STUDI PENGARUH PELARUT ORGANIK ( BENZENA, HEKSANA DAN METANOL) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM PROTEASE DARI Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU
ABSTRAK
STUDI PENGARUH PELARUT ORGANIK ( BENZENA, HEKSANA DAN
METANOL) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM PROTEASE DARI
Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU
Oleh
Rr. ARI KUSUMA NINGSIH
Pada penelitian ini, enzim protease diisolasi dan diproduksi dari Actinomycetes
isolat ANL4 2b-3. Produksi enzim ini dilakukan dalam media fermentasi yakni
Mineral Salt Medium yang mengandung skim milk 2% dan diinkubasi selama 120
jam. Sentrifugasi pada suhu 4ºC dengan laju kecepatan 3500 rpm selama 30 menit
menghasilkan ekstrak kasar enzim. Ekstrak kasar enzim dimurnikan dengan
fraksinasi menggunakan garam Ammonium sulfat dan didialisis dengan membran
selofan. Aktivitas protease di uji dengan menggunakan metode Kunitz dan kadar
protein dengan metode Lowry. Hasil pemurnian di modifikasi dengan pelarut
benzena, heksana dan metanol. Proses pemurnian enzim meningkatkan aktivitas
enzim 0,10 U/mL menjadi 51,6 U/mL pada enzim fraksi Ammonium Sulfat 4050% dengan tingkat kemurnian 1029,74 kali. Hasil penelitian dengan modifikasi
dengan pelarut organik menyebabkan perubahan konformasi struktur dari enzim
protease. Hal ini terbukti dari hasil pengujian lama waktu inkubasi, variasi suhu
dan pH. Pada uji ketahanan lama inkubasi, semua sampel campuran enzimpelarut menunjukan kondisi optimum yang sama yaitu pada lama waktu inkubasi
30 menit. Sedang uji variasi pH, optimum pada pH yang sama yaitu pada pH 7.5.
Untuk uji ketahan panas, sampel dengan penambahan heksana mampu
mempertahankan aktivitas dan stabil hingga suhu 50oC, sedangkan dengan
penambahan metanol dan benzena mengalami penurunan suhu optimum. Dari
ketiga pelarut yang digunakan (heksana, benzena dan metanol), heksana
merupakan pelarut yang paling tepat untuk modifikasi kimia enzim protease
mengingat heksana merupakan pelarut hidrofobik dengan nilai log P sebesar 3,5
mampu mempertahankan aktivitas dan kestabilan termal enzim protease.
Kata kunci: protease, metode kunitz, pelarut organik
ABSTRACT
STUDY OF THE INFLUENCE OF ORGANIC SOLVENT (BENZENE,
HEXANE, AND METHANOL) TOWARDS PR
Actinomycetes
By
Rr. ARI KUSUMA NINGSIH
Protease used in this research was isolated and produced from Actinomycetes
isolate ANL4 2b-3
mineral salt medium with 2%
Centrifugation at 4oC with speed rate 3500 rpm for 30 minutes yielded crude
enzyme. The crude enzyme was then purified by fractination using Ammonium
sulphate and dialysed using selovan membran
de.
Purification process resulted in enzyme which was 1029,74 purer than the crude
activity was
0,10 U/mL, while purified enzyme had 51,6 U/mL activity. Modification of the
organic solvent caused the conformation structure of protease enzyme changed.
This can be seen from the result of incubation time, temperature, and pH variation
experiment. Resistancy test of samples towards incubation time showed that all of
the enzyme-solvent samples had the same optimum condition which was 30
minutes. pH variation test also resulted the same optimum condition for all
samples which was 7,5. Different result exhibited from temperature variation test
to 50o
ed (hexane, benzene, and methanol),
because hexane is hydrophobic solvent with log P value of 3,5 that can maintain
the activity and thermal stability of protease.
Keyword: protease, kunitz, organic solvent
53
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Dari hasil penelitian dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:
1. Uji penambahan pelarut organik ( heksana, benzena dan metanol) pada
enzim protease mempengaruhi keadaan optimum dari enzim dilihat dari
lamanya waktu inkubasi optimum, suhu optimum dan pH optimum pada
masing-masing campuran enzim dengan pelarut organik. Adanya
penambahan pelarut organik tersebut mampu mempertahankan aktivitas
optimumnya pada lama waktu 30 menit dan pH optimum pada 7,5.
