Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing
Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Syahdan Sayidah Ulfah
NIM G84100059
2
ABSTRAK
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka
Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I
MADE ARTIKA dan I MADE TASMA.
Sekuensing genom total dan analisis genom jagung merupakan salah satu
cara untuk mempercepat peningkatan pemuliaan jagung serta untuk meningkatkan
pemahaman mengenai informasi genetik dan genomik jagung. Tujuan penelitian
ini adalah mengkonstruksi pustaka genom dari empat genotipe jagung di
Indonesia (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)) dan menganalisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing genom total.
Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan menempelkan adapter
pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya diklasterisasi dan
disekuensing menggunakan CBOT claster generation dan Next Generation
Sequencing HiSeq2000. Jumlah basa yang dihasilkan selama proses sekuensing
yaitu sebanyak 287.1 Gbp. Klaster pustaka genom yang dihasilkan dengan nilai Q
scores di atas 30 berkisar antara 80.8 – 87.9%. Tingkat kesalahan pembacaan basa
selama proses sekuensing berkisar antara 0.32 – 0.51%. Secara keseluruhan hasil
sekuensing menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori
ideal.
Kata kunci: jagung, pustaka genom, sekuensing genom total, Next Generation
Sequencing
ABSTRACT
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Construction and Quality Analysis of Maize
(Zea mays (L.)) Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Supervised by I
MADE ARTIKA and I MADE TASMA.
Whole genome sequencing and analysis of the maize genome is one of the
ways to accelerate the increase in corn breeding and to improve the understanding
of the genetic and genomic information maize. The purpose of this study is to
construct genomic libraries of four maize genotypes in Indonesia (Sp010BB-3-22-1-B, LK2-45, PSG59-8 (early maturing) and LBP54-50 (pulut)) and analyze the
quality of the results of genomic libraries total genome sequencing. Genomic
library construction performed in vitro by attaching adapters to the ends of DNA
fragments. Clasterization and sequencing of genomic library in this research were
conducted by using cBOT claster generation and Next Generation Sequencing
HiSeq2000. The amount of base produced during the sequencing process as many
as 287.1 Gbp. Cluster genomic library generated with Q values above 30 scores
ranged from 80.8 – 87.9%. Base reading error rate during the sequencing process
was 0.32 – 0.51%. Over all sequencing results showed that quality of the genomic
library cluster was belong to the ideal category.
Keywords: Maize (Zea mays (L.)), Genomic Library, Whole Genome Sequencing,
Next Generation Sequencing (NGS).
3
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
4
5
Judul Skripsi : Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea
mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total
Nama
: Syahdan Sayidah Ulfah
NIM
: G84100059
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I
Dr Ir I Made Tasma, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
6
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya
sehingga penelitian yang berjudul Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka
Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total ini dapat
diselesaikan dengan baik. Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan sejak
bulan Desember 2013 sampai Mei 2014, bertempat di Laboratorium Biologi
Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber
Daya Genetik Pertanian (BB Biogen), Cimanggu, Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada kedua pembimbing penelitian
yaitu Dr Ir I Made Artika MAppSc dan Dr Ir I Made Tasma MSc yang telah
memberikan saran serta kritik yang membangun demi kelancaran penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ida Rosdianti MSi, Habib Rizjaani
MSi, Titin MSi, Fajar MSi serta Ihsan Mentaya SSi yang bersedia mendampingi
selama kegiatan penelitian serta memberikan masukan. Ucapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada kedua orang tua yang senantiasa memberikan motivasi
serta saran yang baik sehingga usulan penelitian ini dapat terselesaikan dengan
baik. Rekan-rekan terutama Yuliana dan Asep yang telah menjadi partner yang
baik selama kegiatan penelitian berlangsung serta Biokimia 47 yang telah
membantu serta memberikan motivasi, penulis juga mengucapkan terima kasih.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih banyak kekurangan. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk
memperbaiki tulisan ini. Atas kritik dan saran yang diberikan, penulis ucapkan
terima kasih. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan
khususnya biokimia.
Bogor, Oktober 2014
Syahdan Sayidah Ulfah
7
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xi
DAFTAR LAMPIRAN
xi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL
8
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
8
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
8
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
9
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
10
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
10
Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung
10
Kualitas Pustaka Genom Jagung
11
Sekuensing Pustaka Genom Jagung
12
PEMBAHASAN
16
Isolasi DNA Genom Jagung
16
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
16
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
17
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
18
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
18
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
19
Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom
Jagung
20
Kualitas Pustaka Genom Jagung
21
Kuantitas Pustaka Genom Jagung
21
Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung
22
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum
22
8
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell
23
Tingkat Kesalahan (error rate) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing
24
SIMPULAN DAN SARAN
24
Simpulan
24
Saran
25
DAFTAR PUSTAKA
25
LAMPIRAN
28
RIWAYAT HIDUP
36
9
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific
Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit
2.0 fluorometer
Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik
Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi
Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi
ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung
Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi
adapter
Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk
sekuensing
Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara
umum
Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Tingkat kesalahan (error rate) dan intensitas basa hasil sekuensing
9
9
9
10
10
11
11
12
13
16
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA genom total jagung
2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah)
3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut)
4 Histrogram jumlah klaster genotipe Sp010BB-3-2-2-1 berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan
5 Histogram jumlah klaster genotipe LK2-45 berdasarkan kualitas sekuen
yang dihasilkan
6 Histogram jumlah klaster genotipe PSG59-8 (genjah) berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan
7 Histogram jumlah klaster genotipe LBP54-50 (pulut) berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan
8 Intensitas banyaknya larutan sekuensing yang tersisa selama proses
sekuensing berlangsung
9 Presentase basa-basa nitrogen selama proses sekuensing
8
11
12
13
13
14
14
14
15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian
2 Hasil analisis pustaka genom secara kuantitatif dengan qPCR
3 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2011)
4 Flow cell Illumina HiSeq2000 (Swiss Federal Institute of Technology
Zurich 2012)
5 Regenerasi Next Generation Sequencing HiSeq2000
28
29
31
32
33
10
Prinsip sekuensing menggunakan Next
HiSeq2000
7 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur
6
Generation
Sequencing
34
35
PENDAHULUAN
Jagung (Zea mays L.) merupakan salah satu tanaman serealia penting yang
tumbuh hampir di seluruh dunia dan digunakan sebagai bahan makanan. Di negara
maju, jagung banyak digunakan untuk pati sebagai bahan pemanis, sirup dan
produk fermentasi, termasuk alkohol. Jagung banyak digunakan untuk bahan baku
pakan di Amerika (Prasanna et al. 2001). Jagung dibutuhkan masyarakat
Indonesia dalam jumlah besar dan terus meningkat, namun tidak diikuti oleh
peningkatan produksi, sehingga terjadi kekurangan sekitar 1,3 juta ton setiap
tahun dan harus dipenuhi melalui import. Menutupi ketersediaan jagung perlu
diupayakan melalui peningkatan produksi. Perakitan varietas unggul baru, berdaya
hasil dan berkualitas tinggi merupakan salah satu upaya untuk mendorong
peningkatan produksi (Azrai 2004).
Produksi tanaman pangan jagung disajikan dalam Berita Resmi Statistik
(BRS) terdiri dari luas panen, produktivitas dan angka produksi jagung. Produksi
jagung pada tahun 2012 mengalami peningkatan sebesar 1,74 juta ton
dibandingkan tahun 2011. Produksi jagung pada tahun 2013 mengalami
penurunan sebesar 0,55 juta ton dibandingkan tahun 2012. Penurunan produksi
diperkirakan terjadi karena penurunan luas panen seluas 66,62 ribu hektar dan
penurunan produktivitas sebesar 0,57 kuintal/hektar (BPS 2013).
Ciri penting ketahanan genetik tanaman jagung terhadap suatu hama atau
penyakit adalah kestabilannya dalam berproduksi, baik pada saat ada hama atau
penyakit maupun pada saat tidak ada hama atau penyakit. Ketahanan genetik
harus dapat memberikan perlindungan yang baik dan menyeluruh dari
kemungkinan kerusakan yang dapat disebabkan oleh suatu penyakit. Penyakit
yang paling banyak menimbulkan kerusakan tanaman jagung di Indonesia adalah
penyakit bulai yang disebabkan oleh strain Peronosclerospora maydis. Penyakit
bulai menyerang di Indonesia secara khusus dan di Asia pada umumnya karena
kondisinya yang tropis (Yen et al. 2004).
Berbagai usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produktivitas jagung.
Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas jagung nasional adalah dengan
perbaikan genetik tanaman. Perbaikan genetik tanaman dipengaruhi oleh isolasi
dan karakterisasi gen. Tahapan tersebut dapat dilakukan dengan memanfaatkan
informasi genomik dan genetik jagung yang diperoleh melalui sekuensing genom
total. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak bergantung pada
penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.
Sekuensing genom total (whole genome sequencing) merupakan proses
penentuan urutan genom suatu organisme yang dilakukan dalam satu waktu.
Sekuensing genom total digunakan untuk mengetahui informasi genomik dan
genetik suatu organisme secara menyeluruh. Instrumen NGS yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu HiSeq 2000 yang dikembangkan oleh Illumina Metode
yang digunakan pada HiSeq 2000 sama seperti pada instrumen NGS yang lainnya
yaitu dengan menggunakan metode sequencing by synthesis. HiSeq 2000
mempunyai kemampuan mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30
kali cakupan secara bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen.
