentase kejadian penyakit dihitung menggunakan rumus Agrios (2005) yaitu :

KjP = x 100% KjP = Kejadian penyakit (%)

a = Jumlah tanaman yang menunjukkan gejala penyakit pada satu perlakuan b = Jumlah tanaman pada perlakuan yang sama

Isolat bakteri endofit yang menunjukkan kemampuan penghambatan tinggi terhadap kejadian penyakit darah diidentifikasi, dikarakterisasi dan dilakukan pengujian mekanisme pengendalian terhadap penyakit darah pada tanaman pisang.

Data hasil pengamatan pertumbuhan tanaman, periode inkubasi penyakit dan kejadian penyakit darah dianalisis secara statistik (ANOVA) dan perlakuan yang berpengaruh nyata dilakukan uji lanjut Dunnett pada taraf 5%.

a b

Lampiran 1 Data Isolat Bakteri Endofit dari Akar Beberapa Jenis Tanaman Pisang : Jumlah

koloni, frekuensi kemunculan isolat, zone hambatan terhadap BDB, dan cirri-ciri

morfologi isolat

Sampel tanaman

Kode isolat

Jumlah koloni (n)

Frekuensi kemunculan

isolat (n/N)

Zone hambatan

(cm)

Ciri-ciri morfologi isolat (warna koloni, bentuk koloni, penampang

melintang koloni, dan bentuk permukaan koloni)

‘Kepok

kuning’-1 EKK1 2 0.13 - Putih,tidak teratur, agak datar, berlendir EKK2 1 0.06 - Putih, bulat, agak datar, agak berlendir EKK3 1 0.06 - Kuning, bulat, cembung, berlendir EKK4 4 0.25* 1.2 Putih, bulat, cembung, berlendir EKK5 1 0.06 - Putih, bulat, cembung dengan permukaan _{datar, berlendir} EKK6 1 0.06 - Putih bening, tidak teratur, datar, agak

berlendir

EKK7 2 0.13 1.5 Putih, tidak teratur, agak datar, berlendir EKK8 1 0.06 4.0 Putih, bulat, agak datar, berlendir EKK9 2 0.13 - Putih, bulat bergerigi, agak datar, berlendir EKK10 1 0.06 < 1 Kecoklatan, bulat, agak datar, berlendir

Jumlah (N) 16

‘Kepok

kuning’-2 EKK11 5 0.38* - Kehijauan, bulat, datar, berlendir EKK12 1 0.08 - Bening, bulat, datar, tidak berlendir EKK13 3 0.23 < 1 Putih, bulat, datar, agar berlendir EKK14 1 0.08 - Putih kecoklatan, tidak teratur, datar,

berlendir

EKK15 2 0.15 < 1 Putih, tidak teratur, datar, tidak berlendir EKK16 1 0.08 - Coklat muda, bulat, agak datar, berlendir

Jumlah (N) 13

‘Kepok

kuning’-3 EKK17 3 0.01 - Kuning, bulat, agak datar, berlendir EKK18 15 0.06 - Putih kekuningan, bulat, agak datar,

berlendir

EKK19 33 0.14 - Kuning dengan pinggir kehijauan, bulat, agak datar, berlendir

EKK20 6 0.03 < 1 Putih, tidak teratur, datar, berlendir EKK21 42 0.18 - Putih, bulat, agak datar, berlendir

EKK22 136 0.58* - Putih dengan pinggir kehijauan, bulat, datar, agak berlendir

Jumlah (N) 235

‘Kepok

kuning’-4 EKK23 23 0.25 -

Kuning dengan pinggir kehijauan, bulat, agak datar, berlendir

EKK24 1 0.01 - Putih dengan cincin bening, bulat, agak datar, agak berlendir

EKK25 2 0.02 - Putih, tidak teratur, agak datar, berlendir EKK26 6 0.07 < 1 Kuning dengan pinggir kehijauan, bulat,

agak datar, agak berlendir EKK27 25 0.27 - Putih, bulat, agak datar, berlendir EKK28 34 0.37* < 1 Putih, bulat kecil-kecil, agak datar, agak

berlendir Jumlah (N) 91

‘Kepok

tanjung’ EKT01 3 0.10 - Coklat tua, bulat, agak datar, berlendir EKT02 13 0.42* - Putih kusam, tidak teratur, datar, agak

berlendir

EKT03 2 0.06 < 1 Putih kusam, bulat, datar, agak berlendir EKT04 11 0.35 < 1 Putih, bulat, datar, agak berlendir EKT05 2 0.06 1.5 Putih bening, bulat, datar, agak berlendir Jumlah (N) 31

