Konstruksi pustaka genom dan sekuensing genom total Kakao (Theobroma cacao L.)
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM DAN SEKUENSING
GENOM TOTAL KAKAO (Theobroma cacao L.)
ASEP DIDI SURYADI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi Pustaka
Genom dan Sekuensing Genom Total Kakao (Theobroma cacao L.) adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Skripsi ini disusun
berdasarkan hasil penelitian pada proyek sekuensing genom kakao di Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian
(BB-Biogen) Bogor tahun 2014. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Asep Didi Suryadi
NIM G84100016
ABSTRAK
ASEP DIDI SURYADI. Konstruksi Pustaka Genom dan Sekuensing Genom Total
Kakao (Theobroma cacao L.). Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan HABIB
RIJZAANI.
Tersedianya sekuen genom rujukan kakao (Theobroma cacao L.)
memungkinkan seluruh potensi variasi genetik tanaman kakao lain dapat dibaca
dan dimanfaatkan untuk pemuliaan melalui pembacaan menyeluruh genomnya
menggunakan next generation sequencing (NGS). Penelitian ini menerangkan
modifikasi metode CTAB untuk isolasi DNA genomik kakao yang mengandung
polisakarida dan polifenol tinggi, konstruksi pustaka DNA genom serta
sekuensing genom total kakao dengan menggunakan metode dari Illumina. DNA
genomik berkualitas tinggi yang ditunjukkan dengan keutuhan molekul telah
dihasilkan. Pustaka genom yang telah dikonstruksi berukuran 314-485 bp. Basa
yang dihasilkan mencapai 391.93 Gbp, dengan ukuran genom mencapai 566.9
Mbp. Kualitas bacaan NGS yang dihasilkan cukup tinggi dengan 67.9-81.3%
bacaan memiliki nilai kualitas di atas Q30. Kesalahan yang terjadi sebesar 0.201.14%. Pustaka genom yang telah dikonstruksi memiliki kualitas yang baik dan
data sekuensing yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis lanjutan.
Kata kunci: isolasi DNA, next generation sequencing, pustaka genom, Theobroma
cacao L.
ABSTRACT
ASEP DIDI SURYADI. Genomic Library Construction and Whole Genome
Sequencing of Cocoa (Theobroma cacao L.). Supervised by I MADE ARTIKA
and HABIB RIJZAANI.
The availability of reference genome sequence of cocoa (Theobroma cacao
L.) allows the full potential of the other cocoa plant genetic variation to be read
and used for breeding through whole genome reading by next generation
sequencing (NGS). This study describes a modification of CTAB method for
extracting genomic DNA contains high polysaccharides and polyphenols,
genomic library construction and whole genome sequencing using methods by
Illumina. High quality of genomic DNA indicated by integrity of the molecule
have been produced. Genomic libraries have been constructed were 314-485 bp in
size. Base generated reach 391.93 Gbp, with genome size reach 566.9 Mbp. The
quality of readings by NGS high enough with 67.9-81.3% of reading has quality
value above Q30. Error rate occurs at 0.20-1.14%. Genomic library have been
constructed possesses good quality and the data from sequencing were ready for
further analysis.
Keywords: DNA extraction, genome library, next generation sequencing,
Theobroma cacao L.
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM DAN SEKUENSING
GENOM TOTAL KAKAO (Theobroma cacao L.)
ASEP DIDI SURYADI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat
dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah
dari hasil penelitian yang dilakukan sejak bulan Januari hingga Juni 2014 ini
berjudul Konstruksi Pustaka Genom dan Sekuensing Genom Total Kakao
(Theobroma cacao L.).
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir I Made Artika,
MAppSc dan Bapak Habib Rijzaani, MSi sebagai pembimbing, serta Bapak Dr I
Made Tasma yang telah banyak memberi saran. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga atas doa dan kasih sayang, serta
kepada keluarga besar Pinus merkusii dan Biokimia 47 atas dukungan yang telah
diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan dan kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Juni 2014
Asep Didi Suryadi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
x
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
1
METODE PENELITIAN
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur
3
HASIL
8
DNA Genom Hasil Isolasi
8
Konsentrasi dan Kemurnian DNA Selama Konstruksi Pustaka Genom
9
Hasil Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka DNA Genom
PEMBAHASAN
11
13
DNA Genom Kakao Hasil Isolasi
13
Fragmentasi dan Modifikasi Ujung Fragmen DNA
14
Adenilasi dan Ligasi Adaptor
15
Purifikasi dan Perbanyakan Fragmen DNA
16
Validasi Pustaka DNA Genom
16
Klasterisasi Pustaka DNA Genom
17
Sekuensing DNA Genom
17
SIMPULAN DAN SARAN
20
Simpulan
20
Saran
21
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
23
RIWAYAT HIDUP
33
DAFTAR TABEL
1 Hasil pengujian konsentrasi dan kemurnian DNA kakao menggunakan
spektrofotometer nanodrop
2 Hasil pengujian konsentrasi dsDNA kakao menggunakan fluorometer
3 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahap fragmentasi dan
modifikasi ujung fragmen
4 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahap adenilasi dan ligasi
adaptor
5 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahap purifikasi dan
amplifikasi
6 Rerata ukuran dan molaritas fragmen DNA hasil validasi pustaka DNA
genom
7 Jumlah basa dan kualitas kaster pustaka genom
8 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
9 Jumlah basa dan pembacaan sekuensing setiap genotipe
8
8
9
9
10
11
11
11
12
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA hasil isolasi: DNA penanda (M), DR1 (1), DR2
(2), DR38 (3), NIE7 (4), PA300 (5), RCC70 (6), SD6225 (7), TSH858
(8), dan UIT1 (9)
2 Elektroforegram hasil bioanalyzer pada tahap validasi pustaka DNA
genom: DNA penanda (ladder), DR1 (1), DR2 (2), NIE7 (3), SD6225
(4)
3 Elektroforegram pada tahap validasi pustaka DNA genom: DNA
penanda (M), DR38 (5), PA300 (6), RCC70 (7), TSH858 (8), UIT1 (9)
4 Perkiraan ukuran genom masing-masing genotipe
5 Kesalahan berdasarkan urutan posisi basa
9
10
10
12
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Jumlah dan densitas klaster pustaka genom serta persentase phasing
dan prephasing selama proses sekuensing
3 Panjang fragmen yang dimasukkan dalam setiap lajur selama proses
sekuensing
4 Jumlah klaster berdasarkan Q30 score
5 Distribusi kualitas setiap posisi basa
6 Histogram perkiraan ukuran fragmen
7 Perkiraan proporsi penggandaan fragmen
8 Rataan kualitas basa berdasarkan posisinya
9 Fraksi basa pada Q30 berdasarkan posisinya
10 Persentase GC content
23
24
25
26
27
28
28
29
29
30
PENDAHULUAN
Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu komoditas yang penting
bagi negara Indonesia, terutama dalam memenuhi permintaan ekspor, yaitu
sebagai bahan baku pembuatan cokelat. Biji kakao digunakan sebagai bahan baku
produksi cokelat karena memiliki kandungan gizi yang tinggi serta menghasilkan
cokelat dengan rasa yang enak. Menurut Wahyudi et al. (2008), biji kakao
mengandung sekitar 50% lemak nabati, 15% karbohidrat, dan sisanya berupa
pektin, lendir, dan getah. Selain itu, biji kakao juga mengandung senyawa
polifenol yang cukup tinggi, diantaranya katekin (33-42%), leukosianidin (2325%), dan antosianin (5%) (Kusuma et al. 2013).
Menurut Pusat Penelitian Kopi dan Kakao (2007), kualitas biji kakao yang
dihasilkan di Indonesia masih relatif rendah walaupun secara kuantitas mengalami
peningkatan setiap tahunnya. Rendahnya produksi kakao Indonesia disebabkan
oleh beberapa faktor, yaitu serangan hama, pemakaian benih yang tidak unggul,
serta masalah pembungaan dan layu buah (Ditjen Perkebunan 2006). Upaya yang
dapat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas kakao adalah dengan
perbaikan genetik tanaman.
Teknik perbaikan genetik tanaman kakao melibatkan prosedur isolasi DNA
serta membutuhkan informasi genomik dan genetik tanaman kakao. Informasi
tersebut dapat diperoleh dengan cara sekuensing genom total kakao. Penelitian
mengenai sekuensing genom kakao sangat penting mengingat banyak genotipe
kakao yang masih belum diketahui sekuennya. Sekuen yang telah dihasilkan
kemudian dibandingkan dengan sekuen rujukan kakao yang telah diperoleh dan
dapat diakses dengan mudah. Adanya sekuen rujukan tersebut dapat dimanfaatkan
untuk mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam meningkatkan produktivitas
dan ketahanan tanaman kakao (Argout et al. 2011).
Tahap yang dilakukan sebelum sekuensing DNA genom adalah isolasi DNA
dan konstruksi pustaka genom. Tahap isolasi DNA dilakukan untuk memperoleh
molekul DNA dari suatu organisme. Isolasi DNA meliputi tahap pemecahan
dinding sel agar molekul DNA dapat dikeluarkan dari sel, deproteinasi untuk
menghilangkan protein dan kontaminan lain, serta pemekatan DNA untuk
memperoleh utas-utas DNA (Walker & Wilson 2000).
Konstruksi pustaka genom yang biasa dilakukan yaitu dengan menyisipkan
fragmen DNA yang telah diisolasi ke dalam suatu vektor tertentu. Teknik
konstruksi pustaka genom yang berkembang akhir-akhir ini melibatkan tahap
fragmentasi dan modifikasi fragmen DNA dengan menempelkan adaptor ke
ujung-ujung fragmen tersebut untuk membentuk suatu pustaka genom.
Berdasarkan protokol dari Illumina (2010a), pustaka DNA genom yang akan
disekuensing harus memiliki panjang fragmen kurang dari 800 bp dan konsentrasi
minimal 2 ng/µL. Pustaka genom yang telah dikonstruksi kemudian disekuensing
untuk memperoleh urutan nukleotida secara lengkap (Illumina 2008).
Terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk proses sekuensing
DNA genom, antara lain adalah metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger
(Sanger et al. 1975). Kedua metode tersebut dinilai memiliki beberapa
kekurangan dalam hal efektifitas dan jumlah basa yang berhasil disekuensing.
Kekurangan tersebut dapat diminimalkan dengan menggunakan teknologi next
2
generation sequencing (NGS) yang dapat mengurutkan genom total dan
menghasilkan sekuen dalam jumlah yang cukup banyak (Metzker 2010).
Instrumen yang digunakan untuk sekuensing dalam penelitian ini adalah NGS
HiSeq2000. Instrumen ini dapat membaca suatu untai DNA sepanjang 2×100 bp
dan menghasilkan data sebesar 200 Gbp dengan akurasi mencapai 99.5% (Zhang
et al. 2011).
Beberapa tanaman perkebunan telah disekuensing dengan menggunakan
NGS HiSeq2000, contohnya kedelai (Kosasih 2012), kopi (Healey et al. 2014),
dan tiga genotipe kakao (ICCR02, ICCR04, dan SUL02) yang dilakukan oleh
Tasma et al. (2012). Penelitian tersebut menyebutkan bahwa pustaka genom yang
telah dikonstruksi memiliki kualitas yang ideal untuk digunakan dalam tahap
sekuensing serta data sekuen yang dihasilkan dapat digunakan untuk identifikasi
marka dan gen-gen yang diinginkan (Tasma et al. 2012).
Informasi mengenai konstruksi pustaka genom kakao dan hasil sekuensing
genom kakao masih terbatas, sehingga usaha peningkatan produksi biji kakao juga
masih mengalami hambatan. Untuk itu perlu dilakukan suatu penelitian mengenai
sekuensing genom kakao. Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi pustaka genom
kakao sehingga dapat digunakan untuk membaca genom kakao dengan
menggunakan next generation sequencing HiSeq2000. Hasil konstruksi pustaka
genom dan sekuensing genom kakao akan memungkinkan terkumpulnya
informasi genetik dan genomik tanaman kakao berbagai genotipe melalui teknik
next generation sequencing. Kualitas hasil sekuensing dan urutan DNA yang
diperoleh dapat digunakan dalam berbagai bidang, misalnya pemetaan gen dan
identifikasi marka molekuler yang sangat diperlukan dalam bidang bioteknologi
dan pemuliaan tanaman kakao. Koleksi marka molekuler yang digunakan untuk
mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam pengendalian ekspresi tertentu
tanaman kakao juga dapat membantu memperpendek siklus pemuliaaan tanaman
kakao.
Hipotesis penelitian ini adalah konstruksi pustaka genom kakao dapat
dilakukan untuk sekuensing genom total dengan menggunakan instrumen NGS
HiSeq2000. Penelitian ini diawali dengan isolasi DNA dari sampel daun kakao
yang sebelumnya telah disimpan dalam mesin pendingin, kemudian dilanjutkan
dengan konstruksi pustaka genom, klasterisasi, dan sekuensing genom total.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA kakao adalah daun kakao
dari sembilan genotipe, yaitu DR1, DR2, DR38, NIE7, PA300, RCC70, SD6225,
TSH858, dan UIT1, nitrogen cair, bufer ekstraksi (NaCl 5 M, PVP 4%, βmerkaptoetanol 1%, CTAB 2%, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA pH 8, dan
akuades), kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v), kloroform, isopropanol dingin,
etanol 80%, dan Nuclease Free Water (NFW). Bahan-bahan yang digunakan
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif DNA hasil isolasi serta purifikasi produk
ligasi adalah serbuk agarose, bufer TAE 1×, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder
3
100 bp, Qubit reagent, Qubit buffer, dan Qubit standard. Bahan yang digunakan
untuk fragmentasi DNA adalah resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan
untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah End Repair Control dan End Repair
Mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH adalah A-Tailing
Mix dan A-Tailing Control. Bahan-bahan yang digunakan untuk ligasi adaptor
adalah Ligase Mix, Ligase Control, Stop Ligase Mix, dan Adapter Index. Tahap
amplifikasi atau perbanyakan fragmen DNA menggunakan PCR Master Mix dan
PCR Primer Cocktail. Setiap tahap dalam konstruksi pustaka genom melibatkan
pencucian fragmen DNA dengan menggunakan AMPure XP Beads, resuspension
buffer, dan etanol 80%. Tahap klasterisasi dan sekuensing genom dilakukan
dengan menggunakan 2 N NaOH, akuades, bufer hibridisasi, TruSeq SR Cluster
Kit v3-cBot-HS, dan TruSeq SBS Kit-HS (200 cycle).
