Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana Baill
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
NIM G351040131
ABSTRACT
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of
Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high
aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant
genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant
must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in
maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim
to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial
digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30
minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA :
vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu) per ml was
obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T.
langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the
size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI.
This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding
to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert
DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens
was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family.
By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f =
insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T.
langsdorffiana genom found in genomic library is 17%.
Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage
RINGKASAN
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan
aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al
tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik
tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat
penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu
spesies.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan
yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan
rekombinan,
DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA
transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis
pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid,
transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.
Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g
DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan
hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio
molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu)
tiap ml. Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.
langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan.
Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor
plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang
tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu
pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus
diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran
genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua
spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini,
volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya
adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 10 3 pfu. Dengan
menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f =
rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh
genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini
berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam
pustaka genom adalah 17%.
Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan
tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NIM
: Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill
: Yasinta Ratna Esti Wulandari
: G351040131
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Anggota
Dr. Ir. Suharsono, DEA.
Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Tanggal Ujian: 27 Juli 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
“Allah turut bekerja dalam segala
sesuatu untuk mendatangkan
kebaikan bagi mereka yang
mengasihi Dia”
Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan
kepada...........
Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap
pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah
hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan
dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris
yang tidak lelah mendampingi dan memberiku
semangat.
Segala jerih payahku takkan pernah terwujud
tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan
syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan
anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai
Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi
Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler
Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA
selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran
selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris
Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan
yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005
dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in
the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma”
dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir.
Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir.
Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga
berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan
Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam
pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak
Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan
bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam
kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya
memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas
bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama,
Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah
memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh
keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekanrekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati,
Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken,
Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.
Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah
ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
NIM G351040131
ABSTRACT
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of
Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high
aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant
genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant
must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in
maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim
to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial
digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30
minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA :
vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu) per ml was
obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T.
langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the
size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI.
This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding
to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert
DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens
was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family.
By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f =
insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T.
langsdorffiana genom found in genomic library is 17%.
Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage
RINGKASAN
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan
aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al
tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik
tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat
penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu
spesies.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan
yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan
rekombinan,
DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA
transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis
pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid,
transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.
Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g
DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan
hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio
molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu)
tiap ml. Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.
langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan.
Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor
plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang
tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu
pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus
diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran
genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua
spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini,
volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya
adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 10 3 pfu. Dengan
menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f =
rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh
genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini
berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam
pustaka genom adalah 17%.
Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan
tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NIM
: Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill
: Yasinta Ratna Esti Wulandari
: G351040131
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Anggota
Dr. Ir. Suharsono, DEA.
Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Tanggal Ujian: 27 Juli 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
“Allah turut bekerja dalam segala
sesuatu untuk mendatangkan
kebaikan bagi mereka yang
mengasihi Dia”
Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan
kepada...........
Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap
pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah
hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan
dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris
yang tidak lelah mendampingi dan memberiku
semangat.
Segala jerih payahku takkan pernah terwujud
tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan
syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan
anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai
Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi
Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler
Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA
selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran
selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris
Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan
yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005
dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in
the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma”
dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir.
Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir.
Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga
berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan
Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam
pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak
Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan
bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam
kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya
memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas
bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama,
Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah
memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh
keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekanrekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati,
Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken,
Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.
Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah
ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jayapura pada tanggal 2 Januari 1981 dari ayah Drs.
F.X. Soewarto Citrotaruno, M.S. dan ibu M.G. Soewarti Pujirahayu, S.E., M.M.
Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2005, penulis
menikah dengan Hugo Herdamon Budianto, SP. dan saat ini telah dikaruniai dua
orang buah hati yaitu Alexander Dimas Raditya dan Brigita Michelle Radisti.
Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Stella Duce I Yogyakarta dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan seleksi masuk
IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah menjadi panitia Biologi
Interaktif dalam rangka Dies Natalis IPB ke-36, dan menjadi pengurus Organisasi
Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2001/2002 dan 2002/2003.
Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester
ganjil tahun ajaran 2002/2003 dan semester genap tahun ajaran 2002/2003, mata
kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada semester ganjil tahun ajaran
2002/2003, serta mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada semester genap tahun
ajaran 2002/2003. Pada bulan Juni hingga Juli 2002, penulis melaksanakan
praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian (BB-BIOGEN) Cimanggu, Bogor. Makalah penulis yang merupakan
bagian dari skripsi yang berjudul Growth and Development of Plant Studies in
Mango using Paclobutrazol and KNO3 Application menjadi Supporting Paper
pada Seminar Nasional X PERSADA di Jakarta pada bulan Juli 2003. Pada tahun
2004, penulis melanjutkan pendidikan strata-2 pada Program Studi Biologi, Sub
Program Studi Fisiologi, Genetika dan Biologi Molekuler Tanaman, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa pascasarjana,
penulis juga aktif mengikuti simposium-simposium dan seminar-seminar yang
berkaitan dengan bioteknologi.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR...............................................................................................xi
PENDAHULUAN
Latar Belakang................................................................................................. 1
Tujuan........................................................................................................... 2
KAJIAN PUSTAKA
Karakter Tibouchina......................................................................................
Pustaka Genom.............................................................................................
Bakteriofage Lambda.....................................................................................
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda ...................................................
Pengemasan DNA Lambda...........................................................................
3
6
7
9
11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian...................................................................... 123
Bahan Penelitian........................................................................................... 123
Metode Penelitian............................................................................................13
Isolasi DNA total tanaman..................................................................... 143
Pemotongan parsial DNA...................................................................... 154
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA.................................. 15
4
Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor............................................ 154
12
Pengemasan fage rekombinan............................................................. 16
Transveksi fage ke dalam E. coli…………......................................... 16
12
Eksisi plasmid dari fage ...................................................................... 16
Isolasi DNA plasmid rekombinan…...................................................... 17
12
Transformasi bakteri.............................................................................. 174
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI............................. 18
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen
DNA............................................................................................................ 19
Konstruksi Fage Rekombinan...................................................................... 20
Ukuran DNA Sisipan................................................................................... 23
Ukuran Pustaka Genom............................................................................... 25
SIMPULAN DAN SARAN..............................................................................
27
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................... 28
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana……..................................................... 5
2 Peta genetik bakteriofage ............................................................................. 8
3 Penyusunan virus bakteriofage λ.................................................................... 10
4 Vektor pengklonan fage
BlueSTAR-1......................................................... 12
BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan…………...........
12
6 Tahapan konstruksi pustaka genom..............................................................
13
5
7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan
Sau3AI........................................................................................................... 19
8 Seleksi biru-putih terhadap plak.................................................................... 21
9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC, lambda,
EMC dari vektor fage .................................................................................. 23
10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI...................................... 24
xi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tibouchina
langsdorffiana
Baill
termasuk
ke
dalam
famili
Melastomataceae. Tumbuhan ini berbunga ungu cerah dan merupakan tumbuhan
hutan hujan di Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan (Faravani & Bakar
2007).
T. langsdorffiana toleran terhadap pH rendah dan aluminium (Al) tinggi.
Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada pH 3. Tumbuhan ini juga toleran
terhadap Al hingga konsentrasi 0.8 mM baik pada pH 4 maupun pada pH 3. Pada
1.6 mM Al atau lebih dalam lingkungan pH 4, pertumbuhan panjang akar T.
langsdorffiana
terhambat
walaupun batang
dan tunas tidak
terhambat
pertumbuhannya (Muhaemin 2008). Tumbuhan ini memiliki toleransi terhadap
pH rendah dan Al tinggi sehingga tumbuhan ini dapat digunakan sebagai sumber
gen toleransi tumbuhan terhadap pH rendah dan Al tinggi. Selain sebagai sumber
gen, tumbuhan ini juga dapat digunakan sebagai model toleransi terhadap pH
rendah dan Al tinggi. Gen yang diduga bertanggungjawab terhadap toleransi
terhadap pH rendah dan Al tinggi dapat diuji di tumbuhan ini dengan metode gene
silencing.
Analisis akumulasi Al menunjukkan bahwa tumbuhan ini mampu
mengakumulasi 4.5 mg Al tiap gram bobot kering daun dan akar setelah mendapat
perlakuan 3.2 mM Al selama dua bulan (Mutiasari 2008). Kemampuannya dalam
mengakumulasi Al memungkinkan tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
fitoremediasi terutama pada lahan yang mempunyai kandungan Al tinggi.