Sedangkan pengaruh suhu terhadap penambahan pelarut organik memiliki
efek yang berbeda-beda. Pelarut yang mampu meningkatkan aktivitas dan
stabil pada suhu optimum yaitu 50oC adalah heksana dibandingkan dengan
kontrol dan campuran enzim lainnya.
2. Uji pengaruh penambahan pelarut organik terhadap variasi konsentrasi
substrat kasein menunjukan adanya peningkatan aktivitas enzim dengan
dan tanpa penambahan pelarut organik. Harga Km menunjukan
konsentrasi substrat yang dihidrolisis dengan kecepatan maksimal
(Vmaks). Enzim dengan tanpa penambahan pelarut memiliki kecepatan
54
reaksi yang paling besar dibandingkan dengan penambahan pelarut
organik heksana,benzena dan metanol.
B. Saran
Disarankan untuk melakukan pemurnian lebih lanjut yaitu dengan kromatografi
kolom untuk mendapatkan enzim yang murni dengan aktivitas yang tinggi dan
dilakukan uji dengan modifikasi pelarut dengan variasi pH,suhu dan variasi
substrat yang lebih tinggi dan variatif untuk mengetahui stabilitas termal protease
termodifikasi pelarut organik.
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Dewasa ini industri enzim telah berkembang pesat dan menempati posisi penting
dalam bidang industri. Kesadaran masyarakat terhadap masalah lingkungan yang
semakin tinggi serta adanya tekanan dari para ahli dan pecinta lingkungan
menjadikan teknologi enzim sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan
berbagai proses kimiawi dalam bidang industri (Falch, 1991). Enzim merupakan
katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi dampak pencemaran dan
pemborosan energi (Aunstrup et al., 1979). Salah satu enzim yang banyak
digunakan dibidang industri baik industri pangan maupun industri non pangan
adalah protease. Protease banyak digunakan sebagai biokatalisator industri di
antaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, hidrolisat protein,
pengolahan susu, farmasi dan limbah (Moon dan Paulekar, 1993).
Dalam bidang industri, enzim banyak digunakan sebagai biokatalisator karena
memiliki banyak sekali keunggulan. Diantaranya adalah reaksinya tidak
membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, tidak beracun (Aunstrup et al.,
1979) dan kemampuannya dalam mengkatalis reaksi 108 sampai 1011 kali lebih
cepat dari reaksi tanpa katalis (Poedjadi, 1994). Namun dalam aplikasinya, enzim
mempunyai beberapa kelemahan hal ini disebabkan karena enzim merupakan
senyawa yang rapuh dibandingkan dengan katalisator industri yang lainnya,
2
misalnya kurang stabilnya enzim pada suhu yang ekstrim dan lingkungan pelarut
organik (Suhartono, 1989).
Kestabilan enzim sangat dipengaruhi oleh struktur atau konformasi dari enzim itu
sendiri. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kestabilan enzim adalah pH,
suhu, pelarut, surfaktan, kofaktor ion logam dan reaksi oksidatif. Adanya
gangguan pada sruktur enzim akan mempengaruhi aktivitas dan kestabilan enzim.
Sedangkan di bidang industri dibutuhkan katalis yang mampu stabil dalam reaksi
dengan menggunakan suhu tinggi dan lingkungan pelarut organik. Pada suhu
tinggi, enzim akan mengalami denaturasi yang membuat enzim menjadi inaktif.
Sedangkan penggunaan suhu tinggi sangat diperlukan untuk meningkatan laju
reaksi dan mengurangi masalah-masalah viskositas (Ahern dan Klibanov, 1987
dalam Junita, 2002). Untuk itu perlu dikembangkan lebih lanjut mengenai suatu
tekhnologi yang dapat mengawetkan dan menjadikan enzim lebih stabil sehinggga
proses proses enzimatis dapat dilakukan secara lebih ekonomis dan mempunyai
daya saing yang lebih tinggi. Salah satu cara untuk meningkatkan kestabilan
enzim adalah dengan modifikasi kimia pada struktur enzim. Menurut Krieger et
al., (2004), pelarut dapat menyebabkan modifikasi di dalam konformasi enzim,
merubah efisiensi katalitik dan spesifitas.