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah sentrifus,
spektrofotometer nanodrop, fluorometer, tabung Covaris, tangki elektroforesis,
Agilent Bioanalyzer, chip DNA, PCR plate, mesin PCR, mesin qPCR, UV
transiluminator, dan magnetic stand. Tahap klasterisasi pustaka genom dilakukan
dalam Illumina cBot Cluster Generation dan tahap sekuensing dilakukan
menggunakan perangkat Illumina HiSeq2000.
Prosedur
Isolasi DNA Genom (Michiels et al. 2003)
Metode isolasi DNA kakao dilakukan dengan merujuk pada metode
Michiels et al. (2003) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 0.3 gram daun kakao
dihaluskan dalam nitrogen cair, kemudian dicampur dengan bufer ekstraksi yang
telah dipanaskan pada suhu 60 oC sebanyak 1 mL. Sampel disentrifus pada 12000
rpm selama 1 menit, lalu supernatan dibuang. Penambahan bufer ekstraksi dan
sentrifus diulangi sebanyak lima kali lagi hingga supernatan tidak berlendir.
Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 65 oC selama 45 menit. Secara berkala,
tabung dibolak-balik untuk mencegah pengendapan. Sebanyak 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v) ditambahkan ke dalam sampel, lalu
divorteks selama 2 menit. Sampel disentrifus pada 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan ditambah dengan 1 volume kloroform. Sampel kemudian divorteks
selama 2 menit, lalu disentrifus pada 12000 rpm selama 5 menit. Penambahan
kloroform diulangi satu kali lagi. Supernatan yang diperoleh kemudian ditambah
dengan 0.8 volume isopropanol, lalu tabung dibolak-balik hingga larutan
tercampur dan terlihat benang-benang berwarna putih. Sampel diinkubasi selama
1 jam pada suhu -20 oC, lalu disentrifus pada 16000 g selama 5 menit. Supernatan
dibuang, kemudian pelet yang diperoleh dicuci dengan 1 mL alkohol 80%.
Sampel kemudian disentrifus pada 16000 g selama 5 menit. Pencucian
menggunakan alkohol 80% diulangi satu kali lagi. Pelet yang diperoleh
dikeringkan di suhu ruang, kemudian ditambah dengan 100 µL nuclease free
water hingga larut, lalu disimpan di suhu -20 oC.
4
Uji Kualitatif DNA Genom (Sambrook 2001)
Uji kualitatif DNA dilakukan untuk mengetahui kualitas molekul DNA yang
telah diisolasi. Uji kualitatif tersebut dilakukan melalui elektroforesis gel agarose
1% yang dibuat dari 0.55 gram serbuk agarose yang dilarutkan dalam 55 mL bufer
TAE 1×. Gel yang telah memadat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang
telah diisi dengan bufer TAE 1×. Sampel yang akan diuji dicampur dengan
loading buffer (loading dye, SyBr Gold 100×, dan MQ Water). Campuran tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarose. Marker yang digunakan
adalah 6.5 µL DNA ladder 100 bp yang telah ditambah dengan 0.5 µL SyBr Gold
100×. Alat elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt selama 30 menit,
kemudian hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV.
Uji Kuantitatif DNA Genom
Uji kuantitatif DNA genom kakao dilakukan untuk mengetahui konsentrasi
dan kemurnian DNA kakao yang diperoleh dari tahap isolasi. Uji tersebut
dilakukan menggunakan instrumen spektrofotometer nanodrop untuk mengetahui
konsentrasi keseluruhan molekul DNA dan fluorometer untuk mengetahui
konsentrasi DNA utas ganda. Blanko yang digunakan untuk spektrofotometri
nanodrop adalah nuclease free water (NFW), dan volume sampel yang digunakan
adalah sebnyak 2 µL.
Uji kuantitatif selanjutnya adalah fluorometri. Qubit Working Solution
(QWS) dibuat terlebih dahulu, yaitu satu bagian Qubit Reagent dilarutkan dalam
199 bagian Qubit Buffer. Sebanyak 190 QWS ditambah dengan 10 µL larutan
standar dalam tabung Eppendorf yang berbeda. Sebanyak 2 µL sampel ditambah
dengan 198 µL QWS. Semua larutan yang telah dibuat divorteks selama 3 detik,
kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Instrumen fluorometer
dinyalakan, kemudian tabung berisi larutan standar dimasukkan untuk mengukur
absorbansi larutan standar. Tabung berisi larutan sampel dimasukkan ke dalam
instrumen flourometer untuk mengetahui konsentrasi DNA utas ganda pada
sampel tersebut.
Konstruksi Pustaka Genom (Illumina 2010c)
Tahap konstruksi pustaka genom terdiri atas beberapa langkah, yaitu
fragmentasi DNA, modifikasi ujung fragmen DNA, adenilasi ujung 3’OH, ligasi
adaptor, purifikasi hasil ligasi, dan amplifikasi fragmen DNA. Spektrofotometri
nanodrop dilakukan setelah tahap modifikasi ujung fragmen, ligasi adaptor, dan
amplifikasi fragmen DNA untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA.
Volume DNA yang digunakan pada spektrofotometri nanodrop tersebut adalah
sebanyak 2 µL dan bufer yang digunakan adalah resuspension buffer.
Fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA dilakukan untuk memperoleh
fragmen DNA berukuran lebih pendek, yaitu 300-400 bp atau kurang dari 800 bp
(Illumina 2008). Sebanyak 130 µL sampel DNA yang telah dilarutkan dalam
resuspension buffer dimasukkan ke dalam tabung Covaris, kemudian dimasukkan
ke dalam instrumen Covaris. Instrumen Covaris diatur sebagai berikut: duty cycle
10%, intensitas 5.0, 200 burst per second, durasi pemotongan selama 200 detik,
mode frequency sweeping, daya 23 W, dan suhu 5.5-6 oC. Sebanyak 50 µL sampel
yang telah difragmentasi dipindahkan ke PCR plate.
5
Modifikasi ujung fragmen DNA. Sebanyak 10 µL End Repair Control dan
40 µL End Repair Mix dicampurkan ke dalam sampel, kemudian diinkubasi pada
suhu 30 oC selama 30 menit dalam thermal cycler. Sebanyak 160 µL AMPure XP
Beads dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen. Campuran tersebut
diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. PCR plate yang berisi sampel
kemudian dipindahkan dalam magnetic stand selama 15 menit hingga sampel
jernih. Sebanyak 127.5 µL supernatan dibuang dengan hati-hati. Tahap tersebut
diulangi satu kali lagi untuk menghilangkan supernatan yang masih tersisa.
Sebanyak 200 µL etanol 80% ditambahkan ke dalam plate dengan hati-hati,
kemudian diinkubasi selama minimal 30 detik. Semua supernatan dalam plate
dibuang. Pencucian dengan etanol 80% tersebut diuangi satu kali lagi. Pelet yang
diperoleh kemudian dikeringkan pada suhu ruang selama 15 menit. Pelet
diresuspensi menggunakan resuspension buffer sebanyak 17.5 µL, kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Plate ditempatkan pada magnetic
stand selama 5 menit hingga cairan jernih. Sebanyak 15 µL supernatan
dipindahkan ke dalam PCR plate yang baru, kemudian disimpan di suhu -20 oC
untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
Adenilasi Ujung 3’OH. Sebanyak 2.5 µL A-Tailing Control dan 12.5 µL ATailing Mix dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen. Campuran tersebut
kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit dalam thermal cycler
untuk selanjutnya digunakan pada tahap ligasi adaptor.
Ligasi Adaptor. Ligase Control, DNA Ligase Mix, dan DNA Adapter Index
masing-masing sebanyak 2.5 µL dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen.
Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 30 oC selama 10 menit dalam thermal
cycler. Sampel kemudian ditambah dengan 5 µL Stop Ligase Mix hingga
homogen, kemudian dilakukan pencucian dengan meggunakan AMPure XP Beads
dan etanol 80%. Hasil pencucian disimpan pada suhu -20 oC untuk digunakan
dalam tahap selanjutnya.
Purifikasi hasil ligasi. Pemurnian hasil ligasi dilakukan dengan
elektroforesis gel agarose 2% yang dibuat dari 1.2 gram serbuk agarose yang
dilarutkan dalam 60 mL bufer TAE 1×. Gel yang telah memadat dipindahkan ke
dalam bak elektroforesis yang telah diisi dengan bufer TAE 1×. Bak elektroforesis
kemudian disimpan di atas UV Transiluminator yang telah dilapisi dengan kaca
anti radiasi. Sebanyak 20 µL sampel hasil ligasi ditambah dengan 4 µL loading
dye, lalu dimasukkan ke dalam sumur bagian atas pada gel agarose. Sumur bagian
bawah diisi dengan NFW sebanyak 25 µL. Marka yang digunakan adalah 12 µL
DNA ladder 100 bp. Elektroforesis dilakukan selama 1 jam pada tegangan 100
volt. Setelah proses elektroforesis selesai, cairan pada sumur bagian bawah
diambil sebanyak 20 µL, lalu dimasukkan ke dalam PCR plate yang baru.
Tahap purifikasi dapat dilanjutkan dengan ekstraksi gel agarose untuk
memperoleh fragmen DNA yang diinginkan jika volume cairan yang diperoleh
dari tahap elektroforesis di atas tidak mencukupi atau memiliki konsentrasi DNA
yang terlalu kecil. Gel hasil elektroforesis dipotong pada bagian fragmen yang
diinginkan, kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL. Sebanyak 3 volume
QG buffer ditambahkan ke dalam tabung, kemudian diinkubasi pada suhu ruang
selama 10 menit atau hingga seluruh gel larut. Setelah gel larut sempurna,
sebanyak 1 volume isopropanol 100% ditambahkan ke dalam campuran tersebut
hingga homogen, kemudian dipindahkan ke dalam MinElute Column dan
6
disentrifus selama 1 menit pada 17900 g atau 13000 rpm. Cairan dibuang,
kemudian sebanyak 0.5 mL QG buffer ditambahkan ke dalam MinElute Column.
Sampel disentrifus pada 17900 g atau 13000 rpm selama 1 menit. Cairan dibuang,
kemudian sebanyak 0.75 mL bufer PE dimasukkan ke dalam MinElute Column.
Kolom dipindahkan ke tabung 1.5 mL, lalu sebanyak 10 µL bufer EB (10 mM
Tris-Cl ph 8.5) atau NFW dimasukkan ke dalam kolom. Kolom tersebut
didiamkan selama 1 menit, kemudian disentrifus pada 17900 g atau 13000 rpm
selama 1 menit. Cairan yang diperoleh dipindahkan ke dalam PCR plate untuk
tahap selanjutnya.
Amplifikasi fragmen DNA. Sebanyak 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25
µL PCR Master Mix dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR. Proses amplifikasi dilakukan dengan
tahap pra denaturasi pada suhu 98 oC selama 30 detik, denaturasi pada suhu 98 oC
selama 10 detik, annealing pada suhu 60 oC selama 30 detik, dan elongasi pada
suhu 72 oC selama 30 detik. Tahap denaturasi hingga elongasi dilakukan sebanyak
10 siklus, kemudian dilanjutkan dengan tahap pasca elongasi pada suhu 72 oC
selama 5 menit. Setelah tahap amplifikasi dalam mesin PCR selesai, sampel
dicuci dengan menggunakan AMPure XP Beads dan etanol 80%, kemudian
disimpan pada suhu -20 oC untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
Validasi Pustaka Genom (Illumina 2010c)
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui molaritas dan ukuran fragmen
pustaka genom yang telah dibuat. Validasi dapat dilakukan menggunakan Agilent
Bioanalyzer dengan High Sensitivity DNA chip atau elektroforesis gel agarose dan
qPCR (quantitative PCR). Sebanyak 9 µL campuran gel dan dye dari kit Agilent
Bioanalyzer High Sensitivity dimasukkan ke dalam chip DNA. Priming station
ditutup dan plunger ditekan selama 1 menit. Setelah priming station dibuka,
sebanyak 5 µL marker dimasukkan ke semua lubang. Sebanyak 1 µL DNA ladder
dimasukkan ke lubang bertanda ladder, kemudian sebanyak 1 µL sampel
dimasukkan ke dalam lubang sampel. Chip DNA divorteks horizontal selama 1
menit pada 2400 rpm. Chip DNA kemudian dimasukkan ke dalam instrumen
Agilent Bioanalyzer. Teknik tersebut dapat diganti dengan elektroforesis gel
agarose biasa karena kedua teknik tersebut memiliki prinsip yang sama. Sebanyak
1.2 gram serbuk agarose dilarutkan dalam 60 mL TAE 1× untuk memperoleh gel
berkonsentrasi 2%. Penanda atau marker dibuat dari 5.5 µL DNA ladder 100 bp
yang dicampurkan dengan 0.5 µL SyBr Gold. Sebanyak 5 µL DNA ditambah
dengan 2 µL loading dye, 0.5 µL SyBr Gold, dan 4.5 µL MQ Water.
Elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada tegangan 100 volt.
Elektroforegram yang dihasilkan kemudian digunakan untuk menganalisis ukuran
fragmen pada pustaka genom.
Validasi pustaka genom menggunakan qPCR bertujuan mengetahui
molaritas fragmen DNA yang kedua ujungnya telah ditempeli adaptor. Langkah
pertama yang dilakukan adalah pembuatan dilution buffer. Sebanyak 100 µL TrisHCl 10 mM pH 8 ditambah dengan 5 µL 0.05% Tween 20 dan 9895 µL ddH2O,
kemudian dicampur hingga homogen. Sebanyak 999 µL dilution buffer ditambah
dengan 1 µL sampel untuk memperoleh pengenceran 1:1000, kemudian divorteks
selama 10 detik. Campuran tersebut diambil sebanyak 100 µL lalu dicampurkan
dengan 100 µL dilution buffer untuk memperoleh pengenceran 1:2000, kemudian
7
divorteks 10 detik. Larutan tersebut diambil sebanyak 100 µL kemudian ditambah
dengan 100 µL dilution buffer untuk memperoleh pengenceran 1:4000, lalu
divorteks selama 10 detik. Larutan PCR mix yang digunakan berupa 75% Kapa
yang dilarutkan dalam NFW. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam
PCR plate sebanyak 16 µL. Sebanyak 4 µL dari setiap hasil pengenceran
dimasukkan ke dalam PCR plate yang telah berisi PCR mix. Larutan standar yang
digunakan dimasukkan sebanyak 4 µL ke dalam lubang lain dalam PCR plate.
