Streptomyces Spp Penghasil Microbial Transglutaminase Dan Pengklonan Dna Penyandinya Melalui Konstruksi Pustaka Genom

PENAPISAN Streptomyces spp PENGHASIL MICROBIAL
TRANSGLUTAMINASE DAN PENGKLONAN DNA PENYANDINYA
MELALUI KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM

SEPRIANTO

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Penapisan Streptomyces
spp Penghasil Microbial Transglutaminase dan Pengklonan DNA Penyandinya
Melalui Konstruksi Pustaka Genom” adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2016
Seprianto
NIM P051130121

RINGKASAN
SEPRIANTO.
Penapisan
Streptomyces
spp
Penghasil
Microbial
Transglutaminase dan Pengklonan DNA Penyandinya melalui Konstruksi
Pustaka Genom. Dibimbing oleh SUHARSONO dan DEWI SESWITA ZILDA.
Enzim transglutaminase (TGase, E.C. 2.3.2.13) merupakan enzim yang
mengkatalisis reaksi perpindahan gugus asil antara residu glutamin (Gln) yang
berfungsi sebagai donor asil dan residu lisin (Lys) sebagai aseptor yang
membentuk ikatan silang (crosslinking) ε-( -glutamyl) lisin isopeptida yang
menghasilkan ikatan kovalen inter atau intramolekuler yang berikatan silang
dengan protein makanan. Produksi enzim Microbial Transglutaminase (MTGase)

dari strain liar mempunyai beberapa kelemahan yaitu selain pertumbuhan selnya
lambat, produk yang dihasilkan sedikit dan protein yang dihasilkan juga
bercampur dengan protein lainnya. Selain itu proses pemurnian cukup sulit karena
memerlukan beberapa tahap pemurnian. Pendekatan teknologi rekayasa genetika
sangat diperlukan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik sehingga dapat
dikembangkan dalam skala industri.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri yang menghasilkan
MTGase dan mengklon fragmen DNA penyandinya. Untuk itu, penelitian ini
dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu, penapisan bakteri Streptomyces spp
penghasil MTGase, identifikasi isolat penghasil MTGase dan pembuatan pustaka
genom dengan mengkloning fragmen DNA 40 kb yang mengandung gen
penyandi MTGase.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa penapisan terhadap bakteri
Streptomyces spp penghasil MTGase yang diisolasi dari berbagai jenis tanah di
Indonesia, mendapatkan satu isolat yang potensial yaitu TTA 02 SDS 14. Analisis
molekuler dengan PCR membuktikan bahwa isolat tersebut mengandung gen
MTGase. Sekuen parsial gen MTGase dari isolat tersebut memiliki homologi 93
% dengan MTGase dari Streptomyces cinnamoneus. Berdasarkan sekuen gen 16S
rRNA, isolat TTA 02 SDS 14 memiliki kekerabatan terdekat dengan
Streptomyces thioleteus dengan homologi 99%. Pustaka genom dengan sisipan

fragmen ~40 Kb yang membawa gen MTGase telah berhasil dikonstruksi dengan
menggunakan fosmid pCC1FOSTM di dalam E.coli EPI300-TIR.
Kata kunci: MTGase gene, Streptomyces spp, Pustaka Genom

SUMMARY
SEPRIANTO. Screening of Streptomyces spp Producing Microbial
Transglutaminase and Cloning of Its Transglutaminase Gene Through Genomic
Library Construction. Supervised by SUHARSONO and DEWI SESWITA
ZILDA.
Transglutaminase (TGase, E.C. 2.3.2.13) is an enzyme that catalyzes acyl
group exchange between the -carboxyamide groups of peptide-bond glutamine
residues (Gln) act as the acyl donors and the ε -amino groups of lysine residues
(Lys) serve as acyl acceptors that crooslinking ε-( -glutamyl) lysine bonds are
formed, resulting covalent bond intermolecular or intramolecular wiht food
protein. Production of Microbial Transglutaminase (MTGase) based on wild
bacterial strains have several drawbacks such as slow cell growing, low yield and
a large amount of non-target proteins interfered with target proteins, and the
difficulty to purify native proteins that requires multiple purification steps. DNA
recombinant technology is an emerging and well established approach to provide
bacterial proteins in sustainable way at the industrial scale.

This research aimed to obtain bacterial isolates which capable MTGase
production and to clone ~40 kb DNA fragment containing MTGase gene.
Therefore, it was conducted several stages that screening of Streptomyces spp
MTGase production, Indentification of MTGase producing isolate and
construction fosmid-based of a genomic library from the isolate and cloning of a
~40 kb fosmid harboring a MTGase gene.
These result showed that screening of MTGase producing Streptomyces
spp isolated from Indonesian soils was obtained one potential isolate, designated
as TTA 02 SDS 14. The partial MTGase-encoding gene was amplified by PCR
and sequenced. The sequence result indicate its similarity of 93 % with that of
Streptomyces cinnamoneus. Based on 16S rRNA gene sequencing of isolate TTA
02 SDS 14 was identified as neighbor of Streptomyces thioleteus with the
similarity at 99%. Fosmid-based construction of a genomic library from the
isolate and subsequent screening led to the isolation of a ~40 kb fosmid
harboring a MTGase gene was successfully to constructed with used fosmid
library pCC1FOSTM into E.coli EPI300-TIR
Keywords: MTGase gene, Streptomyces spp, Genomic library.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENAPISAN Streptomyces spp PENGHASIL MICROBIAL
TRANSGLUTAMINASE DAN PENGKLONAN DNA PENYANDINYA
MELALUI KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM

SEPRIANTO

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi M.Si

Judul Tesis : Penapisan Streptomyces spp Penghasil Microbial Transglutaminase
dan Pengklonan DNA Penyandinya Melalui Konstruksi Pustaka
Genom
Nama
: Seprianto
NIM
: P0530121

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua

Dr. Dewi Seswita Zilda M.Si
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc Agr

Tanggal Ujian:

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis sampaikan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang
dilaksanakan sejak Agustus β014 dengan judul “Penapisan Streptomyces spp
Penghasil Microbial Transglutaminase dan Pengklonan DNA Penyandinya
Melalui Konstruksi Pustaka Genom”. Tesis ini merupakan hasil penelitian yang
dilakukan di Laboratorium Bioteknologi, Pusat Penelitian dan Pengembangan
Daya Saing Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, P3DSBKP-KKP,
Jakarta.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
dan Ibu Dr. Dewi Seswita Zilda M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan
bimbingan dan arahan selama penelitian hingga penyusunan tesis ini. Kepada
Bapak Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku penguji luar komisi yang telah
banyak memberikan masukan dalam sidang tesis serta Ibu Dr. Utut Widiastuti
M.Si atas saran untuk perbiakan dalam kesempurnaan tesis ini. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. rer. nat Agustinus Robert Uria M.Sc
selaku pembimbing lapangan yang telah banyak memberikan ilmu serta
bimbingan selama penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Pusat Penelitian dan Pengembangan Daya Saing Produk dan
Bioteknologi Kelautan Perikanan (P3DSPBKP) yang telah mendanai dan
memfasilitasi penelitian ini dan DIKTI atas Beasiswa BPPDN (Beasiswa

Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri) selama menempuh pendidikan di
pascasarjana IPB
Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Ekowati
Chasanah M.Sc dan Ibu Ir. Yusro Nuri Fawzya M.Si yang telah banyak
memberikan bimbingan dan arahan selama penelitian. Kepada seluruh staf dan
peneliti laboratorium Bioteknologi, laboratorium Kimia, laboratorium
Mikrobiologi, teman-teman mahasiswa seperjuangan di laboratorium
Bioteknologi (P3DSPBKP) dari berbagai universitas, serta rekan–rekan
Pascasarjana Bioteknologi 2013-2014 IPB. Penulis mengucapkan terima kasih
atas segala bantuan dan kerjasamanya dalam menyelesaikan penelitian ini. Karya
kecil ini penulis persembahan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala
doa dan kasih sayangnya sehingga penulis dapat menyelesaikan destinasi ini
dengan baik.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2016
Seprianto

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Enzim Microbial Transglutaminase
Karakteristik Streptomyces sp
Teknologi Rekombinan DNA
Pustaka Genom

3
3
5
5
6

3 METODE
Kerangka Penelitian
Waktu dan Tempat
Bahan
Prosedur Penelitian

8
8
9
9
10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Penapisan Streptomyces spp Penghasil MTGase
Identifikasi Isolat TTA 02 SDS 14 Berdasarkan Sekuen 16S rRNA
Konstruksi Pustaka Genom Menggunakan Plasmid
Konstruksi Pustaka 40 kb Menggunakan Fosmid
Penapisan Klon Rekombinan
Analisis Fosmid pCC1FOSTM Rekombinan
Analisis Sekuensing

14
14
16
18
20
21
23
24

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran

26
26
26

DAFTAR PUSTAKA

27

LAMPIRAN

31

RIWAYAT HIDUP

45

DAFTAR TABEL
1
2

Beberapa primer yang digunakan dalam penelitian ini
Uji aktivitas enzim transglutaminase dari isolat terpilih

10
14

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Mekanisme reaksi enzim TGase
Struktur kristal 3 dimensi MTGase
Diagram alur penelitian
Peta CopyControl fosmid pCC1FOSTM vektor
Peta plasmid pJET1.2/blunt dan pGEMT-Easy
Hasil amplifikasi gen parsial MTGase isolat terpilih
Pensejajaran sekuen asam amino MTGase isolat TTA 02 SDS 14 dengan
MTGase dari kelompok bakteri lain
Hasil Amplifikasi gen 16S rRNA isolat TTA 02 SDS 14
Konstruksi pohon filogenetik isolat TTA 02 SDS 14 dengan beberapa
bakteri lain sebagai outgroup
Konstruksi pustaka genom dengan plasmid pJET1.2/blunt
Konstruksi pustaka genom dengan DNA sisipan pada fosmid pCC1FOSTM
Hasil seleksi fragmen ~40 kb
Hasil transformasi E. coli EPI300-T1 dengan hasil ligasi antara
fragmen ~40 kb dan pCC1FOSTM
Penapisan pustaka genom per pool 96-well microplate dengan
primer SDS 14F/14R
Hasil penapisan klon yang mengandung gen MTGase pada pool F
dan pool H
Hasil pemotongan fosmid pCC1FOSTM rekombinan
Analisis sekuen gen parsial MTGase pada vektor pGEMT-MTG1

3
4
8
9
10
15
16
16
18
19
20
21
22
23
23
24
26

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5.
6.
7.
8.

Uji Aktivitas ekstrak kasar MTGase dari Streptomyces spp
Kurva Standar L-asam glutamat -monohidroxamat
Sekuen nukleotida gen parsial MTGase isolat TTA 02 SDS 14
Analisis kesejajaran BLAST gen parsial MTGase isolat TTA 02 SDS 14
Sekuens nukleotida gen 16S rRNA isolat TTA 02 SDS 14
Analisis kesejajaran BLAST gen parsial 16S rRNA isolat TTA 02 SDS 14
Kromatogram pengurutan gen parsial MTGase di pGEMT-MTG1
Analisis kesejajaran BLAST gen parsial MTGase dari pGEMT-MTG1

31
39
40
40
41
42
43
44

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Peran mikroorganisme dalam menghasilkan berbagai enzim yang
bermanfaat dalam kehidupan manusia telah dikenal cukup luas dan
pengembangannya terus berlangsung sampai saat ini. Penggalian potensi
mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim yang bermanfaat dalam
kehidupan manusia (enzyme bioprospecting) merupakan salah satu kegiatan yang
penting dalam penelitian dibidang mikrobiologi dan enzimologi (Oetomo 2012).
Salah satunya adalah bioprospecting terhadap mikroorganisme penghasil enzim
transglutaminase terutama untuk produk pangan. MTGase telah banyak digunakan
untuk meningkatkan kualitas tekstur beberapa makanan, seperti kamaboko, ham,
sosis, tahu, dan mie (Motoki dan Seguro 1998).
Enzim transglutaminase (TGase, E.C. 2.3.2.13) merupakan enzim yang
mengkatalisis reaksi perpindahan gugus asil antara residu glutamin (Gln) yang
berfungsi sebagai donor asil dan residu lisin (Lys) sebagai aseptor yang
membentuk ikatan silang (crosslinking) ε-( -glutamyl) lisin isopeptida yang
menghasilkan ikatan kovalen inter atau intramolekuler yang berikatan silang
dengan protein makanan (Griffin et al. 2002). TGase tersebar luas di alam dan
telah dipelajari secara ekstensif pada hewan. Aktivitas TGase pada hewan
tergantung Ca+2 dan terlibat dalam berbagai fungsi biologis mulai dari pembekuan
darah hingga diferensiasi sel (Aeshclimann et al. 1994). TGase dari mikroba
dikenal dengan nama MTGase.. Sumbernya yang langka dan rumit dalam proses
pemisahan serta pemurniannya menjadikan enzim ini sangat mahal dengan harga
sekitar US$ 80/unit (Zhu et al. 1995). Salah satu kelebihan MTGase dibandingkan
dengan enzim transglutaminase yang berasal dari hewan adalah aktivitas enzim
MTGase tidak bergantung pada ion Ca+2 dan biaya produksi lebih rendah karena
kemudahan dalam produksi dan purifikasinya (Langston et al. 2006).
Aktivitas MTGase banyak dihasilkan oleh genus Streptoverticillium spp
(Wu et al. 1996), serta beberapa spesies bakteri seperti Candida albicans (Ruis et
al. 1995), Bacillus subtilis (Kobayashi et al. 1998) Streptomyces platensis dan
Streptomyces lividans. (Lin et al. 2006). Beberapa penelitian lain melaporkan
Streptomyces yang menghasilkan MTGase dengan aktivitas yang tinggi seperti
Streptoverticillium mobaraense (Kikuchi et al. 2003), Streptomyces cinnamoneum
(Duran et al. 1998), Streptomyces ladakanum (Ashie dan Lanier 2000),
Streptomyces fradiae (Liu et al. 2007), Streptomyces hygroscopicus (Cui et al.
2007). Meskipun beberapa genus Pseudomonas juga dilaporkan menghasilkan
MTGase (Bech et al. 2002), namun sampai saat ini genus Streptomyces masih
merupakan yang dominan.
Produksi enzim MTGase dari strain liar mempunyai beberapa kelemahan
yaitu selain produk yang dihasilkan sedikit, protein yang dihasilkan juga
bercampur dengan protein non-target dalam jumlah yang banyak sehingga ada
kontaminasi produk. Selain itu proses pemurnian cukup sulit dilakukan karena
memerlukan beberapa tahap pemurnian (Soares et al. 2003). Untuk mengatasi
masalah ini, sentuhan teknologi rekayasa molekular yaitu dengan melakukan

