Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan
KERAGAMAN GEN CSN3 EKSON 4 PADA KAMBING
PERANAKAN ETAWAH DI BPTU KDI-HPT
PELAIHARI KALIMANTAN SELATAN
FREDY FENDER
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Gen CSN3
Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari
Kalimantan Selatan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Fredy Fender
NIM D14100011
ABSTRAK
FREDY FENDER. Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan
Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan. Dibimbing oleh RINI
HERLINA MULYONO dan JAKARIA.
Kambing PE sebagai sumber daya genetik ternak lokal Indonesia memiliki
keunggulan, salah satunya produksi susu yang tinggi. Gen CSN3 merupakan
anggota dari fragmen kasein yang berkaitan dengan protein dan kasein susu.
Tujuan penelitian ini mengidentifikasi keragaman gen CSN3 ekson 4 pada
kambing PE di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan, menggunakan
metode PCR-RFLP. Keragaman gen CSN3 dideteksi dari 115 sampel darah
kambing PE menggunakan enzim restriksi PstI yang memotong fragmen
CTGCA|G. Amplifikasi gen CSN3 menghasilkan 1 fragmen dengan panjang 407
pb yang terletak pada ekson 4 dengan suhu annealing 60 °C selama 20 detik.
Hasil analisis PCR-RFLP menunjukkan gen CSN3 kambing PE yang dianalisis
memiliki alel monomorfik F adalah 100%.
Kata kunci: gen CSN3, kambing PE, PCR-RFLP
ABSTRACT
FREDY FENDER. Polymorphism of Exon 4 CSN3 of Etawah Grade Goats in
BPTU KDI-HPT Pelaihari South Kalimantan. Supervised by RINI HERLINA
MULYONO and JAKARIA.
Etawah grade goat as one of Indonesian local animal genetic resources has
advantages, one of which is its high milk yield. CSN3 gene is a member of casein
fragment related to protein and casein contents. The aim of this study was to
identify polymorphisms of CSN3 in Etawah grade goat from BPTU KDI-HPT
Pelaihari, South Kalimantan using the PCR-RFLP method. Polymorphisms of
CSN3 gene were identified of 115 blood samples using PstI restriction enzyme
that cuts the fragment of CTGCA|G. CSN3 amplification resulted 407 bp which is
located at exon 4 was performed with annealing temperature 60 °C for 20
seconds. The results of PCR-RFLP analysis indicated that the analyzed CSN3
gene of Etawah grade goat which have monomorphic F allele was 100%.
Key words: CSN3 gene, Etawah grade goats, PCR-RFLP
KERAGAMAN GEN CSN3 EKSON 4 PADA KAMBING
PERANAKAN ETAWAH DI BPTU KDI-HPT
PELAIHARI KALIMANTAN SELATAN
FREDY FENDER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
8
9
Judul Skripsi : Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah
di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan
Nama
: Fredy Fender
NIM
: D14100011
Disetujui oleh
Ir Rini Herlina Mulyono, MSi
Pembimbing I
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
10
PRAKATA
Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala
penguasa dan sumber segala ilmu, karena berkat segala karunia-Nya skripsi ini
berhasil diselesaikan. Sholawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada
Nabi Muhammad sollallahu ’alaihi wasallam, keluarganya, sahabatnya, serta
umatnya yang beriman hingga akhir zaman. Tema yang dipilih dalam penelitian
yang dilaksanakan pada Desember 2013 sampai April 2014 adalah kambing lokal
Indonesia dengan judul Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan
Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan.
Perbaikan mutu genetik kambing PE masih dilakukan secara konvensional.
Selain itu, upaya dalam memperbaiki mutu genetik kambing PE perlu didukung
data yang lebih akurat, yaitu dilakukan seleksi dengan identifikasi keragaman
pada tingkat DNA termasuk gen CSN3 yang berperan pada kualitas susu. Hasil
penelitian ini diharapkan memberikan informasi khususnya kepada breeder
kambing perah dan peternak ternak perah secara umum sehingga dapat ditentukan
gen yang menjadi marker assisted selection dalam program pemuliaan.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi RI atas bantuan
Beasiswa Bidikmisi selama masa perkuliahan S1. Terima kasih kepada Ir Rini
Herlina Mulyono, MSi yang mendanai penelitian sekaligus sebagai pembimbing
skripsi bersama Dr Jakaria, SPt MSi. Terima kasih kepada Dr Ir Afton Atabany,
MSi selaku penguji skripsi atas masukan dan sarannya. Penghargaan Penulis
sampaikan kepada Fuad Hasan, SPt MSi dan Pipih S Effendi, SPt yang membantu
pengumpulan bahan penelitian di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan.
Ungkapan terima kasih Penulis sampaikan kepada Ayahanda Edi
Kusmayadi, Ibunda Nurlela, kakak Retno Valentino, dan adik Edo Fernando,
beserta seluruh keluarga besar atas do’a dan kasih sayangnya. Terima kasih
kepada M Jafar Sidiq dan Angga BP Suparman sebagai tim penelitian genetika
molekuler kambing PE, atas kerja sama, kekompakkan, dan bantuan selama
penelitian. Terima kasih kepada Laras Shafa Fauziah, Novita S Thamren,
Leonardus KD Bidara, Hafidz I Albana, dan M Faisal Nurhuda yang mendukung
Penulis dalam penulisan skripsi. Tak lupa terima kasih kepada Eryk Andreas, SPt
MSi; Annisa O Rini, SPt MSi; Isyana Khaerunnisa, SPt; Ahmad Furqon, SPt;
Komang Alit Paramitasari, SPt MSi; Shelvi, SSi; dan teman-teman ABGSCi
(Animal Breeding and Genetic Student Community) atas banyak masukan dan
arahannya. Terima kasih kepada teman-teman D’Ransum Percussion atas
semangat dan dukungannya. Terima kasih juga kepada keluarga besar IPTP
angkatan 47 atas semua dukungannya. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat
bagi semua pihak yang membutuhkan.
Bogor, Oktober 2014
Fredy Fender
11
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitan
1
Ruang Lingkup Penelitian
2
METODE
2
Lokasi dan Waktu Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur
3
Ekstraksi DNA Total
3
Amplifikasi
3
Genotyping
4
Analisis Data
4
Frekuensi Alel dan Genotipe
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Amplifikasi Gen CSN3
5
Genotyping Gen CSN3
5
Frekuensi Alel Gen CSN3 dan Pendugaan Kandungan Kasein Susu
Kambing PE Penelitian Berdasarkan Asosiasi antara Gen CSN3 dengan
7
Kandungan Kasein Susu Kambing pada Penelitian Lain
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
16
12
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Posisi penempelan primer dan situs restriksi PstI pada fragmen gen
CSN3 ekson 4
Amplikon gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 1.5%
Genotipe gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 2%
Lokasi mutasi situs restriksi PstI dan perbandingan sekuen fragmen gen
CSN3 ekson 4 pada kambing di berbagai wilayah
3
5
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Melting temperature (Tm) primer forward (F) dan reverse (R) gen CSN3
ekson 4
Sekuen mRNA gen CSN3 yang diakses di GenBank kode aksesi X60763
Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel F yang diakses di GenBank kode aksesi
AY090466
Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel M yang diakses di GenBank kode aksesi
AY428577
11
11
13
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kambing Peranakan Etawah (PE) berpotensi sebagai salah satu sumber daya
genetik ternak yang dapat dikembangkan lebih luas untuk memenuhi kebutuhan
masyarakat. Kambing PE merupakan galur hasil persilangan antara kambing
Etawah dan kambing Kacang dengan kadar genetik lebih tinggi pada kambing
Etawah karena telah melalui program up grading (kawin tatar). Kambing PE
memiliki kemampuan adaptasi yang cukup tinggi dan memiliki fungsi sebagai
penghasil daging dan susu (dwiguna) (Atabany 2013).
Populasi kambing di Indonesia pada tahun 2012 mencapai 17.91 juta ekor
yang sebagian besar menyebar di Jawa Tengah, Jawa Timur, dan Jawa Barat
(Ditjennak 2013). Finesco (2013) menyatakan bahwa lima juta ekor dari populasi
kambing di Indonesia adalah kambing PE. Produksi susu kambing PE mampu
mencapai 3 L ekor-1 hari-1 (Menteri Pertanian RI 2013). Kualitas susu kambing
PE belum banyak diperhatikan, seperti kandungan kasein dalam protein susu.
Kasein dalam protein susu berperan memperbaiki struktur yogurt (Buckle et al.
2010), selain itu dapat diolah menjadi keju lunak atau keju keras (Atabany 2013).
Struktur dan stabilitas misel kasein protein susu dikontrol oleh gen κ-kasein
(CSN3) yang terletak pada kromosom nomor 6q31 dengan panjang 13 kb dan
terdiri atas 5 ekson dan 4 intron (Threadgill dan Womack 1990). Keragaman gen
CSN3 berpengaruh pada kandungan protein dan lemak susu pada sapi Czech
Fleckvieh (Kucerova et al. 2006) dan kandungan protein susu pada sapi FH
(Sumantri et al. 2004). Chiatti et al. (2005) melaporkan keragaman gen CSN3
pada kambing berhubungan dengan protein dan kasein susu. Hingga saat ini
sudah ditemukan 20 macam alel gen CSN3 pada kambing (Coll et al. 1993;
Yahyaoui et al. 2001; Angiolillo et al. 2002; Yahyaoui et al. 2003; Chessa et al.
2003; Jann et al. 2004; Prinzenberg et al. 2005; Kiplagat et al. 2010). Keragaman
gen CSN3 pada kambing PE diharapkan dapat digunakan dalam program seleksi
untuk meningkatkan produksi kasein susu.
Perkembangan bioteknologi bidang genetika molekuler memungkinkan
penggunaan penanda molekuler untuk mengukur status keragaman genetik
melalui pemanfaatan marker assisted selection (MAS). Keragaman gen CSN3
diharapkan dapat dijadikan MAS dalam program seleksi kambing PE. Teknik
polymorphism chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) merupakan salah satu metode yang mudah dilakukan untuk mendeteksi
keragaman genetik yang berhubungan dengan sifat-sifat pertumbuhan. Penelitian
mengenai keragaman gen CSN3 kambing sudah banyak dilakukan, tetapi pada
kambing PE di Balai Pembibitan Ternak Unggul Kambing Domba Itik Hijauan
Pakan Ternak (BPTU KDI-HPT) Pelaihari Kalimantan Selatan belum dilakukan.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini mengidentifikasi keragaman gen CSN3 ekson 4 pada
kambing PE di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan, menggunakan
metode PCR-RFLP.