Plate kemudian ditutup dengan seal adhesive kemudian dimasukkan ke dalam
instrumen qPCR. Reaksi yang terjadi dalam mesin qPCR adalah initial activation
(95 oC selama 5 menit), denaturation (95 oC selama 30 detik), dan annealing serta
extension (60 oC selama 45 detik). Tahap denaturation hingga extension
dilakukan sebanyak 35 siklus.
Klasterisasi Pustaka Genom (Illumina 2010b)
Molaritas minimal yang dibutuhkan untuk tahap klasterisasi adalah 2 nM.
Sampel yang memiliki molaritas di atas 2 nM harus diencerkan terlebih dahulu
dalam library buffer yang dibuat dari Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20
hingga volume 30 µL. DNA cetakan yang telah berkonsentrasi 2 nM kemudian
diencerkan kembali menggunakan NaOH 0.1 N hingga mencapai konsentrasi 13
pM. Sebanyak 6.5 µL DNA cetakan yang akan digunakan ditambah dengan 6.5
µL NaOH 0.1 N, kemudian dilarutkan dalam 987 µL HT1. Campuran tersebut
divorteks, kemudian diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 20
µL DNA cetakan tersebut diambil, kemudian ditambahkan ke dalam 980 µL HT1.
Klasterisasi dilakukan dalam instrumen cBot Cluster Generation. Sebanyak
120 µL DNA cetakan yang telah dipreparasi dimasukkan ke dalam tube,
kemudian ditambah dengan 1.2 µL PhiX Library Control. Reagen yang akan
digunakan dimasukkan ke dalam kompartemen dalam instrumen cBot Cluster
Generation, kemudian dilakukan pemasangan flow cell dan manifold. Tube yang
berisi DNA cetakan dimasukkan ke dalam kompartemen, kemudian instrumen
cBot Cluster Generation dijalankan.
Sekuensing Pustaka Genom (Illumina 2010a)
Tahap sekuensing DNA genom menggunakan Illumina HiSeq2000 terdiri
atas beberapa tahap, yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk
sekuensing, pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing
(maintenance wash). Reagen yang digunakan adalah SBS (Sequence by Synthesis)
reagent (TruSeq SBS kit), multiplexing reagent, dan paired-end reagent. Reagenreagen tersebut dimasukkan ke dalam rak dan disimpan dalam kompartemen
reagen yang terdapat dalam Illumina HiSeq2000. Parameter yang diperlukan
untuk sekuensing dipilih melalui HiSeq control software interface. Parameter
tersebut adalah flow cell ID, experiment, user name, flow cell type, control lane,
output folder, confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image,
dan align lanes. Tahap selanjutnya adalah dipasangnya flow cell pada flow cell
stage. Sekuensing dilakukan selama 11 hari dengan pembacaan DNA sebanyak 2
× 100 siklus. Tahap terakhir adalah dipindahkannya flow cell dari flow cell stage,
kemudian dilakukan post-run sequensing, yaitu berupa pencucian dan pembilasan
dengan menggunakan air dan NaOH.
8
HASIL
DNA Genom Hasil Isolasi
Konsentrasi DNA kakao yang dihasilkan berada pada rentang 163.3-469.4
ng/µL, sedangkan perbandingan 260/280 dan 260/230 yang diukur menggunakan
spektrofotometer nanodrop masing-masing berada pada rentang 1.78-2.06 dan
0.99-1.73 (Tabel 1). Analisis menggunakan fluorometer bertujuan mengetahui
konsentrasi DNA utas ganda yang terdapat dalam sampel. Konsentrasi DNA utas
ganda yang terdeteksi berada pada rentang 20.9-63.8 ng/µL (Tabel 2).
Elektroforegram hasil elektroforesis gel agarose 1% menunjukkan fragmenfragmen DNA yang telah diisolasi berada di bagian atas dekat sumur, dan
berukuran lebih besar dari 1500 bp (Gambar 1). Fragmen DNA yang dihasilkan
menunjukkan bahwa DNA yang telah diisolasi merupakan DNA genom yang
berukuran besar dan tidak terdegradasi.
Tabel 1 Hasil pengujian konsentrasi dan kemurnian DNA kakao menggunakan
spektrofotometer nanodrop
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
209.9
178.6
438.7
240.4
310.6
235.9
163.3
344.9
469.4
260/280
1.97
2.00
2.01
2.04
1.78
1.84
2.06
1.89
1.90
260/230
1.37
1.26
1.51
1.73
0.99
1.07
1.63
1.18
1.16
Tabel 2 Hasil pengujian konsentrasi dsDNA kakao menggunakan fluorometer
Genotipe
[dsDNA] (µg/mL)
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
0.242
0.219
0.638
0.210
0.228
0.235
0.209
0.208
0.228
Faktor
pengenceran
100
100
100
100
100
100
100
100
100
[dsDNA] (ng/µL)
24.2
21.9
63.8
21.0
22.8
23.5
20.9
20.8
22.8
9
DNA
genom
1500 bp
100 bp
Gambar 1 Elektroforegram DNA hasil isolasi: DNA penanda (M), DR1 (1), DR2
(2), DR38 (3), NIE7 (4), PA300 (5), RCC70 (6), SD6225 (7), TSH858
(8), dan UIT1 (9)
Konsentrasi dan Kemurnian DNA Selama Konstruksi Pustaka Genom
Konsentrasi dan kemurnian DNA masing-masing genotipe selama proses
konstruksi pustaka genom ditunjukkan pada Tabel 3, 4, dan 5. Konsentrasi setiap
genotipe mengalami penurunan, sedangkan kemurniannya cenderung fluktuatif.
Ukuran pustaka DNA genom ditujukkan pada elektroforegram hasil validasi
pustaka DNA genom (Gambar 2 dan 3). Data yang dihasilkan dari tahap validasi
pustaka genom secara ringkas ditampilkan pada Tabel 6.
Tabel 3 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah fragmentasi dan modifikasi
ujung fragmen
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
343.1
286.1
158.9
410.4
209.3
96.7
289.3
143.5
457.0
260/280
2.15
2.35
2.15
2.17
1.54
1.80
2.28
1.78
1.91
260/230
1.86
1.94
1.74
2.23
0.56
0.68
2.49
0.87
1.13
Tabel 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah adenilasi dan ligasi adaptor
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
165.0
29.5
73.1
223.1
31.6
15.3
122.5
47.5
218.2
260/280
2.06
2.31
2.14
2.14
2.07
2.50
2.16
2.17
2.02
260/230
1.79
0.86
2.14
2.04
1.03
1.33
2.03
1.57
1.83
10
Tabel 5 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah purifikasi dan amplifikasi
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
7.5
6.0
9.7
11.5
4.5
9.9
3.2
4.1
9.1
1
260/280
2.18
2.19
1.88
2.01
1.90
1.42
2.04
1.65
1.78
2
3
260/230
1.63
1.82
2.10
1.60
1.21
0.72
1.08
1.63
1.79
4
Gambar 2 Elektroforegram hasil bioanalyzer pada tahap validasi pustaka DNA
genom: DNA penanda (ladder), DR1 (1), DR2 (2), NIE7 (3), SD6225
(4)
500 bp
300 bp
Gambar 3
Elektroforegram pada tahap validasi pustaka DNA genom: DNA
penanda (M), DR38 (5), PA300 (6), RCC70 (7), TSH858 (8), UIT1
(9)
11
Tabel 6 Rerata ukuran dan molaritas fragmen DNA hasil validasi pustaka DNA
genom
Genotipe
Rerata ukuran (bp)
Molaritas (nM/L)
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
452
426
314
485
458
475
461
441
314
10.04
2.04
23.86
5.31
4.70
2.90
3.96
15.06
4.55
Hasil Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka DNA Genom
Tahap klasterisasi dilakukan untuk memperoleh klaster atau kelompok
salinan pustaka DNA genom yang telah divalidasi untuk selanjutnya disekuensing.
Jumlah basa yang dihasilkan pada klaster sebesar 391.93 Gbp (Tabel 7),
sedangkan densitas klaster yang dihasilkan sebesar 654-763 K/mm2, dan
kesalahan yang terjadi sebesar 0.20-1.14 % (Tabel 8). Jumlah basa dan
pembacaan selama proses sekuensing ditampilkan pada Tabel 9. Jumlah
pembacaan yang efektif dilakukan sebesar 48-98 %, dan jumlah basa yang secara
efektif dibaca sebesar 27-94%.
Analisis masing-masing genotipe dilakukan setelah tahap sekuensing yang
bertujuan untuk mengetahui ukuran genom serta kualitas hasil sekuensing masingmasing genotipe. Ukuran genom yang berhasil diperoleh berada pada rentang 1.5566.9 Mbp (Gambar 4). Secara umum, kesalahan yang terjadi bernilai lebih tinggi
di bagian awal dan akhir pembacaan (Gambar 5).
Tabel 7 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom
Jumlah total
basa (Gbp)
Jumlah basa
kontrol (Gbp)
Jumlah basa ≤ 3
eror (Gbp)
Tingkat
kesamaan
% ≤ 3 eror
391.93
5.1
6.1
82.0 %
97.6
Tabel 8 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Genotipe
Lajur 7
(DR38,
PA300)
Lajur 8
(RCC70,
TSH858,
UIT1)
Densitas Klaster
(K/mm2) PF (%)
Phasing
(%)
Prephasing
(%)
Pembacaan
(Mbp)
Read
PF
(Mbp)
Eror
(%)
763
61.0
0.300
0.330
211.1
128.4
1.14
654
87.6
0.215
0.303
180.8
157.9
0.20
12
Tabel 9 Jumlah basa dan pembacaan sekuensing setiap genotipe
Pembacaan
yang
diproses
Pembacaan
yang
dibuang
Pembacaan
efektif (%
input)
Jumlah basa
yang diproses
Jumlah basa
yang terbaca
(% input)
DR38
75521532
38569807
36951725
(48%)
7552153200
2070001641
(27%)
PA300
159147750
4693885
154453865
(97%)
15914775000
14520915847
(91%)
RCC70
102922298
2136739
100785559
(97%)
10292229800
9676710935
(94%)
TSH858
124909656
2059912
UIT1
67373834
20384723
Genotipe
122849744
(98%)
46989111
(69%)
12490965600
6737383400
11691479170
(93%)
3801807562
(56%)
Gambar 4 Perkiraan ukuran genom masing-masing genotipe
Gambar 5 Kesalahan berdasarkan urutan posisi basa
13
PEMBAHASAN
DNA Genom Kakao Hasil Isolasi
Teknik isolasi DNA tanaman kakao memiliki tingkat kesulitan yang relatif
lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman lain. Hal tersebut dapat disebabkan
oleh tingginya konsentrasi kontaminan berupa polisakarida serta pengotor lain
seperti lendir atau getah yang terkandung dalam daun kakao (Argout et al. 2011).
Sebelum melakukan isolasi dengan metode Michiels et al. (2003) yang telah
dimodifikasi, isolasi dilakukan dengan menggunakan metode Michiels et al.
(2003) yang berprinsip pada penggunaan CTAB sebagai senyawa pendegradasi
metabolit sekunder dalam tanaman. DNA yang diperoleh dari hasil isolasi
menggunakan metode tersebut ternyata terkontaminasi oleh karbohidrat dalam
jumlah yang relatif banyak. Untuk menghilangkan kontaminan karbohidrat dalam
DNA yang dihasilkan dari proses isolasi, maka dilakukan modifikasi pada metode
tersebut berupa penambahan bufer ekstraksi sebanyak enam kali penambahan
(Fang et al. 1992).
Uji kuantitas DNA hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer nanodrop dan fluorometer. Spektrofotometer nanodrop akan
mengidentifikasi sampel pada panjang gelombang 230, 260, dan 280 nm. Masingmasing panjang gelombang tersebut merupakan serapan maksimum untuk
polisakarida, asam nukleat, dan protein. Kemurnian DNA dari kontaminan
polisakarida dapat diketahui dengan membandingkan serapan pada panjang
gelombang 260/230, sedangkan kemurnian DNA dari kontaminan protein
diketahui dengan membandingkan serapan pada panjang gelombang 260/280.
Kedua perbandingan tersebut diharapkan berada pada rentang 1.8-2.0. Jika DNA
memiliki kemurnian kurang dari 1.8 maka DNA terkontaminasi oleh protein dan
polisakarida, sedangkan jika DNA memiliki kemurnian lebih dari 2.0 maka DNA
terkontaminasi oleh RNA (Walker & Wilson 2000).
Hasil pengujian
menggunakan spektrofotometer nanodrop menunjukkan bahwa DNA hasil isolasi
memiliki nilai perbandingan 260/280 antara 1.78-2.06, nilai perbandingan
260/230 antara 0.99-1.73, serta konsentrasi antara 163.3-469.4 ng/µL (Tabel 1).
Data tersebut menunjukkan bahwa DNA masih terkontaminasi oleh polisakarida,
namun sudah relatif murni dari protein. Menurut penelitian yang telah dilakukan
oleh Tasma et al. (2012), DNA kakao hasil isolasi memiliki konsentrasi pada
rentang 198.1-303.7 ng/µL. Perbedaan konsentrasi DNA yang dihasilkan dapat
disebabkan oleh adanya kontaminan serta terbuangnya DNA selama tahap isolasi
(Henry 2001).
Uji kuantitatif lain yang digunakan yaitu fluorometri. Analisis ini digunakan
untuk mengidentifikasi kuantitas DNA utas ganda (dsDNA) dalam sampel hasil
isolasi. Data konsentrasi dsDNA yang diperoleh dari fluorometri perlu diketahui
sebagai dasar penentuan volume sampel yang akan digunakan pada tahap
fragmentasi DNA. Konsentrasi DNA utas ganda hasil isolasi berada pada rentang
20.82-63.84 ng/µL (Tabel 2). Konsentrasi DNA utas ganda minimal yang dapat
digunakan untuk tahap selanjutnya adalah 20 ng/µL (Illumina 2008). Konsentrasi
DNA yang dihasilkan dari flourometer lebih kecil dibandingkan dengan
konsentrasi DNA yang dihasilkan dari spektrofotometer nanodrop karena
14
sebagian DNA mengalami denaturasi sehingga memiliki konformasi berupa DNA
utas tunggal yang tidak dapat terbaca pada fluorometer (Beaudet et al 2007).