2
kloning dan ekspresi gen penyandi MTGase sangat diperlukan. Pendekatan
rekayasa genetika memberikan kelebihan pada produksi skala industri yaitu
diantaranya dapat dilakukan overekspresi dengan menginduksi dengan induser,
menambahkan fusi protein untuk proses pemurnian dan dapat menghindari bakteri
patogen sebagai sumber enzim dengan mengkloning gen penyandi protein target
ke dalam sel inang. Lin et al. (2004, 2006) telah berhasil melakukan kloning dan
mengekspresikan gen MTGase yang berasal dari Streptomyces platensis dan
Streptoverticillium ladakanum ke dalam sel inang Streptomyces lividans
menggunakan vektor pIJ702 dengan promoter melC dengan berat molekul 38
kDa. Akan tetapi hasil yang dilaporkan oleh Lin et al. (2006) menunjukkan bahwa
ekspresi gen MTGase diregulasi oleh promoter indigenus dari gen MTGase
Streptomyces lividans serta berhasil memproduksi enzim MTGase rekombinan
dalam skala pabrik percontohan (pilot plant) dan proses pemurnian yang
dilakukan secara efisien.
Meskipun enzim ini telah diproduksi secara komersial, namun penelitian
yang berkaitan dengan penapisan mikroba penghasil MTGase, medium produksi
dan aplikasi MTGase masih banyak dilakukan guna mendapatkan keunggulan
tertentu. Medium produksi enzim MTGase umumnya mengandung ekstrak
khamir, pepton, dan sodium kaseinat sebagai nutrisi bagi mikroorganisme
penghasil. Modifikasi telah banyak dilakukan untuk mendapatkan komponen
media yang murah serta aktivitas enzim yang baik seperti pemanfaatan hidrolisat
sorgum jerami (Tellez-Luiz et al. 2004), limbah cair tahu dan hidrolisat tepung
tapioka (Fawzya et al. 2011) namun belum memberikan hasil yang maksimal.
Untuk itu pendekatan teknik molekular dengan metode PCR merupakan suatu
alternatif penapisan mikroba penghasil MTGase dengan mencari gen penyandi
enzim MTGase dari bakteri tanah khususnya dari spesies Streptomyces spp yang
kemudian dikloning dan diekspresikan ke dalam Escherichia coli sehingga
menghasilkan MTGase rekombinan yang dapat diproduksi dalam skala industri.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mendapatkan Streptomyces spp yang
menghasilkan enzim Microbial Transglutaminase (MTGase) dan mengklon
fragmen DNA yang mengandung gen penyandi MTGase melalui pendekatan
konstruksi pustaka genom.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kemudahan dalam penapisan
isolat bakteri penghasil MTGase serta merupakan tahapan awal dalam produksi
enzim transglutaminase rekombinan sehingga memudahkan dalam proses
purifikasi dan meningkatkan hasil produksi.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Enzim Microbial Transglutaminase (MTGase)
Transglutaminase (TGase) merupakan enzim yang termasuk ke dalam
kelompok transferase, memiliki peran yang sangat penting dalam pembentukan
gel dan elastisitas produk berbahan dasar daging lumat surimi. Enzim ini
mengkatalis polimerisasi dan membentuk ikatan silang (crosslinking) ε-(
glutamyl) lisin antara residu glutamin (Gln) dan lisin (Lys) pada protein bahan
pangan (Motoki dan Seguro 1998). Mekanisme kerja enzim transglutaminase
adalah mengkatalisis reaksi pengikatan asam amino-asam amino yang
ditambahkan pada molekul protein. Hal ini ditunjukkan oleh terikatnya metionin
pada berbagai protein pangan. Kandungan metionin pada kasein, protein-protein
kedelai dan gluten meningkat setelah dilakukan pengikatan silang menggunakan
TGase (Nielsen et al. 1995). Salah satu sumber penghasil enzim TGase adalah
mikroorganisme, sehingga enzim yang dihasilkan biasanya disebut dengan
Microbial Transglutaminase (MTGase). Pada umumnya MTGase berasal dari
kelompok Actinomycetes seperti dari genus Streptoverticillium dan Streptomyces
(Fawzya et al. 2011).
Enzim TGase mempunyai nama sistematika yaitu amin- glutamiltransferase yang termasuk dalam kelas enzim transferase (E.C.2),
asiltransferase (E.C.2.3), aminoasiltransferase (E.C.2.3.2), protein glutamin- glutamiltransferase dan mempunyai nama alternatif yaitu fibrinoligase.
Mekanisme reaksi TGase diawali dengan amina nukleofil (X-NH2) menyerang C Gln yang terasilasi Cys diikuti proses transfer H+ dari S-C(O)’’NH2-X yang
diduga Asp sebagai asam atau basa. Oksianion yang dihasilkan mengalami
penataan ulang dan menyebabkan deasilasi dari residu Cys. Pelepasan produk
isopeptida atau Gln -teramidasi dan pembentukan kembali Cys thiolat disajikan
pada Gambar 1 (Motoki dan Seguro 1998).

Gambar 1 Mekanisme reaksi enzim TGase (Motoki dan Seguro 1998)
Struktur primer dari enzim MTGase pertama kali ditentukan oleh Kanaji et
al pada tahun 1993. Kashiwagi et al. (2002) melaporkan bahwa MTGase yang
berasal dari Streptoverticillium mobaraense memiliki struktur kristal yang
berinteraksi kuat secara intermolekul antar molekul tersier membentuk struktur
kuartener dengan sisi aktif pada residu Cys64, His274 dan Asp255 (Gambar 2).

4

A
B
Gambar 2 Struktur kristal 3 dimensi MTGase. (A) Struktur kuartener (B) sisi aktif
enzim MTGase (Kashiwagi et al. 2002)
Transglutaminase tersebar secara luas pada mikroorganisme eukariot dan
prokariot. Berdasarkan sumbernya, menurut Greenberg et al. (1991) enzim
transglutaminase dibagi kedalam dua golongan. Golongan pertama yaitu mamalia
transglutaminase (TGase), aktivitas enzim ini ditemukan tersebar secara luas
dalam plasma, jaringan dan cairan ekstraseluler. Enzim transglutaminase tersebut
digolongkan ke dalam 5 golongan, yaitu :
a) Faktor XIII (plasma dan plasenta) yang tersusun dari rantai a2 dan rantai
b2 (a2b2) berasosiasi secara kovalen. Berbeda dengan yang lain enzim ini
diaktifkan oleh trombin selama koagulasi darah dan memiliki berat
molekul 360 kDa.
b) Transglutaminase jaringan (TGc) ditemukan pada hati babi guinea,
makrofag tikus, dan sel endothelia manusia, enzim ini memiliki berat
molekul 77 kDa.
c) Transglutaminase keratinosit (TGk) ditemukan pada kulit, kuku dan
rambut, enzim ini mengandung ester atau tioester palmitat dan miristat
yang bertanggung jawab untuk melekatnya membran dan berat molekul
dari enzim ini 90 kDa
d) Transglutaminase epidermis yang struktur subunitnya bersifat monomer
dan memiliki aktivitas protease dengan berat molekul 80 kDa
e) Transglutaminase prostata yang struktur subunitnya bersifat homodimetrik
dengan berat molekul 150 kDa, namun enzim ini tidak memiliki aktivitas
protease.
Golongan yang kedua, yaitu Microbial Transglutaminase (MTGase),
menurut Haard dan Simpson (2000) enzim transglutaminase dari mikroba ada
dalam dua bentuk, yaitu transglutaminase intraseluler yang ditemukan pada
bakteri Bacillus subtilis dan pada sporula Physarum polycephalum, sedangkan
bentuk ekstraseluler ditemukan pada filtrat kultur Streptomyces cinnamoneum
(Duran et al. 1998), Streptomyces ladakanum (Ashie dan Lanier 2000),
Steptoverticillium ladakanum (Ho et al. 2000), Streptoverticillium mobaraense
(Kikuchi et al. 2003), Streptomyces fradiae (Liu et al. 2007), Streptomyces
hygroscopicus (Cui et al. 2007).