2
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 115 sampel darah kambing PE (8 ekor
jantan dan 107 ekor betina) yang terdapat di BPTU KDI-HPT Pelaihari
Kalimanatan Selatan. Keragaman gen CSN3 ekson 4 dianalisis menggunakan
metode PCR-RFLP dengan enzim restriksi PstI (CTGCA|G).
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetika, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari
Desember 2013 sampai April 2014.
Bahan
Sampel darah yang digunakan berasal dari 115 ekor darah kambing PE (8
ekor jantan dan 107 ekor betina) yang berasal dari BPTU KDI-HPT Pelaihari,
Kalimantan Selatan yang telah diawetkan dalam EtOH 70% dengan perbandingan
1:1 atau dalam serbuk EDTA. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi
DNA diantaranya sampel darah, NaCl 0.2% (untuk sampel darah yang diawetkan
dalam EDTA), DW (untuk sampel darah yang diawetkan dalam EtOH 70%), SDS
(sodium dodecylsulphate) 10%, proteinase-K (5 mg mL-1), 1×STE (sodium trisEDTA), phenol solution, CIAA (chloroform isoamylalcohol), NaCl 5M, dan TE
(tris-EDTA) 80%. Bahan-bahan yang digunakan untuk prosedur amplifikasi
(PCR), elektroforesis, dan analisis RFLP diantaranya isolat DNA, DreamTaq
Buffer, MgCl2, dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate), pasangan primer
forward dan primer reverese, DreamTaq polymerase (fermentas), produk PCR
(amplikon), serbuk agarosa, 0.5×TBE (tris borat-EDTA), EtBr (etidium bromida),
loading dye (0.01% xylene cyanol, 0.01% bromthymol blue, dan 50% gliserol),
DNA marker dengan jarak 100 pb (pasang basa), enzim restriksi PstI
(CTGCA|G), dan Buffer O.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi DNA, amplifikasi, dan analisis
RFLP terdiri atas tabung eppendorf 1.5 mL, satu set mikro pipet, tip pipet,
microsentifuge berpendingin, inkubator, vortex, nutating mixer, refrigerator,
mesin PCR Eppendorf, tabung 0.2 mL (PCR), dan tabung 0.5 mL (RFLP). Alat
yang digunakan dalam prosedur elektroforesis yaitu timbangan analitik, gelas
ukur, microwave, magnetic stirrer, satu set tray pencetak gel, power supply
electrophoresis 100 V, dan UV transilluminator.
3
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989).
Darah dalam EtOH diambil sebanyak 200 μL, lalu ditambahkan 1 000 μL DW
dalam tabung eppendorf 1.5 mL, kemudian divortex dan didiamkan selama 5
menit. Darah dalam EDTA diambil sebanyak 50 μL, lalu ditambahkan 1 000 μL
NaCl 0.2%, kemudian divortex dan didiamkan selama 5 menit. Sampel
disentrifius pada kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit dan supernatan yang
terbentuk dibuang. Endapan ditambahkan 40 μL SDS 10%, 10 μL proteinase-K
(5 mg mL-1), dan 1×STE sampai 400 μL, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C
selama 2 jam sambil digoyang secara perlahan menggunakan nutating mixer.
Degradasi bahan organik dilakukan dengan menambahkan 400 μL phenol
solution, 400 μL CIAA, dan 40 μl NaCl 5M, kemudian digoyang selama 1 jam
pada suhu ruang.
Molekul DNA dipisahkan dari fenol dengan cara disentrifius pada kecepatan
12 000 rpm selama 5 menit sehingga terbentuk fase DNA (bening). Fase DNA
sebanyak 400 μL dipindahkan ke tabung baru ditambahkan 800 μL EtOH
abssolute 70% dan 40 μL NaCl 5M, kemudian freezing (overnight). Molekul
DNA disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan
EtOH absolute. Supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan didiamkan hingga
kering untuk disuspensikan dalam 100 μL TE 80%. Sampel DNA disimpan
dalam refrigerator. Sampel DNA dielektoforesis dalam gel agarosa 1% untuk
memastikan keberhasilan ekstraksi.
Amplifikasi
Fragmen DNA diamplifikasi dengan teknik PCR. Sampel DNA hasil
ekstraksi sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam tabung 0.2 mL, lalu ditambahkan
14 μL larutan premix. Premix tersusun atas 10.8 μL DW, 1.5 μL 10×DreamTaq
Buffer, 1 μL MgCl2, 0.2 μL dNTPs, 0.2 μL primer forward dan 0.2 μL primer
reverse, serta 0.2 μL DreamTaq polymerase (fermentas). Premix dihomogenkan
dengan vortex lalu spin down agar premix berada di dasar tabung. Campuran
premix dan sampel DNA diinkubasi dalam thermalcycler untuk diamplifikasi.
Posisi penempelan primer menurut Prinzenberg et al. (2005) dapat dilihat pada
Gambar 1 (GenBank dengan kode aksesi AY428577).
Keterangan:
primer forward;
primer reverse;
situs restriksi PstI
Gambar 1 Posisi penempelan primer dan situs restriksi PstI pada fragmen gen
CSN3 ekson 4
4
Kondisi mesin thermalcycler hasil optimasi yaitu pradenaturasi 95 °C
selama 5 menit dan siklus yang terdiri atas denaturasi 95 °C selama 10 detik,
penempelan primer pada suhu 60 °C selama 20 detik, dan ekstensi 72 °C selama
30 detik berlangsung selama 35 siklus, selanjutnya ekstensi akhir pada suhu 72 °C
selama 5 menit. Amplikon dielektroforesis dalam gel agarosa 1.5%.
Genotyping
Genotyping dilakukan dengan teknik RFLP dan elektroforesis produk
restriksi dalam agarose gel 2%. Sebanyak 5 μL amplikon ditambah 1.1 μL DW,
0.7 μL Buffer O, dan 0.2 μL PstI kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu
37 °C selama 16 jam (overnight). Produk restriksi dielektroforesis dalam gel
agarosa 2%. Gel dibuat dengan melarutkan 0.6 g serbuk agarosa dalam 30 mL
0.5×TBE, kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit suhu mediumhigh, lalu dikocok menggunakan magnetic stirrer dan ditambahkan 2.5 μL EtBr.
Larutan agarosa dituangkan ke dalam pencetak gel, kemudian sisir ditempatkan di
dekat tepian gel hingga gel mengeras dan membentuk sumur-sumur. Gel yang
sudah mengeras ditempatkan pada gel tray elektroforesis yang berisi larutan
Buffer 0.5×TBE. Sebanyak 5 μL produk restriksi ditambahkan 1 μL loading dye
dan dilakukan spin down, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel.
Selanjutnya DNA marker 100 pb ditaruh pada sumur paling kiri sebagai penanda.
Gel dialiri listrik pada tegangan 100 V selama 35-45 menit. Molekul DNA yang
bermuatan negatif (katode) pada pH netral akan bergerak ke arah positif (anode).
Panjang fragmen setelah selesai proses elektroforesis diamati di bawah sinar UV.
Panjang dan jumlah fragmen DNA yang muncul dibandingkan dengan DNA
marker untuk ditentukan genotipe fragmen gen CSN3. Genotyping dilakukan
berdasarkan penentuan alel menurut Prinzenberg et al. (2005). Alel F tidak
memiliki titik potong PstI dan hanya menunjukkan 1 fragmen yang memiliki
panjang sama dengan amplikon yaitu 407 pb. Alel M memiliki titik potong PstI
dan menunjukkan dua fragmen dengan panjang masing-masing 73 pb dan 334 pb.
Analisis Data
Frekuensi Alel dan Genotipe
Frekuensi alel dihitung menggunakan rumus menurut Nei dan Kumar
(2000) sebagai berikut:
∑
(
)
Frekuensi genotipe dihitung dengan rumus menurut Nei dan Kumar (2000)
sebagai berikut:
Keterangan:
xi
= frekuensi alel ke-i
xii = frekuensi genotipe ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe ii
nij = jumlah individu bergenotipe ij
N = jumlah total sampel
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen CSN3
Fragmen DNA target (DNA template) gen κ-kasein (CSN3) ekson 4
berhasil digandakan (diamplifikasi) pada suhu optimasi mesin thermalcycler dan
komposisi pereaksi.
Fragmen gen CSN3 ekson 4 berhasil diamplifikasi
menggunakan primer spesifik pada suhu optimasi annealing 60 °C selama 20
detik, dengan panjang amplikon yaitu 407 pb (Gambar 2). Sebanyak 115 sampel
darah kambing PE berhasil diamplifikasi pada gen CSN3 ekson 4 dengan tingkat
keberhasilan 100%. Suhu annealing hasil penelitian lebih tinggi dan lama proses
lebih cepat dari yang disarankan Chessa et al. (2003) pada suhu 59 °C selama 40
detik dan Zurriyati et al. (2011) pada suhu 55 °C selama 45 detik.
Gambar 2 Amplikon gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 1.5%
Keterangan: M = marker DNA 100 pb, 1-16 = sampel kambing PE Pelaihari
Suhu Tm (melting tempeature) adalah suhu penempelan primer yang
dihitung berdasarkan komposisi susunan basa nukleotida primer tersebut. Suhu
annealing hasil optimasi juga jauh lebih rendah dibandingkan dengan suhu Tm
primer forward (64 °C) maupun reverse (64 °C) (Lampiran 1). Hal ini disebabkan
perbedaan kondisi mesin thermalcycler dan komposisi pereaksi amplifikasi. PeltVerkuil et al. (2008) menyatakan bahwa lama waktu annealing bergantung pada
kapasitas pemanasan mesin thermalcycler, konsentrasi primer dan gen target,
serta volume pereaksi.