Lampiran 1 Data Isolat Bakteri Endofit dari Akar Beberapa Jenis Tanaman Pisang : Jumlah

koloni, frekuensi kemunculan isolat, zone hambatan terhadap BDB, dan cirri-ciri

morfologi isolat (lanjutan)

Sampel tanaman

Kode isolat

Jumlah koloni (n)

Frekuensi kemunculan

isolat (n/N)

Zone hambatan

(cm)

Ciri-ciri morfologi isolat (warna koloni, bentuk koloni, penampang

melintang koloni, dan bentuk permukaan koloni)

‘Raja bulu’-1 ERB01 48 0.08 - Coklat, bulat, datar, agak berlendir ERB02 101 0.16 - Putih kusam, bulat, datar, agak berlendir ERB03 57 0.09 - Kehijauan, bulat, datar, agak berlendir ERB04 4 0.01 1.6 Kecoklatan, tidak teratur, datar, agak

berlendir

ERB05 355 0.56* - Kehijauan, bulat, agak datar, berlendir ERB06 18 0.03 < 1 Putih kekuningan, bulat, agak datar,

berlendir

ERB07 49 0.08 - Putih, bulat, agak datar, berlendir Jumlah (N) 632

‘Raja bulu’-2 ERB08 3 0.13 < 1 Putih, bulat besar, agak datar, berlendir ERB09 3 0.13 - Kuning bening, bulat, bentuk kancing, _berlendir ERB10 4 0.17 < 1 Kuning, bulat, agak datar, berlendir ERB11 1 0.04 - Kekuningan, tidak teratur, agak datar,

berlendir

ERB12 1 0.04 - Bening, tidak teratur, datar, berlendir ERB13 6 0.26* - Kecoklatan, bulat kecil, cembung, berlendir ERB14 5 0.22 - Putih, tidak teratur, datar, tdak berlendir Jumlah (N) 23

‘Raja bulu’-3 ERB15 14 0.67* - Kemerahan, bulat, cembung, berlendir ERB16 2 0.10 < 1 Kehijauan, bulat, cembung, berlendir ERB17 3 0.14 - Putih kecoklatan, bulat, cembung, berlendir ERB18 1 0.05 - Putih, bulat, cembung, berlendir

ERB19 1 0.05 - Putih kecoklatan, bulat, cembung, agak berlendir

Jumlah (N) 21

‘Raja nangka’ ERN01 20 0.18 < 1 Putih, bulat besar, agak datar, berlendir ERN02 42 0.37 - Putih kehijauan, tidak teratur, datar, agak

berlendir

ERN03 13 0.11 - Kehijauan, bulat, datar, agak berlendir ERN04 15 0.13 - Putih, bulat, agak datar, berlendir ERN05 24 0.21 2..3 Putih dengan cincin bening, bulat, datar, _{agak berlendir}

Jumlah (N) 114

‘Raja uli’ ERU01 3 0.12 - Kekuningan, bulat, datar, tidak berlendir ERU02 15 0.58* - Kekuningan, bulat, datar, berlendir ERU03 4 0.15 - Kekuningan, bulat, agak datar, berlendir ERU04 1 0.04 - Kuning, bulat, datar, tidak berlendir ERU05 1 0.04 - Putih, bulat, datar, berlendir ERU06 1 0.04 2.0 Putih, bulat, datar, tidak berlendir ERU07 1 0.04 - Coklat, bulat, datar, berlendir

Jumlah (N) 26

‘Ambon EAL01 9 0.300 - Bening, bulat, datar, tidak berlendir lumut’-1 EAL02 10 0.333* < 1 Bening, bulat, datar, agak berlendir EAL03 7 0.233 - Kuning, bulat, agak datar, berlendir EAL04 2 0.067 - Bening, bulat, agak datar, tidak berlendir EAL05 1 0.033 - Kecoklatan, bulat, datar, tiak berlendir EAL06 1 0.033 - Kehijauan, bulat, datar, agak berlendir Jumlah (N) 30

Lampiran 1 Data Isolat Bakteri Endofit dari Akar Beberapa Jenis Tanaman Pisang : Jumlah

koloni, frekuensi kemunculan isolat, zone hambatan terhadap BDB, dan cirri-ciri

morfologi isolat (lanjutan)

Sampel tanaman

Kode isolat

Jumlah koloni (n)