5
Karakteristik Streptomyces sp
Sekitar 90 % Actinomycetes yang disolasi dari tanah merupakan genus
dari Streptomyces. Bakteri ini merupakan kelompok bakteri gram positif, yang
secara taksonomi merupakan salah satu genus dari filum Actinobacteria, ordo
Actinomycetales, dan famili Streptomycetaceae. Streptomyces bersifat toleran
yang dapat hidup pada suhu 45 – 55 °C. Hampir semua Streptomyces bersifat
aerobik dan memiliki kemampuan untuk mendegradasi material yang sulit
diuraikan seperti lignin, kitin, pektin dan komplek aromatik (Paul dan Clark
1996). Streptomyces dapat memproduksi senyawa volatil yaitu geosmin yang
memiliki bau khas pada tanah. Bakteri ini juga memiliki kemampuan
menghasilkan senyawa–senyawa metabolit seperti enzim, inhibitor, biopigmen
dan imunomodifer (Hayawaka 2003)
Streptomyces memiliki ukuran dengan diameter antara 0.5 – 1.0 µm
dengan ciri-ciri ialah pleomorfisme sel-selnya dan kecendrungan membentuk
filamen (hifa) bercabang. Pada beberapa spesies, hifa-hifa itu bersatu membentuk
miselium. Streptomyces bersifat aerobik yaitu tumbuh pada kondisi lingkungan
yang banyak oksigen atau konsentrasi karbondioksida sedikit, serta mampu
tumbuh optimum pada temperatur 25 °C dan pH 6.5 - 8.5. Bakteri ini juga bersifat
kemoorganotrof dan mesofilik. Streptomyces kebanyakan hidup saprofit pada
tanah, dan juga ditemukan pada tumbuhan yang membusuk. Reproduksi bakteri
ini adalah dengan miselium aerial atau germinasi spora yang memiliki permukaan
halus sampai sedikit kasar (Madigan et al. 2012)
Streptomyces sp mempunyai ukuran genom 8 mb dengan kandungan basa
G+C yang cukup tinggi yaitu 73 % (Kieser et al. 1992). Bakteri ini telah banyak
dipelajari dan digunakan untuk industri terutama kerena kemampuannya
memproduksi sejumlah metabolit sekunder seperti antibiotik dan antikanker.
Teknologi DNA Rekombinan
Transformasi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel
hidup, salah satunya bakteri yang kemudian tumbuh dan membelah untuk
memperbanyak klon. Secara umum, terdapat dua tujuan dari transformasi DNA
rekombinan pada bakteri. Tujuan yang pertama adalah memproduksi DNA
rekombinan dalam jumlah yang besar dari material awal yang sedikit. Tujuan
kedua adalah agar jumlah produksi DNA rekombinan memenuhi untuk tahap
pemurnian. Pemurnian dari DNA rekombinan penting sekali dilakukan, karena
dalam hasil ligasi selain terdapat vektor plasmid dan DNA sisipan yang telah
terligasi terdapat pula molekul vektor tidak terligasi, molekul DNA tidak terligasi,
molekul vektor yang mengalami resirkularisasi tanpa DNA sisipan dan DNA
rekombinan yang membawa fragmen DNA yang salah (Brown 2006).
Tidak semua bakteri dapat dijadikan objek transformasi, hanya sel
kompeten saja yang dapat digunakan. Sel kompeten adalah bakteri yang telah
diberi perlakuan fisika atau kimia untuk meningkatkan kemampuannya agar dapat
menerima DNA rekombinan. Pembuatan sel kompeten dapat dilakukan dengan
metode penambahan CaCl2 atau dengan penambahan DMSO dengan metode TSS
(Chung et al. 1989). Sel kompeten harus dipanen pada fase-log dan disimpan pada

6
temperatur dingin (-80ºC). Penyimpanan pada suhu ruang akan menurunkan
kualitas sel kompeten (Moelhard 2007)
Salah satu vektor kloning yang sering digunakan dalam konstruksi pustaka
genom adalah pJET1.2/blunt. Vektor ini merupakan plasmid yang bersifat linear
yang dapat menerima sisipan dari 6 kb sampai 10 kb. Pada ujung 5’ vektor
mengandung gugus fosforil sehingga forforilasi primer tidak diperlukan. Ujung
γ’dA-overhangs dihasilkan dengan menggunakan Taq DNA polimerase dengan
menggunakan blunt repairing enzymes. Produk PCR blunt –end dihasilkan oleh
pembacaan DNA polimerase yang dapat langsung diligasikan ke dalam vektor
dalam waktu 5 menit. Vektor pJET1.2/blunt mengandung lethal gene (gen
mematikan) yang dapat membunuh host jika tersisipkan dalam host bakteri, tetapi
apabila vektor ini tersisipkan oleh fragment DNA (gen) maka lethal gen tersebut
menjadi tidak aktif sehingga dalam proses seleksi sel transforman yang
mengandung fragmen sisipan saja yang dapat hidup. (Thermoscientific, Cat.No.
#K1231)
CopyControlTM Fosmid Library pCC1FOSTM Vektor (Epicentre) merupakan
salah satu vektor yang digunakan untuk pustaka genom. Vektor ini memiliki
ukuran 8.1 kb yang bersifat linear yang dapat menerima sisipan 40 kb fragmen
DNA. pCC1FOSTM membawa gen resisten kloramfenikol sebagai seleksi
antibiotik dan gen LacZ sebagai seleksi biru putih. Keunggulan menggunakan
vektor pCC1FOSTM adalah DNA yang diperoleh dapat diinduksi untuk
mendapatkan high copy number dalam penggandaan klon rekombinan dari single
copy menjadi 10–200 copies per selnya, sehingga meningkat DNA fosmid untuk
sekuensing, sidik jari (fingerprint), subkloning, in-vitro transkripsi, dan aplikasi
lainnya. (Epicentre.Cat.No.CCFOS110).