Genotyping Gen CSN3
Fragmen gen CSN3 ekson 4 tidak terpotong oleh enzim restriksi PstI pada
semua cDNA (cloned genomic DNA) darah individu kambing, sehingga hanya
diperoleh 1 macam genotipe yaitu FF dengan 1 fragmen pita dengan panjang 407
pb (Gambar 3). Hal ini menunjukkan adanya mutasi situs restriksi PstI pada gen
CSN3 pada semua cDNA darah individu kambing PE yang diamati, sehingga pada
sekuen gen bersifat monomorfik (seragam). Enzim PstI tidak mengenali situs
restriksi pada fragmen gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE Pelaihari.
6
Gambar 3 Genotipe gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 2%
Keterangan: M = marker DNA 100 pb, 1-16 = sampel darah kambing PE
Pelaihari
Penelitian Zurriyati et al. (2011) dengan teknik PCR-RFLP dengan primer
dan enzim restriksi yang sama memberikan hasil yang tidak berbeda, yaitu gen
CSN3 ekson 4 hanya memiliki 1 alel (monomorfik) dengan alel F. Single
nucleotide polymorphism (SNP) atau keragaman nukelotida tunggal digunakan
sebagai penciri genetik untuk program seleksi pada tingkat molekuler. Gen CSN3
yang monomorfik menunjukkan tidak ditemukannya titik SNP. Hasil sekuen pada
gen CSN3 ekson 4 kambing PE yang monomorfik pada penelitian Zurriyati et al.
(2011) menyatakan bahwa mutasi substitusi tipe transisi ditemukan pada situs
restriksi PstI. Mutasi (CT) menyebabkan perubahan asam amino dari Alanin
(Ala) menjadi Valin (Val) yang menentukan alel F. Kemungkinan pada sampel
darah kambing penelitian terjadi mutasi yang sama yaitu substitusi tipe transisi
pada gen CSN3 ekson 4.
Coll et al. (1993) melakukan sekuen nukleotida cDNA untuk gen CSN3
ekson 4 yang pertama kali dari kelenjar susu kambing periode laktasi.
Berdasarkan sekuen gen CSN3 yang diakses di GenBank dengan kode aksesi
X60763 tidak ditemukan situs restriksi PstI. Hal itu tejadi pada situs restriksi
PstI yaitu basa nukleotida ke 550 yang juga ditemukan pada kambing asal Italia
(teramana, girgentana, dan sarda) dan kambing asal Spanyol (wild goat) yang
seharusnya C berubah menjadi T (Yahyaoui et al. 2003). Hal yang tidak berbeda
juga ditemukan pada kambing PE, saanen, dan PESA yang dilaporkan oleh
Zurriyati et al. (2011). Sementara itu, pada kambing asal Kamerun (Red Sokoto),
Kenya (Small-East Africa), dan Somalia (Long-Eared Somali) basa nukleotida
pada posisi 550 adalah basa C, dikenali sebagai sekuen yang memiliki situs
restriksi enzim PstI (CTGCA|G) yang menentukan alel M (Prinzenberg et al.
2005; Kiplagat et al. 2010).
Mutasi non-synonymous adalah mutasi titik basa nukleotida yang
menyebabkan perubahan asam amino. Alel M (yang mengalami mutasi)
dibedakan dari alel F (wild type) berdasarkan 2 titik mutasi non-synonymous yang
menyebabkan perubahan asam amino (Prinzenberg et al. 2005). Mutasi tersebut
(alel M) terjadi pada posisi nukleotida 384 (GA) yang merubah asam amino
Aspartat (Asp) menjadi Asparagin (Asn), serta pada posisi nukleotida 550 (TC)
7
menyebabkan perubahan asam amino Valin (Val) menjadi Alanin (Ala). Hasil
sekuensing menunjukkan bahwa mutasi terjadi pada basa nukleotida posisi 550
(TC). Hasil sekuensing tersebut dikonfirmasi kembali dengan teknik PCRRFLP dengan menggunakan enzim restriksi PstI. Genotyping memperlihatkan
bahwa PstI mengenali fragmen situs restriksi (CTGCA|G) pada gen CSN3
(Prinzenberg et al. 2005).
Berdasarkan urutan sekuen enzim PstI (CTGCA|G), lokasi mutasi terdapat
pada basa nukleotida di posisi 4 (CT) (Zurriyati et al. 2011) atau posisi
nukleotida 550 dari cDNA (GenBank kode aksesi X60763). Hal ini menunjukkan
pada semua kambing PE Pelaihari kemungkinan terjadi mutasi fragmen gen CSN3
di situs restriksi enzim PstI di posisi 4 (CT), sehingga situs restriksi menjadi
tidak dikenali enzim restriksi (CTGTA|G). Mutasi yang terjadi pada situs restriksi
juga memungkinkan terjadinya perubahan asam amino. Gambar 4 menunjukkan
lokasi mutasi sekuen fragmen gen CSN3 ekson 4 pada berbagai kambing di
berbagai wilayah.
X60763a
AY090466(WG)b
AY428577(RS-CN)c
LES-Sd
PE-Be
550
....|....|
TGAACACTGT
------------------C
---------C
----------
560
....|....|
AGATAATCCA
-------------------------------------
570
....|....|
GAAGCTTCCT
-------------------------------------
580
....|....|
CAGAATCGAT
-------------------------------------
590
....|....|
TGCGAGTGCA
-------------------------------------
Keterangan:
a
Capra hircus Spanyol (Coll et al. 1993); b Capra pyrenaica sp. hispanica (wild
goat) Spanyol (Yahyaoui et al. 2003); c kambing Red Sokoto Kamerun/Nigeria
(Prinzenberg et al. 2005); d kambing Long Eared Somali Somalia (Kiplagat et al.
2010); e kambing Peranakan Etawah Bogor (Zurriyati et al. 2011); ----- basa
nukleotida yang sama dengan GenBank kode aksesi X60763; ____ situs restriksi
PstI (CTGCA|G)
Gambar 4
Lokasi mutasi situs restriksi PstI dan perbandingan sekuen fragmen
gen CSN3 ekson 4 pada kambing di berbagai wilayah
Frekuensi Alel Gen CSN3 dan Pendugaan Kandungan Kasein Susu Kambing
PE Penelitian Berdasarkan Asosiasi antara Gen CSN3 dengan Kandungan
Kasein Susu pada Penelitian Lain
Gen CSN3 ekson 4 kambing PE Pelaihari bersifat monomorfik karena hanya
ditemukan 1 macam alel yaitu alel F pada semua individu. Gen tersebut telah
terfiksasi pada alel F karena telah terjadi seleksi alam. Yahyaoui et al. (2001)
melaporkan bahwa alel F pada gen CSN3 merupakan tipe liar (wild type) yang
ditemukan pada kambing liar di Spanyol dengan frekuensi yang tinggi.
Keragaman genetik adalah terdapatnya lebih dari 1 macam genotipe dalam
populasi. Nei dan Kumar (2000) menjelaskan bahwa sumber keragaman genetik
disebabkan pengulangan urutan sekuen, insersi, delesi, dan rekombinasi di dalam
runutan DNA antar individu, kelompok atau suatu populasi.
Hasil penelitian bersesuaian dengan Zurriyati et al. (2011). Alel F juga
ditemukan terfiksasi pada kelompok kambing PE yang dipelihara di BPTU KDI-
8
HPT Pelaihari Kalimantan Selatan dan Cariu Bogor Jawa Barat. Hal yang sama
juga ditemukan pada hasil silangan kambing PE dengan kambing saanen (PESA)
serta pada kambing saanen. Sementara itu alel M tidak ditemukan pada kambing
PE, PESA, maupun saanen. Tabel 1 menyajikan frekuensi alel gen CSN3 ekson 4
pada kambing PE penelitian, kambing PE, PESA, dan saanen di berbagai wilayah
dengan sebaran geografis yang lain.
Tabel 1 Frekuensi alel gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE dan beberapa bangsa
kambing di berbagai wilayah
Kambing
PE-Pa
PE-Bb
PESAc
Saanend
Keterangan:
Frekuensi Alel
F
M
1.00 (115)
0.00 (0)
1.00 (48)
0.00 (0)
1.00 (51)
0.00 (0)
1.00 (51)
0.00 (0)
Sumber
Hasil penelitian
Zurriyati et al. (2011)
a
kambing PE BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan; b kambing PE Ciapus
dan Cariu Bogor; c kambing persilangan PE dan saanen asal Cijeruk, Cariu, dan
Balitnak Ciawi Bogor; d kambing saanen Cijeruk dan Cariu Bogor
Gen CSN3 terfiksasi pada alel F di kambing PE Pelaihari. Sementara itu alel
M tidak ditemukan pada semua kambing PE Pelaihari. Chiatti et al. (2005)
menyatakan bahwa alel F pada gen CSN3 termasuk dalam kelompok alel yang
memiliki kandungan protein (3.04%) dengan kasein (2.19%) susu yang lebih
rendah dibandingkan dengan alel M yang termasuk dalam kelompok alel dengan
kandungan protein (3.18%) dengan kasein (2.29%) susu yang lebih tinggi pada
kambing Camosciata, Frisa, Orobica, dan Verzasca di Italia.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE Pelaihari diperoleh hanya 1 macam
genotipe dan alel yaitu genotipe FF dan alel F (100%). Gen CSN3|PstI ekson 4
bersifat monomorfik (seragam).
Saran
Perlu dilakukan penelitian menggunakan pendekatan penciri genetik yang
lebih beragam seperti PCR-SSCP atau sekuensing untuk mengetahui runutan basa
sekuen. Penelitian juga perlu dilakukan pada fragmen lain untuk melihat
keragaman gen CSN3 kambing lokal. Selain itu, analisis keragaman perlu
dilakukan pada populasi kambing PE dan kambing jenis lain dengan sebaran
geografis yang lebih luas untuk menentukan alel gen CSN3 pada ternak kambing
di Indonesia.
9
DAFTAR PUSTAKA
Atabany A. 2013. Panduan Sukses Beternak Kambing Peranakan Etawah.
Bogor (ID): IPB Pr.
Angiolillo A, Yahyaoui MH, Sanchez A, Pilla F, Folch JM. 2002. Short
communication: characterization of a new genetic variant in the Caprine κcasein gene. J Dairy Sci. 85:2679-2680.
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 2010. Ilmu Pangan. Purnomo
H, Adiono, penerjemah. Jakarta (ID): UI Pr. Terjemahan dari: Food
Science.