Instrumen ini menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp
selama 11 hari. Secara umum, terdapat empat tahapan yang dilakukan dalam
sekuensing DNA menggunakan HiSeq 2000 adalah preparasi sampel pustaka
2
DNA, klasterisasi cetakan DNA, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina
2010).
Sekuensing genom total jagung diawali dengan mengkonstruksi pustaka
genom kentang menggunakan Low Throughput Protocol dari illumina dan
disekuensing menggunakan NGS Illumina Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini
relatif sangat mudah dan singkat karena tidak membutuhkan vektor untuk
menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak membutuhkan ruangan khusus untuk
penyimpanan serta tidak membutuhkan DNA dalam jumlah banyak, namun DNA
yang digunakan merupakan DNA double stranded (dsDNA) dengan konsentrasi
rendah (20 ng/uL). Metode konstruksi yang digunakan memiliki prinsip yang
sama dengan konstruksi genom menggunakan metode shotgun sequencing yaitu
fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan DNA genom tidak disisipkan
dalam suatu vektor pada sel inang, namun tahapan setelah fragmentasi DNA
berbeda. Metode shotgun sequencing, DNA yang telah difragmentasi tidak
dilakukan ligasi adapter tetapi langsung dilakukan sekuensing. Fragmen DNA
yang dihasilkan sebelum disekuens, dipreparasi dengan menempelkan adapter
pada ujung fragmen DNA. adapter tersebut pada tahapan selanjutnya (klasterisasi)
akan menempel pada flow cell untuk amplifikasi fragmen DNA melalui metode
bridge amplification (Mardis 2008, Metzker 2010, Commins et al. 2011).
Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan menganalisis kualitas pustaka
genom tanaman jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45,
PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) yang pada tahapan selanjutnya dapat
digunakan untuk pemetaan genom jagung melalui sekuensing dengan
menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq 2000. Hipotesis
penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi pustaka genom jagung empat genotipe
yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut),
kemudian disekuensing menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq
2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi genetika
dan studi tentang keseluruhan genom jagung. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang
dihasilkan diharapkan mampu untuk pemetaan gen secara fisik pada tahapan
selanjutnya.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun jagung empat
genotipe (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)), es batu, etanol teknis, nitrogen cair, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil
Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), Chisam (kloroform : isoamil
alkohol dengan perbandingan 24 : 1), isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan
etanol 70%, 0.2 % beta merkaptoetanol dan natrium bisulfit. Bahan-bahan yang
digunakan untuk elektroforesis adalah serbuk agarosa, 1 x TAE, SyBr Gold,
loading dye dan DNA ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk fragmentasi
adalah isolat DNA dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk
modifikasi ujung fragmen DNA adalah end repair control, end repair mix, Sample
Purification Beads, etanol 80 % dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang
3
digunakan untuk adenilasi ujung 3’ DNA adalah A-tailing control dan A-tailing
mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk penempelan adapter adalah ligase
control, DNA ligase mix, DNA adapter index, stop ligase mix, Sample Purification
Beads, etanol 80 %, dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk
uji kualitas pustaka genom dengan agilent 2100 bioanalyzer adalah sampel DNA
yang sudah dipustaka, dye mix dan ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji
kualitas pustaka genom menggunakan qPCR adalah sampel yang sudah dipustaka,
buffer qPCR, reagen qPCR dan larutan standar. Bahan-bahan yang digunakan
untuk klasterisasi dan sekuensing genom jagung adalah 2 N NaOH, buffer
hibridisasi, Tris-Cl, buffer library, TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS, Truseq SBS
Kit-HS (200 cycle).
Alat
Alat-alat yang digunakan meliputi mortar, tabung 15 mL, tabung 2 mL,
tabung 1.5 mL, penangas air, inkubator thermostat, sentrifus 5810X, thermolyne
vortex mixer maxi II, mikropipet, tip pipet, nanodrop thermoscientific 2000c, qubit
2.0 fluorometer, tabung covaris AFA Fiber Snap Cap 6x16mm, Covaris M220,
microwave panasonic, microfuge, kotak es, sarung tangan karet, termos, neraca
analitik, cetakan gel, sisir, alat pengering, thermal cycler biometra T1, sudip, gelas
piala, parafilm, power supply, perangkat elektroforesis, kolom elusi gel minElute
Spin, UV Transilluminator DigiDoc-It Imaging System, magnetic stand, mesin
pendingin tropicalized Sansio, cBot Cluster Generation, Agilent 2100
Bioanalyzer, qPCR, High Sensitivity DNA Chip dan Illumina Hiseq 2000.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Doyle & Doyle (1987) yang dimodifikasi
Daun jagung ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletakkan dalam
mortar pestel dan ditambah nitrogen cair dan digerus sampai halus sempurna,
kemudian dimasukan ke dalam Eppendorf 2 ml. Ditambahkan 0,5 ml bufer
ekstraksi CTAB (CTAB: 2%, 1 M Tris-HCl pH 8, 0.5 M EDTA pH 8, NaCl 5 M,
akuades, 0,20% ß-mercaptoetanol dan natrium disulfit. Lima belas menit sebelum
proses ekstraksi, bufer dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 65°C, lalu
contoh daun yang telah ditambah bufer ekstraksi CTAB.
Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi
contoh ke dalam waterbath suhu 65°C selama 60 menit atau sampai fase padat
terpisah dari fase cair. Selanjutnya, tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkan
beberapa menit sampai suhu contoh menurun. Tabung berisi contoh yang telah
diinkubasi lalu ditambah khloroform: isoamil-alkohol (CIA 24:1) 500 μl. Tabung
lalu dikocok menggunakan vortex mixer sampai contoh dann CIA 24:1 tercampur,
kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Bagian atas
contoh yang berupa cairan jernih (supernatan) dipindahkan 500 μl ke dalam
tabung baru.
Supernatan yang sudah bersih dipindahkan ke tabung baru, kemudian
ditambah 500 μl isopropanol dingin. Selanjutnya tabung dibolak-balik secara hatihati untuk melarutkan supernatan dan isopropanol. Tabung contoh lalu disimpan
pada suhu -20°C selama semalam dan tidak boleh kena guncangan. Kemudian
tabung dibolak-balik perlahan dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama
4
10 menit. Fase cair dibuang secara perlahan, sedangkan pelet yang tertinggal di
dalam Eppendorf dicuci dengan 500 μl etanol absolut, kemudian dilarutkan
dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan. Larutan kemudian
disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Fase cair dibuang secara
perlahan, sedangkan pelet dicuci lagi dengan 200 μl etanol 70% dingin,
selanjutnya dilarutkan dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan.
Larutan kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. DNA
dikeringkan di udara selama semalam.
Setelah cukup kering, pelet DNA dilarutkan dengan menambahkan 100 μl
bufer TE (1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base, 0,50 M EDTA pH 8,0,
18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat 2H2O). Larutan DNA diinkubasi 65oC
selama 15 menit. Larutan kemudian ditambahkan 2 μl RNAse pada dinding
Eppendorf dan di-spin down dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC selama 30 menit.
Jika tidak langsung digunakan, DNA disimpan pada suhu -20°C. Penyimpanan
pada suhu -20°C ini dilakukan agar DNA tidak rusak dan dalam kualitas yang
baik.
Analisis Kualitas dan Kuantitas Isolasi DNA
Analisis kualitatif isolasi DNA (Sambrook & Russel 2001 yang
dimodifikasi). Uji ini menggunakan metode elektroforesis gel agarosa. Sampel
DNA diambil sebanyak 3 μL dan dielektroforesis dengan konsentrasi 1 % selama
30 menit pada kuat arus 100 V ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1x.
Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran loading dye 6x, SyBr Gold
100x dan molecular water. Setelah itu marker dibuat dengan campuran DNA
ladder 100 bp plus dan SyBr Gold 100x. Loading buffer dan marker ini divorteks.
Kemudian diinjeksikan ke dalam sumur elektroforesis beserta sampel yang telah
diisolasi.
Analisis kuantitatif isolasi DNA (Invitrogen 2010). Uji kuantitatif ini
menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific dan Qubit 2.0
fluorometer. Metode menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific
sebanyak 1 μL sampel diambil dan dianalisis. Metode menggunakan fluorometer,
sebanyak 200 μL buffer Qubit disiapkan masing-masing untuk dua larutan standar
dan larutan yang berisi sampel. Sebanyak 190 μL working solution ditambahkan
10 μL larutan standar 0 ng, kemudian untuk larutan standar 2 sebanyak 190 μL
working solution ditambahkan 10 μL larutan standar 10 ng. Sebanyak 198 μL
working solution ditambahkan 2 μL sampel. Kemudian semua larutan divortex
selama 3 detik dan diinkubasi selama 2 menit. Larutan standar 1 dan standar 2
serta sampel dibaca pada alat fluorometer.
Konstruksi Pustaka Genom (TruSeq DNA low throughput protocol 2010)
Fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA dilakukan dengan menggunakan
metode sonikasi DNA. DNA yang sudah dilarutkan dengan Resuspension Buffer
sampai 55 μL diletakkan dalam tabung covaris sebanyak 52.5 μL. Kemudian
difragmentasi menggunakan alat covaris. Sebanyak 50 μL sampel yang telah
difragmentasi, dipindahkan ke dalam tabung PCR 0.3 ml. Kemudian sebanyak 80
μL Sample Purification Beads yang telah divortex, ditambahkan ke dalam sampel
tersebut dan diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand
5
selama 8 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian buang 125
μL supernatan tanpa menggangu beads. Kemudian pencucian pelet dilakukan
secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30
detik, selanjutnya, etanol 80% dibuang. Pelet kemudian dikeringkan selama 5
menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Setelah itu,
tambahkan 52.5 μL Resuspension Buffer dan tabung PCR diangkat dari magnetic
stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dan diinkubasi pada
magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dipindahkan sebanyak 50 μL ke dalam
tabung PCR 0.3 ml yang baru.
Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Sebanyak 10 μL End repair control
dan 40 μL End Repair Mix ditambahkan dalam tabung hasil fragmentasi. Sampel
dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10
kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler
selama 30 menit pada suhu 30oC. Kemudian tabung diangkat dari thermal cycler.
Diluted beads mixture dibuat terlebih dahulu dengan komposisi 109.25 μL sample
purification buffer dan 74.75 μL nuclease free water untuk 1 sampel. Sebanyak
160 μL diluted beads mixture yang telah divortex ditambahkan ke dalam sampel,
kemudian diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand
selama 5 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian transfer 125
μL supernatan tanpa menggangu beads dan lakukan sebanyak 2 kali. Kemudian
30 μL sample purification beads yang telah divortex selama 1 menit ditambahkan
ke dalam sampel. Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan
diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dibuang sebanyak
276 μL. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80% dibuang.
Pelet kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
magnetic stand. Kemudian tambahkan 17.5 μL Resuspension Buffer dan tabung
PCR diangkat dari magnetic stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2
menit dan diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan
dipindahkan sebanyak 15 μL ke dalam tabung PCR 0.3 ml yang baru.
Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 μL dan A-tailing mix 12.5
μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung
yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 30 menit
pada suhu 37oC, 70oC selama 5 menit dan 4oC selama 5 menit.
Penempelan Adapter. Ligase control 2.5 μL, DNA Ligase Mix 2 2.5 μL
dan DNA Adapter Index 2.5 μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel.
Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam
thermal cycler selama 10 menit pada suhu 30oC. Sebanyak 5 μL Stop Ligase Mix
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian,sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Langkah
selanjutnya yaitu pemurnan sampel yang diawali dengan penambahan 42.5 μL
Sample Purification Beads yang telah divorteks ke dalam sampel. Sampel
dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10
kali. Campuran sampel dan Sample Purification Beads diinkubasi selama 5 menit
pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam
6
magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 80 μL supernatan
dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada
dinding tabung.
Ulangi tahapan sebelumnya untuk menghilangkan supernatan yang masih
tersisa. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80%. Pelet
kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 52.5 μL ditambahkan ke dalam
tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan
cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2
menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam
magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit untuk memisahkan supernatan
dengan pelet. Sample purification beads ditambahkan sebanyak 50 μL dan
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian
dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit.
Kemudian sebanyak 95 μL supernatan dibuang dengan hati-hati jangan
sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Pencucian pelet,
sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik.
Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan
penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan
selama 5 menit pada suhu ruang. Sample purification beads ditambahkan
sebanyak 22.5 μL dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang
berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang
selama 5 menit. Sebanyak 20 μL supernatan dipindahkan ke dalam tabung PCR
0.3 ml yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin.
Analisis Pustaka Genom Jagung
Analisis pustaka genom dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif untuk
mengecek ukuran pustaka genom dan mengetahui konsentrasi dari pustaka genom
yang dihasilkan memenuhi persyaratan untuk sekuensing menggunakan next
generation sequencing HiSeq 2000. Syarat-syarat tersebut yaitu memiliki panjang
fragmen sekitar 300-500 bp dengan konsentrasi 10 nM.
Analisis kualitas pustaka genom (Agilent Technologies 2003). Uji ini
digunakan untuk mengetahui ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang
dilakukan dengan mengikuti protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. High
Sensitivity DNA Chip diletakkan di atas priming station chip dan kemudian ke
dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix kemudian ditekan
menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah dibuka kemudian ke dalam
lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix dan marker pada masingmasing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke dalam lubang ladder
ditambahkan 1 μL High Sensitivity DNA ladder. Selanjutnya 1 μL sampel
dimasukkan ke dalam lubang sampel. Chip kemudian divorteks selama 1 menit
dan kemudian di-running pada alat agilent 2100 bioanalyzer yang terhubung
dengan komputer. Kualitas ukuran pustaka juga menggunakan metode
elektroforesis agarose 2 %. Sampel yang digunakan merupakan sampel hasil dari
qPCR. Kemudian hasil elektroforegram dianalisis dengan menggunakan software
bioinformatika photocap molecule weight.
7
Analisis kuantitas pustaka genom (Sigma 2008). Tahapan ini dilakukan
untuk mengetahui jumlah atau konsentrasi pustaka genom yang mencukupi
sebagai syarat untuk proses klasterisasi. Sampel dibuat sebanyak triplo dan setiap
ulangan dibuat tiga pengenceran berbeda, yaitu 1:1000, 1:2000 dan 1:4000.
Sebanyak 1 μL sampel dilarutkan dalam 999 μL buffer qPCR, kemudian divorteks
selama 10 detik. Pada ulangan ke dua yaitu sebanyak 100 μL sampel yang telah
dilarutkan ditambahkan ke dalam 100 μL buffer qPCR dan untuk ulangan ketiga
sebanyak 100 μL sampel dari ulangan 2 ditambahkan ke dalam 100 μL buffer
qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak 4 ul
dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan. Kemudian tabung PCR
dimasukkan ke dalam alat qPCR dan di-running selama 2 jam. Hasil yang
diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka genom. Sebelum
klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka genom yang
dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer pustaka (TrisCl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).
Klasterisasi Pustaka Genom Jagung (cBot cluster generation protocol 2010)
Klaterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua
tahapan, yaitu denaturasi dengan menggunakan 2 N NaOH dan pelarutan DNA
dalam buffer hibridisasi. Denaturasi diawali dengan penambahan 17 μL Tris-Cl 10
mM, pH 8.5 dan 1 μL 2 N NaOH ke dalam 2 μL sampel DNA sehingga diperoleh
konsentrasi DNA sebesar 1 nM. Campuran tersebut kemudian divorteks sampai
homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk
mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah
didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan
dilakukan.
Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer
hibridisasi. Tahapan ini diawali dengan pengenceran 1 nM DNA hasil denaturasi
menjadi DNA yang memiliki konsentrasi 5 pM, 6 pM, 7 pM dan 8 pM.
Konsentrasi tersebut didapat dari pengenceran 5 μL dalam 995 μL (5 pM), 6 μL
dalam 994 μL (6 pM), 7 μL dalam 993 μL (7 pM) dan 8 μL dalam 992 μL (8 pM).
Sebanyak 120 μL control library disiapkan dalam tabung pertama dalam suatu
lajur yang memiliki 8 tabung untuk digunakan sebagai kontrol dalam flow cell.
Sampel DNA yang telah diencerkan sebelumnya kemudian dipindahkan dalam
tabung yang lain dalam lajur tersebut. Posisi sampel dicatat dan tabung disimpan
dalam mesin pendingin sampai sampel akan dimasukkan kedalam cBot Cluster
Generation.
Sekuensing Pustaka Genom Jagung (HiSeq 2000 protocol 2011)
Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari
beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,
pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).
Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS
kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut
dimasukkan kedalam rak reagen compartment yang terdapat dalam Illumina
Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing dilakukan melalui Hiseq
control software interface. Parameter yang tersedia diantaranya flow cell ID,
8
experiment, user name, flow cell type, control lane, output folder,confirm first
base, keep intensity files, existing recipe, save image dan align lanes. Tahapan
selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah diklasterisasi melalui cBot
cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing dilakukan selama sekitar 11
hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus. Tahapan terakhir setelah
proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan dipindahkannya flow cell dari
flow cell stage dan dilakukannya post-run sequencing yaitu maintenance wash.
Tahapan maintenance wash terdiri dari pembilasan dengan menggunakan air dan
NaOH.
HASIL
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) diuji secara kualitatif
menggunakan metode elektroforesis gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keempat
genotipe ini menunjukkan hasil yang baik. Hal ini ditunjukkan dengan intensitas
pita DNA yang jelas dan terang. Masih terdapatnya RNA ditunjukkan dengan
adanya intensitas pita DNA pada dasar sumur gel. DNA yang dihasilkan juga
merupakan DNA genom karena DNA yang dihasilkan berukuran besar, yaitu
lebih dari 1500 bp (Gambar 1).
1500 bp
a
b
c
d
e
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom total jagung. DNA marker (a), Sp010BB3-2-2-1-B (b), LK2-45 (c), PSG59-8 (genjah) (d) dan LBP54-50
(pulut) (e).
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
Uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific
dilakukan untuk mengetahui konsentrasi DNA serta kemurnian DNA terhadap
protein dan polisakarida. Keempat genotipe jagung yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menunjukkan hasil yang baik
dengan konsentrasi DNA yang tinggi berkisar 745.10 ng/µL – 2547.20 ng/µL
serta rasio kemurnian A260/A280 (terhadap protein) dan A260/A230 (terhadap
polisakarida) masing-masing berkisar 1.97 – 2.03 dan 2.03 – 2.17 (Tabel 1). Rasio
kemurnian terhadap protein dan polisakarida ditunjukkan dengan hasil yang baik.