Pustaka Genom
Pustaka genom (genomic library) adalah kumpulan klon rekombinan
dalam bentuk plasmid, phage atau kosmid yang membawa fragmen molekul DNA
tertentu secara independen, berukuran tertentu dan merupakan kumpulan
keseluruhan informasi genetik suatu organisme (Winnaker et al. 1987). Suatu gen
spesifik dalam kumpulan klon rekombinan dipengaruhi oleh panjang fragmen
DNA dan tingkat kompleksitas genom. Semakin tinggi tingkat suatu spesies,
maka semakin kompleks genomnya. Klon rekombinan yang membawa pustaka
genom dapat diukur menjadi fragmen kecil, biasanya 500 bp sampai 1000 bp
untuk memudahkan dalam proses sekuensing (Muse dan Gibson 2004). Beberapa
tahap penting yang dapat menentukan keberhasilan pembuatan pustaka genom
adalah penyiapan fragmen DNA, penyiapan vektor yang sesuai, reaksi ligasi, dan
perbanyakan DNA dalam sel inang (Losick et al. 2008).
Konstruksi pustaka genom dapat menggunakan beberapa vektor yang
dapat menerima sisipan lebih besar. Vektor adalah molekul DNA sirkular yang
dapat bereplikasi secara autonom dalam sel bakteri dan tersebar secara luas pada
sel prokariot. Ukuran dari vektor beragam dari yang pendek hingga yang
berukuran ratusan kb (1–250 kb). Vektor hampir selalu membawa satu atau lebih
gen yang bermanfaat bagi bakteri yang direkayasa. Salah satunya kemampuan
bertahan dalam konsentrasi toksik antibiotik seperti kloramfenikol dan ampisilin

7
dikarenakan keberadaan dari vektor yang membawa gen resisten antiobiotik.
Kebanyakan vektor memiliki sekuen origin of replication (ORI), sehingga vektor
dapat memperbanyak diri dalam sel secara independen. Plasmid sebagai vektor
kloning memiliki ukuran kurang dari 10 kb. Sebagai vektor kloning, plasmid
harus memiliki daerah penyisipan bagi DNA. Daerah ini disebut dengan situs
enzim restriksi yang biasanya membentuk multiple cloning site. Hal yang penting
pula bagi plasmid sebagai vektor kloning adalah angka penggandaan atau copy
number (Brown 2006).
Pustaka genom dapat dibuat dengan memurnikan DNA kromosom dan
memotong DNA tersebut secara parsial dengan enzim restriksi tertentu, baik
melalui variasi konsentrasi enzim maupun variasi waktu inkubasi yang dikenal
dengan teknik Shot-gun (Losick et al. 2008). Fragmen tersebut diharapkan
mewakili keseluruhan gen pada suatu organisme. Ada beberapa jenis vektor yang
tersedia dengan berbagai kapasitas sisipan. Pustaka genom mengandung semua
untaian DNA suatu genom. Pada pustaka genom tersimpan gen (coding regions)
total yang dipunyai oleh suatu organisme dan daerah bukan pengode protein (non
coding regions) (Pattersson et al. 2009). Umumnya, pustaka genom terbuat dari
organisme dengan ukuran genom yang lebih besar sehingga memerlukan vektor
dengan sisipan yang lebih besar, sehingga lebih sedikit molekul vektor yang
diperlukan untuk membuat pustaka. Peneliti dapat memilih vektor dengan ukuran
sisipan yang ideal untuk mendapat klon yang membawa cakupan genom utuh
(Hartwell dan Leland 2008).

8

3 METODE PENELITIAN
Kerangka Penelitian
Kerangka Penelitian disajikan pada Gambar 3
Penapisan 178 isolat bakteri
Streptomyces spp

Uji aktivitas MTGase
Kuantitatif
Molekuler

Isolat Terpilih

Isolasi DNA Genom

Identifikasi gen 16S rRNA

Konstruksi Pustaka Genom
Pengkonan 3-8 kb
pada pJET1.2/blunt

Analisis BLAST

Konstruksi pohon filogenetik
dengan MEGA 6.0

Pengkonan 40 kb
dengan fosmid
pCC1FOSTM
Penapisan klon
yang mengandung
gen MTGase

Analisis fosmid
rekombinan
Sekuensing
Gambar 3 Diagram alur penelitian

9
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2014 – Desember 2015 di
Laboratorium Bioteknologi Pusat Penelitian dan Pengembangan Daya Saing
Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan (P3DSBKP– KKP) Jakarta.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 178 isolat Streptomyces
spp dari tanah yang merupakan koleksi dari Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI,
Streptoverticillium ladakanum NRRL-3191 dari American Research Services
digunakan sebagai kontrol positif menghasilkan MTGase. Konstruksi pustaka
genom dilakukan dengan 2 cara yaitu dengan menggunakan fosmid library
pCC1FOSTM (Epicentre) (Gambar 4) dan plasmid pJET1.2/blunt
(Thermoscientific) (Gambar 5). Subkloning gen parsial MTGase menggunakan
pGEM-T Easy (Promega) (Gambar 5). Beberapa primer digunakan untuk
mendeteksi gen MTGase dan gen 16S rRNA disajikan pada Tabel 1.

A

B
Gambar 4 Peta CopyControl Fosmid Library pCC1FOSTM Vektor. (A)
Fosmid pCC1FOSTM (B) Bagian pCC1FOSTM yang linear
pada situs Eco721
TM

10

A

B

Gambar 5 Peta plasmid (A) pJET1.2/blunt, (B) pGEM-T Easy
Tabel 1 Beberapa primer yang digunakan dalam penelitian ini
Primer
27F
1492R
PTGase 4
PTGase 5
SDS-14F
SDS-14R

Sekuen nukleotida (5’ ke γ’)
5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-γ’
5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-γ’
5’-TACGGCTGCGTCGGTGTCAC-γ’
5’-GACGGTCGTGATTGCCTCC-γ’
5’-AGAAGTTCGAGCGGCTGTCC-γ’
5’- TTACGGCTGCGTCGGTGT-γ’

Kegunaan
Gen 16S rRNA
Deteksi Gen
MTGase
Deteksi Gen
MTGase

Prosedur Penelitian
Pembiakan Streptomyces spp
Streptomyces penghasil MTGase dikulturkan pada media cair
International Streptomyces Project (ISP-2) yang merupakan media selektif untuk
Streptomyces dengan komposisi yaitu malt ekstrak 1%, yeast ekstrak 0.4% dan
glukosa 0.4%. Kultivasi bakteri dilakukan dengan menginokulasikan 1 koloni
bakteri Streptomyces spp dari media padat ke dalam 15 mL media cair ISP,
kemudian biakan diinkubasi pada suhu 30 0C di dalam inkubator bergoyang
dengan kecepatan 125 rpm selama 5–7 hari.
Penapisan Streptomyces spp Penghasil MTGase
Penapisan Streptomyces spp penghasil MTGase dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim ekstrak kasar MTGase berdasarkan Folk dan Cole (1965) dalam
(Bourneouw et al. 2012) yang telah dimodifikasi dengan menggunakan
spektrofotometer berdasarkan pembentukan hidroksamat dari N-carbobenzoxyl–