Chessa S, Budelli E, Gutscher K, Caroli A, Erhardt G. 2003. Short
communication: simultaneous identification of five κ-casein (CSN3) alleles
in domestic goat by polymerase chain reaction-single strand conformation
polymorphism. J Dairy Sci. 86:3726-3729.
Chiatti F, Caroli A, Chessa S, Bolla P, Pagnacco G. 2005. Relationship between
goat κ-casein (CSN3) polymorphism and milk composition. Proc The Role
of Biotechnology; 5-7 Maret 2005; Turin, Italy. Turin (IT): Villa Gualino.
hlm 163-164.
Coll A, Folch JM, Sanchez A. 1993. Nucleotide sequence of the goat kappacasein cDNA. J Anim Sci. 71:2833
[Ditjennak] Direktorat Jenderal Peternakan. 2013. Statistik Peternakan dan
Kesehatan Hewan 2013. Jakarta (ID): Direktorat Jenderal Peternakan RI.
Finesco GM. 2013. Harga susu tinggi, kambing Etawa kian diminati. Mulyadi A,
editor. Kompas.com [Internet]. [diunduh 2013 Agustus 31]. Tersedia pada
http://regional.kompas.com/read/2013/04/28/21122982/Harga.Susu.Tinggi.
Kambing.Etawa.Kian.Diminati.
Jann OC, Prinzenberg EM, Luikart G, Caroli A, Erhardt G. 2004. High
polymorphism in the Kappa-casein (CSN3) gene from wild and domestic
caprine species revealed by DNA sequencing. J Dairy Res. 71:188-195.
Kiplagat SK, Agaba M, Kosgey IS, Okeyo M, Indetie D, Hanotte O, Limo MK.
2010. Genetic polymorphism of kappa-casein gene in indigeneous Eastern
Africa goat populations. Int J Gene Mol Biol. 2(1):001-005.
Kucerova J, Matejicek A, Jandurova OM, Sorensen P, Nemcova E, Stipkova M,
Kott T, Bouska J, Frelich J. 2006. Milk protein genes CSN1S1, CSN2,
CSN3, LGB and their relation to genetic values of milk production
parameters in Czech Fleckvieh. Czech J Anim Sci. 51(6):241-247.
Menteri Pertanian RI. 2013. Keputusan Menteri Pertanian Nomor 695/ Kpts/
410/ 2/ 2013 tentang Penetapan Rumpun Kambing Peranakan Etawah.
Jakarta (ID): Menteri Pertanian RI.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York
(US): Oxford University Pr.
Pelt-Verkuil van E, Belkum van A, Hays JP. 2008. Principles and Technical
Aspects of PCR Amplification. Netherlands (NL): Springer.
Prizenberg EM, Gutscher K, Chessa S, Caroli A, Erhardt G. 2005. Caprine κcasein (CSN3) polymorphism: New developments in molecular knowledge.
J Dairy Sci. 88:1490-1498.
10
Sambrook J, Fritsch EF, Medrano JF. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. 2nd ed. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr.
Sumantri C, Anggraeni A, Maheswari RRA, Diwyanto K, Farajallah A,
Brahmantiyo B. 2004. Frekuensi gen kappa kasein (κ-kasein) pada sapi
perah FH berdasarkan produksi susu di BPTU Baturraden. Pros. Seminar
Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner; 4-7 Agustus 2004; Bogor,
Indonesia. Bogor (ID): Puslitbang Peternakan. hlm 175-182.
Threadgill DW, Womack JE. 1990. Genomic analysis of the major bovine milk
protein genes. Nucleic Acids Research. 18(23):6935-6942.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnosis PCR Handbook.
Netherlands (NL): Springer.
Yahyaoui MH, Coll A, Sanchez A, Folch JM. 2001. Genetic polymorphism of
the caprine kappa casein gene. J Dairy Res. 68:209-216.
Yahyaoui MH, Angiolillo A, Pilla F, Sanchez A, Folch JM.
2003.
Characterization and genotyping of the caprine kappa casein variants. J
Dairy Sci. 86:2715-2720.
Zurriyati Y, Noor RR, Maheswari RRA. 2011. Analisis molekuler genotipe
kappa kasein (κ-kasein) dan komposisi susu kambing Peranakan Etawah,
Saanen dan persilangannya. JITV. 16(1):61-70.
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Melting temperature (Tm) primer forward (F) dan reverse (R) gen
CSN3 ekson 4
Melting temperature dihitung menggunakan rumus berikut (Viljoen et al. 2005):
Keterangan: G = jumlah basa G (guanina) pada sekuen primer
C = jumlah basa C (sitosina) pada sekuen primer
A = jumlah basa A (adenina) pada sekuen primer
T = jumlah basa T (timina) pada sekuen primer
Sekuen primer: Forward (F) 5’-GGTATCCTAGTTATGGACTCAAT-3’
Reverse (R) 5’-GTTGAAGTAACTTGGGCTGTGT-3’
Tm F = 4 ( 5 + 4 ) + 2 ( 6 + 8 )
= 64 °C
Tm R = 4 ( 8 + 2 ) + 2 ( 4 + 8 )
= 64 °C
Lampiran 2 Sekuen mRNA gen CSN3 yang diakses di GenBank kode aksesi
X60763
GenBank:
X60763.1
LOCUS
X60763.1 826 bp mRNA linear MAM 27-FEB-1994
DEFINITION C.hircus mRNA for kappa casein.
ACCESSION
X60763
VERSION
X60763.1 GI:977
KEYWORDS casein; kappa-casein.
SOURCE
Capra hircus (goat)
ORGANISM Capra hircus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia;
Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1
AUTHORS
Coll,A., Folch,J.M. and Sanchez,A.
TITLE
Nucleotide sequence of the goat kappa-casein cDNA
JOURNAL
J. Anim. Sci. 71 (10), 2833 (1993)
PUBMED
8226388
REFERENCE 2 (bases 1 to 826)
AUTHORS
Coll,A.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (02-JUL-1991) A. Coll, Universitat Autonoma de
Barcelona,
12
Unitat de Genetica I Millora, Facultat de Veterinaria, 08193
Bellaterra (Barcelona), SPAIN
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..826
/organism="Capra hircus"
/mol_type="mRNA"
/strain="ssp. aegagrus"
/db_xref="taxon:9925"
/clone="pKCnc1"
/tissue_type="mammary gland"
/clone_lib="pTZ 18 U"
/dev_stage="adult"
mRNA
632
/experiment="experimental evidence, no additional details
recorded"
/note="kappa casein"
CDS
54..632
/codon_start=1
/product="kappa casein"
/protein_id="CAA43174.1"
/db_xref="GI:978"
/db_xref="GOA:P02670"
/db_xref="InterPro:IPR000117"
/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P02670"
/translation="MMKSFFLVVTILALTLPFLGAQEQNQEQPICCEKDERFFDDKI
AKYIPIQYVLSRYPSYGLNYYQQRPVALINNQFLPYPYYAKPVAVRSPAQ
TLQWQVLPNTVPAKSCQDQPTTLARHPHPHLSFMAIPPKKDQDKTEVPAI
NTIASAEPTVHSTPTTEAIVNTVDNPEASSESIASASETNTAQVTSTEV"
sig_peptide
54..116
mat_peptide 117..629
/product="kappa casein"
polyA_signal 820..825
ORIGIN
1 ggccaactga atctactgcc aagcaagagc tgacggtcac aaggaaaggt gcaatgatga
61 agagtttttt cctagttgtg actatcctgg cattaaccct gccatttttg ggtgcccagg
121 agcaaaacca ggaacagccg atatgctgtg agaaagatga aagattcttc gatgacaaaa
181 tagccaaata tatcccaatt cagtatgtgc tgagtaggta tcctagttat ggactcaatt
241 actatcaaca gagaccagtt gcactaatta ataatcaatt tctgccatac ccatattatg
301 caaagccagt tgcagttagg tcacctgccc aaactcttca atggcaagtt ttgccaaata
361 ctgtgcctgc caagtcctgc caagaccagc caactaccct ggcacgtcac ccacacccac
421 atttatcatt tatggccatt ccaccaaaga aagatcagga taaaacagaa gtccctgcca
481 tcaataccat tgctagtgct gagcctacag tacacagtac acctaccacc gaagcaatag
13
541 tgaacactgt agataatcca gaagcttcct cagaatcgat tgcgagtgca tctgagacca
601 acacagccca agttacttca accgaggtct aaaaactcta aggagacatc aaagaggaca
661 acgcaggtct agctgaaacc aaatgactac ttcaaacttt cctttggcca gttgtctgcc
721 ttcagtgaac agagaatatg attttcacag atccagctcc tttctcatct cctcttacat
781 tttacattta tgccgcattt agttttttga ttcctgcata ataaag
//
Lampiran 3 Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel F yang diakses di GenBank kode
aksesi AY090466
GenBank:
AY090466.1
LOCUS
AY090466 494 bp DNA linear MAM 14-AUG-2003
DEFINITION Capra hircus kappa casein gene, allele F, partial cds.
ACCESSION
AY090466
VERSION
AY090466.1 GI:20159722
KEYWORDS .
SOURCE
Capra hircus (goat)
ORGANISM Capra hircus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia;
Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1 (bases 1 to 494)
AUTHORS
Yahyaoui,M.H., Angiolillo,A., Pilla,F., Sanchez,A. and
Folch,J.M.
TITLE
Characterization and genotyping of the caprine kappa-casein
variants
JOURNAL
J. Dairy Sci. 86 (8), 2715-2720 (2003)
PUBMED
12939096
REFERENCE 2 (bases 1 to 494)
AUTHORS
Yahyaoui,M.H., Sanchez,A. and Folch,J.M.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (18-MAR-2002) Ciencia Animal i dels Aliments,
Facultat de Veterinaria, Universitat Autonoma de Barcelona,
Campus UAB,
Bellaterra, Barcelona 08193, Spain
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..494
/organism="Capra hircus"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:9925"
gene
494
/gene="kappa casein"
/allele="F"
14
mRNA
exon
CDS
494
/gene="kappa casein"
/allele="F"
/product="kappa casein"
1..>494
/gene="kappa casein"
/allele="F"
527
16
CDS
/gene="CSN3"
/allele="M"
/number=4
PERANAKAN ETAWAH DI BPTU KDI-HPT
PELAIHARI KALIMANTAN SELATAN
FREDY FENDER
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Gen CSN3
Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari
Kalimantan Selatan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Fredy Fender
NIM D14100011
ABSTRAK
FREDY FENDER. Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan
Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan. Dibimbing oleh RINI
HERLINA MULYONO dan JAKARIA.