9
Tabel 1 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
1303.00
2547.20
1788.40
745.10
A260
26.06
50.94
35.77
14.90
A280
12.85
25.76
17.68
7.55
A260/A280
2.03
1.98
2.02
1.97
A260/A230
2.03
2.06
2.17
2.15
Uji kuantitas DNA menggunakan Qubit 2.0 fluorometer dilakukan untuk
mengetahui konsentrasi DNA double stranded yang menjadi tolak ukur dalam
pustaka genom dengan konsentrasi minimal 20 ng/µL. Qubit 2.0 fluorometer
berbeda dengan spektrofotometer nanodrop thermoscientific karena Qubit 2.0
fluorometer hanya menghitung double stranded DNA yang akan digunakan untuk
konstruksi pustaka genom, kemudian disekuensing. Qubit 2.0 fluorometer
memiliki akurasi yang baik karena mampu mendeteksi konsentrasi double
stranded DNA dalam konsentrasi yang rendah. Konsentrasi double stranded DNA
memenuhi prasyarat tersebut dengan kisaran 55.60 – 112.00 ng/µL (Tabel 2).
Tabel 2 Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit
2.0 fluorometer
Genotipe
[DNA]
(µg/mL)
1.12
0.57
0.63
0.55
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
Faktor
Dilusi
100.00
100.00
100.00
100.00
[dsDNA]
(ng/µL)
112.00
57.20
63.40
55.60
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
DNA genom yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus
memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. DNA genom yang digunakan harus
utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil serta memiliki
konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi DNA double stranded yang telah diukur
menggunakan Qubit 2.0 fluorometer, diencerkan dengan buffer resuspensi
mencapai volume 55 µL untuk memulai proses fragmentasi. Buffer resuspensi ini
akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil serta dapat
melarutkan kembali DNA. DNA diencerkan dengan konsentrasi 20 ng/ µL.
Volume DNA yang digunakan berkisar antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Volume
DNA yang dibutuhkan untuk pengenceran diperoleh dengan perhitungan :
Tabel 3 Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[dsDNA]
(ng/µL)
112.00
57.20
63.40
55.60
Volume DNA
(µL)
9.82
19.23
17.35
19.78
Volume Buffer
Resuspensi (µL)
45.18
35.77
37.65
35.22
Volume Total
(µL)
55.00
55.00
55.00
55.00
10
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
Fragmentasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu fragmentasi secara
fisik dengan cara sonikasi menggunakan covaris M220. Covaris M220 akan
memotong dan menghasilkan fragmen double stranded DNA dengan ujung 3’
atau 5’ overhang. Setelah difragmentasi dengan teknik sonikasi menggunakan
covaris M220, kemudian dilihat kuantitas DNA dan kemurniannya menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA menurun drastis
karena DNA yang sudah terpotong-potong pada proses fragmentasi ini. Hasil
fragmentasi juga memiliki konsentrasi DNA yang menurun drastis dibandingkan
dengan DNA hasil isolasi. DNA genom hasil fragmentasi memiliki rasio A260/A280
berkisar 1.86 - 2.15 dan rasio A260/A230 berkisar 1.61 – 2.03 yang menunjukkan
kemurnian yang baik (Tabel 4).
Tabel 4 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
13.00
19.10
13.40
18.10
A260
0.26
0.38
0.27
0.36
A280
0.12
0.21
0.13
0.19
A260/A280
2.15
1.86
2.06
1.89
A260/ A230
1.83
1.61
2.03
1.75
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
Tahapan modifikasi ujung fragmen DNA setelah fragmentasi bertujuan
mengubah ujung lengket pada fragmen DNA menjadi ujung tumpul (blunt end).
Hasil end repair diuji secara kuantitas menggunakan spektrofotometer nanodrop
thermoscientific untuk mengetahui konsentrasi DNA dan kemurniannya.
Konsentrasi DNA meningkat drastis dari tahapan fragmentasi. Konsentrasi DNA
tahapan fragmentasi berkisar 13.00 – 19.10 ng/µL meningkat pada tahapan end
repair menjadi kisaran 562.00 – 590.00 ng/µL (Tabel 5). Konsentrasi DNA yang
meningkat dapat disebabkan karena penambahan sample purification beads
sebanyak dua kali. Sample purification beads mengandung manik-manik
paramagnetik yang akan mengikat fragmen DNA dan memisahkannya dari
kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan sehingga DNA yang terjerap semakin
banyak dan konsentrasinya meningkat. Rasio A260/A280 tergolong baik karena
masih dikisaran 1.80 – 2.00.
Tabel 5 Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi
ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
580.00
562.00
590.00
580.70
A260
11.60
11.24
11.80
11.61
A280
5.28
5.08
5.38
5.36
A260/A280
2.20
2.21
2.19
2.39
A260/ A230
2.36
2.38
2.36
2.39
Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung
Ligasi merupakan tahapan terakhir pada pustaka genom. Ligasi adapter
merupakan proses pelekatan indeks atau adapter pada ujung fragmen DNA dan
menyiapkan pengikatan pustaka untuk hibridisasi pada flow cell saat tahapan
11
klasterisasi pustaka genom. Konsentrasi DNA berkisar 4.50 – 13.00 ng/µL dengan
rasio A260/A280 dengan kisaran 1.98 – 4.54 (Tabel 6). Kemurnian yang didapat
tidak murni. Hal ini dapat dikarenakan kontaminasi protein maupun polisakarida
atau dapat dikarenakan beads masih tercampur dengan DNA ketika injeksi ke
spektrofotometer nanodrop thermoscientific.
Tabel 6 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi
adapter
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
13.00
4.50
6.10
9.60
A260
0.26
0.09
0.12
0.19
A280
0.08
0.02
0.03
0.10
A260/A280
3.12
4.54
3.51
1.98
A260/ A230
1.16
0.82
1.58
0.79
Kualitas Pustaka DNA Genom Jagung
Pustaka genom divisualisasikan melalui elektroforegram hasil pengukuran
menggunakan agilent bioanalyzer. Agilent bioanalyzer mengukur semua hasil
pustaka berdasarkan potongan fragmen yang ditempeli adaptor pada salah satu
ujungnya atau pada kedua ujungnya. Genotipe LK2-45 berukuran 638 bp
sedangkan PSG59-8 berukuran 970 bp (Gambar 2). Fragmen DNA yang
dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu berukuran kurang dari 800 bp untuk
mendapatkan hasil sekuensing yang baik karena dapat mempengaruhi intensitas
basa yang dihasilkan. Genotipe PSG59-8 yang berukuran lebih dari 800 bp tetap
diklasterisasi untuk melihat perbandingan hasil sekuensing.
Gambar 2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah).
Analisis kualitatif pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer juga menghasilkan tabel yang memuat ukuran fragmen dan molaritas
sampel hasil pustaka. Molaritas untuk genotipe LK2-45 dan PSG59-8 masingmasing adalah 6.88 dan 10.80 nmol/L (Tabel 7).
Tabel 7 Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk
sekuensing
Genotipe
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
Ukuran Fragmen (bp)
638.00
970.00
Molaritas (nmol/L)
6.88
10.80
12
Analisis kualitatif pustaka genom juga menggunakan elektroforesis
agarose dengan konsentrasi 2 %. Setelah dilektroforesis, hasilnya dianalisis
menggunakan software bioinformatika photocap molecule weight. Kedua genotipe
ini memiliki ukuran yang sama yaitu 658 bp (Gambar 3).
1500 bp
a
b
Gambar 3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B (a) dan LBP54-50 (Pulut) (b).
Sekuensing Pustaka Genom Jagung
Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh
sebanyak 287.1 Gbp atau 287.1 x 109 bp dan memiliki jumlah yang sama dengan
nilai yang diprediksi selama proses sekuensing (projected total yield) 287.1 Gbp
atau 287.1 x 109 bp (Tabel 8). Kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing
ditunjukkan dengan nilai yield perfect dan yield
GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing
Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Syahdan Sayidah Ulfah
NIM G84100059
2
ABSTRAK
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka
Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I
MADE ARTIKA dan I MADE TASMA.
Sekuensing genom total dan analisis genom jagung merupakan salah satu
cara untuk mempercepat peningkatan pemuliaan jagung serta untuk meningkatkan
pemahaman mengenai informasi genetik dan genomik jagung. Tujuan penelitian
ini adalah mengkonstruksi pustaka genom dari empat genotipe jagung di
Indonesia (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)) dan menganalisis kualitas pustaka genom hasil sekuensing genom total.
Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan menempelkan adapter
pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya diklasterisasi dan
disekuensing menggunakan CBOT claster generation dan Next Generation
Sequencing HiSeq2000. Jumlah basa yang dihasilkan selama proses sekuensing
yaitu sebanyak 287.1 Gbp. Klaster pustaka genom yang dihasilkan dengan nilai Q
scores di atas 30 berkisar antara 80.8 – 87.9%. Tingkat kesalahan pembacaan basa
selama proses sekuensing berkisar antara 0.32 – 0.51%. Secara keseluruhan hasil
sekuensing menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom termasuk kategori
ideal.
Kata kunci: jagung, pustaka genom, sekuensing genom total, Next Generation
Sequencing
ABSTRACT
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH. Construction and Quality Analysis of Maize
(Zea mays (L.)) Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Supervised by I
MADE ARTIKA and I MADE TASMA.
Whole genome sequencing and analysis of the maize genome is one of the
ways to accelerate the increase in corn breeding and to improve the understanding
of the genetic and genomic information maize. The purpose of this study is to
construct genomic libraries of four maize genotypes in Indonesia (Sp010BB-3-22-1-B, LK2-45, PSG59-8 (early maturing) and LBP54-50 (pulut)) and analyze the
quality of the results of genomic libraries total genome sequencing. Genomic
library construction performed in vitro by attaching adapters to the ends of DNA
fragments. Clasterization and sequencing of genomic library in this research were
conducted by using cBOT claster generation and Next Generation Sequencing
HiSeq2000. The amount of base produced during the sequencing process as many
as 287.1 Gbp. Cluster genomic library generated with Q values above 30 scores
ranged from 80.8 – 87.9%. Base reading error rate during the sequencing process
was 0.32 – 0.51%. Over all sequencing results showed that quality of the genomic
library cluster was belong to the ideal category.