Pengujian kualitas DNA hasil isolasi dilakukan menggunakan elektroforesis
gel agarose 1%. Prinsip pengujian tersebut adalah pemisahan molekul dalam suatu
medium berupa gel dengan adanya pengaruh medan listrik. Elektroforesis
digunakan karena pelaksanaannya yang relatif lebih mudah dan cepat, serta dapat
memisahkan berbagai fragmen DNA yang tidak dapat dipisahkan secara tepat
oleh metode lain seperti sentrifugasi gradien densitas (Walker & Wilson 2000).
SyBr Gold yang digunakan pada tahap elektroforesis merupakan suatu
pewarna atau fluoresen yang dapat mendeteksi asam nukleat (utas tunggal dan
ganda) dalam gel elektroforesis. Visualisasinya dapat dilakukan dengan
menggunakan UV transiluminator standar pada panjang gelombang 300 nm.
Sensitivitasnya lebih tinggi (25-100 kali) dibandingkan dengan etidium bromida
dan SyBr Green yang juga biasa digunakan sebagai pewarna asam nukleat dalam
gel elektroforesis, sehingga dapat mendeteksi DNA hingga 25 pg. Komponen
utama dalam SyBr Gold adalah dimetil sulfoksida atau DMSO (Molecular Probes
2001).
Pemisahan menggunakan elektroforesis gel agarose 1% menunjukkan hasil
yang cukup baik (Gambar 1). Pita DNA yang berada pada bagian atas gel
menunjukkan bahwa molekul DNA sampel berukuran cukup besar dan tidak
terdegradasi. Ukuran molekul DNA yang besar tersebut menandakan bahwa
molekul DNA yang telah diisolasi merupakan DNA genom. Molekul DNA genom
tidak akan termigrasi lebih lanjut dalam gel agarose karena memiliki ukuran yang
lebih besar dibandingkan dengan ukuran pori-pori gel (Sahu et al. 2012).
Fragmentasi dan Modifikasi Ujung Fragmen DNA
Fragmentasi merupakan tahap awal dalam proses konstruksi pustaka genom.
Tahap fragmentasi bertujuan memperoleh fragmen-fragmen DNA berukuran lebih
kecil yang akan digunakan dalam tahap sekuensing. Menurut Illumina (2008),
fragmen DNA yang digunakan dalam tahap sekuensing adalah fragmen yang
berukuran kurang dari 800 bp. Ukuran fragmen yang dipilih pada penelitian ini
adalah 300-400 bp. Ukuran tersebut dipilih untuk memudahkan pembuatan
pustaka genom yang optimum untuk tahap sekuensing (Barnum 2005).
Tahap fragmentasi pada penelitian ini dilakukan dengan metode sonikasi,
yaitu dengan memajankan gelombang ultrasonik pada larutan DNA. Metode ini
termasuk ke dalam teknik fragmentasi secara mekanik. Menurut Pirrung (2007),
sonikasi merupakan salah satu teknik yang efektif dalam pencampuran, proses
reaksi, dan pemecahan bahan dengan bantuan energi tinggi. Efek yang dihasilkan
dari proses sonikasi tersebut dapat berupa efek fisik dan efek kimia. Secara fisik,
sampel yang mengalami sonikasi akan teremulsi, sementara secara kimia akan
terjadi interaksi antara molekul dalam sampel tersebut yang selanjutnya akan
menyebabkan perubahan ikatan kimia dalam sampel (Suslick & Price 2000).
Interaksi tersebut terjadi karena panjang gelombang ultrasonik lebih tinggi
dibandingkan dengan panjang gelombang molekul-molekul dalam sampel
(Wardiyati et al. 2004).
DNA yang telah difragmentasi kemudian dimodifikasi ujung-ujungnya
untuk memperoleh fragmen DNA berujung tumpul. Modifikasi tersebut berupa
penambahan End Repair Mix yang mengandung enzim eksonuklease dan
15
polimerase. Enzim eksonuklease akan memotong nukleotida pada ujung 3’OH
yang menggantung, sedangkan enzim polimerase akan melengkapi ujung 5’P
yang menggantung dengan cara mensintesis utas DNA baru yang komplemen
dengan ujung 5’P tersebut (Illumina 2010c).
Hasil fragmentasi dan modifikasi ujung fragmen DNA diuji konsentrasi dan
kemurniannya secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop.
Konsentrasi DNA hasil fragmentasi dan modifikasi ujung fragmen berada pada
rentang 96.7-475.0 ng/µL dengan perbandingan 260/280 sebesar 1.54-2.35 dan
perbandingan 260/230 sebesar 0.56-2.49 (Tabel 3). Jika dibandingkan dengan
hasil isolasi DNA pada Tabel 1, maka dapat diketahui bahwa konsentrasi DNA
beberapa sampel mengalami peningkatan (DR1, DR2, NIE7, dan SD6225), dan
beberapa sampel yang lain (DR38, PA300, RCC70, TSH858, dan UIT1)
mengalami penurunan. Penurunan konsentrasi DNA tersebut dapat disebabkan
oleh adanya fragmen DNA yang tidak terikat pada AMPure XP Beads selama
proses purifikasi, sehingga fragmen DNA tersebut terbuang bersama etanol 80%.
AMPure XP Beads yang digunakan untuk tahap pencucian mengandung butiranbutiran halus paramagnetik yang akan mengikat fragmen-fragmen DNA dan
menghilangkan kelebihan pereaksi yang dapat mengganggu pada tahap
selanjutnya (Agencourt Bioscience 2009).
Adenilasi dan Ligasi Adaptor
Tahap adenilasi bertujuan menambahkan nukleotida adenin ke ujung tumpul
(3’OH) untuk mencegah terjadinya ligasi antar fragmen DNA selama proses ligasi
adaptor berlangsung. Proses adenilasi dilakukan dengan menambahkan A-Tailing
Mix yang berisi basa adenin dan A-Tailing Control ke dalam sampel hasil
modifikasi ujung fragmen DNA. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 oC
dilakukan untuk mengoptimalkan penempelan basa adenin di ujung fragmen DNA
(Illumina 2008).
Tahap selanjutnya setelah adenilasi adalah ligasi adaptor. Reagen yang
ditambahkan pada tahap ini adalah Ligase Control, Ligase Mix, Adapter Index,
dan Stop Ligase Mix. Ligase Control akan mempertahankan kondisi optimal
sampel selama tahap ligasi, sedangkan Ligase Mix yang berisi enzim ligase akan
menyambungkan fragmen DNA dengan adaptor melalui reaksi ligasi. Adapter
Index berisi sekumpulan sekuen nukleotida (6-7 basa) yang ditambahkan di ujung
fragmen DNA untuk mempersiapkan fragmen dalam tahap hibridisasi dalam flow
cell. Salah satu ujung adaptor akan menempel pada ujung-ujung fragmen DNA
yang telah mengalami adenilasi, sedangkan ujung adaptor yang lain akan
menempel pada dinding flow cell. Adapter Index yang digunakan terdiri atas tiga
jenis yang memiliki urutan nukleotida ACAGTG, GCCAAT, dan GTGAAA. Stop
Ligase Mix yang ditambahkan setelah inkubasi berfungsi menghentikan reaksi
ligasi (Illumina 2008).
Hasil pengujian konsentrasi dan kemurnian fragmen DNA menggunakan
spektrofotometer nanodrop setelah dilakukan tahap adenilasi dan ligasi adaptor
ditampilkan pada Tabel 4. Konsentrasi DNA semua genotipe pada tahap tersebut
mengalami penurunan dibandingkan dengan konsentrasi DNA pada tahap
sebelumnya (Tabel 3), yaitu berada pada rentang 15.3-223.1 ng/µL. Penurunan
konsentrasi tersebut dapat disebabkan oleh hilangnya fragmen DNA selama
proses pencucian menggunakan AMPure XP Beads. Perbandingan serapan pada
16
panjang gelombang 260/280 berada pada rentang 2.02-2.50, sedangkan
perbandingan serapan pada panjang gelombang 260/230 berada pada rentang
0.86-2.14. Data tersebut menunjukkan bahwa fragmen DNA hasil adenilasi dan
ligasi adaptor mengandung kontaminan RNA. Perubahan kemurnian sampel dapat
disebabkan oleh kontaminasi yang berasal dari reagen-reagen yang digunakan
(Illumina 2008).
Purifikasi dan Perbanyakan Fragmen DNA
Fragmen DNA hasil adenilasi dan ligasi adaptor dimurnikan dan
diamplifikasi untuk memperoleh fragmen-fragmen yang telah ditempeli oleh
adaptor dalam keadaan murni dan dalam jumlah yang cukup banyak. Pemurnian
fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarose 1%,
sedangkan amplifikasi dilakukan dalam mesin PCR. Amplifikasi menggunakan
mesin PCR terdiri atas tiga tahap utama, yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi.
Tahap denaturasi merupakan proses terjadinya pemisahan utas ganda DNA
menjadi utas tunggal. DNA utas tunggal tersebut kemudian ditempeli dengan
primer pada tahap annealing. Tahap elongasi atau pemanjangan primer adalah
proses sintesis nukleotida yang komplemen dengan sekuen nukleotida pada utas
cetakan. Hasil akhir dari ketiga tahap tersebut adalah amplikon fragmen DNA
yang terdiri atas satu utas DNA cetakan dan satu utas DNA hasil sintesis yang
keduanya saling komplemen. Ketiga tahap tersebut dilakukan selama beberapa
siklus sehingga menghasilkan fragmen DNA dalam jumlah yang bertambah secara
eksponensial (Krane & Raymer 2002).
Fragmen DNA hasil purifikasi dan amplifikasi diuji konsentrasi dan
kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop. Konsentrasi
sampel berada pada rentang 3.2-11.5 ng/µL, dengan perbandingan serapan pada
panjang gelombang 260/280 berada pada rentang 1.42-2.19, dan perbandingan
serapan pada panjang gelombang 260/230 berada pada rentang 0.72-2.10 (Tabel
5). Konsentrasi DNA semua genotipe pada tahap ini lebih rendah dibandingkan
dengan konsentrasi DNA pada tahap sebelumnya (Tabel 4). Hal tersebut dapat
disebabkan oleh terbuangnya sebagian fragmen DNA selama proses pencucian
dengan menggunakan AMPure XP Beads. Perbandingan serapan pada panjang
gelombang 260/230 menunjukkan bahwa fragmen DNA masih mengandung
kontaminan polisakarida (Henry 2001).
Validasi Pustaka DNA Genom
Pustaka DNA genom yang telah dikonstruksi harus divalidasi untuk
menentukan ukuran fragmen dan molaritas pustaka DNA genom yang diperoleh.
Klaster yang memiliki densitas tinggi harus dibuat terlebih dahulu agar diperoleh
data hasil sekuensing yang berkualitas baik. Oleh karena itu dilakukan tahap
kuantifikasi menggunakan qPCR untuk menentukan molaritas pustaka DNA
genom yang akan digunakan sebagai cetakan dalam tahap sekuensing.
Elektroforesis gel agarose 2% dilakukan untuk mengetahui ukuran fragmen
pustaka DNA genom yang telah dibuat (Illumina 2008).
Elektroforesis gel agarose dapat diganti dengan instrumen Agilent
Bioanalyzer untuk mengetahui ukuran dan konsentrasi fragmen DNA. Prinsip
bioanalyzer hampir sama dengan elektroforesis gel, namun dilakukan dalam suatu
DNA chip, sehingga volume sampel yang dibutuhkan lebih sedikit dan
17
memerlukan waktu yang lebih singkat dibandingkan dengan elektroforesis gel.
Ukuran fragmen yang dihasilkan dari tahap bioanalyzer juga lebih akurat
dibandingkan dengan hasil analisis elektroforegram menggunakan perangkat
bioinformatika biasa (Healey et al. 2014).
Data hasil validasi pustaka DNA genom ditunjukkan pada Tabel 6. Fragmen
DNA yang dihasilkan dari tahap elektroforesis gel agarose dan bioanalyzer berada
pada rentang 314-485 bp. Ukuran tersebut masih berada pada rentang yang
dibutuhkan untuk sekuensing pustaka DNA genom, yaitu kurang dari 800 bp.
Molaritas DNA hasil konstruksi pustaka genom berada pada rentang 2.04-23.86
nM/L. Hasil tersebut cukup bagus karena berada di atas molaritas minimal yang
dibutuhkan untuk tahap sekuensing yaitu 2 nM/L (Illumina 2008).
Klasterisasi Pustaka DNA Genom
Pustaka DNA genom yang telah dibuat memiliki kualitas dan kuantitas yang
cukup baik dan berada dalam rentang yang diinginkan, sehingga dapat digunakan
untuk tahap klasterisasi dan sekuensing. Tahap klasterisasi bertujuan membentuk
klaster atau kelompok salinan pustaka genom yang akan disekuen. Proses
klasterisasi tersebut dilakukan dalam sebuah flow cell dengan menggunakan
instrumen cBot Cluster Generation. Pembentukan klaster pada tahap klasterisasi
dapat memudahkan pembacaan atau deteksi pendaran oleh HiSeq2000. Terdapat
tiga tahap yang terjadi selama proses klasterisasi, yaitu imobilisasi dan
pemanjangan DNA, amplifikasi fragmen DNA dengan prinsip bridge
amplification, serta linearisasi dan hibridisasi fragmen DNA (Illumina 2010b).
Fragmen DNA utas tunggal yang telah diinjeksikan ke dalam flow cell akan
menempel di dinding flow cell. Penempelan tersebut terjadi karena fragmen DNA
sebelumnya telah berikatan dengan adaptor yang ditambahkan pada proses
konstruksi pustaka genom. Fragmen tersebut kemudian akan dibuat
komplemennya serta diamplifikasi melalui bridge amplification sehingga
terbentuk salinan fragmen pada akhir proses klasterisasi (Mardis 2008).
Teknik klasterisasi yang dilakukan pada pustaka DNA genom kakao adalah
multiplexing indexes, yaitu genotipe yang ditempeli oleh jenis adaptor yang
berbeda dimasukkan ke
GENOM TOTAL KAKAO (Theobroma cacao L.)