Kambing PE sebagai sumber daya genetik ternak lokal Indonesia memiliki
keunggulan, salah satunya produksi susu yang tinggi. Gen CSN3 merupakan
anggota dari fragmen kasein yang berkaitan dengan protein dan kasein susu.
Tujuan penelitian ini mengidentifikasi keragaman gen CSN3 ekson 4 pada
kambing PE di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan, menggunakan
metode PCR-RFLP. Keragaman gen CSN3 dideteksi dari 115 sampel darah
kambing PE menggunakan enzim restriksi PstI yang memotong fragmen
CTGCA|G. Amplifikasi gen CSN3 menghasilkan 1 fragmen dengan panjang 407
pb yang terletak pada ekson 4 dengan suhu annealing 60 °C selama 20 detik.
Hasil analisis PCR-RFLP menunjukkan gen CSN3 kambing PE yang dianalisis
memiliki alel monomorfik F adalah 100%.
Kata kunci: gen CSN3, kambing PE, PCR-RFLP
ABSTRACT
FREDY FENDER. Polymorphism of Exon 4 CSN3 of Etawah Grade Goats in
BPTU KDI-HPT Pelaihari South Kalimantan. Supervised by RINI HERLINA
MULYONO and JAKARIA.
Etawah grade goat as one of Indonesian local animal genetic resources has
advantages, one of which is its high milk yield. CSN3 gene is a member of casein
fragment related to protein and casein contents. The aim of this study was to
identify polymorphisms of CSN3 in Etawah grade goat from BPTU KDI-HPT
Pelaihari, South Kalimantan using the PCR-RFLP method. Polymorphisms of
CSN3 gene were identified of 115 blood samples using PstI restriction enzyme
that cuts the fragment of CTGCA|G. CSN3 amplification resulted 407 bp which is
located at exon 4 was performed with annealing temperature 60 °C for 20
seconds. The results of PCR-RFLP analysis indicated that the analyzed CSN3
gene of Etawah grade goat which have monomorphic F allele was 100%.
Key words: CSN3 gene, Etawah grade goats, PCR-RFLP
KERAGAMAN GEN CSN3 EKSON 4 PADA KAMBING
PERANAKAN ETAWAH DI BPTU KDI-HPT
PELAIHARI KALIMANTAN SELATAN
FREDY FENDER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
8
9
Judul Skripsi : Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan Etawah
di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan
Nama
: Fredy Fender
NIM
: D14100011
Disetujui oleh
Ir Rini Herlina Mulyono, MSi
Pembimbing I
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
10
PRAKATA
Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala
penguasa dan sumber segala ilmu, karena berkat segala karunia-Nya skripsi ini
berhasil diselesaikan. Sholawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada
Nabi Muhammad sollallahu ’alaihi wasallam, keluarganya, sahabatnya, serta
umatnya yang beriman hingga akhir zaman. Tema yang dipilih dalam penelitian
yang dilaksanakan pada Desember 2013 sampai April 2014 adalah kambing lokal
Indonesia dengan judul Keragaman Gen CSN3 Ekson 4 pada Kambing Peranakan
Etawah di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan.
Perbaikan mutu genetik kambing PE masih dilakukan secara konvensional.
Selain itu, upaya dalam memperbaiki mutu genetik kambing PE perlu didukung
data yang lebih akurat, yaitu dilakukan seleksi dengan identifikasi keragaman
pada tingkat DNA termasuk gen CSN3 yang berperan pada kualitas susu. Hasil
penelitian ini diharapkan memberikan informasi khususnya kepada breeder
kambing perah dan peternak ternak perah secara umum sehingga dapat ditentukan
gen yang menjadi marker assisted selection dalam program pemuliaan.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi RI atas bantuan
Beasiswa Bidikmisi selama masa perkuliahan S1. Terima kasih kepada Ir Rini
Herlina Mulyono, MSi yang mendanai penelitian sekaligus sebagai pembimbing
skripsi bersama Dr Jakaria, SPt MSi. Terima kasih kepada Dr Ir Afton Atabany,
MSi selaku penguji skripsi atas masukan dan sarannya. Penghargaan Penulis
sampaikan kepada Fuad Hasan, SPt MSi dan Pipih S Effendi, SPt yang membantu
pengumpulan bahan penelitian di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan.
Ungkapan terima kasih Penulis sampaikan kepada Ayahanda Edi
Kusmayadi, Ibunda Nurlela, kakak Retno Valentino, dan adik Edo Fernando,
beserta seluruh keluarga besar atas do’a dan kasih sayangnya. Terima kasih
kepada M Jafar Sidiq dan Angga BP Suparman sebagai tim penelitian genetika
molekuler kambing PE, atas kerja sama, kekompakkan, dan bantuan selama
penelitian. Terima kasih kepada Laras Shafa Fauziah, Novita S Thamren,
Leonardus KD Bidara, Hafidz I Albana, dan M Faisal Nurhuda yang mendukung
Penulis dalam penulisan skripsi. Tak lupa terima kasih kepada Eryk Andreas, SPt
MSi; Annisa O Rini, SPt MSi; Isyana Khaerunnisa, SPt; Ahmad Furqon, SPt;
Komang Alit Paramitasari, SPt MSi; Shelvi, SSi; dan teman-teman ABGSCi
(Animal Breeding and Genetic Student Community) atas banyak masukan dan
arahannya. Terima kasih kepada teman-teman D’Ransum Percussion atas
semangat dan dukungannya. Terima kasih juga kepada keluarga besar IPTP
angkatan 47 atas semua dukungannya. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat
bagi semua pihak yang membutuhkan.
Bogor, Oktober 2014
Fredy Fender
11
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitan
1
Ruang Lingkup Penelitian
2
METODE
2
Lokasi dan Waktu Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur
3
Ekstraksi DNA Total
3
Amplifikasi
3
Genotyping
4
Analisis Data
4
Frekuensi Alel dan Genotipe
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Amplifikasi Gen CSN3
5
Genotyping Gen CSN3
5
Frekuensi Alel Gen CSN3 dan Pendugaan Kandungan Kasein Susu
Kambing PE Penelitian Berdasarkan Asosiasi antara Gen CSN3 dengan
7
Kandungan Kasein Susu Kambing pada Penelitian Lain
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
16
12
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Posisi penempelan primer dan situs restriksi PstI pada fragmen gen
CSN3 ekson 4
Amplikon gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 1.5%
Genotipe gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 2%
Lokasi mutasi situs restriksi PstI dan perbandingan sekuen fragmen gen
CSN3 ekson 4 pada kambing di berbagai wilayah
3
5
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Melting temperature (Tm) primer forward (F) dan reverse (R) gen CSN3
ekson 4
Sekuen mRNA gen CSN3 yang diakses di GenBank kode aksesi X60763
Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel F yang diakses di GenBank kode aksesi
AY090466
Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel M yang diakses di GenBank kode aksesi
AY428577
11
11
13
15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kambing Peranakan Etawah (PE) berpotensi sebagai salah satu sumber daya
genetik ternak yang dapat dikembangkan lebih luas untuk memenuhi kebutuhan
masyarakat. Kambing PE merupakan galur hasil persilangan antara kambing
Etawah dan kambing Kacang dengan kadar genetik lebih tinggi pada kambing
Etawah karena telah melalui program up grading (kawin tatar). Kambing PE
memiliki kemampuan adaptasi yang cukup tinggi dan memiliki fungsi sebagai
penghasil daging dan susu (dwiguna) (Atabany 2013).
Populasi kambing di Indonesia pada tahun 2012 mencapai 17.91 juta ekor
yang sebagian besar menyebar di Jawa Tengah, Jawa Timur, dan Jawa Barat
(Ditjennak 2013). Finesco (2013) menyatakan bahwa lima juta ekor dari populasi
kambing di Indonesia adalah kambing PE. Produksi susu kambing PE mampu
mencapai 3 L ekor-1 hari-1 (Menteri Pertanian RI 2013). Kualitas susu kambing
PE belum banyak diperhatikan, seperti kandungan kasein dalam protein susu.
Kasein dalam protein susu berperan memperbaiki struktur yogurt (Buckle et al.
2010), selain itu dapat diolah menjadi keju lunak atau keju keras (Atabany 2013).
Struktur dan stabilitas misel kasein protein susu dikontrol oleh gen κ-kasein
(CSN3) yang terletak pada kromosom nomor 6q31 dengan panjang 13 kb dan
terdiri atas 5 ekson dan 4 intron (Threadgill dan Womack 1990). Keragaman gen
CSN3 berpengaruh pada kandungan protein dan lemak susu pada sapi Czech
Fleckvieh (Kucerova et al. 2006) dan kandungan protein susu pada sapi FH
(Sumantri et al. 2004). Chiatti et al. (2005) melaporkan keragaman gen CSN3
pada kambing berhubungan dengan protein dan kasein susu. Hingga saat ini
sudah ditemukan 20 macam alel gen CSN3 pada kambing (Coll et al. 1993;
Yahyaoui et al. 2001; Angiolillo et al. 2002; Yahyaoui et al. 2003; Chessa et al.
2003; Jann et al. 2004; Prinzenberg et al. 2005; Kiplagat et al. 2010). Keragaman
gen CSN3 pada kambing PE diharapkan dapat digunakan dalam program seleksi
untuk meningkatkan produksi kasein susu.
Perkembangan bioteknologi bidang genetika molekuler memungkinkan
penggunaan penanda molekuler untuk mengukur status keragaman genetik
melalui pemanfaatan marker assisted selection (MAS). Keragaman gen CSN3
diharapkan dapat dijadikan MAS dalam program seleksi kambing PE. Teknik
polymorphism chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) merupakan salah satu metode yang mudah dilakukan untuk mendeteksi
keragaman genetik yang berhubungan dengan sifat-sifat pertumbuhan. Penelitian
mengenai keragaman gen CSN3 kambing sudah banyak dilakukan, tetapi pada
kambing PE di Balai Pembibitan Ternak Unggul Kambing Domba Itik Hijauan
Pakan Ternak (BPTU KDI-HPT) Pelaihari Kalimantan Selatan belum dilakukan.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini mengidentifikasi keragaman gen CSN3 ekson 4 pada
kambing PE di BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan, menggunakan
metode PCR-RFLP.