Keywords: Maize (Zea mays (L.)), Genomic Library, Whole Genome Sequencing,
Next Generation Sequencing (NGS).
3
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM JAGUNG (Zea mays (L.)) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
SYAHDAN SAYIDAH ULFAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
4
5
Judul Skripsi : Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Jagung (Zea
mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total
Nama
: Syahdan Sayidah Ulfah
NIM
: G84100059
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I
Dr Ir I Made Tasma, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
6
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya
sehingga penelitian yang berjudul Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka
Genom Jagung (Zea mays (L.)) untuk Sekuensing Genom Total ini dapat
diselesaikan dengan baik. Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan sejak
bulan Desember 2013 sampai Mei 2014, bertempat di Laboratorium Biologi
Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber
Daya Genetik Pertanian (BB Biogen), Cimanggu, Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada kedua pembimbing penelitian
yaitu Dr Ir I Made Artika MAppSc dan Dr Ir I Made Tasma MSc yang telah
memberikan saran serta kritik yang membangun demi kelancaran penelitian ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ida Rosdianti MSi, Habib Rizjaani
MSi, Titin MSi, Fajar MSi serta Ihsan Mentaya SSi yang bersedia mendampingi
selama kegiatan penelitian serta memberikan masukan. Ucapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada kedua orang tua yang senantiasa memberikan motivasi
serta saran yang baik sehingga usulan penelitian ini dapat terselesaikan dengan
baik. Rekan-rekan terutama Yuliana dan Asep yang telah menjadi partner yang
baik selama kegiatan penelitian berlangsung serta Biokimia 47 yang telah
membantu serta memberikan motivasi, penulis juga mengucapkan terima kasih.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih banyak kekurangan. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk
memperbaiki tulisan ini. Atas kritik dan saran yang diberikan, penulis ucapkan
terima kasih. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan
khususnya biokimia.
Bogor, Oktober 2014
Syahdan Sayidah Ulfah
7
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xi
DAFTAR LAMPIRAN
xi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL
8
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
8
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
8
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
9
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
10
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
10
Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung
10
Kualitas Pustaka Genom Jagung
11
Sekuensing Pustaka Genom Jagung
12
PEMBAHASAN
16
Isolasi DNA Genom Jagung
16
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
16
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
17
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
18
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
18
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
19
Kuantitas Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adapter DNA Genom
Jagung
20
Kualitas Pustaka Genom Jagung
21
Kuantitas Pustaka Genom Jagung
21
Klasterisasi dan Hasil Sekuensing Genom Total DNA Jagung
22
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom Secara Umum
22
8
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom pada Setiap Lajur dalam Flow Cell
23
Tingkat Kesalahan (error rate) dan Intensitas Basa Hasil Sekuensing
24
SIMPULAN DAN SARAN
24
Simpulan
24
Saran
25
DAFTAR PUSTAKA
25
LAMPIRAN
28
RIWAYAT HIDUP
36
9
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific
Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit
2.0 fluorometer
Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik
Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi
Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi
ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung
Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi
adapter
Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk
sekuensing
Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing secara
umum
Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Tingkat kesalahan (error rate) dan intensitas basa hasil sekuensing
9
9
9
10
10
11
11
12
13
16
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA genom total jagung
2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah)
3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B dan LBP54-50 (pulut)
4 Histrogram jumlah klaster genotipe Sp010BB-3-2-2-1 berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan
5 Histogram jumlah klaster genotipe LK2-45 berdasarkan kualitas sekuen
yang dihasilkan
6 Histogram jumlah klaster genotipe PSG59-8 (genjah) berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan
7 Histogram jumlah klaster genotipe LBP54-50 (pulut) berdasarkan kualitas
sekuen yang dihasilkan
8 Intensitas banyaknya larutan sekuensing yang tersisa selama proses
sekuensing berlangsung
9 Presentase basa-basa nitrogen selama proses sekuensing
8
11
12
13
13
14
14
14
15
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian
2 Hasil analisis pustaka genom secara kuantitatif dengan qPCR
3 Tahapan klasterisasi pustaka genom (Illumina 2011)
4 Flow cell Illumina HiSeq2000 (Swiss Federal Institute of Technology
Zurich 2012)
5 Regenerasi Next Generation Sequencing HiSeq2000
28
29
31
32
33
10
Prinsip sekuensing menggunakan Next
HiSeq2000
7 Grafik jumlah densitas klaster setiap lajur
6
Generation
Sequencing
34
35
PENDAHULUAN
Jagung (Zea mays L.) merupakan salah satu tanaman serealia penting yang
tumbuh hampir di seluruh dunia dan digunakan sebagai bahan makanan. Di negara
maju, jagung banyak digunakan untuk pati sebagai bahan pemanis, sirup dan
produk fermentasi, termasuk alkohol. Jagung banyak digunakan untuk bahan baku
pakan di Amerika (Prasanna et al. 2001). Jagung dibutuhkan masyarakat
Indonesia dalam jumlah besar dan terus meningkat, namun tidak diikuti oleh
peningkatan produksi, sehingga terjadi kekurangan sekitar 1,3 juta ton setiap
tahun dan harus dipenuhi melalui import. Menutupi ketersediaan jagung perlu
diupayakan melalui peningkatan produksi. Perakitan varietas unggul baru, berdaya
hasil dan berkualitas tinggi merupakan salah satu upaya untuk mendorong
peningkatan produksi (Azrai 2004).
Produksi tanaman pangan jagung disajikan dalam Berita Resmi Statistik
(BRS) terdiri dari luas panen, produktivitas dan angka produksi jagung. Produksi
jagung pada tahun 2012 mengalami peningkatan sebesar 1,74 juta ton
dibandingkan tahun 2011. Produksi jagung pada tahun 2013 mengalami
penurunan sebesar 0,55 juta ton dibandingkan tahun 2012. Penurunan produksi
diperkirakan terjadi karena penurunan luas panen seluas 66,62 ribu hektar dan
penurunan produktivitas sebesar 0,57 kuintal/hektar (BPS 2013).
Ciri penting ketahanan genetik tanaman jagung terhadap suatu hama atau
penyakit adalah kestabilannya dalam berproduksi, baik pada saat ada hama atau
penyakit maupun pada saat tidak ada hama atau penyakit. Ketahanan genetik
harus dapat memberikan perlindungan yang baik dan menyeluruh dari
kemungkinan kerusakan yang dapat disebabkan oleh suatu penyakit. Penyakit
yang paling banyak menimbulkan kerusakan tanaman jagung di Indonesia adalah
penyakit bulai yang disebabkan oleh strain Peronosclerospora maydis. Penyakit
bulai menyerang di Indonesia secara khusus dan di Asia pada umumnya karena
kondisinya yang tropis (Yen et al. 2004).
Berbagai usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produktivitas jagung.
Salah satu cara untuk meningkatkan produktivitas jagung nasional adalah dengan
perbaikan genetik tanaman. Perbaikan genetik tanaman dipengaruhi oleh isolasi
dan karakterisasi gen. Tahapan tersebut dapat dilakukan dengan memanfaatkan
informasi genomik dan genetik jagung yang diperoleh melalui sekuensing genom
total. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak bergantung pada
penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.
Sekuensing genom total (whole genome sequencing) merupakan proses
penentuan urutan genom suatu organisme yang dilakukan dalam satu waktu.
Sekuensing genom total digunakan untuk mengetahui informasi genomik dan
genetik suatu organisme secara menyeluruh. Instrumen NGS yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu HiSeq 2000 yang dikembangkan oleh Illumina Metode
yang digunakan pada HiSeq 2000 sama seperti pada instrumen NGS yang lainnya
yaitu dengan menggunakan metode sequencing by synthesis. HiSeq 2000
mempunyai kemampuan mengurutkan lebih dari lima genom manusia dalam 30
kali cakupan secara bersamaan, serta mengurutkan lebih dari 192 ekspresi gen.
Instrumen ini menghasilkan 540-600 Gb dengan panjang fragmen 2 x 100 bp
selama 11 hari. Secara umum, terdapat empat tahapan yang dilakukan dalam
sekuensing DNA menggunakan HiSeq 2000 adalah preparasi sampel pustaka
2
DNA, klasterisasi cetakan DNA, sekuensing dan analisis data sekuens (Illumina
2010).
Sekuensing genom total jagung diawali dengan mengkonstruksi pustaka
genom kentang menggunakan Low Throughput Protocol dari illumina dan
disekuensing menggunakan NGS Illumina Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini
relatif sangat mudah dan singkat karena tidak membutuhkan vektor untuk
menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak membutuhkan ruangan khusus untuk
penyimpanan serta tidak membutuhkan DNA dalam jumlah banyak, namun DNA
yang digunakan merupakan DNA double stranded (dsDNA) dengan konsentrasi
rendah (20 ng/uL). Metode konstruksi yang digunakan memiliki prinsip yang
sama dengan konstruksi genom menggunakan metode shotgun sequencing yaitu
fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan DNA genom tidak disisipkan
dalam suatu vektor pada sel inang, namun tahapan setelah fragmentasi DNA
berbeda. Metode shotgun sequencing, DNA yang telah difragmentasi tidak
dilakukan ligasi adapter tetapi langsung dilakukan sekuensing. Fragmen DNA
yang dihasilkan sebelum disekuens, dipreparasi dengan menempelkan adapter
pada ujung fragmen DNA. adapter tersebut pada tahapan selanjutnya (klasterisasi)
akan menempel pada flow cell untuk amplifikasi fragmen DNA melalui metode
bridge amplification (Mardis 2008, Metzker 2010, Commins et al. 2011).
Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan menganalisis kualitas pustaka
genom tanaman jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45,
PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) yang pada tahapan selanjutnya dapat
digunakan untuk pemetaan genom jagung melalui sekuensing dengan
menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq 2000. Hipotesis
penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi pustaka genom jagung empat genotipe
yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut),
kemudian disekuensing menggunakan NGS (Next Generation Sequencing) HiSeq
2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi genetika
dan studi tentang keseluruhan genom jagung. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang
dihasilkan diharapkan mampu untuk pemetaan gen secara fisik pada tahapan
selanjutnya.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun jagung empat
genotipe (Sp010BB-3-2-2-1-B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50
(pulut)), es batu, etanol teknis, nitrogen cair, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil
Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), Chisam (kloroform : isoamil
alkohol dengan perbandingan 24 : 1), isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan
etanol 70%, 0.2 % beta merkaptoetanol dan natrium bisulfit. Bahan-bahan yang
digunakan untuk elektroforesis adalah serbuk agarosa, 1 x TAE, SyBr Gold,
loading dye dan DNA ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk fragmentasi
adalah isolat DNA dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk
modifikasi ujung fragmen DNA adalah end repair control, end repair mix, Sample
Purification Beads, etanol 80 % dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang
3
digunakan untuk adenilasi ujung 3’ DNA adalah A-tailing control dan A-tailing
mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk penempelan adapter adalah ligase
control, DNA ligase mix, DNA adapter index, stop ligase mix, Sample Purification
Beads, etanol 80 %, dan resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk
uji kualitas pustaka genom dengan agilent 2100 bioanalyzer adalah sampel DNA
yang sudah dipustaka, dye mix dan ladder. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji
kualitas pustaka genom menggunakan qPCR adalah sampel yang sudah dipustaka,
buffer qPCR, reagen qPCR dan larutan standar. Bahan-bahan yang digunakan
untuk klasterisasi dan sekuensing genom jagung adalah 2 N NaOH, buffer
hibridisasi, Tris-Cl, buffer library, TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS, Truseq SBS
Kit-HS (200 cycle).
Alat
Alat-alat yang digunakan meliputi mortar, tabung 15 mL, tabung 2 mL,
tabung 1.5 mL, penangas air, inkubator thermostat, sentrifus 5810X, thermolyne
vortex mixer maxi II, mikropipet, tip pipet, nanodrop thermoscientific 2000c, qubit
2.0 fluorometer, tabung covaris AFA Fiber Snap Cap 6x16mm, Covaris M220,
microwave panasonic, microfuge, kotak es, sarung tangan karet, termos, neraca
analitik, cetakan gel, sisir, alat pengering, thermal cycler biometra T1, sudip, gelas
piala, parafilm, power supply, perangkat elektroforesis, kolom elusi gel minElute
Spin, UV Transilluminator DigiDoc-It Imaging System, magnetic stand, mesin
pendingin tropicalized Sansio, cBot Cluster Generation, Agilent 2100
Bioanalyzer, qPCR, High Sensitivity DNA Chip dan Illumina Hiseq 2000.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Doyle & Doyle (1987) yang dimodifikasi
Daun jagung ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletakkan dalam
mortar pestel dan ditambah nitrogen cair dan digerus sampai halus sempurna,
kemudian dimasukan ke dalam Eppendorf 2 ml. Ditambahkan 0,5 ml bufer
ekstraksi CTAB (CTAB: 2%, 1 M Tris-HCl pH 8, 0.5 M EDTA pH 8, NaCl 5 M,
akuades, 0,20% ß-mercaptoetanol dan natrium disulfit. Lima belas menit sebelum
proses ekstraksi, bufer dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 65°C, lalu
contoh daun yang telah ditambah bufer ekstraksi CTAB.
Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi
contoh ke dalam waterbath suhu 65°C selama 60 menit atau sampai fase padat
terpisah dari fase cair. Selanjutnya, tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkan
beberapa menit sampai suhu contoh menurun. Tabung berisi contoh yang telah
diinkubasi lalu ditambah khloroform: isoamil-alkohol (CIA 24:1) 500 μl. Tabung
lalu dikocok menggunakan vortex mixer sampai contoh dann CIA 24:1 tercampur,
kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Bagian atas
contoh yang berupa cairan jernih (supernatan) dipindahkan 500 μl ke dalam
tabung baru.
Supernatan yang sudah bersih dipindahkan ke tabung baru, kemudian
ditambah 500 μl isopropanol dingin. Selanjutnya tabung dibolak-balik secara hatihati untuk melarutkan supernatan dan isopropanol. Tabung contoh lalu disimpan
pada suhu -20°C selama semalam dan tidak boleh kena guncangan. Kemudian
tabung dibolak-balik perlahan dan disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama
4
10 menit. Fase cair dibuang secara perlahan, sedangkan pelet yang tertinggal di
dalam Eppendorf dicuci dengan 500 μl etanol absolut, kemudian dilarutkan
dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan. Larutan kemudian
disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. Fase cair dibuang secara
perlahan, sedangkan pelet dicuci lagi dengan 200 μl etanol 70% dingin,
selanjutnya dilarutkan dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan-lahan.
Larutan kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit. DNA
dikeringkan di udara selama semalam.
Setelah cukup kering, pelet DNA dilarutkan dengan menambahkan 100 μl
bufer TE (1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 g Trisma Base, 0,50 M EDTA pH 8,0,
18,61 g disodium etilen diamin tetra asetat 2H2O). Larutan DNA diinkubasi 65oC
selama 15 menit. Larutan kemudian ditambahkan 2 μl RNAse pada dinding
Eppendorf dan di-spin down dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC selama 30 menit.
Jika tidak langsung digunakan, DNA disimpan pada suhu -20°C. Penyimpanan
pada suhu -20°C ini dilakukan agar DNA tidak rusak dan dalam kualitas yang
baik.
Analisis Kualitas dan Kuantitas Isolasi DNA
Analisis kualitatif isolasi DNA (Sambrook & Russel 2001 yang
dimodifikasi). Uji ini menggunakan metode elektroforesis gel agarosa. Sampel
DNA diambil sebanyak 3 μL dan dielektroforesis dengan konsentrasi 1 % selama
30 menit pada kuat arus 100 V ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1x.
Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran loading dye 6x, SyBr Gold
100x dan molecular water. Setelah itu marker dibuat dengan campuran DNA
ladder 100 bp plus dan SyBr Gold 100x. Loading buffer dan marker ini divorteks.
Kemudian diinjeksikan ke dalam sumur elektroforesis beserta sampel yang telah
diisolasi.
Analisis kuantitatif isolasi DNA (Invitrogen 2010). Uji kuantitatif ini
menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific dan Qubit 2.0
fluorometer. Metode menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific
sebanyak 1 μL sampel diambil dan dianalisis. Metode menggunakan fluorometer,
sebanyak 200 μL buffer Qubit disiapkan masing-masing untuk dua larutan standar
dan larutan yang berisi sampel. Sebanyak 190 μL working solution ditambahkan
10 μL larutan standar 0 ng, kemudian untuk larutan standar 2 sebanyak 190 μL
working solution ditambahkan 10 μL larutan standar 10 ng. Sebanyak 198 μL
working solution ditambahkan 2 μL sampel. Kemudian semua larutan divortex
selama 3 detik dan diinkubasi selama 2 menit. Larutan standar 1 dan standar 2
serta sampel dibaca pada alat fluorometer.
Konstruksi Pustaka Genom (TruSeq DNA low throughput protocol 2010)
Fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA dilakukan dengan menggunakan
metode sonikasi DNA. DNA yang sudah dilarutkan dengan Resuspension Buffer
sampai 55 μL diletakkan dalam tabung covaris sebanyak 52.5 μL. Kemudian
difragmentasi menggunakan alat covaris. Sebanyak 50 μL sampel yang telah
difragmentasi, dipindahkan ke dalam tabung PCR 0.3 ml. Kemudian sebanyak 80
μL Sample Purification Beads yang telah divortex, ditambahkan ke dalam sampel
tersebut dan diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand
5
selama 8 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian buang 125
μL supernatan tanpa menggangu beads. Kemudian pencucian pelet dilakukan
secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30
detik, selanjutnya, etanol 80% dibuang. Pelet kemudian dikeringkan selama 5
menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari magnetic stand. Setelah itu,
tambahkan 52.5 μL Resuspension Buffer dan tabung PCR diangkat dari magnetic
stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit dan diinkubasi pada
magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dipindahkan sebanyak 50 μL ke dalam
tabung PCR 0.3 ml yang baru.
Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Sebanyak 10 μL End repair control
dan 40 μL End Repair Mix ditambahkan dalam tabung hasil fragmentasi. Sampel
dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10
kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler
selama 30 menit pada suhu 30oC. Kemudian tabung diangkat dari thermal cycler.