ASEP DIDI SURYADI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi Pustaka
Genom dan Sekuensing Genom Total Kakao (Theobroma cacao L.) adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Skripsi ini disusun
berdasarkan hasil penelitian pada proyek sekuensing genom kakao di Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian
(BB-Biogen) Bogor tahun 2014. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Asep Didi Suryadi
NIM G84100016
ABSTRAK
ASEP DIDI SURYADI. Konstruksi Pustaka Genom dan Sekuensing Genom Total
Kakao (Theobroma cacao L.). Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan HABIB
RIJZAANI.
Tersedianya sekuen genom rujukan kakao (Theobroma cacao L.)
memungkinkan seluruh potensi variasi genetik tanaman kakao lain dapat dibaca
dan dimanfaatkan untuk pemuliaan melalui pembacaan menyeluruh genomnya
menggunakan next generation sequencing (NGS). Penelitian ini menerangkan
modifikasi metode CTAB untuk isolasi DNA genomik kakao yang mengandung
polisakarida dan polifenol tinggi, konstruksi pustaka DNA genom serta
sekuensing genom total kakao dengan menggunakan metode dari Illumina. DNA
genomik berkualitas tinggi yang ditunjukkan dengan keutuhan molekul telah
dihasilkan. Pustaka genom yang telah dikonstruksi berukuran 314-485 bp. Basa
yang dihasilkan mencapai 391.93 Gbp, dengan ukuran genom mencapai 566.9
Mbp. Kualitas bacaan NGS yang dihasilkan cukup tinggi dengan 67.9-81.3%
bacaan memiliki nilai kualitas di atas Q30. Kesalahan yang terjadi sebesar 0.201.14%. Pustaka genom yang telah dikonstruksi memiliki kualitas yang baik dan
data sekuensing yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis lanjutan.
Kata kunci: isolasi DNA, next generation sequencing, pustaka genom, Theobroma
cacao L.
ABSTRACT
ASEP DIDI SURYADI. Genomic Library Construction and Whole Genome
Sequencing of Cocoa (Theobroma cacao L.). Supervised by I MADE ARTIKA
and HABIB RIJZAANI.
The availability of reference genome sequence of cocoa (Theobroma cacao
L.) allows the full potential of the other cocoa plant genetic variation to be read
and used for breeding through whole genome reading by next generation
sequencing (NGS). This study describes a modification of CTAB method for
extracting genomic DNA contains high polysaccharides and polyphenols,
genomic library construction and whole genome sequencing using methods by
Illumina. High quality of genomic DNA indicated by integrity of the molecule
have been produced. Genomic libraries have been constructed were 314-485 bp in
size. Base generated reach 391.93 Gbp, with genome size reach 566.9 Mbp. The
quality of readings by NGS high enough with 67.9-81.3% of reading has quality
value above Q30. Error rate occurs at 0.20-1.14%. Genomic library have been
constructed possesses good quality and the data from sequencing were ready for
further analysis.
Keywords: DNA extraction, genome library, next generation sequencing,
Theobroma cacao L.
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM DAN SEKUENSING
GENOM TOTAL KAKAO (Theobroma cacao L.)
ASEP DIDI SURYADI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat
dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah
dari hasil penelitian yang dilakukan sejak bulan Januari hingga Juni 2014 ini
berjudul Konstruksi Pustaka Genom dan Sekuensing Genom Total Kakao
(Theobroma cacao L.).
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir I Made Artika,
MAppSc dan Bapak Habib Rijzaani, MSi sebagai pembimbing, serta Bapak Dr I
Made Tasma yang telah banyak memberi saran. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga atas doa dan kasih sayang, serta
kepada keluarga besar Pinus merkusii dan Biokimia 47 atas dukungan yang telah
diberikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan dan kemajuan ilmu
pengetahuan.
Bogor, Juni 2014
Asep Didi Suryadi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
x
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
1
METODE PENELITIAN
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur
3
HASIL
8
DNA Genom Hasil Isolasi
8
Konsentrasi dan Kemurnian DNA Selama Konstruksi Pustaka Genom
9
Hasil Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka DNA Genom
PEMBAHASAN
11
13
DNA Genom Kakao Hasil Isolasi
13
Fragmentasi dan Modifikasi Ujung Fragmen DNA
14
Adenilasi dan Ligasi Adaptor
15
Purifikasi dan Perbanyakan Fragmen DNA
16
Validasi Pustaka DNA Genom
16
Klasterisasi Pustaka DNA Genom
17
Sekuensing DNA Genom
17
SIMPULAN DAN SARAN
20
Simpulan
20
Saran
21
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
23
RIWAYAT HIDUP
33
DAFTAR TABEL
1 Hasil pengujian konsentrasi dan kemurnian DNA kakao menggunakan
spektrofotometer nanodrop
2 Hasil pengujian konsentrasi dsDNA kakao menggunakan fluorometer
3 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahap fragmentasi dan
modifikasi ujung fragmen
4 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahap adenilasi dan ligasi
adaptor
5 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahap purifikasi dan
amplifikasi
6 Rerata ukuran dan molaritas fragmen DNA hasil validasi pustaka DNA
genom
7 Jumlah basa dan kualitas kaster pustaka genom
8 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
9 Jumlah basa dan pembacaan sekuensing setiap genotipe
8
8
9
9
10
11
11
11
12
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA hasil isolasi: DNA penanda (M), DR1 (1), DR2
(2), DR38 (3), NIE7 (4), PA300 (5), RCC70 (6), SD6225 (7), TSH858
(8), dan UIT1 (9)
2 Elektroforegram hasil bioanalyzer pada tahap validasi pustaka DNA
genom: DNA penanda (ladder), DR1 (1), DR2 (2), NIE7 (3), SD6225
(4)
3 Elektroforegram pada tahap validasi pustaka DNA genom: DNA
penanda (M), DR38 (5), PA300 (6), RCC70 (7), TSH858 (8), UIT1 (9)
4 Perkiraan ukuran genom masing-masing genotipe
5 Kesalahan berdasarkan urutan posisi basa
9
10
10
12
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Jumlah dan densitas klaster pustaka genom serta persentase phasing
dan prephasing selama proses sekuensing
3 Panjang fragmen yang dimasukkan dalam setiap lajur selama proses
sekuensing
4 Jumlah klaster berdasarkan Q30 score
5 Distribusi kualitas setiap posisi basa
6 Histogram perkiraan ukuran fragmen
7 Perkiraan proporsi penggandaan fragmen
8 Rataan kualitas basa berdasarkan posisinya
9 Fraksi basa pada Q30 berdasarkan posisinya
10 Persentase GC content
23
24
25
26
27
28
28
29
29
30
PENDAHULUAN
Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu komoditas yang penting
bagi negara Indonesia, terutama dalam memenuhi permintaan ekspor, yaitu
sebagai bahan baku pembuatan cokelat. Biji kakao digunakan sebagai bahan baku
produksi cokelat karena memiliki kandungan gizi yang tinggi serta menghasilkan
cokelat dengan rasa yang enak. Menurut Wahyudi et al. (2008), biji kakao
mengandung sekitar 50% lemak nabati, 15% karbohidrat, dan sisanya berupa
pektin, lendir, dan getah. Selain itu, biji kakao juga mengandung senyawa
polifenol yang cukup tinggi, diantaranya katekin (33-42%), leukosianidin (2325%), dan antosianin (5%) (Kusuma et al. 2013).
Menurut Pusat Penelitian Kopi dan Kakao (2007), kualitas biji kakao yang
dihasilkan di Indonesia masih relatif rendah walaupun secara kuantitas mengalami
peningkatan setiap tahunnya. Rendahnya produksi kakao Indonesia disebabkan
oleh beberapa faktor, yaitu serangan hama, pemakaian benih yang tidak unggul,
serta masalah pembungaan dan layu buah (Ditjen Perkebunan 2006). Upaya yang
dapat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas kakao adalah dengan
perbaikan genetik tanaman.
Teknik perbaikan genetik tanaman kakao melibatkan prosedur isolasi DNA
serta membutuhkan informasi genomik dan genetik tanaman kakao. Informasi
tersebut dapat diperoleh dengan cara sekuensing genom total kakao. Penelitian
mengenai sekuensing genom kakao sangat penting mengingat banyak genotipe
kakao yang masih belum diketahui sekuennya. Sekuen yang telah dihasilkan
kemudian dibandingkan dengan sekuen rujukan kakao yang telah diperoleh dan
dapat diakses dengan mudah. Adanya sekuen rujukan tersebut dapat dimanfaatkan
untuk mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam meningkatkan produktivitas
dan ketahanan tanaman kakao (Argout et al. 2011).
Tahap yang dilakukan sebelum sekuensing DNA genom adalah isolasi DNA
dan konstruksi pustaka genom. Tahap isolasi DNA dilakukan untuk memperoleh
molekul DNA dari suatu organisme. Isolasi DNA meliputi tahap pemecahan
dinding sel agar molekul DNA dapat dikeluarkan dari sel, deproteinasi untuk
menghilangkan protein dan kontaminan lain, serta pemekatan DNA untuk
memperoleh utas-utas DNA (Walker & Wilson 2000).
Konstruksi pustaka genom yang biasa dilakukan yaitu dengan menyisipkan
fragmen DNA yang telah diisolasi ke dalam suatu vektor tertentu. Teknik
konstruksi pustaka genom yang berkembang akhir-akhir ini melibatkan tahap
fragmentasi dan modifikasi fragmen DNA dengan menempelkan adaptor ke
ujung-ujung fragmen tersebut untuk membentuk suatu pustaka genom.
Berdasarkan protokol dari Illumina (2010a), pustaka DNA genom yang akan
disekuensing harus memiliki panjang fragmen kurang dari 800 bp dan konsentrasi
minimal 2 ng/µL. Pustaka genom yang telah dikonstruksi kemudian disekuensing
untuk memperoleh urutan nukleotida secara lengkap (Illumina 2008).
Terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk proses sekuensing
DNA genom, antara lain adalah metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger
(Sanger et al. 1975). Kedua metode tersebut dinilai memiliki beberapa
kekurangan dalam hal efektifitas dan jumlah basa yang berhasil disekuensing.
Kekurangan tersebut dapat diminimalkan dengan menggunakan teknologi next
2
generation sequencing (NGS) yang dapat mengurutkan genom total dan
menghasilkan sekuen dalam jumlah yang cukup banyak (Metzker 2010).
Instrumen yang digunakan untuk sekuensing dalam penelitian ini adalah NGS
HiSeq2000. Instrumen ini dapat membaca suatu untai DNA sepanjang 2×100 bp
dan menghasilkan data sebesar 200 Gbp dengan akurasi mencapai 99.5% (Zhang
et al. 2011).
Beberapa tanaman perkebunan telah disekuensing dengan menggunakan
NGS HiSeq2000, contohnya kedelai (Kosasih 2012), kopi (Healey et al. 2014),
dan tiga genotipe kakao (ICCR02, ICCR04, dan SUL02) yang dilakukan oleh
Tasma et al. (2012). Penelitian tersebut menyebutkan bahwa pustaka genom yang
telah dikonstruksi memiliki kualitas yang ideal untuk digunakan dalam tahap
sekuensing serta data sekuen yang dihasilkan dapat digunakan untuk identifikasi
marka dan gen-gen yang diinginkan (Tasma et al. 2012).
Informasi mengenai konstruksi pustaka genom kakao dan hasil sekuensing
genom kakao masih terbatas, sehingga usaha peningkatan produksi biji kakao juga
masih mengalami hambatan. Untuk itu perlu dilakukan suatu penelitian mengenai
sekuensing genom kakao. Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi pustaka genom
kakao sehingga dapat digunakan untuk membaca genom kakao dengan
menggunakan next generation sequencing HiSeq2000. Hasil konstruksi pustaka
genom dan sekuensing genom kakao akan memungkinkan terkumpulnya
informasi genetik dan genomik tanaman kakao berbagai genotipe melalui teknik
next generation sequencing. Kualitas hasil sekuensing dan urutan DNA yang
diperoleh dapat digunakan dalam berbagai bidang, misalnya pemetaan gen dan
identifikasi marka molekuler yang sangat diperlukan dalam bidang bioteknologi
dan pemuliaan tanaman kakao. Koleksi marka molekuler yang digunakan untuk
mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam pengendalian ekspresi tertentu
tanaman kakao juga dapat membantu memperpendek siklus pemuliaaan tanaman
kakao.
Hipotesis penelitian ini adalah konstruksi pustaka genom kakao dapat
dilakukan untuk sekuensing genom total dengan menggunakan instrumen NGS
HiSeq2000. Penelitian ini diawali dengan isolasi DNA dari sampel daun kakao
yang sebelumnya telah disimpan dalam mesin pendingin, kemudian dilanjutkan
dengan konstruksi pustaka genom, klasterisasi, dan sekuensing genom total.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA kakao adalah daun kakao
dari sembilan genotipe, yaitu DR1, DR2, DR38, NIE7, PA300, RCC70, SD6225,
TSH858, dan UIT1, nitrogen cair, bufer ekstraksi (NaCl 5 M, PVP 4%, βmerkaptoetanol 1%, CTAB 2%, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA pH 8, dan
akuades), kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v), kloroform, isopropanol dingin,
etanol 80%, dan Nuclease Free Water (NFW). Bahan-bahan yang digunakan
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif DNA hasil isolasi serta purifikasi produk
ligasi adalah serbuk agarose, bufer TAE 1×, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder
3
100 bp, Qubit reagent, Qubit buffer, dan Qubit standard. Bahan yang digunakan
untuk fragmentasi DNA adalah resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan
untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah End Repair Control dan End Repair
Mix. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH adalah A-Tailing
Mix dan A-Tailing Control. Bahan-bahan yang digunakan untuk ligasi adaptor
adalah Ligase Mix, Ligase Control, Stop Ligase Mix, dan Adapter Index. Tahap
amplifikasi atau perbanyakan fragmen DNA menggunakan PCR Master Mix dan
PCR Primer Cocktail. Setiap tahap dalam konstruksi pustaka genom melibatkan
pencucian fragmen DNA dengan menggunakan AMPure XP Beads, resuspension
buffer, dan etanol 80%. Tahap klasterisasi dan sekuensing genom dilakukan
dengan menggunakan 2 N NaOH, akuades, bufer hibridisasi, TruSeq SR Cluster
Kit v3-cBot-HS, dan TruSeq SBS Kit-HS (200 cycle).