2
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi analisis pada 115 sampel darah kambing PE (8 ekor
jantan dan 107 ekor betina) yang terdapat di BPTU KDI-HPT Pelaihari
Kalimanatan Selatan. Keragaman gen CSN3 ekson 4 dianalisis menggunakan
metode PCR-RFLP dengan enzim restriksi PstI (CTGCA|G).
METODE
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetika, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari
Desember 2013 sampai April 2014.
Bahan
Sampel darah yang digunakan berasal dari 115 ekor darah kambing PE (8
ekor jantan dan 107 ekor betina) yang berasal dari BPTU KDI-HPT Pelaihari,
Kalimantan Selatan yang telah diawetkan dalam EtOH 70% dengan perbandingan
1:1 atau dalam serbuk EDTA. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi
DNA diantaranya sampel darah, NaCl 0.2% (untuk sampel darah yang diawetkan
dalam EDTA), DW (untuk sampel darah yang diawetkan dalam EtOH 70%), SDS
(sodium dodecylsulphate) 10%, proteinase-K (5 mg mL-1), 1×STE (sodium trisEDTA), phenol solution, CIAA (chloroform isoamylalcohol), NaCl 5M, dan TE
(tris-EDTA) 80%. Bahan-bahan yang digunakan untuk prosedur amplifikasi
(PCR), elektroforesis, dan analisis RFLP diantaranya isolat DNA, DreamTaq
Buffer, MgCl2, dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate), pasangan primer
forward dan primer reverese, DreamTaq polymerase (fermentas), produk PCR
(amplikon), serbuk agarosa, 0.5×TBE (tris borat-EDTA), EtBr (etidium bromida),
loading dye (0.01% xylene cyanol, 0.01% bromthymol blue, dan 50% gliserol),
DNA marker dengan jarak 100 pb (pasang basa), enzim restriksi PstI
(CTGCA|G), dan Buffer O.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi DNA, amplifikasi, dan analisis
RFLP terdiri atas tabung eppendorf 1.5 mL, satu set mikro pipet, tip pipet,
microsentifuge berpendingin, inkubator, vortex, nutating mixer, refrigerator,
mesin PCR Eppendorf, tabung 0.2 mL (PCR), dan tabung 0.5 mL (RFLP). Alat
yang digunakan dalam prosedur elektroforesis yaitu timbangan analitik, gelas
ukur, microwave, magnetic stirrer, satu set tray pencetak gel, power supply
electrophoresis 100 V, dan UV transilluminator.
3
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989).
Darah dalam EtOH diambil sebanyak 200 μL, lalu ditambahkan 1 000 μL DW
dalam tabung eppendorf 1.5 mL, kemudian divortex dan didiamkan selama 5
menit. Darah dalam EDTA diambil sebanyak 50 μL, lalu ditambahkan 1 000 μL
NaCl 0.2%, kemudian divortex dan didiamkan selama 5 menit. Sampel
disentrifius pada kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit dan supernatan yang
terbentuk dibuang. Endapan ditambahkan 40 μL SDS 10%, 10 μL proteinase-K
(5 mg mL-1), dan 1×STE sampai 400 μL, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C
selama 2 jam sambil digoyang secara perlahan menggunakan nutating mixer.
Degradasi bahan organik dilakukan dengan menambahkan 400 μL phenol
solution, 400 μL CIAA, dan 40 μl NaCl 5M, kemudian digoyang selama 1 jam
pada suhu ruang.
Molekul DNA dipisahkan dari fenol dengan cara disentrifius pada kecepatan
12 000 rpm selama 5 menit sehingga terbentuk fase DNA (bening). Fase DNA
sebanyak 400 μL dipindahkan ke tabung baru ditambahkan 800 μL EtOH
abssolute 70% dan 40 μL NaCl 5M, kemudian freezing (overnight). Molekul
DNA disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan
EtOH absolute. Supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan didiamkan hingga
kering untuk disuspensikan dalam 100 μL TE 80%. Sampel DNA disimpan
dalam refrigerator. Sampel DNA dielektoforesis dalam gel agarosa 1% untuk
memastikan keberhasilan ekstraksi.
Amplifikasi
Fragmen DNA diamplifikasi dengan teknik PCR. Sampel DNA hasil
ekstraksi sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam tabung 0.2 mL, lalu ditambahkan
14 μL larutan premix. Premix tersusun atas 10.8 μL DW, 1.5 μL 10×DreamTaq
Buffer, 1 μL MgCl2, 0.2 μL dNTPs, 0.2 μL primer forward dan 0.2 μL primer
reverse, serta 0.2 μL DreamTaq polymerase (fermentas). Premix dihomogenkan
dengan vortex lalu spin down agar premix berada di dasar tabung. Campuran
premix dan sampel DNA diinkubasi dalam thermalcycler untuk diamplifikasi.
Posisi penempelan primer menurut Prinzenberg et al. (2005) dapat dilihat pada
Gambar 1 (GenBank dengan kode aksesi AY428577).
Keterangan:
primer forward;
primer reverse;
situs restriksi PstI
Gambar 1 Posisi penempelan primer dan situs restriksi PstI pada fragmen gen
CSN3 ekson 4
4
Kondisi mesin thermalcycler hasil optimasi yaitu pradenaturasi 95 °C
selama 5 menit dan siklus yang terdiri atas denaturasi 95 °C selama 10 detik,
penempelan primer pada suhu 60 °C selama 20 detik, dan ekstensi 72 °C selama
30 detik berlangsung selama 35 siklus, selanjutnya ekstensi akhir pada suhu 72 °C
selama 5 menit. Amplikon dielektroforesis dalam gel agarosa 1.5%.
Genotyping
Genotyping dilakukan dengan teknik RFLP dan elektroforesis produk
restriksi dalam agarose gel 2%. Sebanyak 5 μL amplikon ditambah 1.1 μL DW,
0.7 μL Buffer O, dan 0.2 μL PstI kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu
37 °C selama 16 jam (overnight). Produk restriksi dielektroforesis dalam gel
agarosa 2%. Gel dibuat dengan melarutkan 0.6 g serbuk agarosa dalam 30 mL
0.5×TBE, kemudian dipanaskan dalam microwave selama 5 menit suhu mediumhigh, lalu dikocok menggunakan magnetic stirrer dan ditambahkan 2.5 μL EtBr.
Larutan agarosa dituangkan ke dalam pencetak gel, kemudian sisir ditempatkan di
dekat tepian gel hingga gel mengeras dan membentuk sumur-sumur. Gel yang
sudah mengeras ditempatkan pada gel tray elektroforesis yang berisi larutan
Buffer 0.5×TBE. Sebanyak 5 μL produk restriksi ditambahkan 1 μL loading dye
dan dilakukan spin down, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel.
Selanjutnya DNA marker 100 pb ditaruh pada sumur paling kiri sebagai penanda.
Gel dialiri listrik pada tegangan 100 V selama 35-45 menit. Molekul DNA yang
bermuatan negatif (katode) pada pH netral akan bergerak ke arah positif (anode).
Panjang fragmen setelah selesai proses elektroforesis diamati di bawah sinar UV.
Panjang dan jumlah fragmen DNA yang muncul dibandingkan dengan DNA
marker untuk ditentukan genotipe fragmen gen CSN3. Genotyping dilakukan
berdasarkan penentuan alel menurut Prinzenberg et al. (2005). Alel F tidak
memiliki titik potong PstI dan hanya menunjukkan 1 fragmen yang memiliki
panjang sama dengan amplikon yaitu 407 pb. Alel M memiliki titik potong PstI
dan menunjukkan dua fragmen dengan panjang masing-masing 73 pb dan 334 pb.
Analisis Data
Frekuensi Alel dan Genotipe
Frekuensi alel dihitung menggunakan rumus menurut Nei dan Kumar
(2000) sebagai berikut:
∑
(
)
Frekuensi genotipe dihitung dengan rumus menurut Nei dan Kumar (2000)
sebagai berikut:
Keterangan:
xi
= frekuensi alel ke-i
xii = frekuensi genotipe ke-i
nii = jumlah individu bergenotipe ii
nij = jumlah individu bergenotipe ij
N = jumlah total sampel
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen CSN3
Fragmen DNA target (DNA template) gen κ-kasein (CSN3) ekson 4
berhasil digandakan (diamplifikasi) pada suhu optimasi mesin thermalcycler dan
komposisi pereaksi.
Fragmen gen CSN3 ekson 4 berhasil diamplifikasi
menggunakan primer spesifik pada suhu optimasi annealing 60 °C selama 20
detik, dengan panjang amplikon yaitu 407 pb (Gambar 2). Sebanyak 115 sampel
darah kambing PE berhasil diamplifikasi pada gen CSN3 ekson 4 dengan tingkat
keberhasilan 100%. Suhu annealing hasil penelitian lebih tinggi dan lama proses
lebih cepat dari yang disarankan Chessa et al. (2003) pada suhu 59 °C selama 40
detik dan Zurriyati et al. (2011) pada suhu 55 °C selama 45 detik.
Gambar 2 Amplikon gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 1.5%
Keterangan: M = marker DNA 100 pb, 1-16 = sampel kambing PE Pelaihari
Suhu Tm (melting tempeature) adalah suhu penempelan primer yang
dihitung berdasarkan komposisi susunan basa nukleotida primer tersebut. Suhu
annealing hasil optimasi juga jauh lebih rendah dibandingkan dengan suhu Tm
primer forward (64 °C) maupun reverse (64 °C) (Lampiran 1). Hal ini disebabkan
perbedaan kondisi mesin thermalcycler dan komposisi pereaksi amplifikasi. PeltVerkuil et al. (2008) menyatakan bahwa lama waktu annealing bergantung pada
kapasitas pemanasan mesin thermalcycler, konsentrasi primer dan gen target,
serta volume pereaksi.
Genotyping Gen CSN3
Fragmen gen CSN3 ekson 4 tidak terpotong oleh enzim restriksi PstI pada
semua cDNA (cloned genomic DNA) darah individu kambing, sehingga hanya
diperoleh 1 macam genotipe yaitu FF dengan 1 fragmen pita dengan panjang 407
pb (Gambar 3). Hal ini menunjukkan adanya mutasi situs restriksi PstI pada gen
CSN3 pada semua cDNA darah individu kambing PE yang diamati, sehingga pada
sekuen gen bersifat monomorfik (seragam). Enzim PstI tidak mengenali situs
restriksi pada fragmen gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE Pelaihari.