11
L–glutaminilglycine (CBZ). Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah
pembentukan 1 µmol hidroksamat dalam waktu 1 menit pada suhu 37 °C.
Sebanyak 1500 µL kultur bakteri dimasukan ke dalam tabung mikro 2 ml dan
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm. Supernatan diambil 100 µL kemudian
direaksikan dengan reagen A (200 µL 0.1 M bufer sitrat pH 6, 25 µL 2.0 M
hydroxylamine, 25 µL glutathione dan 75 µL 0.1 M carbobenzoxyl-Lglutaminylglycine/CBZ). Selanjutnya larutan diinkubasi pada suhu 37 °C selama
60 menit dan dihentikan dengan penambahan 425 µL reagen B (15% TCA yang
mengandung 5% FeCl3). Selanjutnya hasil reaksi disentrifugasi (4500 rpm selama
15 menit), kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit dan supernatan
dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada = 5β5 nm. Untuk kontrol
negatif, supernatan dari reagen A tanpa larutan dari bakteri ditambahkan setelah
larutan direaksikan dengan reagen B. Kontrol positif menggunakan bakteri
Streptoverticillium ladakanum NRRL 3191. Kurva standar dibuat menggunakan
L-glutamic acid- -monohydroxamat acid sebagai standar.
Amplifikasi Gen MTGase dengan Metode PCR
Isolat yang menghasilkan MTGase berdasarkan uji aktivitas, kemudian
ditapis dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Untuk itu, bakteri
dibiakan dalam media ISP-2 pada inkubator bergoyang dengan 125 rpm selama 24
jam pada suhu 37°C. Sebanyak 1.5 mL biakan bakteri ditransfer ke dalam tabung
mikro 1,5 mL dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit.
Isolasi DNA dilakukan dengan mengikuti prosedur standar Presto mini gDNA
Bacteria Kit (Geneaid). Amplifikasi gen MTGase menggunakan primer PTGase-4
dan PTGase-5 dengan 25 µL reaksi PCR yang mengandung 1 µL DNA genom 30
µg/mL , 12.5 µL PCR Taq Green Master Mix 2x (Thermo Scientific), 1 µL
masing–masing primer 10 µM, 9.5 µL ddH2O. Amplifikasi PCR dilakukan
sebanyak 35 siklus menggunakan Gene Amp® PCR System 9700 (Applied
Biosystem). Kondisi PCR adalah pra-PCR dilakukan selama 3 menit pada suhu
94°C sebanyak satu kali, denaturasi 94°C selama 30 detik, penempelan primer
pada suhu 60°C selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72°C selama 60 detik
sebanyak 30 siklus. Pada siklus pasca-PCR dilakukan pada suhu 72°C selama 7
menit. Hasil PCR dimigrasikan di dalam gel agarose 1% pada kondisi 100 volt
selama 40 menit. Setelah itu gel didiamkan dalam buffer TAE 1x yang telah diberi
Cyber Gold 1x selama 30 menit. DNA di dalam gel divisualisasikan dengan UV
transiluminator BIORAD dan didokumentasikan dengan Gel –Doc apparatus
(Biometra).
Identifikasi Isolat Terpilih dengan 16S rRNA
Isolat yang mengandung gen MTGase diidentifikasi dengan
mengamplifikasi gen 16S rRNA dengan menggunakan primer universal yaitu 27F
dan 1492R (Lane et al. 1985; Lane, 1991). Komposisi PCR dengan total volume
50 µL reaksi mengandung 2 µL DNA genom 30 µg/mL, 1 µL masing–masing
primer 27F dan 1492R 10 µM , 25 µL Taq Green Master Mix 2x, dan 19 µL
ddH2O. PCR dilakukan dengan kondisi pra –PCR pada 95 0C selama 3 menit,
denaturasi 95 0C selama 30 detik, penempelan (annealing) 55 0C selama 30 detik

12
dan pemanjangan 72 0C selama 1 menit. Siklus PCR dilakukan sebanyak 30
siklus, dan pasca-PCR dilakukan pada suhu 72 0C selama 7 menit dan diisimpan
pada suhu 4 0C. Hasil PCR disekuensing di tempat Genetika Science, Malaysia
menggunakan Genetic Analyzer dan hasil sekuen dianalisis menggunakan
software bioedit, kemudian disejajarkan dengan sekuen 16S rRNA data GeneBank
pada situs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) dengan menggunakan perangkat lunak
BLASTn (Basic Local Alignmet Search Tools for nucleotide) (Altschul et al.
1990). Analisis kekerabatan terdekat dengan pohon filogenetik menggunakan
MEGA6.0 (Tamura et al. 2013).
Konstruksi Pustaka Genom dengan Plasmid pJET1.2/blunt
DNA genom dipotong secara acak dengan mengunakan enzim restriksi
BglII (NEB). Ke dalam tabung mikro secara berurutan ditambahkan 68 µL
ddH2O, 10 µL buffer fast digest 10x, 20 µL DNA genom 30 µg/mL , dan 2 µL
enzim BglII 10 U/µL. Larutan ini diinkubasi pada suhu 37 0C selama 3 jam.
Reaksi dihentikan dengan diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit. DNA
hasil pemotongan dielektroforesis di dalam 1 % agarosa dalam TAE buffer 1x.
Gel yang mengandung fragmen DNA berukuran 3-8 kb dipotong dari gel dan
dipindahkan ke tabung mikro, DNA dipurifikasi dari gel dengan Quick Gel
Extraction Kit (Thermo Scientific). DNA kemudian ditambahkan dengan DNA
blunting enzymes (NEB) untuk mendapatkan kedua ujung genom secara tumpul
(blunt).
Fragmen DNA disisipkan ke dalam vektor pJET1.2/blunt (Thermo
scientific) menggunakan enzim T4 ligase (Thermo scientific), pada suhu 220C
selama 12 jam. Hasil ligasi dimasukan ke dalam sel kompeten E. coli TOP10
(Invitrogen) dengan metode elektroporasi berdasarkan Sambrook dan Rusell
(2001). Hasil transformasi ditumbuhkan di media agar LB yang mengandung
ampisilin (100 g/mL) selama semalam pada suhu 37 0C. Koloni yang tumbuh
dipindahkan pada media LB cair yang mengandung ampisilin (50 g/mL) pada
96-well microplate untuk dipilih yang mengandung gen MTGase. Masing–masing
koloni yang tumbuh dengan baik dalam 96-well microplate diamplifikasi dengan
PCR menggunakan primer SDS 14-F/SDS 14-R. Koloni yang positif membawa
gen MTGase disekuen untuk mendapatkan fragmen DNA yang mengandung gen
utuh hingga memperoleh daerah open reading frame (ORF).
Konstruksi dan Penapisan Pustaka Genom dengan CopyControlTM
Fosmid Library KIT (pCC1FOSTM Vektor)
Isolasi Fragmen ~40 kb yang Berujung Tumpul
DNA genom dipotong secara acak dengan perlakuan fisik menggunakan
pipetmikro. Fragment yang terpotong dibuat tumpul (blunt) pada kedua ujung
terminal dengan mencampurkan 6 µL 10x End- repair buffer, 6 µL 2.5 mM
dNTP, 6 µL ATP 10 mM, 39 µL DNA genom 30 µg/mL dan 3 µL End-Repair
Enzim mix 2 U/µL. Campuran reaksi diinkubasi selama 45 menit pada temperatur
ruang, selanjutnya diinaktivasi pada suhu 70 0C selama 10 menit. Hasil repairing
DNA genom diseleksi menggunakan Low Melting Point Agarose (LMP) 1%.