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah sentrifus,
spektrofotometer nanodrop, fluorometer, tabung Covaris, tangki elektroforesis,
Agilent Bioanalyzer, chip DNA, PCR plate, mesin PCR, mesin qPCR, UV
transiluminator, dan magnetic stand. Tahap klasterisasi pustaka genom dilakukan
dalam Illumina cBot Cluster Generation dan tahap sekuensing dilakukan
menggunakan perangkat Illumina HiSeq2000.
Prosedur
Isolasi DNA Genom (Michiels et al. 2003)
Metode isolasi DNA kakao dilakukan dengan merujuk pada metode
Michiels et al. (2003) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 0.3 gram daun kakao
dihaluskan dalam nitrogen cair, kemudian dicampur dengan bufer ekstraksi yang
telah dipanaskan pada suhu 60 oC sebanyak 1 mL. Sampel disentrifus pada 12000
rpm selama 1 menit, lalu supernatan dibuang. Penambahan bufer ekstraksi dan
sentrifus diulangi sebanyak lima kali lagi hingga supernatan tidak berlendir.
Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 65 oC selama 45 menit. Secara berkala,
tabung dibolak-balik untuk mencegah pengendapan. Sebanyak 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1, v/v) ditambahkan ke dalam sampel, lalu
divorteks selama 2 menit. Sampel disentrifus pada 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan ditambah dengan 1 volume kloroform. Sampel kemudian divorteks
selama 2 menit, lalu disentrifus pada 12000 rpm selama 5 menit. Penambahan
kloroform diulangi satu kali lagi. Supernatan yang diperoleh kemudian ditambah
dengan 0.8 volume isopropanol, lalu tabung dibolak-balik hingga larutan
tercampur dan terlihat benang-benang berwarna putih. Sampel diinkubasi selama
1 jam pada suhu -20 oC, lalu disentrifus pada 16000 g selama 5 menit. Supernatan
dibuang, kemudian pelet yang diperoleh dicuci dengan 1 mL alkohol 80%.
Sampel kemudian disentrifus pada 16000 g selama 5 menit. Pencucian
menggunakan alkohol 80% diulangi satu kali lagi. Pelet yang diperoleh
dikeringkan di suhu ruang, kemudian ditambah dengan 100 µL nuclease free
water hingga larut, lalu disimpan di suhu -20 oC.
4
Uji Kualitatif DNA Genom (Sambrook 2001)
Uji kualitatif DNA dilakukan untuk mengetahui kualitas molekul DNA yang
telah diisolasi. Uji kualitatif tersebut dilakukan melalui elektroforesis gel agarose
1% yang dibuat dari 0.55 gram serbuk agarose yang dilarutkan dalam 55 mL bufer
TAE 1×. Gel yang telah memadat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang
telah diisi dengan bufer TAE 1×. Sampel yang akan diuji dicampur dengan
loading buffer (loading dye, SyBr Gold 100×, dan MQ Water). Campuran tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarose. Marker yang digunakan
adalah 6.5 µL DNA ladder 100 bp yang telah ditambah dengan 0.5 µL SyBr Gold
100×. Alat elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt selama 30 menit,
kemudian hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV.
Uji Kuantitatif DNA Genom
Uji kuantitatif DNA genom kakao dilakukan untuk mengetahui konsentrasi
dan kemurnian DNA kakao yang diperoleh dari tahap isolasi. Uji tersebut
dilakukan menggunakan instrumen spektrofotometer nanodrop untuk mengetahui
konsentrasi keseluruhan molekul DNA dan fluorometer untuk mengetahui
konsentrasi DNA utas ganda. Blanko yang digunakan untuk spektrofotometri
nanodrop adalah nuclease free water (NFW), dan volume sampel yang digunakan
adalah sebnyak 2 µL.
Uji kuantitatif selanjutnya adalah fluorometri. Qubit Working Solution
(QWS) dibuat terlebih dahulu, yaitu satu bagian Qubit Reagent dilarutkan dalam
199 bagian Qubit Buffer. Sebanyak 190 QWS ditambah dengan 10 µL larutan
standar dalam tabung Eppendorf yang berbeda. Sebanyak 2 µL sampel ditambah
dengan 198 µL QWS. Semua larutan yang telah dibuat divorteks selama 3 detik,
kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Instrumen fluorometer
dinyalakan, kemudian tabung berisi larutan standar dimasukkan untuk mengukur
absorbansi larutan standar. Tabung berisi larutan sampel dimasukkan ke dalam
instrumen flourometer untuk mengetahui konsentrasi DNA utas ganda pada
sampel tersebut.
Konstruksi Pustaka Genom (Illumina 2010c)
Tahap konstruksi pustaka genom terdiri atas beberapa langkah, yaitu
fragmentasi DNA, modifikasi ujung fragmen DNA, adenilasi ujung 3’OH, ligasi
adaptor, purifikasi hasil ligasi, dan amplifikasi fragmen DNA. Spektrofotometri
nanodrop dilakukan setelah tahap modifikasi ujung fragmen, ligasi adaptor, dan
amplifikasi fragmen DNA untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA.
Volume DNA yang digunakan pada spektrofotometri nanodrop tersebut adalah
sebanyak 2 µL dan bufer yang digunakan adalah resuspension buffer.
Fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA dilakukan untuk memperoleh
fragmen DNA berukuran lebih pendek, yaitu 300-400 bp atau kurang dari 800 bp
(Illumina 2008). Sebanyak 130 µL sampel DNA yang telah dilarutkan dalam
resuspension buffer dimasukkan ke dalam tabung Covaris, kemudian dimasukkan
ke dalam instrumen Covaris. Instrumen Covaris diatur sebagai berikut: duty cycle
10%, intensitas 5.0, 200 burst per second, durasi pemotongan selama 200 detik,
mode frequency sweeping, daya 23 W, dan suhu 5.5-6 oC. Sebanyak 50 µL sampel
yang telah difragmentasi dipindahkan ke PCR plate.
5
Modifikasi ujung fragmen DNA. Sebanyak 10 µL End Repair Control dan
40 µL End Repair Mix dicampurkan ke dalam sampel, kemudian diinkubasi pada
suhu 30 oC selama 30 menit dalam thermal cycler. Sebanyak 160 µL AMPure XP
Beads dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen. Campuran tersebut
diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. PCR plate yang berisi sampel
kemudian dipindahkan dalam magnetic stand selama 15 menit hingga sampel
jernih. Sebanyak 127.5 µL supernatan dibuang dengan hati-hati. Tahap tersebut
diulangi satu kali lagi untuk menghilangkan supernatan yang masih tersisa.
Sebanyak 200 µL etanol 80% ditambahkan ke dalam plate dengan hati-hati,
kemudian diinkubasi selama minimal 30 detik. Semua supernatan dalam plate
dibuang. Pencucian dengan etanol 80% tersebut diuangi satu kali lagi. Pelet yang
diperoleh kemudian dikeringkan pada suhu ruang selama 15 menit. Pelet
diresuspensi menggunakan resuspension buffer sebanyak 17.5 µL, kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Plate ditempatkan pada magnetic
stand selama 5 menit hingga cairan jernih. Sebanyak 15 µL supernatan
dipindahkan ke dalam PCR plate yang baru, kemudian disimpan di suhu -20 oC
untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
Adenilasi Ujung 3’OH. Sebanyak 2.5 µL A-Tailing Control dan 12.5 µL ATailing Mix dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen. Campuran tersebut
kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit dalam thermal cycler
untuk selanjutnya digunakan pada tahap ligasi adaptor.
Ligasi Adaptor. Ligase Control, DNA Ligase Mix, dan DNA Adapter Index
masing-masing sebanyak 2.5 µL dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen.
Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 30 oC selama 10 menit dalam thermal
cycler. Sampel kemudian ditambah dengan 5 µL Stop Ligase Mix hingga
homogen, kemudian dilakukan pencucian dengan meggunakan AMPure XP Beads
dan etanol 80%. Hasil pencucian disimpan pada suhu -20 oC untuk digunakan
dalam tahap selanjutnya.
Purifikasi hasil ligasi. Pemurnian hasil ligasi dilakukan dengan
elektroforesis gel agarose 2% yang dibuat dari 1.2 gram serbuk agarose yang
dilarutkan dalam 60 mL bufer TAE 1×. Gel yang telah memadat dipindahkan ke
dalam bak elektroforesis yang telah diisi dengan bufer TAE 1×. Bak elektroforesis
kemudian disimpan di atas UV Transiluminator yang telah dilapisi dengan kaca
anti radiasi. Sebanyak 20 µL sampel hasil ligasi ditambah dengan 4 µL loading
dye, lalu dimasukkan ke dalam sumur bagian atas pada gel agarose. Sumur bagian
bawah diisi dengan NFW sebanyak 25 µL. Marka yang digunakan adalah 12 µL
DNA ladder 100 bp. Elektroforesis dilakukan selama 1 jam pada tegangan 100
volt. Setelah proses elektroforesis selesai, cairan pada sumur bagian bawah
diambil sebanyak 20 µL, lalu dimasukkan ke dalam PCR plate yang baru.
Tahap purifikasi dapat dilanjutkan dengan ekstraksi gel agarose untuk
memperoleh fragmen DNA yang diinginkan jika volume cairan yang diperoleh
dari tahap elektroforesis di atas tidak mencukupi atau memiliki konsentrasi DNA
yang terlalu kecil. Gel hasil elektroforesis dipotong pada bagian fragmen yang
diinginkan, kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL. Sebanyak 3 volume
QG buffer ditambahkan ke dalam tabung, kemudian diinkubasi pada suhu ruang
selama 10 menit atau hingga seluruh gel larut. Setelah gel larut sempurna,
sebanyak 1 volume isopropanol 100% ditambahkan ke dalam campuran tersebut
hingga homogen, kemudian dipindahkan ke dalam MinElute Column dan
6
disentrifus selama 1 menit pada 17900 g atau 13000 rpm. Cairan dibuang,
kemudian sebanyak 0.5 mL QG buffer ditambahkan ke dalam MinElute Column.
Sampel disentrifus pada 17900 g atau 13000 rpm selama 1 menit. Cairan dibuang,
kemudian sebanyak 0.75 mL bufer PE dimasukkan ke dalam MinElute Column.
Kolom dipindahkan ke tabung 1.5 mL, lalu sebanyak 10 µL bufer EB (10 mM
Tris-Cl ph 8.5) atau NFW dimasukkan ke dalam kolom. Kolom tersebut
didiamkan selama 1 menit, kemudian disentrifus pada 17900 g atau 13000 rpm
selama 1 menit. Cairan yang diperoleh dipindahkan ke dalam PCR plate untuk
tahap selanjutnya.
Amplifikasi fragmen DNA. Sebanyak 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25
µL PCR Master Mix dicampurkan ke dalam sampel hingga homogen. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR. Proses amplifikasi dilakukan dengan
tahap pra denaturasi pada suhu 98 oC selama 30 detik, denaturasi pada suhu 98 oC
selama 10 detik, annealing pada suhu 60 oC selama 30 detik, dan elongasi pada
suhu 72 oC selama 30 detik. Tahap denaturasi hingga elongasi dilakukan sebanyak
10 siklus, kemudian dilanjutkan dengan tahap pasca elongasi pada suhu 72 oC
selama 5 menit. Setelah tahap amplifikasi dalam mesin PCR selesai, sampel
dicuci dengan menggunakan AMPure XP Beads dan etanol 80%, kemudian
disimpan pada suhu -20 oC untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
Validasi Pustaka Genom (Illumina 2010c)
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui molaritas dan ukuran fragmen
pustaka genom yang telah dibuat. Validasi dapat dilakukan menggunakan Agilent
Bioanalyzer dengan High Sensitivity DNA chip atau elektroforesis gel agarose dan
qPCR (quantitative PCR). Sebanyak 9 µL campuran gel dan dye dari kit Agilent
Bioanalyzer High Sensitivity dimasukkan ke dalam chip DNA. Priming station
ditutup dan plunger ditekan selama 1 menit. Setelah priming station dibuka,
sebanyak 5 µL marker dimasukkan ke semua lubang. Sebanyak 1 µL DNA ladder
dimasukkan ke lubang bertanda ladder, kemudian sebanyak 1 µL sampel
dimasukkan ke dalam lubang sampel. Chip DNA divorteks horizontal selama 1
menit pada 2400 rpm. Chip DNA kemudian dimasukkan ke dalam instrumen
Agilent Bioanalyzer. Teknik tersebut dapat diganti dengan elektroforesis gel
agarose biasa karena kedua teknik tersebut memiliki prinsip yang sama. Sebanyak
1.2 gram serbuk agarose dilarutkan dalam 60 mL TAE 1× untuk memperoleh gel
berkonsentrasi 2%. Penanda atau marker dibuat dari 5.5 µL DNA ladder 100 bp
yang dicampurkan dengan 0.5 µL SyBr Gold. Sebanyak 5 µL DNA ditambah
dengan 2 µL loading dye, 0.5 µL SyBr Gold, dan 4.5 µL MQ Water.
Elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada tegangan 100 volt.
Elektroforegram yang dihasilkan kemudian digunakan untuk menganalisis ukuran
fragmen pada pustaka genom.
Validasi pustaka genom menggunakan qPCR bertujuan mengetahui
molaritas fragmen DNA yang kedua ujungnya telah ditempeli adaptor. Langkah
pertama yang dilakukan adalah pembuatan dilution buffer. Sebanyak 100 µL TrisHCl 10 mM pH 8 ditambah dengan 5 µL 0.05% Tween 20 dan 9895 µL ddH2O,
kemudian dicampur hingga homogen. Sebanyak 999 µL dilution buffer ditambah
dengan 1 µL sampel untuk memperoleh pengenceran 1:1000, kemudian divorteks
selama 10 detik. Campuran tersebut diambil sebanyak 100 µL lalu dicampurkan
dengan 100 µL dilution buffer untuk memperoleh pengenceran 1:2000, kemudian
7
divorteks 10 detik. Larutan tersebut diambil sebanyak 100 µL kemudian ditambah
dengan 100 µL dilution buffer untuk memperoleh pengenceran 1:4000, lalu
divorteks selama 10 detik. Larutan PCR mix yang digunakan berupa 75% Kapa
yang dilarutkan dalam NFW. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam
PCR plate sebanyak 16 µL. Sebanyak 4 µL dari setiap hasil pengenceran
dimasukkan ke dalam PCR plate yang telah berisi PCR mix. Larutan standar yang
digunakan dimasukkan sebanyak 4 µL ke dalam lubang lain dalam PCR plate.