Diluted beads mixture dibuat terlebih dahulu dengan komposisi 109.25 μL sample
purification buffer dan 74.75 μL nuclease free water untuk 1 sampel. Sebanyak
160 μL diluted beads mixture yang telah divortex ditambahkan ke dalam sampel,
kemudian diaduk dengan pipet mikro sebanyak 10 kali. Sampel tersebut
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan diinkubasi pada magnetic stand
selama 5 menit. Sampel tetap berada pada magnetic stand, kemudian transfer 125
μL supernatan tanpa menggangu beads dan lakukan sebanyak 2 kali. Kemudian
30 μL sample purification beads yang telah divortex selama 1 menit ditambahkan
ke dalam sampel. Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan
diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan dibuang sebanyak
276 μL. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80% dibuang.
Pelet kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
magnetic stand. Kemudian tambahkan 17.5 μL Resuspension Buffer dan tabung
PCR diangkat dari magnetic stand. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2
menit dan diinkubasi pada magnetic stand selama 5 menit. Supernatan
dipindahkan sebanyak 15 μL ke dalam tabung PCR 0.3 ml yang baru.
Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 μL dan A-tailing mix 12.5
μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung
yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermal cycler selama 30 menit
pada suhu 37oC, 70oC selama 5 menit dan 4oC selama 5 menit.
Penempelan Adapter. Ligase control 2.5 μL, DNA Ligase Mix 2 2.5 μL
dan DNA Adapter Index 2.5 μL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel.
Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam
thermal cycler selama 10 menit pada suhu 30oC. Sebanyak 5 μL Stop Ligase Mix
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian,sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Langkah
selanjutnya yaitu pemurnan sampel yang diawali dengan penambahan 42.5 μL
Sample Purification Beads yang telah divorteks ke dalam sampel. Sampel
dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10
kali. Campuran sampel dan Sample Purification Beads diinkubasi selama 5 menit
pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam
6
magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 80 μL supernatan
dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada
dinding tabung.
Ulangi tahapan sebelumnya untuk menghilangkan supernatan yang masih
tersisa. Pencucian pelet dilakukan secara duplo, sebanyak 200 μL etanol 80%
ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik, selanjutnya etanol 80%. Pelet
kemudian dikeringkan selama 5 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
magnetic stand. Resuspension buffer sebanyak 52.5 μL ditambahkan ke dalam
tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan
cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, sampel diinkubasi selama 2
menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan dalam
magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit untuk memisahkan supernatan
dengan pelet. Sample purification beads ditambahkan sebanyak 50 μL dan
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian
dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang selama 5 menit.
Kemudian sebanyak 95 μL supernatan dibuang dengan hati-hati jangan
sampai mengenai pelet yang terletak pada dinding tabung. Pencucian pelet,
sebanyak 200 μL etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik.
Selanjutnya, etanol 80% yang telah ditambahkan dibuang dan tahapan
penambahan etanol 80% diulangi kembali satu kali. Pelet kemudian dikeringkan
selama 5 menit pada suhu ruang. Sample purification beads ditambahkan
sebanyak 22.5 μL dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang
berisi sampel kemudian dipindahkan dalam magnetic stand pada suhu ruang
selama 5 menit. Sebanyak 20 μL supernatan dipindahkan ke dalam tabung PCR
0.3 ml yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin.
Analisis Pustaka Genom Jagung
Analisis pustaka genom dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif untuk
mengecek ukuran pustaka genom dan mengetahui konsentrasi dari pustaka genom
yang dihasilkan memenuhi persyaratan untuk sekuensing menggunakan next
generation sequencing HiSeq 2000. Syarat-syarat tersebut yaitu memiliki panjang
fragmen sekitar 300-500 bp dengan konsentrasi 10 nM.
Analisis kualitas pustaka genom (Agilent Technologies 2003). Uji ini
digunakan untuk mengetahui ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang
dilakukan dengan mengikuti protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. High
Sensitivity DNA Chip diletakkan di atas priming station chip dan kemudian ke
dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix kemudian ditekan
menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah dibuka kemudian ke dalam
lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 μL dye mix dan marker pada masingmasing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke dalam lubang ladder
ditambahkan 1 μL High Sensitivity DNA ladder. Selanjutnya 1 μL sampel
dimasukkan ke dalam lubang sampel. Chip kemudian divorteks selama 1 menit
dan kemudian di-running pada alat agilent 2100 bioanalyzer yang terhubung
dengan komputer. Kualitas ukuran pustaka juga menggunakan metode
elektroforesis agarose 2 %. Sampel yang digunakan merupakan sampel hasil dari
qPCR. Kemudian hasil elektroforegram dianalisis dengan menggunakan software
bioinformatika photocap molecule weight.
7
Analisis kuantitas pustaka genom (Sigma 2008). Tahapan ini dilakukan
untuk mengetahui jumlah atau konsentrasi pustaka genom yang mencukupi
sebagai syarat untuk proses klasterisasi. Sampel dibuat sebanyak triplo dan setiap
ulangan dibuat tiga pengenceran berbeda, yaitu 1:1000, 1:2000 dan 1:4000.
Sebanyak 1 μL sampel dilarutkan dalam 999 μL buffer qPCR, kemudian divorteks
selama 10 detik. Pada ulangan ke dua yaitu sebanyak 100 μL sampel yang telah
dilarutkan ditambahkan ke dalam 100 μL buffer qPCR dan untuk ulangan ketiga
sebanyak 100 μL sampel dari ulangan 2 ditambahkan ke dalam 100 μL buffer
qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak 4 ul
dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan. Kemudian tabung PCR
dimasukkan ke dalam alat qPCR dan di-running selama 2 jam. Hasil yang
diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka genom. Sebelum
klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka genom yang
dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer pustaka (TrisCl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).
Klasterisasi Pustaka Genom Jagung (cBot cluster generation protocol 2010)
Klaterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua
tahapan, yaitu denaturasi dengan menggunakan 2 N NaOH dan pelarutan DNA
dalam buffer hibridisasi. Denaturasi diawali dengan penambahan 17 μL Tris-Cl 10
mM, pH 8.5 dan 1 μL 2 N NaOH ke dalam 2 μL sampel DNA sehingga diperoleh
konsentrasi DNA sebesar 1 nM. Campuran tersebut kemudian divorteks sampai
homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk
mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah
didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan
dilakukan.
Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer
hibridisasi. Tahapan ini diawali dengan pengenceran 1 nM DNA hasil denaturasi
menjadi DNA yang memiliki konsentrasi 5 pM, 6 pM, 7 pM dan 8 pM.
Konsentrasi tersebut didapat dari pengenceran 5 μL dalam 995 μL (5 pM), 6 μL
dalam 994 μL (6 pM), 7 μL dalam 993 μL (7 pM) dan 8 μL dalam 992 μL (8 pM).
Sebanyak 120 μL control library disiapkan dalam tabung pertama dalam suatu
lajur yang memiliki 8 tabung untuk digunakan sebagai kontrol dalam flow cell.
Sampel DNA yang telah diencerkan sebelumnya kemudian dipindahkan dalam
tabung yang lain dalam lajur tersebut. Posisi sampel dicatat dan tabung disimpan
dalam mesin pendingin sampai sampel akan dimasukkan kedalam cBot Cluster
Generation.
Sekuensing Pustaka Genom Jagung (HiSeq 2000 protocol 2011)
Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari
beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,
pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).
Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS
kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut
dimasukkan kedalam rak reagen compartment yang terdapat dalam Illumina
Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing dilakukan melalui Hiseq
control software interface. Parameter yang tersedia diantaranya flow cell ID,
8
experiment, user name, flow cell type, control lane, output folder,confirm first
base, keep intensity files, existing recipe, save image dan align lanes. Tahapan
selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah diklasterisasi melalui cBot
cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing dilakukan selama sekitar 11
hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus. Tahapan terakhir setelah
proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan dipindahkannya flow cell dari
flow cell stage dan dilakukannya post-run sequencing yaitu maintenance wash.
Tahapan maintenance wash terdiri dari pembilasan dengan menggunakan air dan
NaOH.
HASIL
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kualitatif
Isolasi DNA genom jagung empat genotipe yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) diuji secara kualitatif
menggunakan metode elektroforesis gel agarose dengan konsentrasi 1%. Keempat
genotipe ini menunjukkan hasil yang baik. Hal ini ditunjukkan dengan intensitas
pita DNA yang jelas dan terang. Masih terdapatnya RNA ditunjukkan dengan
adanya intensitas pita DNA pada dasar sumur gel. DNA yang dihasilkan juga
merupakan DNA genom karena DNA yang dihasilkan berukuran besar, yaitu
lebih dari 1500 bp (Gambar 1).
1500 bp
a
b
c
d
e
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom total jagung. DNA marker (a), Sp010BB3-2-2-1-B (b), LK2-45 (c), PSG59-8 (genjah) (d) dan LBP54-50
(pulut) (e).
Isolasi DNA Genom Jagung secara Kuantitatif
Uji kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific
dilakukan untuk mengetahui konsentrasi DNA serta kemurnian DNA terhadap
protein dan polisakarida. Keempat genotipe jagung yaitu Sp010BB-3-2-2-1-B,
LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut) menunjukkan hasil yang baik
dengan konsentrasi DNA yang tinggi berkisar 745.10 ng/µL – 2547.20 ng/µL
serta rasio kemurnian A260/A280 (terhadap protein) dan A260/A230 (terhadap
polisakarida) masing-masing berkisar 1.97 – 2.03 dan 2.03 – 2.17 (Tabel 1). Rasio
kemurnian terhadap protein dan polisakarida ditunjukkan dengan hasil yang baik.