Frekuensi kemunculan

isolat (n/N)

Zone hambatan

(cm)

Ciri-ciri morfologi isolat (warna koloni, bentuk koloni, penampang

melintang koloni, dan bentuk permukaan koloni)

‘Ambon

lumut’-2 EAL07 2 0.050 - Kuning, bulat, agak datar, berlendir EAL08 4 0.100 - Kekuningan, bulat besar, agak datar,

berlendir

EAL09 10 0.250* < 1 Putih, bulat, datar, agak berlendir EAL10 5 0.125 - Kuning dengan pinggir kehijauan, bulat,

datar, agak berlendir

EAL11 5 0.125 < 1 Kuning, bulat, cembung, berlendir EAL12 2 0.050 - Kuning, bulat besar, agak datar, berlendir

Jumlah (N) 28

‘Ambon

lumut’-3 EAL13 1 0.111 -

Putih, tidak teratur/besar, agak datar, berlendir

EAL14 5 0.556* 1.1 Putih, bulat besar, bentuk kancing, berlendir EAL15 1 0.111 < 1 Putih, bulat, cembung, berlendir

EAL16 2 0.222 - Bening, bulat, agak datar, berlendir

Jumlah (N) 9

‘Ambon

lumut’-4 EAL17 88 0.898* - Putih, bulat, cembung, berlendir EAL18 2 0.020 - Kehijauan dengan bagian tengah hitam, _{bulat, cembung, berlendir} EAL19 1 0.010 - Kehijauan, bulat, cembung, berlendir EAL20 7 0.071 < 1 Putih dengan pinggir bening, bulat besar,

agak datar, berlendir

Jumlah (N) 98

‘Ambon

lumut’-5 EAL21 14 0.107 -

Kuning kehijauan, bulat besar, agak datar, berlendir

EAL22 2 0.015 - Putih, bulat, agak datar, berlendir EAL23 5 0.038 - Kehijauan, bulat kecil-kecil, cembung,

berlendir

EAL24 105 0.802* - Putih, bulat kecil-kecil, cembung, berlendir EAL25 5 0.038 - Putih kecoklatan, bulat, cembung, berlendir EAL26 2 0.015 < 1 Kehijauan, bulat, cembung, berlendir Jumlah (N) 133

Lampiran 2 Perbandingan sekuens parsial 16s rRNA dari isolat bakteri endofit

EAL15 dengan

Serratia liquefaciens

strain AIMST 3 (Gene Bank :

HQ683839.1)