Plate kemudian ditutup dengan seal adhesive kemudian dimasukkan ke dalam
instrumen qPCR. Reaksi yang terjadi dalam mesin qPCR adalah initial activation
(95 oC selama 5 menit), denaturation (95 oC selama 30 detik), dan annealing serta
extension (60 oC selama 45 detik). Tahap denaturation hingga extension
dilakukan sebanyak 35 siklus.
Klasterisasi Pustaka Genom (Illumina 2010b)
Molaritas minimal yang dibutuhkan untuk tahap klasterisasi adalah 2 nM.
Sampel yang memiliki molaritas di atas 2 nM harus diencerkan terlebih dahulu
dalam library buffer yang dibuat dari Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20
hingga volume 30 µL. DNA cetakan yang telah berkonsentrasi 2 nM kemudian
diencerkan kembali menggunakan NaOH 0.1 N hingga mencapai konsentrasi 13
pM. Sebanyak 6.5 µL DNA cetakan yang akan digunakan ditambah dengan 6.5
µL NaOH 0.1 N, kemudian dilarutkan dalam 987 µL HT1. Campuran tersebut
divorteks, kemudian diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 20
µL DNA cetakan tersebut diambil, kemudian ditambahkan ke dalam 980 µL HT1.
Klasterisasi dilakukan dalam instrumen cBot Cluster Generation. Sebanyak
120 µL DNA cetakan yang telah dipreparasi dimasukkan ke dalam tube,
kemudian ditambah dengan 1.2 µL PhiX Library Control. Reagen yang akan
digunakan dimasukkan ke dalam kompartemen dalam instrumen cBot Cluster
Generation, kemudian dilakukan pemasangan flow cell dan manifold. Tube yang
berisi DNA cetakan dimasukkan ke dalam kompartemen, kemudian instrumen
cBot Cluster Generation dijalankan.
Sekuensing Pustaka Genom (Illumina 2010a)
Tahap sekuensing DNA genom menggunakan Illumina HiSeq2000 terdiri
atas beberapa tahap, yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk
sekuensing, pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing
(maintenance wash). Reagen yang digunakan adalah SBS (Sequence by Synthesis)
reagent (TruSeq SBS kit), multiplexing reagent, dan paired-end reagent. Reagenreagen tersebut dimasukkan ke dalam rak dan disimpan dalam kompartemen
reagen yang terdapat dalam Illumina HiSeq2000. Parameter yang diperlukan
untuk sekuensing dipilih melalui HiSeq control software interface. Parameter
tersebut adalah flow cell ID, experiment, user name, flow cell type, control lane,
output folder, confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image,
dan align lanes. Tahap selanjutnya adalah dipasangnya flow cell pada flow cell
stage. Sekuensing dilakukan selama 11 hari dengan pembacaan DNA sebanyak 2
× 100 siklus. Tahap terakhir adalah dipindahkannya flow cell dari flow cell stage,
kemudian dilakukan post-run sequensing, yaitu berupa pencucian dan pembilasan
dengan menggunakan air dan NaOH.
8
HASIL
DNA Genom Hasil Isolasi
Konsentrasi DNA kakao yang dihasilkan berada pada rentang 163.3-469.4
ng/µL, sedangkan perbandingan 260/280 dan 260/230 yang diukur menggunakan
spektrofotometer nanodrop masing-masing berada pada rentang 1.78-2.06 dan
0.99-1.73 (Tabel 1). Analisis menggunakan fluorometer bertujuan mengetahui
konsentrasi DNA utas ganda yang terdapat dalam sampel. Konsentrasi DNA utas
ganda yang terdeteksi berada pada rentang 20.9-63.8 ng/µL (Tabel 2).
Elektroforegram hasil elektroforesis gel agarose 1% menunjukkan fragmenfragmen DNA yang telah diisolasi berada di bagian atas dekat sumur, dan
berukuran lebih besar dari 1500 bp (Gambar 1). Fragmen DNA yang dihasilkan
menunjukkan bahwa DNA yang telah diisolasi merupakan DNA genom yang
berukuran besar dan tidak terdegradasi.
Tabel 1 Hasil pengujian konsentrasi dan kemurnian DNA kakao menggunakan
spektrofotometer nanodrop
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
209.9
178.6
438.7
240.4
310.6
235.9
163.3
344.9
469.4
260/280
1.97
2.00
2.01
2.04
1.78
1.84
2.06
1.89
1.90
260/230
1.37
1.26
1.51
1.73
0.99
1.07
1.63
1.18
1.16
Tabel 2 Hasil pengujian konsentrasi dsDNA kakao menggunakan fluorometer
Genotipe
[dsDNA] (µg/mL)
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
0.242
0.219
0.638
0.210
0.228
0.235
0.209
0.208
0.228
Faktor
pengenceran
100
100
100
100
100
100
100
100
100
[dsDNA] (ng/µL)
24.2
21.9
63.8
21.0
22.8
23.5
20.9
20.8
22.8
9
DNA
genom
1500 bp
100 bp
Gambar 1 Elektroforegram DNA hasil isolasi: DNA penanda (M), DR1 (1), DR2
(2), DR38 (3), NIE7 (4), PA300 (5), RCC70 (6), SD6225 (7), TSH858
(8), dan UIT1 (9)
Konsentrasi dan Kemurnian DNA Selama Konstruksi Pustaka Genom
Konsentrasi dan kemurnian DNA masing-masing genotipe selama proses
konstruksi pustaka genom ditunjukkan pada Tabel 3, 4, dan 5. Konsentrasi setiap
genotipe mengalami penurunan, sedangkan kemurniannya cenderung fluktuatif.
Ukuran pustaka DNA genom ditujukkan pada elektroforegram hasil validasi
pustaka DNA genom (Gambar 2 dan 3). Data yang dihasilkan dari tahap validasi
pustaka genom secara ringkas ditampilkan pada Tabel 6.
Tabel 3 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah fragmentasi dan modifikasi
ujung fragmen
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
343.1
286.1
158.9
410.4
209.3
96.7
289.3
143.5
457.0
260/280
2.15
2.35
2.15
2.17
1.54
1.80
2.28
1.78
1.91
260/230
1.86
1.94
1.74
2.23
0.56
0.68
2.49
0.87
1.13
Tabel 4 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah adenilasi dan ligasi adaptor
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
165.0
29.5
73.1
223.1
31.6
15.3
122.5
47.5
218.2
260/280
2.06
2.31
2.14
2.14
2.07
2.50
2.16
2.17
2.02
260/230
1.79
0.86
2.14
2.04
1.03
1.33
2.03
1.57
1.83
10
Tabel 5 Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah purifikasi dan amplifikasi
Genotipe
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
[DNA] (ng/µL)
7.5
6.0
9.7
11.5
4.5
9.9
3.2
4.1
9.1
1
260/280
2.18
2.19
1.88
2.01
1.90
1.42
2.04
1.65
1.78
2
3
260/230
1.63
1.82
2.10
1.60
1.21
0.72
1.08
1.63
1.79
4
Gambar 2 Elektroforegram hasil bioanalyzer pada tahap validasi pustaka DNA
genom: DNA penanda (ladder), DR1 (1), DR2 (2), NIE7 (3), SD6225
(4)
500 bp
300 bp
Gambar 3
Elektroforegram pada tahap validasi pustaka DNA genom: DNA
penanda (M), DR38 (5), PA300 (6), RCC70 (7), TSH858 (8), UIT1
(9)
11
Tabel 6 Rerata ukuran dan molaritas fragmen DNA hasil validasi pustaka DNA
genom
Genotipe
Rerata ukuran (bp)
Molaritas (nM/L)
DR 1
DR 2
DR 38
NIE 7
PA 300
RCC 70
SD 6225
TSH 858
UIT 1
452
426
314
485
458
475
461
441
314
10.04
2.04
23.86
5.31
4.70
2.90
3.96
15.06
4.55
Hasil Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka DNA Genom
Tahap klasterisasi dilakukan untuk memperoleh klaster atau kelompok
salinan pustaka DNA genom yang telah divalidasi untuk selanjutnya disekuensing.
Jumlah basa yang dihasilkan pada klaster sebesar 391.93 Gbp (Tabel 7),
sedangkan densitas klaster yang dihasilkan sebesar 654-763 K/mm2, dan
kesalahan yang terjadi sebesar 0.20-1.14 % (Tabel 8). Jumlah basa dan
pembacaan selama proses sekuensing ditampilkan pada Tabel 9. Jumlah
pembacaan yang efektif dilakukan sebesar 48-98 %, dan jumlah basa yang secara
efektif dibaca sebesar 27-94%.
Analisis masing-masing genotipe dilakukan setelah tahap sekuensing yang
bertujuan untuk mengetahui ukuran genom serta kualitas hasil sekuensing masingmasing genotipe. Ukuran genom yang berhasil diperoleh berada pada rentang 1.5566.9 Mbp (Gambar 4). Secara umum, kesalahan yang terjadi bernilai lebih tinggi
di bagian awal dan akhir pembacaan (Gambar 5).
Tabel 7 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom
Jumlah total
basa (Gbp)
Jumlah basa
kontrol (Gbp)
Jumlah basa ≤ 3
eror (Gbp)
Tingkat
kesamaan
% ≤ 3 eror
391.93
5.1
6.1
82.0 %
97.6
Tabel 8 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Genotipe
Lajur 7
(DR38,
PA300)
Lajur 8
(RCC70,
TSH858,
UIT1)
Densitas Klaster
(K/mm2) PF (%)
Phasing
(%)
Prephasing
(%)
Pembacaan
(Mbp)
Read
PF
(Mbp)
Eror
(%)
763
61.0
0.300
0.330
211.1
128.4
1.14
654
87.6
0.215
0.303
180.8
157.9
0.20
12
Tabel 9 Jumlah basa dan pembacaan sekuensing setiap genotipe
Pembacaan
yang
diproses
Pembacaan
yang
dibuang
Pembacaan
efektif (%
input)
Jumlah basa
yang diproses
Jumlah basa
yang terbaca
(% input)
DR38
75521532
38569807
36951725
(48%)
7552153200
2070001641
(27%)
PA300
159147750
4693885
154453865
(97%)
15914775000
14520915847
(91%)
RCC70
102922298
2136739
100785559
(97%)
10292229800
9676710935
(94%)
TSH858
124909656
2059912
UIT1
67373834
20384723
Genotipe
122849744
(98%)
46989111
(69%)
12490965600
6737383400
11691479170
(93%)
3801807562
(56%)
Gambar 4 Perkiraan ukuran genom masing-masing genotipe
Gambar 5 Kesalahan berdasarkan urutan posisi basa
13
PEMBAHASAN
DNA Genom Kakao Hasil Isolasi
Teknik isolasi DNA tanaman kakao memiliki tingkat kesulitan yang relatif
lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman lain. Hal tersebut dapat disebabkan
oleh tingginya konsentrasi kontaminan berupa polisakarida serta pengotor lain
seperti lendir atau getah yang terkandung dalam daun kakao (Argout et al. 2011).
Sebelum melakukan isolasi dengan metode Michiels et al. (2003) yang telah
dimodifikasi, isolasi dilakukan dengan menggunakan metode Michiels et al.
(2003) yang berprinsip pada penggunaan CTAB sebagai senyawa pendegradasi
metabolit sekunder dalam tanaman. DNA yang diperoleh dari hasil isolasi
menggunakan metode tersebut ternyata terkontaminasi oleh karbohidrat dalam
jumlah yang relatif banyak. Untuk menghilangkan kontaminan karbohidrat dalam
DNA yang dihasilkan dari proses isolasi, maka dilakukan modifikasi pada metode
tersebut berupa penambahan bufer ekstraksi sebanyak enam kali penambahan
(Fang et al. 1992).
Uji kuantitas DNA hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer nanodrop dan fluorometer. Spektrofotometer nanodrop akan
mengidentifikasi sampel pada panjang gelombang 230, 260, dan 280 nm. Masingmasing panjang gelombang tersebut merupakan serapan maksimum untuk
polisakarida, asam nukleat, dan protein. Kemurnian DNA dari kontaminan
polisakarida dapat diketahui dengan membandingkan serapan pada panjang
gelombang 260/230, sedangkan kemurnian DNA dari kontaminan protein
diketahui dengan membandingkan serapan pada panjang gelombang 260/280.
Kedua perbandingan tersebut diharapkan berada pada rentang 1.8-2.0. Jika DNA
memiliki kemurnian kurang dari 1.8 maka DNA terkontaminasi oleh protein dan
polisakarida, sedangkan jika DNA memiliki kemurnian lebih dari 2.0 maka DNA
terkontaminasi oleh RNA (Walker & Wilson 2000).
Hasil pengujian
menggunakan spektrofotometer nanodrop menunjukkan bahwa DNA hasil isolasi
memiliki nilai perbandingan 260/280 antara 1.78-2.06, nilai perbandingan
260/230 antara 0.99-1.73, serta konsentrasi antara 163.3-469.4 ng/µL (Tabel 1).
Data tersebut menunjukkan bahwa DNA masih terkontaminasi oleh polisakarida,
namun sudah relatif murni dari protein. Menurut penelitian yang telah dilakukan
oleh Tasma et al. (2012), DNA kakao hasil isolasi memiliki konsentrasi pada
rentang 198.1-303.7 ng/µL. Perbedaan konsentrasi DNA yang dihasilkan dapat
disebabkan oleh adanya kontaminan serta terbuangnya DNA selama tahap isolasi
(Henry 2001).
Uji kuantitatif lain yang digunakan yaitu fluorometri. Analisis ini digunakan
untuk mengidentifikasi kuantitas DNA utas ganda (dsDNA) dalam sampel hasil
isolasi. Data konsentrasi dsDNA yang diperoleh dari fluorometri perlu diketahui
sebagai dasar penentuan volume sampel yang akan digunakan pada tahap
fragmentasi DNA. Konsentrasi DNA utas ganda hasil isolasi berada pada rentang
20.82-63.84 ng/µL (Tabel 2). Konsentrasi DNA utas ganda minimal yang dapat
digunakan untuk tahap selanjutnya adalah 20 ng/µL (Illumina 2008). Konsentrasi
DNA yang dihasilkan dari flourometer lebih kecil dibandingkan dengan
konsentrasi DNA yang dihasilkan dari spektrofotometer nanodrop karena
14
sebagian DNA mengalami denaturasi sehingga memiliki konformasi berupa DNA
utas tunggal yang tidak dapat terbaca pada fluorometer (Beaudet et al 2007).