9
Tabel 1 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom total jagung menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
1303.00
2547.20
1788.40
745.10
A260
26.06
50.94
35.77
14.90
A280
12.85
25.76
17.68
7.55
A260/A280
2.03
1.98
2.02
1.97
A260/A230
2.03
2.06
2.17
2.15
Uji kuantitas DNA menggunakan Qubit 2.0 fluorometer dilakukan untuk
mengetahui konsentrasi DNA double stranded yang menjadi tolak ukur dalam
pustaka genom dengan konsentrasi minimal 20 ng/µL. Qubit 2.0 fluorometer
berbeda dengan spektrofotometer nanodrop thermoscientific karena Qubit 2.0
fluorometer hanya menghitung double stranded DNA yang akan digunakan untuk
konstruksi pustaka genom, kemudian disekuensing. Qubit 2.0 fluorometer
memiliki akurasi yang baik karena mampu mendeteksi konsentrasi double
stranded DNA dalam konsentrasi yang rendah. Konsentrasi double stranded DNA
memenuhi prasyarat tersebut dengan kisaran 55.60 – 112.00 ng/µL (Tabel 2).
Tabel 2 Kuantitas double stranded DNA genom total jagung menggunakan Qubit
2.0 fluorometer
Genotipe
[DNA]
(µg/mL)
1.12
0.57
0.63
0.55
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
Faktor
Dilusi
100.00
100.00
100.00
100.00
[dsDNA]
(ng/µL)
112.00
57.20
63.40
55.60
Konsentrasi DNA double stranded untuk Pustaka Genom Jagung
DNA genom yang dibutuhkan untuk konstruksi pustaka genom harus
memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. DNA genom yang digunakan harus
utuh, sedikit mengandung fragmen DNA yang berukuran kecil serta memiliki
konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi DNA double stranded yang telah diukur
menggunakan Qubit 2.0 fluorometer, diencerkan dengan buffer resuspensi
mencapai volume 55 µL untuk memulai proses fragmentasi. Buffer resuspensi ini
akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil serta dapat
melarutkan kembali DNA. DNA diencerkan dengan konsentrasi 20 ng/ µL.
Volume DNA yang digunakan berkisar antara 9.82 – 19.78 µL (Tabel 3). Volume
DNA yang dibutuhkan untuk pengenceran diperoleh dengan perhitungan :
Tabel 3 Volume DNA genom jagung yang digunakan untuk uji pustaka genomik
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[dsDNA]
(ng/µL)
112.00
57.20
63.40
55.60
Volume DNA
(µL)
9.82
19.23
17.35
19.78
Volume Buffer
Resuspensi (µL)
45.18
35.77
37.65
35.22
Volume Total
(µL)
55.00
55.00
55.00
55.00
10
Kuantitas Hasil Fragmentasi DNA Genom Jagung
Fragmentasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu fragmentasi secara
fisik dengan cara sonikasi menggunakan covaris M220. Covaris M220 akan
memotong dan menghasilkan fragmen double stranded DNA dengan ujung 3’
atau 5’ overhang. Setelah difragmentasi dengan teknik sonikasi menggunakan
covaris M220, kemudian dilihat kuantitas DNA dan kemurniannya menggunakan
spektrofotometer nanodrop thermoscientific. Konsentrasi DNA menurun drastis
karena DNA yang sudah terpotong-potong pada proses fragmentasi ini. Hasil
fragmentasi juga memiliki konsentrasi DNA yang menurun drastis dibandingkan
dengan DNA hasil isolasi. DNA genom hasil fragmentasi memiliki rasio A260/A280
berkisar 1.86 - 2.15 dan rasio A260/A230 berkisar 1.61 – 2.03 yang menunjukkan
kemurnian yang baik (Tabel 4).
Tabel 4 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA genom jagung hasil fragmentasi
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
13.00
19.10
13.40
18.10
A260
0.26
0.38
0.27
0.36
A280
0.12
0.21
0.13
0.19
A260/A280
2.15
1.86
2.06
1.89
A260/ A230
1.83
1.61
2.03
1.75
Kuantitas Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA Genom Jagung (End
Repair)
Tahapan modifikasi ujung fragmen DNA setelah fragmentasi bertujuan
mengubah ujung lengket pada fragmen DNA menjadi ujung tumpul (blunt end).
Hasil end repair diuji secara kuantitas menggunakan spektrofotometer nanodrop
thermoscientific untuk mengetahui konsentrasi DNA dan kemurniannya.
Konsentrasi DNA meningkat drastis dari tahapan fragmentasi. Konsentrasi DNA
tahapan fragmentasi berkisar 13.00 – 19.10 ng/µL meningkat pada tahapan end
repair menjadi kisaran 562.00 – 590.00 ng/µL (Tabel 5). Konsentrasi DNA yang
meningkat dapat disebabkan karena penambahan sample purification beads
sebanyak dua kali. Sample purification beads mengandung manik-manik
paramagnetik yang akan mengikat fragmen DNA dan memisahkannya dari
kelebihan pereaksi-pereaksi yang digunakan sehingga DNA yang terjerap semakin
banyak dan konsentrasinya meningkat. Rasio A260/A280 tergolong baik karena
masih dikisaran 1.80 – 2.00.
Tabel 5 Kuantitas dan rasio kemurnian fragmen DNA setelah tahapan modifikasi
ujung fragmen DNA pada preparasi konstruksi pustaka genom jagung
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
580.00
562.00
590.00
580.70
A260
11.60
11.24
11.80
11.61
A280
5.28
5.08
5.38
5.36
A260/A280
2.20
2.21
2.19
2.39
A260/ A230
2.36
2.38
2.36
2.39
Kuantitas Hasil Ligasi Adapter DNA Genom Jagung
Ligasi merupakan tahapan terakhir pada pustaka genom. Ligasi adapter
merupakan proses pelekatan indeks atau adapter pada ujung fragmen DNA dan
menyiapkan pengikatan pustaka untuk hibridisasi pada flow cell saat tahapan
11
klasterisasi pustaka genom. Konsentrasi DNA berkisar 4.50 – 13.00 ng/µL dengan
rasio A260/A280 dengan kisaran 1.98 – 4.54 (Tabel 6). Kemurnian yang didapat
tidak murni. Hal ini dapat dikarenakan kontaminasi protein maupun polisakarida
atau dapat dikarenakan beads masih tercampur dengan DNA ketika injeksi ke
spektrofotometer nanodrop thermoscientific.
Tabel 6 Kuantitas dan rasio kemurnian DNA cetakan setelah tahapan ligasi
adapter
Genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
LBP54-50 (Pulut)
[DNA] (ng/µL)
13.00
4.50
6.10
9.60
A260
0.26
0.09
0.12
0.19
A280
0.08
0.02
0.03
0.10
A260/A280
3.12
4.54
3.51
1.98
A260/ A230
1.16
0.82
1.58
0.79
Kualitas Pustaka DNA Genom Jagung
Pustaka genom divisualisasikan melalui elektroforegram hasil pengukuran
menggunakan agilent bioanalyzer. Agilent bioanalyzer mengukur semua hasil
pustaka berdasarkan potongan fragmen yang ditempeli adaptor pada salah satu
ujungnya atau pada kedua ujungnya. Genotipe LK2-45 berukuran 638 bp
sedangkan PSG59-8 berukuran 970 bp (Gambar 2). Fragmen DNA yang
dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu berukuran kurang dari 800 bp untuk
mendapatkan hasil sekuensing yang baik karena dapat mempengaruhi intensitas
basa yang dihasilkan. Genotipe PSG59-8 yang berukuran lebih dari 800 bp tetap
diklasterisasi untuk melihat perbandingan hasil sekuensing.
Gambar 2 Elektroforegram hasil pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer genotipe LK2-45 dan PSG59-8 (genjah).
Analisis kualitatif pustaka genom jagung menggunakan agilent
bioanalyzer juga menghasilkan tabel yang memuat ukuran fragmen dan molaritas
sampel hasil pustaka. Molaritas untuk genotipe LK2-45 dan PSG59-8 masingmasing adalah 6.88 dan 10.80 nmol/L (Tabel 7).
Tabel 7 Ukuran fragmen dan konsentrasi DNA hasil pustaka genom untuk
sekuensing
Genotipe
LK2-45
PSG59-8 (Genjah)
Ukuran Fragmen (bp)
638.00
970.00
Molaritas (nmol/L)
6.88
10.80
12
Analisis kualitatif pustaka genom juga menggunakan elektroforesis
agarose dengan konsentrasi 2 %. Setelah dilektroforesis, hasilnya dianalisis
menggunakan software bioinformatika photocap molecule weight. Kedua genotipe
ini memiliki ukuran yang sama yaitu 658 bp (Gambar 3).
1500 bp
a
b
Gambar 3 Elektroforegram hasil pustaka genom yang sudah di qPCR genotipe
Sp010BB-3-2-2-1-B (a) dan LBP54-50 (Pulut) (b).
Sekuensing Pustaka Genom Jagung
Jumlah basa hasil sekuensing empat genotipe jagung (Sp010BB-3-2-2-1B, LK2-45, PSG59-8 (genjah) dan LBP54-50 (pulut)) secara total diperoleh
sebanyak 287.1 Gbp atau 287.1 x 109 bp dan memiliki jumlah yang sama dengan
nilai yang diprediksi selama proses sekuensing (projected total yield) 287.1 Gbp
atau 287.1 x 109 bp (Tabel 8). Kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing
ditunjukkan dengan nilai yield perfect dan yield