Enzim protease dapat diproduksi dari berbagai mikroorganisme, diantaranya
adalah Actinomycetes (Alina. A, 2003). Actinomycetes adalah suatu kelompok
mikroorganisme yang morfologinya merupakan bentuk peralihan antara bakteri
dan jamur. Actinomycetes
Actinomycetes yang digunakan untuk produksi
3
enzim protease didapatkan dari isolasi lumpur hutan bakau yang berada di Pantai
Ringgung Teluk Lampung yang diambil pada kedalaman 2 cm. Berdasarkan
hasil penelitian pendahuluan yang telah dilakukan oleh Andini (2010), bakteri ini
telah diuji kemampuan proteolitiknya pada media Mineral Salt Medium pada suhu
37 ºC, pH 7 dan waktu inkubasi 120 jam. Enzim protease dari bakteri ini juga
berhasil diisolasi dan mempunyai aktivitas optimum pada kondisi suhu 50 ºC, pH
7 dan waktu inkubasi 60 menit. Namun sampai saat ini belum dipelajari
mengenai pengaruh pelarut organik terhadap aktivitas proteolitik dari enzim
protease tersebut.
Berdasarkan uraian diatas maka dalam penelitian ini akan dipelajari pengaruh
penambahan pelarut organik terhadap aktivitas proteolitik enzim protease dari
Actinomycetes isolat lumpur hutan bakau. Pelarut organik yang digunakan yaitu
benzena, heksana dan metanol dengan nilai log P masing-masing adalah heksana
3,5, benzena 2,2 dan metanol -0,77. Nilai log P merupakan salah satu parameter
untuk menentukan hidrofobisitas pelarut. Pelarut tersebut diharapkan mampu
meningkatkan kestabilan konformasi dari enzim protease dengan adanya interaksi
hidrofobik yang terbentuk didalam struktur enzim sehingga dapat meningkatkan
keterikatan substrat dan proses katalitiknya.
B. Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah
4
1. Mempelajari pengaruh pelarut organik (benzena, heksana dan metanol)
terhadap aktifitas enzim protease dari Actinomycetes isolat lumpur hutan
bakau.
2. Mengetahui kemampuan dari pelarut organik (benzena, heksana dan metanol)
dalam meningkatkan aktifitas enzim protease dari Actinomycetes isolat lumpur
hutan bakau.
C. Manfaat
Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi mengenai
pengaruh pelarut organik dan jenis pelarut organik yang dapat meningkatkan
aktivitas proteolitik enzim protease dari Actinomycetes isolat lumpur hutan bakau
sehingga dapat meningkatkan pemanfaatannya dalam bidang industri, penelitian,
ilmu pengetahuan, dan sebagainya.
STUDI PENGARUH PELARUT ORGANIK ( BENZENA, HEKSANA DAN
METANOL) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM PROTEASE DARI
Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU
Oleh
Rr. ARI KUSUMA NINGSIH
Pada penelitian ini, enzim protease diisolasi dan diproduksi dari Actinomycetes
isolat ANL4 2b-3. Produksi enzim ini dilakukan dalam media fermentasi yakni
Mineral Salt Medium yang mengandung skim milk 2% dan diinkubasi selama 120
jam. Sentrifugasi pada suhu 4ºC dengan laju kecepatan 3500 rpm selama 30 menit
menghasilkan ekstrak kasar enzim. Ekstrak kasar enzim dimurnikan dengan
fraksinasi menggunakan garam Ammonium sulfat dan didialisis dengan membran
selofan. Aktivitas protease di uji dengan menggunakan metode Kunitz dan kadar
protein dengan metode Lowry. Hasil pemurnian di modifikasi dengan pelarut
benzena, heksana dan metanol. Proses pemurnian enzim meningkatkan aktivitas
enzim 0,10 U/mL menjadi 51,6 U/mL pada enzim fraksi Ammonium Sulfat 4050% dengan tingkat kemurnian 1029,74 kali. Hasil penelitian dengan modifikasi
dengan pelarut organik menyebabkan perubahan konformasi struktur dari enzim
protease. Hal ini terbukti dari hasil pengujian lama waktu inkubasi, variasi suhu
dan pH. Pada uji ketahanan lama inkubasi, semua sampel campuran enzimpelarut menunjukan kondisi optimum yang sama yaitu pada lama waktu inkubasi
30 menit. Sedang uji variasi pH, optimum pada pH yang sama yaitu pada pH 7.5.
Untuk uji ketahan panas, sampel dengan penambahan heksana mampu
mempertahankan aktivitas dan stabil hingga suhu 50oC, sedangkan dengan
penambahan metanol dan benzena mengalami penurunan suhu optimum. Dari
ketiga pelarut yang digunakan (heksana, benzena dan metanol), heksana
merupakan pelarut yang paling tepat untuk modifikasi kimia enzim protease
mengingat heksana merupakan pelarut hidrofobik dengan nilai log P sebesar 3,5
mampu mempertahankan aktivitas dan kestabilan termal enzim protease.