Pengujian kualitas DNA hasil isolasi dilakukan menggunakan elektroforesis
gel agarose 1%. Prinsip pengujian tersebut adalah pemisahan molekul dalam suatu
medium berupa gel dengan adanya pengaruh medan listrik. Elektroforesis
digunakan karena pelaksanaannya yang relatif lebih mudah dan cepat, serta dapat
memisahkan berbagai fragmen DNA yang tidak dapat dipisahkan secara tepat
oleh metode lain seperti sentrifugasi gradien densitas (Walker & Wilson 2000).
SyBr Gold yang digunakan pada tahap elektroforesis merupakan suatu
pewarna atau fluoresen yang dapat mendeteksi asam nukleat (utas tunggal dan
ganda) dalam gel elektroforesis. Visualisasinya dapat dilakukan dengan
menggunakan UV transiluminator standar pada panjang gelombang 300 nm.
Sensitivitasnya lebih tinggi (25-100 kali) dibandingkan dengan etidium bromida
dan SyBr Green yang juga biasa digunakan sebagai pewarna asam nukleat dalam
gel elektroforesis, sehingga dapat mendeteksi DNA hingga 25 pg. Komponen
utama dalam SyBr Gold adalah dimetil sulfoksida atau DMSO (Molecular Probes
2001).
Pemisahan menggunakan elektroforesis gel agarose 1% menunjukkan hasil
yang cukup baik (Gambar 1). Pita DNA yang berada pada bagian atas gel
menunjukkan bahwa molekul DNA sampel berukuran cukup besar dan tidak
terdegradasi. Ukuran molekul DNA yang besar tersebut menandakan bahwa
molekul DNA yang telah diisolasi merupakan DNA genom. Molekul DNA genom
tidak akan termigrasi lebih lanjut dalam gel agarose karena memiliki ukuran yang
lebih besar dibandingkan dengan ukuran pori-pori gel (Sahu et al. 2012).
Fragmentasi dan Modifikasi Ujung Fragmen DNA
Fragmentasi merupakan tahap awal dalam proses konstruksi pustaka genom.
Tahap fragmentasi bertujuan memperoleh fragmen-fragmen DNA berukuran lebih
kecil yang akan digunakan dalam tahap sekuensing. Menurut Illumina (2008),
fragmen DNA yang digunakan dalam tahap sekuensing adalah fragmen yang
berukuran kurang dari 800 bp. Ukuran fragmen yang dipilih pada penelitian ini
adalah 300-400 bp. Ukuran tersebut dipilih untuk memudahkan pembuatan
pustaka genom yang optimum untuk tahap sekuensing (Barnum 2005).
Tahap fragmentasi pada penelitian ini dilakukan dengan metode sonikasi,
yaitu dengan memajankan gelombang ultrasonik pada larutan DNA. Metode ini
termasuk ke dalam teknik fragmentasi secara mekanik. Menurut Pirrung (2007),
sonikasi merupakan salah satu teknik yang efektif dalam pencampuran, proses
reaksi, dan pemecahan bahan dengan bantuan energi tinggi. Efek yang dihasilkan
dari proses sonikasi tersebut dapat berupa efek fisik dan efek kimia. Secara fisik,
sampel yang mengalami sonikasi akan teremulsi, sementara secara kimia akan
terjadi interaksi antara molekul dalam sampel tersebut yang selanjutnya akan
menyebabkan perubahan ikatan kimia dalam sampel (Suslick & Price 2000).
Interaksi tersebut terjadi karena panjang gelombang ultrasonik lebih tinggi
dibandingkan dengan panjang gelombang molekul-molekul dalam sampel
(Wardiyati et al. 2004).
DNA yang telah difragmentasi kemudian dimodifikasi ujung-ujungnya
untuk memperoleh fragmen DNA berujung tumpul. Modifikasi tersebut berupa
penambahan End Repair Mix yang mengandung enzim eksonuklease dan
15
polimerase. Enzim eksonuklease akan memotong nukleotida pada ujung 3’OH
yang menggantung, sedangkan enzim polimerase akan melengkapi ujung 5’P
yang menggantung dengan cara mensintesis utas DNA baru yang komplemen
dengan ujung 5’P tersebut (Illumina 2010c).
Hasil fragmentasi dan modifikasi ujung fragmen DNA diuji konsentrasi dan
kemurniannya secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop.
Konsentrasi DNA hasil fragmentasi dan modifikasi ujung fragmen berada pada
rentang 96.7-475.0 ng/µL dengan perbandingan 260/280 sebesar 1.54-2.35 dan
perbandingan 260/230 sebesar 0.56-2.49 (Tabel 3). Jika dibandingkan dengan
hasil isolasi DNA pada Tabel 1, maka dapat diketahui bahwa konsentrasi DNA
beberapa sampel mengalami peningkatan (DR1, DR2, NIE7, dan SD6225), dan
beberapa sampel yang lain (DR38, PA300, RCC70, TSH858, dan UIT1)
mengalami penurunan. Penurunan konsentrasi DNA tersebut dapat disebabkan
oleh adanya fragmen DNA yang tidak terikat pada AMPure XP Beads selama
proses purifikasi, sehingga fragmen DNA tersebut terbuang bersama etanol 80%.
AMPure XP Beads yang digunakan untuk tahap pencucian mengandung butiranbutiran halus paramagnetik yang akan mengikat fragmen-fragmen DNA dan
menghilangkan kelebihan pereaksi yang dapat mengganggu pada tahap
selanjutnya (Agencourt Bioscience 2009).
Adenilasi dan Ligasi Adaptor
Tahap adenilasi bertujuan menambahkan nukleotida adenin ke ujung tumpul
(3’OH) untuk mencegah terjadinya ligasi antar fragmen DNA selama proses ligasi
adaptor berlangsung. Proses adenilasi dilakukan dengan menambahkan A-Tailing
Mix yang berisi basa adenin dan A-Tailing Control ke dalam sampel hasil
modifikasi ujung fragmen DNA. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 oC
dilakukan untuk mengoptimalkan penempelan basa adenin di ujung fragmen DNA
(Illumina 2008).
Tahap selanjutnya setelah adenilasi adalah ligasi adaptor. Reagen yang
ditambahkan pada tahap ini adalah Ligase Control, Ligase Mix, Adapter Index,
dan Stop Ligase Mix. Ligase Control akan mempertahankan kondisi optimal
sampel selama tahap ligasi, sedangkan Ligase Mix yang berisi enzim ligase akan
menyambungkan fragmen DNA dengan adaptor melalui reaksi ligasi. Adapter
Index berisi sekumpulan sekuen nukleotida (6-7 basa) yang ditambahkan di ujung
fragmen DNA untuk mempersiapkan fragmen dalam tahap hibridisasi dalam flow
cell. Salah satu ujung adaptor akan menempel pada ujung-ujung fragmen DNA
yang telah mengalami adenilasi, sedangkan ujung adaptor yang lain akan
menempel pada dinding flow cell. Adapter Index yang digunakan terdiri atas tiga
jenis yang memiliki urutan nukleotida ACAGTG, GCCAAT, dan GTGAAA. Stop
Ligase Mix yang ditambahkan setelah inkubasi berfungsi menghentikan reaksi
ligasi (Illumina 2008).
Hasil pengujian konsentrasi dan kemurnian fragmen DNA menggunakan
spektrofotometer nanodrop setelah dilakukan tahap adenilasi dan ligasi adaptor
ditampilkan pada Tabel 4. Konsentrasi DNA semua genotipe pada tahap tersebut
mengalami penurunan dibandingkan dengan konsentrasi DNA pada tahap
sebelumnya (Tabel 3), yaitu berada pada rentang 15.3-223.1 ng/µL. Penurunan
konsentrasi tersebut dapat disebabkan oleh hilangnya fragmen DNA selama
proses pencucian menggunakan AMPure XP Beads. Perbandingan serapan pada
16
panjang gelombang 260/280 berada pada rentang 2.02-2.50, sedangkan
perbandingan serapan pada panjang gelombang 260/230 berada pada rentang
0.86-2.14. Data tersebut menunjukkan bahwa fragmen DNA hasil adenilasi dan
ligasi adaptor mengandung kontaminan RNA. Perubahan kemurnian sampel dapat
disebabkan oleh kontaminasi yang berasal dari reagen-reagen yang digunakan
(Illumina 2008).
Purifikasi dan Perbanyakan Fragmen DNA
Fragmen DNA hasil adenilasi dan ligasi adaptor dimurnikan dan
diamplifikasi untuk memperoleh fragmen-fragmen yang telah ditempeli oleh
adaptor dalam keadaan murni dan dalam jumlah yang cukup banyak. Pemurnian
fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarose 1%,
sedangkan amplifikasi dilakukan dalam mesin PCR. Amplifikasi menggunakan
mesin PCR terdiri atas tiga tahap utama, yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi.
Tahap denaturasi merupakan proses terjadinya pemisahan utas ganda DNA
menjadi utas tunggal. DNA utas tunggal tersebut kemudian ditempeli dengan
primer pada tahap annealing. Tahap elongasi atau pemanjangan primer adalah
proses sintesis nukleotida yang komplemen dengan sekuen nukleotida pada utas
cetakan. Hasil akhir dari ketiga tahap tersebut adalah amplikon fragmen DNA
yang terdiri atas satu utas DNA cetakan dan satu utas DNA hasil sintesis yang
keduanya saling komplemen. Ketiga tahap tersebut dilakukan selama beberapa
siklus sehingga menghasilkan fragmen DNA dalam jumlah yang bertambah secara
eksponensial (Krane & Raymer 2002).
Fragmen DNA hasil purifikasi dan amplifikasi diuji konsentrasi dan
kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop. Konsentrasi
sampel berada pada rentang 3.2-11.5 ng/µL, dengan perbandingan serapan pada
panjang gelombang 260/280 berada pada rentang 1.42-2.19, dan perbandingan
serapan pada panjang gelombang 260/230 berada pada rentang 0.72-2.10 (Tabel
5). Konsentrasi DNA semua genotipe pada tahap ini lebih rendah dibandingkan
dengan konsentrasi DNA pada tahap sebelumnya (Tabel 4). Hal tersebut dapat
disebabkan oleh terbuangnya sebagian fragmen DNA selama proses pencucian
dengan menggunakan AMPure XP Beads. Perbandingan serapan pada panjang
gelombang 260/230 menunjukkan bahwa fragmen DNA masih mengandung
kontaminan polisakarida (Henry 2001).
Validasi Pustaka DNA Genom
Pustaka DNA genom yang telah dikonstruksi harus divalidasi untuk
menentukan ukuran fragmen dan molaritas pustaka DNA genom yang diperoleh.
Klaster yang memiliki densitas tinggi harus dibuat terlebih dahulu agar diperoleh
data hasil sekuensing yang berkualitas baik. Oleh karena itu dilakukan tahap
kuantifikasi menggunakan qPCR untuk menentukan molaritas pustaka DNA
genom yang akan digunakan sebagai cetakan dalam tahap sekuensing.
Elektroforesis gel agarose 2% dilakukan untuk mengetahui ukuran fragmen
pustaka DNA genom yang telah dibuat (Illumina 2008).
Elektroforesis gel agarose dapat diganti dengan instrumen Agilent
Bioanalyzer untuk mengetahui ukuran dan konsentrasi fragmen DNA. Prinsip
bioanalyzer hampir sama dengan elektroforesis gel, namun dilakukan dalam suatu
DNA chip, sehingga volume sampel yang dibutuhkan lebih sedikit dan
17
memerlukan waktu yang lebih singkat dibandingkan dengan elektroforesis gel.
Ukuran fragmen yang dihasilkan dari tahap bioanalyzer juga lebih akurat
dibandingkan dengan hasil analisis elektroforegram menggunakan perangkat
bioinformatika biasa (Healey et al. 2014).
Data hasil validasi pustaka DNA genom ditunjukkan pada Tabel 6. Fragmen
DNA yang dihasilkan dari tahap elektroforesis gel agarose dan bioanalyzer berada
pada rentang 314-485 bp. Ukuran tersebut masih berada pada rentang yang
dibutuhkan untuk sekuensing pustaka DNA genom, yaitu kurang dari 800 bp.
Molaritas DNA hasil konstruksi pustaka genom berada pada rentang 2.04-23.86
nM/L. Hasil tersebut cukup bagus karena berada di atas molaritas minimal yang
dibutuhkan untuk tahap sekuensing yaitu 2 nM/L (Illumina 2008).
Klasterisasi Pustaka DNA Genom
Pustaka DNA genom yang telah dibuat memiliki kualitas dan kuantitas yang
cukup baik dan berada dalam rentang yang diinginkan, sehingga dapat digunakan
untuk tahap klasterisasi dan sekuensing. Tahap klasterisasi bertujuan membentuk
klaster atau kelompok salinan pustaka genom yang akan disekuen. Proses
klasterisasi tersebut dilakukan dalam sebuah flow cell dengan menggunakan
instrumen cBot Cluster Generation. Pembentukan klaster pada tahap klasterisasi
dapat memudahkan pembacaan atau deteksi pendaran oleh HiSeq2000. Terdapat
tiga tahap yang terjadi selama proses klasterisasi, yaitu imobilisasi dan
pemanjangan DNA, amplifikasi fragmen DNA dengan prinsip bridge
amplification, serta linearisasi dan hibridisasi fragmen DNA (Illumina 2010b).
Fragmen DNA utas tunggal yang telah diinjeksikan ke dalam flow cell akan
menempel di dinding flow cell. Penempelan tersebut terjadi karena fragmen DNA
sebelumnya telah berikatan dengan adaptor yang ditambahkan pada proses
konstruksi pustaka genom. Fragmen tersebut kemudian akan dibuat
komplemennya serta diamplifikasi melalui bridge amplification sehingga
terbentuk salinan fragmen pada akhir proses klasterisasi (Mardis 2008).
Teknik klasterisasi yang dilakukan pada pustaka DNA genom kakao adalah
multiplexing indexes, yaitu genotipe yang ditempeli oleh jenis adaptor yang
berbeda dimasukkan ke