Query 27 TTGTGACGAGAGCCGGAGAGGTGAGTAAAGTGTGGGGAACAGTGCGAgggggggggAGAT 86 ||||||| || |||||| |||||||||| || |||| ||| | || | |||||| || Sbjct 54 TTGTGACAAGTGCCGGAAAGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGTAGGGGGATAT 113 Query 87 CTCCNGTGAACAGGGTCTCATACCGCGTATAGTCTCGCGAGACCAAAGGGGGAGCTTTTG 146 || | || ||||| ||| ||||| | || ||||| ||| ||||||||| ||| || Sbjct 114 CTACTGTAAACAGTATCTAATACCCCATAACGTCTCACGACCAAAAAGGGGGACCTTCTG 173 Query 147 GGCTCTTGTGCTCTCATATGTGCCCATGGGGTTATATATAATGTGGGGGGACACCTCTCC 206 | |||||| ||||||||| |||||||| |||| ||| |||||||| | ||| || Sbjct 174 GCCTCTTGCCATCTCATATGCCCCCATGGGATTATCTATTATGTGGGGTAATGTCTCACC 233 Query 207 TCTGCGACAATACCCATATGGGGTGAGAGGAGGAGACCCCCCACTGTGGCTGAGACACGG 266 | ||||||||| || || ||| |||||| | || |||| |||||| ||||||||||| Sbjct 234 TATGCGACAATCCCTATCTGGTCTGAGAGAATGACCCCCCACACTGTAACTGAGACACGG 293 Query 267 GCCCCACACTCC--CAgggggggCCACTGGGGAAAATTTTGCACTGGGGGCACGCCTGAG 324 ||||||||| |||| || |||||| |||| ||| | || |||| ||| |||||| Sbjct 294 --TCCACACTCCTACAGGAGGCACCACTGTGGAATATTGTACAATGGGCGCAAGCCTGAT 351 Query 325 GCGCCCCTGTGCCGTGTGTaaaaaaaGCGTTTTCGTTTTAAAAAACTTTTTCCGCGGAGA 384 |||||| ||||||||||||||||| || | ||| |||| ||||| |||||||||| Sbjct 352 ATACCCCTGCCCCGTGTGTAAAAAAAGCCTTCTGGTTGTAAAGTACTTTCTCCGCGGAGA 411 Query 385 AAAGGGTTGTGGGTAAAAACCCCACCGCTTGAGATTTCCCCCACAAAAAACACCCCCTAA 444 |||| | || || ||| |||| | ||| ||| ||||||||||||||||||||||| |||| Sbjct 412 AAAGCGCTGAGGTTAATAACCTCTCCGATTGTGATTTCCCCCACAAAAAACACCCGCTAA 471 Query 445 ATCTCTGTGCCCACCCCCGGTAATATAGAGGGGGCGCGCGTTTATCTCAATTTCTGGGCG 504 || ||| |||||||||| ||||| |||||| || |||||| ||||||||||||||||| Sbjct 472 CTCCCTGCCCCCACCCCCGCTAATACAGAGGGTGCACGCGTTAATCTCAATTTCTGGGCG 531 Query 505 TATAAAGCACACANGCGCNCTGTGAAGTCNCATATGAAATCTCCCGGCTCTACCTGTGAA 564 || | ||||||| ||| |||| ||||| |||||||||| ||||||||| |||||||| Sbjct 532 TAAAGCGCACACACGCGGTCTGTCAAGTCTGATATGAAATCCCCCGGCTCTCCCTGTGAA 591 Query 565 CTGTGTTTTAAACTGTGANGCGATAGTCTTGTGTAGGGGGGTATANATTTCGGTGTGTCG 624 || ||| |||||||||| || |||||||||||| |||||||| | || |||| ||| Sbjct 592 CTCCGTTCTAAACTGTGACGCTTGAGTCTTGTGTAGAGGGGTATAATTCTCCGTGTATCG 651 Query 625 NTGTAATGTGTATAGATCTGGAGANGTATCGGTGTGGAAAGCGGNCCCCTGNGNANAAAC 684 || |||| |||||||||| ||| | | || ||||||| |||| | | |||| Sbjct 652 CTGAAATGCGTATAGATCTCGAGGAAAACCCCTGGCGAAAGCGCCCCCCCGTACAAAAAC 711 Query 685 TGAGACTCTCGTGTGCAAACGTGTGGAGCGCACACGATAATATA-TNCTGTGAGTCCACA 743 ||| |||| |||| | ||||||||||||| |||||||| ||||| | |||| |||||| Sbjct 712 TGACACTCACGTGCGAAAACGTGTGGAGCACACACGATTATATACCCCCGTGATTCCACA 771

Lampiran 3 Perbandingan sekuens parsial 16s rRNA dari isolat bakteri endofit

EKK10 dengan

Bacillus megaterium

strain WIF34 (Gene Bank :

HM480315.1)