13
Ukuran ~40 kb dipilih berdasarkan marker fosmid control DNA yang ditandai pita
tunggal dengan ukuran 36 kb. Elektroforesis dilakukan dengan voltase 70 volt
selama 15 menit pertama kemudian voltase diturunkan menjadi 40 volt selama 6
jam. Gel yang mengandung fragmen ~40 kb DNA dipotong dan DNA di gel
dipurifikasi dengan menggunakan Epicentre’s GELaseTM agarose (Epicentre) dan
peqGOLD Gel Exstraction Kit (peqLab).
Konstruksi Pustaka Genom ~40 kb
Fragmen ~40 kb diligasikan ke dalam vektor pCC1FOSTM dengan total
volume reaksi 10 µL dengan mencampurkan 1 µL 10x Fast-Link Ligation Buffer,
1 µL 10 mM ATP, 1 µL pCC1FOSTM 0.5 µg/µL , 6 µL DNA ~40 kb 30 µg/mL
dan 1 µL Fast-Link DNA Ligase 2 U/µL. Reaksi diinkubasi selama 4 jam pada
temperatur ruang kemudian diinaktifkan pada suhu 70 0C selama 10 menit.
Transformasi dilakukan dengan elektroforasi sesuai metode Sambrook dan Rusell
(2001) dengan menggunakan 2 µL hasil ligasi dan 75 µL sel E. coli EPI300-T1R.
Hasil elektroforasi ditambah dengan 1 mL media LB cair dan dikultur selama 1
jam pada inkubator bergoyang dengan suhu 37 0C. Kemudian bakteri disebar
dalam media LB padat yang mengandung kloramfenikol (Cm) 12.5 µg/mL, Xgal
20 mg/mL dan IPTG 0.1 M dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.
Penapisan Klon yang Mengandung Gen MTGase dengan Metode 96-well
microplate
Semua koloni yang berwarna putih ditumbuhkan di dalam media cair
LB+Cm (12.5 g/mL) pada 96-well microplate selama 16 jam pada suhu 37 0C.
Sebanyak 10 L kultur pada masing–masing sumuran (well) digabungkan
berdasarkan baris pada sumuran (pool). Kemudian gen MTGase yang terdapat di
dalam biakan bakteri diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer SDS-14F
dan SDS-14R dengan 25 µL reaksi PCR yang mengandung 1 µL kultur sel E
coli EPI300-T1R transforman, 12,5 µL KAPA Taq Hot Start Master Mix 2x
(KAPA Biosystem), 1 µL masing–masing primer 10 µM, 9,5 µL ddH2O.
Analisis Fosmid pCC1FOSTM Rekombian
Koloni putih yang mengandung MTGase berdasarkan PCR koloni
ditumbuhkan di dalam 10 mL LB+Cm selama 16 jam pada suhu 370C pada
inkubator bergoyang. Setelah 16 jam, 1 mL dari biakan tersebut dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang didalamnya terdapat 9 ml LB+Cm dan ditambahkan 20
µL induction solution 1x dan diinkubasi selama 5 jam pada suhu yang sama.
Kultur disentrifugasi dengan kecepatan 6000 g selama 10 menit dan supernatan
dibuang. Fosmid rekombinan diisolasi menggunakan GeneJET Plasmid Miniprep
Kit (Thermo Scientific). Keberadaan sisipan diverifikasi menggunakan enzim
restriksi NotI, BamHI dan EcoRV. Hasil pemotongan fosmid rekombinan
diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer SDS 14F/SDS 14 dan PTGase
4/PTGase 5. Hasil produk PCR kemudian disubkloning ke dalam pGEM-T Easy
untuk disekuen

14

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Penapisan Streptomyces spp penghasil MTGase
Streptomyces spp merupakan kelompok bakteri yang dominan menghasilkan
enzim MTGase (Wu et al. 1996). Berdasarkan pengukuran aktivitas, dari 178
isolat Streptomyces spp (Lampiran 1), terdapat 10 isolat berpotensi menghasilkan
enzim transglutaminase dengan ditandai aktivitas enzim yang cukup tinggi. Eshra
et al (2015) melaporkan penapisan Actinomycetes yang menghasilkan MTGase
dari 21 jenis tanah yang berbeda diperoleh 15 isolat yang potensial menghasilkan
MTGase berdasarkan pengujian aktivitasnya. Bakteri Streptoverticillium
ladakanum NRRL-3191 dari American Research Services digunakan sebagai
kontrol penghasil MTGase (Tabel 2). Aktivitas MTGase ditunjukkan dengan
adanya perubahan warna kuning pada larutan menjadi warna merah kecoklatan
dengan penambahan indikator reagen B (15% TCA yang mengandung 5% FeCl3).
Hal ini dikarenakan terbentuknya komplek ion logam hasil reaksi antara asam
hidroxamat dengan TCA sehingga terjadi perubahan warna dari kuning menjadi
merah muda (Bourneouw et al. 2012). Aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu
unit enzim yang diperlukan untuk menghasilkan produk 1 µmol asam hidroxamat
per menit pada kondisi tertentu. Penentuan aktivitas MTGase dilakukan dengan
menggunakan metode kolorimetri prosedur hidroxamat dengan menggunakan
kurva standar asam L-glutamat -monohidroxamat (Lampiran 2)
Isolat TTA 02 SDS 14 mempunyai aktivitas transglutaminase yang lebih
tinggi dibanding dengan isolat lainnya yaitu sebesar 3.3886 U/mL yang tidak jauh
berbeda dengan S. ladakanum NRRL-3191 (Tabel 2). Isolat TTA 02 SDS 14
menghasilkan enzim transglutaminase secara ektraseluler pada suhu 25 0C dengan
pH media 6.0 selama 7 hari. Pengukuran aktivitas enzim MTGase menggunakan
buffer sitrat pada pH 6. Kondisi pH rendah atau pH tinggi dapat menyebabkan
terjadinya proses denaturasi enzim dan ini akan mengakibatkan menurunnya
aktivitas enzim (Hames dan Hoper 2005). Isolat TTA 02 SDS 14 ini diisolasi dari
savana Gunung Tambora, Dompu Nusa Tenggara Barat (NTB).
Tabel 2 Uji aktivitas enzim transglutaminase dari isolat terpilih
Asal Isolat
Kode Isolat
Aktivitas U/ml
Kontrol +
S. ladakanum NRRL3191
5.8524
SumSel
GKRL 5
1.0873
SumSel
GKRL 11
0.3886
SumSel
GKRL 7
0.2349
NTB
TSA 03 SDS 12
1.0723
NTB
TTA 02 SDS 14
3.8886
NTB
TCA 01 SDS 17
0.4799
Bogor
CL1 04 RC2
0.4598
Cibinong
ID 04 561
0.9890
Jambi
ID 04 509
0.3353
ID 04 677
0.3012
Purwodadi