6
Gambar 3 Genotipe gen CSN3 ekson 4 pada gel agarosa 2%
Keterangan: M = marker DNA 100 pb, 1-16 = sampel darah kambing PE
Pelaihari
Penelitian Zurriyati et al. (2011) dengan teknik PCR-RFLP dengan primer
dan enzim restriksi yang sama memberikan hasil yang tidak berbeda, yaitu gen
CSN3 ekson 4 hanya memiliki 1 alel (monomorfik) dengan alel F. Single
nucleotide polymorphism (SNP) atau keragaman nukelotida tunggal digunakan
sebagai penciri genetik untuk program seleksi pada tingkat molekuler. Gen CSN3
yang monomorfik menunjukkan tidak ditemukannya titik SNP. Hasil sekuen pada
gen CSN3 ekson 4 kambing PE yang monomorfik pada penelitian Zurriyati et al.
(2011) menyatakan bahwa mutasi substitusi tipe transisi ditemukan pada situs
restriksi PstI. Mutasi (CT) menyebabkan perubahan asam amino dari Alanin
(Ala) menjadi Valin (Val) yang menentukan alel F. Kemungkinan pada sampel
darah kambing penelitian terjadi mutasi yang sama yaitu substitusi tipe transisi
pada gen CSN3 ekson 4.
Coll et al. (1993) melakukan sekuen nukleotida cDNA untuk gen CSN3
ekson 4 yang pertama kali dari kelenjar susu kambing periode laktasi.
Berdasarkan sekuen gen CSN3 yang diakses di GenBank dengan kode aksesi
X60763 tidak ditemukan situs restriksi PstI. Hal itu tejadi pada situs restriksi
PstI yaitu basa nukleotida ke 550 yang juga ditemukan pada kambing asal Italia
(teramana, girgentana, dan sarda) dan kambing asal Spanyol (wild goat) yang
seharusnya C berubah menjadi T (Yahyaoui et al. 2003). Hal yang tidak berbeda
juga ditemukan pada kambing PE, saanen, dan PESA yang dilaporkan oleh
Zurriyati et al. (2011). Sementara itu, pada kambing asal Kamerun (Red Sokoto),
Kenya (Small-East Africa), dan Somalia (Long-Eared Somali) basa nukleotida
pada posisi 550 adalah basa C, dikenali sebagai sekuen yang memiliki situs
restriksi enzim PstI (CTGCA|G) yang menentukan alel M (Prinzenberg et al.
2005; Kiplagat et al. 2010).
Mutasi non-synonymous adalah mutasi titik basa nukleotida yang
menyebabkan perubahan asam amino. Alel M (yang mengalami mutasi)
dibedakan dari alel F (wild type) berdasarkan 2 titik mutasi non-synonymous yang
menyebabkan perubahan asam amino (Prinzenberg et al. 2005). Mutasi tersebut
(alel M) terjadi pada posisi nukleotida 384 (GA) yang merubah asam amino
Aspartat (Asp) menjadi Asparagin (Asn), serta pada posisi nukleotida 550 (TC)
7
menyebabkan perubahan asam amino Valin (Val) menjadi Alanin (Ala). Hasil
sekuensing menunjukkan bahwa mutasi terjadi pada basa nukleotida posisi 550
(TC). Hasil sekuensing tersebut dikonfirmasi kembali dengan teknik PCRRFLP dengan menggunakan enzim restriksi PstI. Genotyping memperlihatkan
bahwa PstI mengenali fragmen situs restriksi (CTGCA|G) pada gen CSN3
(Prinzenberg et al. 2005).
Berdasarkan urutan sekuen enzim PstI (CTGCA|G), lokasi mutasi terdapat
pada basa nukleotida di posisi 4 (CT) (Zurriyati et al. 2011) atau posisi
nukleotida 550 dari cDNA (GenBank kode aksesi X60763). Hal ini menunjukkan
pada semua kambing PE Pelaihari kemungkinan terjadi mutasi fragmen gen CSN3
di situs restriksi enzim PstI di posisi 4 (CT), sehingga situs restriksi menjadi
tidak dikenali enzim restriksi (CTGTA|G). Mutasi yang terjadi pada situs restriksi
juga memungkinkan terjadinya perubahan asam amino. Gambar 4 menunjukkan
lokasi mutasi sekuen fragmen gen CSN3 ekson 4 pada berbagai kambing di
berbagai wilayah.
X60763a
AY090466(WG)b
AY428577(RS-CN)c
LES-Sd
PE-Be
550
....|....|
TGAACACTGT
------------------C
---------C
----------
560
....|....|
AGATAATCCA
-------------------------------------
570
....|....|
GAAGCTTCCT
-------------------------------------
580
....|....|
CAGAATCGAT
-------------------------------------
590
....|....|
TGCGAGTGCA
-------------------------------------
Keterangan:
a
Capra hircus Spanyol (Coll et al. 1993); b Capra pyrenaica sp. hispanica (wild
goat) Spanyol (Yahyaoui et al. 2003); c kambing Red Sokoto Kamerun/Nigeria
(Prinzenberg et al. 2005); d kambing Long Eared Somali Somalia (Kiplagat et al.
2010); e kambing Peranakan Etawah Bogor (Zurriyati et al. 2011); ----- basa
nukleotida yang sama dengan GenBank kode aksesi X60763; ____ situs restriksi
PstI (CTGCA|G)
Gambar 4
Lokasi mutasi situs restriksi PstI dan perbandingan sekuen fragmen
gen CSN3 ekson 4 pada kambing di berbagai wilayah
Frekuensi Alel Gen CSN3 dan Pendugaan Kandungan Kasein Susu Kambing
PE Penelitian Berdasarkan Asosiasi antara Gen CSN3 dengan Kandungan
Kasein Susu pada Penelitian Lain
Gen CSN3 ekson 4 kambing PE Pelaihari bersifat monomorfik karena hanya
ditemukan 1 macam alel yaitu alel F pada semua individu. Gen tersebut telah
terfiksasi pada alel F karena telah terjadi seleksi alam. Yahyaoui et al. (2001)
melaporkan bahwa alel F pada gen CSN3 merupakan tipe liar (wild type) yang
ditemukan pada kambing liar di Spanyol dengan frekuensi yang tinggi.
Keragaman genetik adalah terdapatnya lebih dari 1 macam genotipe dalam
populasi. Nei dan Kumar (2000) menjelaskan bahwa sumber keragaman genetik
disebabkan pengulangan urutan sekuen, insersi, delesi, dan rekombinasi di dalam
runutan DNA antar individu, kelompok atau suatu populasi.
Hasil penelitian bersesuaian dengan Zurriyati et al. (2011). Alel F juga
ditemukan terfiksasi pada kelompok kambing PE yang dipelihara di BPTU KDI-
8
HPT Pelaihari Kalimantan Selatan dan Cariu Bogor Jawa Barat. Hal yang sama
juga ditemukan pada hasil silangan kambing PE dengan kambing saanen (PESA)
serta pada kambing saanen. Sementara itu alel M tidak ditemukan pada kambing
PE, PESA, maupun saanen. Tabel 1 menyajikan frekuensi alel gen CSN3 ekson 4
pada kambing PE penelitian, kambing PE, PESA, dan saanen di berbagai wilayah
dengan sebaran geografis yang lain.
Tabel 1 Frekuensi alel gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE dan beberapa bangsa
kambing di berbagai wilayah
Kambing
PE-Pa
PE-Bb
PESAc
Saanend
Keterangan:
Frekuensi Alel
F
M
1.00 (115)
0.00 (0)
1.00 (48)
0.00 (0)
1.00 (51)
0.00 (0)
1.00 (51)
0.00 (0)
Sumber
Hasil penelitian
Zurriyati et al. (2011)
a
kambing PE BPTU KDI-HPT Pelaihari Kalimantan Selatan; b kambing PE Ciapus
dan Cariu Bogor; c kambing persilangan PE dan saanen asal Cijeruk, Cariu, dan
Balitnak Ciawi Bogor; d kambing saanen Cijeruk dan Cariu Bogor
Gen CSN3 terfiksasi pada alel F di kambing PE Pelaihari. Sementara itu alel
M tidak ditemukan pada semua kambing PE Pelaihari. Chiatti et al. (2005)
menyatakan bahwa alel F pada gen CSN3 termasuk dalam kelompok alel yang
memiliki kandungan protein (3.04%) dengan kasein (2.19%) susu yang lebih
rendah dibandingkan dengan alel M yang termasuk dalam kelompok alel dengan
kandungan protein (3.18%) dengan kasein (2.29%) susu yang lebih tinggi pada
kambing Camosciata, Frisa, Orobica, dan Verzasca di Italia.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen CSN3 ekson 4 pada kambing PE Pelaihari diperoleh hanya 1 macam
genotipe dan alel yaitu genotipe FF dan alel F (100%). Gen CSN3|PstI ekson 4
bersifat monomorfik (seragam).
Saran
Perlu dilakukan penelitian menggunakan pendekatan penciri genetik yang
lebih beragam seperti PCR-SSCP atau sekuensing untuk mengetahui runutan basa
sekuen. Penelitian juga perlu dilakukan pada fragmen lain untuk melihat
keragaman gen CSN3 kambing lokal. Selain itu, analisis keragaman perlu
dilakukan pada populasi kambing PE dan kambing jenis lain dengan sebaran
geografis yang lebih luas untuk menentukan alel gen CSN3 pada ternak kambing
di Indonesia.
9
DAFTAR PUSTAKA
Atabany A. 2013. Panduan Sukses Beternak Kambing Peranakan Etawah.
Bogor (ID): IPB Pr.
Angiolillo A, Yahyaoui MH, Sanchez A, Pilla F, Folch JM. 2002. Short
communication: characterization of a new genetic variant in the Caprine κcasein gene. J Dairy Sci. 85:2679-2680.
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 2010. Ilmu Pangan. Purnomo
H, Adiono, penerjemah. Jakarta (ID): UI Pr. Terjemahan dari: Food
Science.