Kata kunci: protease, metode kunitz, pelarut organik
ABSTRACT
STUDY OF THE INFLUENCE OF ORGANIC SOLVENT (BENZENE,
HEXANE, AND METHANOL) TOWARDS PR
Actinomycetes
By
Rr. ARI KUSUMA NINGSIH
Protease used in this research was isolated and produced from Actinomycetes
isolate ANL4 2b-3
mineral salt medium with 2%
Centrifugation at 4oC with speed rate 3500 rpm for 30 minutes yielded crude
enzyme. The crude enzyme was then purified by fractination using Ammonium
sulphate and dialysed using selovan membran
de.
Purification process resulted in enzyme which was 1029,74 purer than the crude
activity was
0,10 U/mL, while purified enzyme had 51,6 U/mL activity. Modification of the
organic solvent caused the conformation structure of protease enzyme changed.
This can be seen from the result of incubation time, temperature, and pH variation
experiment. Resistancy test of samples towards incubation time showed that all of
the enzyme-solvent samples had the same optimum condition which was 30
minutes. pH variation test also resulted the same optimum condition for all
samples which was 7,5. Different result exhibited from temperature variation test
to 50o
ed (hexane, benzene, and methanol),
because hexane is hydrophobic solvent with log P value of 3,5 that can maintain
the activity and thermal stability of protease.
Keyword: protease, kunitz, organic solvent
53
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Dari hasil penelitian dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:
1. Uji penambahan pelarut organik ( heksana, benzena dan metanol) pada
enzim protease mempengaruhi keadaan optimum dari enzim dilihat dari
lamanya waktu inkubasi optimum, suhu optimum dan pH optimum pada
masing-masing campuran enzim dengan pelarut organik. Adanya
penambahan pelarut organik tersebut mampu mempertahankan aktivitas
optimumnya pada lama waktu 30 menit dan pH optimum pada 7,5.
Sedangkan pengaruh suhu terhadap penambahan pelarut organik memiliki
efek yang berbeda-beda. Pelarut yang mampu meningkatkan aktivitas dan
stabil pada suhu optimum yaitu 50oC adalah heksana dibandingkan dengan
kontrol dan campuran enzim lainnya.
2. Uji pengaruh penambahan pelarut organik terhadap variasi konsentrasi
substrat kasein menunjukan adanya peningkatan aktivitas enzim dengan
dan tanpa penambahan pelarut organik. Harga Km menunjukan
konsentrasi substrat yang dihidrolisis dengan kecepatan maksimal
(Vmaks). Enzim dengan tanpa penambahan pelarut memiliki kecepatan
54
reaksi yang paling besar dibandingkan dengan penambahan pelarut
organik heksana,benzena dan metanol.
B. Saran
Disarankan untuk melakukan pemurnian lebih lanjut yaitu dengan kromatografi
kolom untuk mendapatkan enzim yang murni dengan aktivitas yang tinggi dan
dilakukan uji dengan modifikasi pelarut dengan variasi pH,suhu dan variasi
substrat yang lebih tinggi dan variatif untuk mengetahui stabilitas termal protease
termodifikasi pelarut organik.
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Dewasa ini industri enzim telah berkembang pesat dan menempati posisi penting
dalam bidang industri. Kesadaran masyarakat terhadap masalah lingkungan yang
semakin tinggi serta adanya tekanan dari para ahli dan pecinta lingkungan
menjadikan teknologi enzim sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan
berbagai proses kimiawi dalam bidang industri (Falch, 1991). Enzim merupakan
katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi dampak pencemaran dan
pemborosan energi (Aunstrup et al., 1979). Salah satu enzim yang banyak
digunakan dibidang industri baik industri pangan maupun industri non pangan
adalah protease. Protease banyak digunakan sebagai biokatalisator industri di
antaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, hidrolisat protein,
pengolahan susu, farmasi dan limbah (Moon dan Paulekar, 1993).
Dalam bidang industri, enzim banyak digunakan sebagai biokatalisator karena
memiliki banyak sekali keunggulan. Diantaranya adalah reaksinya tidak
membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, tidak beracun (Aunstrup et al.,
1979) dan kemampuannya dalam mengkatalis reaksi 108 sampai 1011 kali lebih
cepat dari reaksi tanpa katalis (Poedjadi, 1994). Namun dalam aplikasinya, enzim
mempunyai beberapa kelemahan hal ini disebabkan karena enzim merupakan
senyawa yang rapuh dibandingkan dengan katalisator industri yang lainnya,
2
misalnya kurang stabilnya enzim pada suhu yang ekstrim dan lingkungan pelarut
organik (Suhartono, 1989).