15
Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH larutan yang
disebabkan oleh berubahnya keadaan ion enzim dan ion substrat. Perubahan ini
dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi sebagai katalitik pengikat
substrat maupun mempertahankan struktur tersier dan kuartetener enzim yang
aktif. Macedo et al. (2011) melaporkan bahwa pH optimum untuk aktivitas
MTGase dari Streptomyces sp adalah pH 6 – 6.5 dengan menggunakan buffer
sitrat. pH optimum tersebut merupakan titik optimum enzim MTGase untuk
bekerja secara optimal melakukan reaksi katalisis CBZ-gln-gly dan hidrosilamin
membentuk hidrosamat. Karakteristik pH optimum setiap spesies berbeda-beda
dalam menghasilkan MTGase. Menurut Suzuki et al. (2000) pH optimum pada
Bacillus subtilis adalah pH 7.5 – 8.2 dengan buffer Tris-HCl serta Warratao dan
Yongsawatdigul (2005) melaporkan bahwa pH optimum aktivitas
transglutaminase pada mamalia dan ikan nila (Oreochromis niloticus) adalah pH
7–7.5 dengan buffer Tris-HCl.
Kondisi aktivitas transglutaminase ini menjadi acuan untuk pengujian secara
molekuler untuk memastikan bahwa kesepuluh isolat tersebut benar-benar
memiliki gen MTGase. Konfirmasi bahwa 10 isolat tersebut mengandung gen
penyandi MTGase dilakukan dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
menggunakan primer PTGase 4 dan PTGase 5. Hasil PCR menunjukkan bahwa
isolat TTA 02 SDS 14 mengandung pita DNA berukuran 470 bp (Gambar 6).
Ukuran ini sesuai dengan sebagian gen MTGase yang diamplifikasi dengan
primer tersebut. Gen MTGase memiliki panjang open reading frame (ORF) 1254
bp yang menyandi 418 asam amino (Lin et al. 2006). Hal ini juga diperkuat
dengan hasil sekuen gen MTGase (Lampiran 3) dari isolat TTA 02 SDS 14 yang
memiliki kemiripan dengan gen MTGase dari Streptomyces cinnamoneus dengan
homologi sebesar 93 % (Lampiran 4). Analisis pensejajaran sekuens protein dari
sebagian gen MTGase dari isolat TTA 02 SDS 14 dengan beberapa gen MTGase
dari beberapa kelompok Streptomyces dan bakteri lain juga menunjukkan adanya
daerah konservatif yang menandakan adanya persamaan sekuens asam amino
yang dimilikinya (Gambar 7). Homologi sekuen asam amino dari beberapa
organisme prokariot dan eukariot menunjukkan adanya sekuens yang konservatif
pada bagian sisi aktif yang bersifat triad katalitik (Li et al. 2009)
M K+ 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 K-

3000 bp

500 bp

Gambar 6 Hasil amplifikasi gen parsial MTGase dari isolat terpilih. (M) marker
100 bp plus, (K+) S. ladakanum NRRL3191, (1) GKRL 5, (2) GKRL
11, (3) GKRL 7, (4) TSA 03 SDS 12, (5) TTA 02 SDS 14, (6) TCA
01 SDS 17, (7) Cli 04 RC2, (8) ID 04 561, (9) ID 04 509, (10) ID 04
677, (K-) Salmonella sp

16
Code Sample

conserve region

conserve region

Gambar 7 Pensejajaran sekuens asam amino MTGase isolat TTA 02 SDS 14
dengan MTGase dari beberapa kelompok bakteri
Identifikasi Isolat TTA 02 SDS 14 Berdasarkan Sekuen 16S rRNA
Isolat TTA 02 SDS 14 diindentifikasi berdasarkan sekuen DNA dari gen
penyandi 16S rRNA dengan menggunakan primer 27F dan 1492R. Produk PCR
yang dihasilkan adalah fragmen DNA berukuran 1400 bp (Gambar 8). Besarnya
ukuran pita yang muncul sesuai dengan ukuran yang diharapkan dari gen 16S
rRNA bakteri yaitu antara 1300 – 1500 bp (Marchesi et al. 1998).
M

1

10000 bp

1500 bp

1400 bp

Gambar 8. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA isolat TTA 02 SDS 14. (1) DNA
isolat TTA 02 SDS 14 (M) Marker 100 bp DNA Ledder
Analisis BLAST bertujuan untuk mensejajarkan dan mencocokan hasil
sekuensing yang diperoleh dari sampel penelitian dengan data di GenBank.
Analisis hasil BLAST tersebut memberikan informasi mengenai bakteri apa yang
mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan
untuk identifikasi bakteri. Informasi dari hasil BLAST tersebut berupa Score,
Query Coverage, E-value dan Maximum identity. Score adalah jumlah keselarasan
semua segmen dari urutan database yang cocok dengan urutan nukleotida. Nilai
skor menunjukkan keakuratan nilai penjajaran sekuens berupa nukleotida yang
tidak diketahui dengan sekuens nukleotida yang terdapat di dalam GenBank.
Semakin tinggi nilai skor yang diperoleh maka semakin tinggi tingkat homologi

17
kedua sekuens. Query coverage adalah persentasi dari panjang nukleotida yang
selaras dengan database yang terdapat pada BLAST. Max identity adalah nilai
tertinggi dari persentasi identitas atau kecocokan antara sekuen query dengan
sekuen database yang tersejajarkan (Altschul et al, 1990).
Berdasarkan hasil sekuen gen 16S rRNA (Lampiran 5) dan hasil
penelusuran BLAST dari data GenBank, isolat TTA 02 SDS 14 teridentifikasi
sebagai Steptomyces thioleteus dengan homologi 99 % dan nilai E value sama
dengan 0 (Lampiran 6). Hagstrom et al (2000) menyatakan bahwa bakteri yang
mempunyai persamaan sekuen 16S rRNA lebih besar dari 97% adalah spesies
yang sama. Sedangkan persamaan sekuen antara 93% - 97% dapat mewakili
identitas pada tingkat genus tetapi berbeda pada tingkat spesies. Nilai E-value
merupakan nilai dugaan yang memberikan ukuran statistic yang signifikan
terhadap kedua sekuen. Nilai E-value yang semakin tinggi menunjukkan tingkat
homologi antara sekuen semakin rendah, sedangkan nilai E-value yang semakin
rendah menunjukkan tingkat homologi antar sekuens semakin tinggi. Nilai Evalue bernilai 0 (nol) menunjukkan bahwa kedua sekuen tersebut identik (Claverie
dan Notredame 2003).
Homologi sekuen 16S rRNA dari masing-masing isolat bakteri dengan
sekuens 16S rRNA dari database GenBank dapat diketahui bahwa tidak ada
sekuens 16S rRNA bakteri yang identik. Untuk melihat hubungan kekerabatan
yang mirip antara isolat TTA 02 SDS 14 dengan beberapa spesies Steptomyces
dari hasil BLAST dan beberapa kelompok bakteri lain sebagai kelompok luar
dapat disajikan dalam bentuk pohon filogenetik. Hasil analisis pohon filogenetik
juga menunjukkan bahwa Isolat TTA 02 SDS 14 memiliki kekerabatan terdekat
dengan Steptomyces thioleteus yang ditunjukan pada Gambar 9.
Analisis filogenetik menggunakan metode Neighbour Joining yaitu
pasangan nukleotida yang mengalami perubahan terkecil diantara sekuen yang
telah dibandingkan. Nilai jarak dilambangkan oleh garis skala yang menunjukkan
jumlah subtitusi nekleotida untuk tiap posisi sekuen. Nilai jarak sebesar 0.02 pada
hasil konstruksi pohon filogenetik menunjukkan rendahnya subtitusi nukleotida
pada sekuen 16S rRNA pada masing- masing pengelompokan berdasarkan tingkat
devisio dari kelompok Actinobacteria, Bacillales, Deltaproteobacteria,
Gammaproteobacteria dan Betaproteobacteria. Pengelompokan ini untuk melihat
seberapa jauh dan dekatnya hubungan kekerabatan masing–masing kelompok.
Isolat TTA 02 SDS 14 masih tergolong kedalam Actinobacteria