Chessa S, Budelli E, Gutscher K, Caroli A, Erhardt G. 2003. Short
communication: simultaneous identification of five κ-casein (CSN3) alleles
in domestic goat by polymerase chain reaction-single strand conformation
polymorphism. J Dairy Sci. 86:3726-3729.
Chiatti F, Caroli A, Chessa S, Bolla P, Pagnacco G. 2005. Relationship between
goat κ-casein (CSN3) polymorphism and milk composition. Proc The Role
of Biotechnology; 5-7 Maret 2005; Turin, Italy. Turin (IT): Villa Gualino.
hlm 163-164.
Coll A, Folch JM, Sanchez A. 1993. Nucleotide sequence of the goat kappacasein cDNA. J Anim Sci. 71:2833
[Ditjennak] Direktorat Jenderal Peternakan. 2013. Statistik Peternakan dan
Kesehatan Hewan 2013. Jakarta (ID): Direktorat Jenderal Peternakan RI.
Finesco GM. 2013. Harga susu tinggi, kambing Etawa kian diminati. Mulyadi A,
editor. Kompas.com [Internet]. [diunduh 2013 Agustus 31]. Tersedia pada
http://regional.kompas.com/read/2013/04/28/21122982/Harga.Susu.Tinggi.
Kambing.Etawa.Kian.Diminati.
Jann OC, Prinzenberg EM, Luikart G, Caroli A, Erhardt G. 2004. High
polymorphism in the Kappa-casein (CSN3) gene from wild and domestic
caprine species revealed by DNA sequencing. J Dairy Res. 71:188-195.
Kiplagat SK, Agaba M, Kosgey IS, Okeyo M, Indetie D, Hanotte O, Limo MK.
2010. Genetic polymorphism of kappa-casein gene in indigeneous Eastern
Africa goat populations. Int J Gene Mol Biol. 2(1):001-005.
Kucerova J, Matejicek A, Jandurova OM, Sorensen P, Nemcova E, Stipkova M,
Kott T, Bouska J, Frelich J. 2006. Milk protein genes CSN1S1, CSN2,
CSN3, LGB and their relation to genetic values of milk production
parameters in Czech Fleckvieh. Czech J Anim Sci. 51(6):241-247.
Menteri Pertanian RI. 2013. Keputusan Menteri Pertanian Nomor 695/ Kpts/
410/ 2/ 2013 tentang Penetapan Rumpun Kambing Peranakan Etawah.
Jakarta (ID): Menteri Pertanian RI.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York
(US): Oxford University Pr.
Pelt-Verkuil van E, Belkum van A, Hays JP. 2008. Principles and Technical
Aspects of PCR Amplification. Netherlands (NL): Springer.
Prizenberg EM, Gutscher K, Chessa S, Caroli A, Erhardt G. 2005. Caprine κcasein (CSN3) polymorphism: New developments in molecular knowledge.
J Dairy Sci. 88:1490-1498.
10
Sambrook J, Fritsch EF, Medrano JF. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. 2nd ed. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr.
Sumantri C, Anggraeni A, Maheswari RRA, Diwyanto K, Farajallah A,
Brahmantiyo B. 2004. Frekuensi gen kappa kasein (κ-kasein) pada sapi
perah FH berdasarkan produksi susu di BPTU Baturraden. Pros. Seminar
Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner; 4-7 Agustus 2004; Bogor,
Indonesia. Bogor (ID): Puslitbang Peternakan. hlm 175-182.
Threadgill DW, Womack JE. 1990. Genomic analysis of the major bovine milk
protein genes. Nucleic Acids Research. 18(23):6935-6942.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnosis PCR Handbook.
Netherlands (NL): Springer.
Yahyaoui MH, Coll A, Sanchez A, Folch JM. 2001. Genetic polymorphism of
the caprine kappa casein gene. J Dairy Res. 68:209-216.
Yahyaoui MH, Angiolillo A, Pilla F, Sanchez A, Folch JM.
2003.
Characterization and genotyping of the caprine kappa casein variants. J
Dairy Sci. 86:2715-2720.
Zurriyati Y, Noor RR, Maheswari RRA. 2011. Analisis molekuler genotipe
kappa kasein (κ-kasein) dan komposisi susu kambing Peranakan Etawah,
Saanen dan persilangannya. JITV. 16(1):61-70.
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Melting temperature (Tm) primer forward (F) dan reverse (R) gen
CSN3 ekson 4
Melting temperature dihitung menggunakan rumus berikut (Viljoen et al. 2005):
Keterangan: G = jumlah basa G (guanina) pada sekuen primer
C = jumlah basa C (sitosina) pada sekuen primer
A = jumlah basa A (adenina) pada sekuen primer
T = jumlah basa T (timina) pada sekuen primer
Sekuen primer: Forward (F) 5’-GGTATCCTAGTTATGGACTCAAT-3’
Reverse (R) 5’-GTTGAAGTAACTTGGGCTGTGT-3’
Tm F = 4 ( 5 + 4 ) + 2 ( 6 + 8 )
= 64 °C
Tm R = 4 ( 8 + 2 ) + 2 ( 4 + 8 )
= 64 °C
Lampiran 2 Sekuen mRNA gen CSN3 yang diakses di GenBank kode aksesi
X60763
GenBank:
X60763.1
LOCUS
X60763.1 826 bp mRNA linear MAM 27-FEB-1994
DEFINITION C.hircus mRNA for kappa casein.
ACCESSION
X60763
VERSION
X60763.1 GI:977
KEYWORDS casein; kappa-casein.
SOURCE
Capra hircus (goat)
ORGANISM Capra hircus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia;
Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1
AUTHORS
Coll,A., Folch,J.M. and Sanchez,A.
TITLE
Nucleotide sequence of the goat kappa-casein cDNA
JOURNAL
J. Anim. Sci. 71 (10), 2833 (1993)
PUBMED
8226388
REFERENCE 2 (bases 1 to 826)
AUTHORS
Coll,A.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (02-JUL-1991) A. Coll, Universitat Autonoma de
Barcelona,
12
Unitat de Genetica I Millora, Facultat de Veterinaria, 08193
Bellaterra (Barcelona), SPAIN
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..826
/organism="Capra hircus"
/mol_type="mRNA"
/strain="ssp. aegagrus"
/db_xref="taxon:9925"
/clone="pKCnc1"
/tissue_type="mammary gland"
/clone_lib="pTZ 18 U"
/dev_stage="adult"
mRNA
632
/experiment="experimental evidence, no additional details
recorded"
/note="kappa casein"
CDS
54..632
/codon_start=1
/product="kappa casein"
/protein_id="CAA43174.1"
/db_xref="GI:978"
/db_xref="GOA:P02670"
/db_xref="InterPro:IPR000117"
/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P02670"
/translation="MMKSFFLVVTILALTLPFLGAQEQNQEQPICCEKDERFFDDKI
AKYIPIQYVLSRYPSYGLNYYQQRPVALINNQFLPYPYYAKPVAVRSPAQ
TLQWQVLPNTVPAKSCQDQPTTLARHPHPHLSFMAIPPKKDQDKTEVPAI
NTIASAEPTVHSTPTTEAIVNTVDNPEASSESIASASETNTAQVTSTEV"
sig_peptide
54..116
mat_peptide 117..629
/product="kappa casein"
polyA_signal 820..825
ORIGIN
1 ggccaactga atctactgcc aagcaagagc tgacggtcac aaggaaaggt gcaatgatga
61 agagtttttt cctagttgtg actatcctgg cattaaccct gccatttttg ggtgcccagg
121 agcaaaacca ggaacagccg atatgctgtg agaaagatga aagattcttc gatgacaaaa
181 tagccaaata tatcccaatt cagtatgtgc tgagtaggta tcctagttat ggactcaatt
241 actatcaaca gagaccagtt gcactaatta ataatcaatt tctgccatac ccatattatg
301 caaagccagt tgcagttagg tcacctgccc aaactcttca atggcaagtt ttgccaaata
361 ctgtgcctgc caagtcctgc caagaccagc caactaccct ggcacgtcac ccacacccac
421 atttatcatt tatggccatt ccaccaaaga aagatcagga taaaacagaa gtccctgcca
481 tcaataccat tgctagtgct gagcctacag tacacagtac acctaccacc gaagcaatag
13
541 tgaacactgt agataatcca gaagcttcct cagaatcgat tgcgagtgca tctgagacca
601 acacagccca agttacttca accgaggtct aaaaactcta aggagacatc aaagaggaca
661 acgcaggtct agctgaaacc aaatgactac ttcaaacttt cctttggcca gttgtctgcc
721 ttcagtgaac agagaatatg attttcacag atccagctcc tttctcatct cctcttacat
781 tttacattta tgccgcattt agttttttga ttcctgcata ataaag
//
Lampiran 3 Sekuen gen CSN3 ekson 4 alel F yang diakses di GenBank kode
aksesi AY090466
GenBank:
AY090466.1
LOCUS
AY090466 494 bp DNA linear MAM 14-AUG-2003
DEFINITION Capra hircus kappa casein gene, allele F, partial cds.
ACCESSION
AY090466
VERSION
AY090466.1 GI:20159722
KEYWORDS .
SOURCE
Capra hircus (goat)
ORGANISM Capra hircus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia;
Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra.
REFERENCE 1 (bases 1 to 494)
AUTHORS
Yahyaoui,M.H., Angiolillo,A., Pilla,F., Sanchez,A. and
Folch,J.M.
TITLE
Characterization and genotyping of the caprine kappa-casein
variants
JOURNAL
J. Dairy Sci. 86 (8), 2715-2720 (2003)
PUBMED
12939096
REFERENCE 2 (bases 1 to 494)
AUTHORS
Yahyaoui,M.H., Sanchez,A. and Folch,J.M.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (18-MAR-2002) Ciencia Animal i dels Aliments,
Facultat de Veterinaria, Universitat Autonoma de Barcelona,
Campus UAB,
Bellaterra, Barcelona 08193, Spain
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..494
/organism="Capra hircus"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:9925"
gene
494
/gene="kappa casein"
/allele="F"
14
mRNA
exon
CDS
494
/gene="kappa casein"
/allele="F"
/product="kappa casein"
1..>494
/gene="kappa casein"
/allele="F"
527
16
CDS
/gene="CSN3"
/allele="M"
/number=4