Kestabilan enzim sangat dipengaruhi oleh struktur atau konformasi dari enzim itu
sendiri. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kestabilan enzim adalah pH,
suhu, pelarut, surfaktan, kofaktor ion logam dan reaksi oksidatif. Adanya
gangguan pada sruktur enzim akan mempengaruhi aktivitas dan kestabilan enzim.
Sedangkan di bidang industri dibutuhkan katalis yang mampu stabil dalam reaksi
dengan menggunakan suhu tinggi dan lingkungan pelarut organik. Pada suhu
tinggi, enzim akan mengalami denaturasi yang membuat enzim menjadi inaktif.
Sedangkan penggunaan suhu tinggi sangat diperlukan untuk meningkatan laju
reaksi dan mengurangi masalah-masalah viskositas (Ahern dan Klibanov, 1987
dalam Junita, 2002). Untuk itu perlu dikembangkan lebih lanjut mengenai suatu
tekhnologi yang dapat mengawetkan dan menjadikan enzim lebih stabil sehinggga
proses proses enzimatis dapat dilakukan secara lebih ekonomis dan mempunyai
daya saing yang lebih tinggi. Salah satu cara untuk meningkatkan kestabilan
enzim adalah dengan modifikasi kimia pada struktur enzim. Menurut Krieger et
al., (2004), pelarut dapat menyebabkan modifikasi di dalam konformasi enzim,
merubah efisiensi katalitik dan spesifitas.
Enzim protease dapat diproduksi dari berbagai mikroorganisme, diantaranya
adalah Actinomycetes (Alina. A, 2003). Actinomycetes adalah suatu kelompok
mikroorganisme yang morfologinya merupakan bentuk peralihan antara bakteri
dan jamur. Actinomycetes
Actinomycetes yang digunakan untuk produksi
3
enzim protease didapatkan dari isolasi lumpur hutan bakau yang berada di Pantai
Ringgung Teluk Lampung yang diambil pada kedalaman 2 cm. Berdasarkan
hasil penelitian pendahuluan yang telah dilakukan oleh Andini (2010), bakteri ini
telah diuji kemampuan proteolitiknya pada media Mineral Salt Medium pada suhu
37 ºC, pH 7 dan waktu inkubasi 120 jam. Enzim protease dari bakteri ini juga
berhasil diisolasi dan mempunyai aktivitas optimum pada kondisi suhu 50 ºC, pH
7 dan waktu inkubasi 60 menit. Namun sampai saat ini belum dipelajari
mengenai pengaruh pelarut organik terhadap aktivitas proteolitik dari enzim
protease tersebut.
Berdasarkan uraian diatas maka dalam penelitian ini akan dipelajari pengaruh
penambahan pelarut organik terhadap aktivitas proteolitik enzim protease dari
Actinomycetes isolat lumpur hutan bakau. Pelarut organik yang digunakan yaitu
benzena, heksana dan metanol dengan nilai log P masing-masing adalah heksana
3,5, benzena 2,2 dan metanol -0,77. Nilai log P merupakan salah satu parameter
untuk menentukan hidrofobisitas pelarut. Pelarut tersebut diharapkan mampu
meningkatkan kestabilan konformasi dari enzim protease dengan adanya interaksi
hidrofobik yang terbentuk didalam struktur enzim sehingga dapat meningkatkan
keterikatan substrat dan proses katalitiknya.
B. Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah
4
1. Mempelajari pengaruh pelarut organik (benzena, heksana dan metanol)
terhadap aktifitas enzim protease dari Actinomycetes isolat lumpur hutan
bakau.
2. Mengetahui kemampuan dari pelarut organik (benzena, heksana dan metanol)
dalam meningkatkan aktifitas enzim protease dari Actinomycetes isolat lumpur
hutan bakau.
C. Manfaat
Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi mengenai
pengaruh pelarut organik dan jenis pelarut organik yang dapat meningkatkan
aktivitas proteolitik enzim protease dari Actinomycetes isolat lumpur hutan bakau
sehingga dapat meningkatkan pemanfaatannya dalam bidang industri, penelitian,
ilmu pengetahuan, dan sebagainya.