Query 19 TGGTTCTNTGACGTGACGAGTGGGACGAGGGGAG-AACATGTGGGGGGCCGGCC-GTATG 76 || |||| |||||| | | | ||||| || ||| |||| ||||| || ||| ||| | Sbjct 49 TGCTTCTATGACGTTA-GCGGCGGACG-GGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAG 106 Query 77 ACTGGGGGANCTTCCGGAAACCGGTAGCT--TACCCGATAGGATCTTCTCGTTCATGGGG 134 |||||| | |||| |||||||| |||| |||| |||||||||||||| |||||||| Sbjct 107 ACTGGGATAACTTCGGGAAACCGA-AGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGA 165 Query 135 GAGGACCGTCGGATGGNACCCCCTCTCATGAACCCATGGGGCCTCGGCGCGTTAGCGGGG 194 || || | ||||| | || ||| || ||||| || ||| || ||||| | Sbjct 166 GATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGT 225 Query 195 TGGCGGCGCACCTGCTCAACAATGCCTCGATGGTCAGACAAGCTGACCGGGTGATC---- 250 ||| | | | | ||||| ||| || ||||| || | | |||| |||||||| Sbjct 226 TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC 285 Query 251 ----TGGAACTGAGACACTGTCCCAACTCCTACGGTCCGACGGGAGGGGGAATATTGGAA 306 ||| |||||||||| | || |||||||||| |||| | | |||| Sbjct 286 ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG---GAGGCAGCAGTAGGGAA 337 Query 307 TCTGCCCCAATGCCTGAAGCTCTGACGGAGCGTGTCCGAGTGAGGCCTTCAGGTTTTCGG 366 ||| || ||||| ||| ||||||||||| ||| ||||| | ||| |||||| Sbjct 338 TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGG 397 Query 367 GTCTTTCA-CTCTGTAGGAAGGGAAGAACATTTACAACTTCACCTGCTGATACCTTGACG 425 ||| | | |||||| | ||||||||||| ||||| | ||||| |||||||||| Sbjct 398 GTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACG 457 Query 426 GTACCAAACACCAAATCCCTCCCTAACTACGTGCCAGCAACCGCGGAAGTACCTAGGTGG 485 ||||| ||| ||| || ||||||||||||||||| |||||| | ||| ||||||| Sbjct 458 GTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG 517 Query 486 CAAGCGTTTTCCTGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCTGGCGGTTTCTAAGTTCTGATG 545 |||||||| ||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||| | ||||||| Sbjct 518 CAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATG 577 Query 546 TGAAACTCCACCGCTCAACTGTGTTCGGTCATTGNAAACTGGAGTCCTTGAGTGCAGAGT 605 ||||| |||| ||||||| ||| |||||||| ||||||| | |||||||||||| Sbjct 578 TGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAG 637 Query 606 AGAATTCCGGANTTCCNCGTGAAACGCTGAAATGTCTAGAGAAGTGCCGGAACACCAGTG 665 |||| |||| |||| |||| | || ||||||| |||||| ||| |||||||||||| Sbjct 638 AGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTG 697 Query 666 GCNAANGTGGATTNNTGCTCTGTCACTGACGCTGANGCGCGAAAGCNTGAGGGAGAAAAC 725 || || | || || || ||||| ||||||||||| |||||||||| || ||||| |||| Sbjct 698 GCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTG-GGGAGCAAAC 756 Query 726 ATGATTAGGTACCCTGGTATGCCACNCATGTCACCNTGAGTGCTGAGTGCTTAGAGGGNT 785 | |||||| |||||||||| |||| | || |||||||| |||| |||||||| | Sbjct 757 AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTG-TTAGAGGGTT 815 Query 786 GCCTTCCTTNAGCTGCTGCGTCTAACCCATNNACCCGCTCCGCCTGGGNCAGTACGGTTC 845 || |||| || |||||| ||||| ||| | | ||||||||||| ||||||| || Sbjct 816 TCCGCCCTTTAG-TGCTGCAGCTAACGCATTAA-GCACTCCGCCTGGGG-AGTACGG-TC 871 Query 846 GACACGNACTGTNAATTCANNGGGANNNNACGCGNGAGCCCGCACAAGCATGTGGGATCA 905 | || | |||| || ||| |||| ||| | | |||||||||||| | ||| || Sbjct 872 G-CAAG-ACTG-AAACTCAAAGGGAATTGACG-GGGGGCCCGCACAAGC--GGTGGAGCA 925 Query 906 TGTTGGNTTAA 916

||| || |||| Sbjct 926 TGTGGGTTTAA 936

Lampiran 4 Perbandingan sekuens parsial 16s rRNA dari isolat bakteri endofit

EKK20 dengan

Enterobacter cloacae

strain Fm50 (Gene Bank :

GU954429.1)

Query 12 AGAGGAACTTGCTCCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGC 71 |||||| ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 51 AGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGC 110 Query 72 CTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCA 131 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111 CTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCA 170 Query 132 AAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGG 191 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 171 AAGAGGGGGACCTTAGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGG 230 Query 192 TGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACA 251 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 231 TGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACA 290 Query 252 CTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT 311 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 291 CTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT 350 Query 312 GGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTA 371 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 351 GGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTA 410 Query 372 CTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGA 431 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 411 CTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGA 470 Query 432 AGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAAT 491 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 471 AGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAAT 530 Query 492 CGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCG 551 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 531 CGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCG 590 Query 552 GGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGA 611 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 591 GGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGA 650 Query 612 ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGC 671 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 651 ATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGC 710 Query 672 CTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC 731 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 711 CTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC 770 Query 732 CCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTT 791 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 771 CCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTT 830 Query 792 CCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAA 851 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 831 CCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAA 890 Query 852 TGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAA 911 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 891 TGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAA 950 Query 912 GAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAAGTTTCCAGAGATGGGAATGTGCCTTCGGGA 971 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| Sbjct 951 GAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAAGTTTCCAGAGATGGGAACGTGCCTTCGGGA 1010 Query 972 ACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT 1031 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1011 ACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT 1070