Untuk
memanfaatkan
gen-gen
yang
mengendalikan
toleransi
T.
langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al tinggi dan kemampuannya dalam
mengakumulasi Al, maka bahan genetik tumbuhan ini harus disimpan di dalam
pustaka genom. Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA
genom total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung
seluruh sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Pustaka genom
sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh
suatu spesies. Selain sebagai penyimpan bahan genetik, pustaka genom juga
2
sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang mengandung promoter,
terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi gen. Peta fisik suatu
genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka genom merupakan
bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman, baik melalui
teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan konvensional (Suharsono
2002).
Pustaka genom manusia dan beberapa hewan mamalia, ikan, dan
tumbuhan sudah dikonstruksi. Beberapa pustaka genom telah dikonstruksi, seperti
pustaka genom kedelai kultivar Slamet yang toleran Al (Suharsono 2002) dan
kultivar Lumut yang peka terhadap Al (Suharsono 2007) dalam rangka
menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh kedelai lokal Indonesia.
Dari pustaka genom kedelai kultivar Lumut, penapisan dengan pelacak gen
penyandi peroksidase dari Arabidopsis telah dilakukan untuk mendapatkan gen
utuh penyandi peroksidase dari kedelai (Suharsono et al. 2003). Miftahudin et al.
(1998) telah mengkonstruksi pustaka cDNA dari kedelai (MLG3474) melalui
mRNA yang diisolasi dari tanaman yang mendapat cekaman kekeringan. Elvawati
(1999) telah mengkonstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai yang diinduksi
cekaman Al. Kurnia (2005) juga telah berhasil mengisolasi gen penyandi
glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Dari
pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang mengandung
gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh Rachman (2005).
Kurniawan (2005), telah berhasil mengisolasi fragmen DNA yang mengandung
gen penyandi glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar
Lumut. Dari pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang
mengandung gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh
Rahmawati (2005).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana.
KAJIAN PUSTAKA
Karakter Tibouchina
Genus Tibouchina (sinonim dengan Chaetogastra, Hephestionia, Itatiaia,
Lasiandra, Micranthella, Oreocosmus, Pleroma, Purpurella) terdiri dari 300
spesies (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina biasa dikenal dengan nama
“princess flower”, “glory bushes” atau kadang-kadang “glory trees” (Judd et al.
2005; Faravani & Bakar 2007). Tanaman ini merupakan tanaman asli di hutan
hujan Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan, terutama Brazil. Namanya
berasal dari adaptasi tempat asalnya yaitu “Guiana” (Faravani & Bakar 2007).
Tibouchina merupakan anggota famili Melastomaceae (di dalam literatur
biasa ditulis Melastomataceae), merupakan tanaman dikotil berbunga, berbiji
tertutup (angiospermae). Famili melastomataceae terdiri dari 3000 spesies di
neotropika, 1000 di Asia tropis, 240 di Afrika, 225 di Madagaskar (150-166
genus), dan 70 di Thailand (15 genus) (Renner et al. 2001). Melastomataceae
kemudian menyebar di India, Australia, Sri Lanka, Asia Tenggara termasuk
Filipina dan Taiwan, sampai Papua New Guinea, Pulau Pasifik, Mauritius,
Jamaica, dan Amerika Serikat (Renner 1993).
T. langsdorffiana digunakan sebagai tanaman hias karena nilai estetikanya
yaitu warna bunga ungu cerah yang sangat menarik. Sebagian besar
Melastomataceae dan Memecylaceae memiliki warna bunga ungu, bervariasi dari
merah muda sampai magenta. Sebagai contoh, warna bunga ungu umumnya
ditemui pada Dichaetanthera, Meriania, Mouriri, Rhynchanthera dan Tibouchina,
dimana kebanyakan merupakan akumulator Al (Jansen et al. 2002).
Tanaman ini tumbuh dengan baik pada tanah yang bersifat asam. Jika
tanah tidak cukup asam, ujung daun akan seperti terbakar, kemudian menjadi
coklat atau bahkan daun akan mati. Jika hal itu terjadi, keasaman tanah dibuat
dengan menambahkan sulfur ke tanah di sekitar akar, atau menggunakan pupuk
yang bersifat asam. Tanaman ini tidak perlu dipangkas, karena dapat tumbuh
menjadi pohon besar (http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm).
Tibouchina yang berupa semak cantik yang banyak tumbuh di daerah
tropis Amerika latin mirip sekali dengan Dissotis canescens yang masih sekerabat
4
yaitu memiliki ciri-ciri semak berkayu lembut, mencapai tinggi 1.5 m dengan
lebar tajuk 1 m, bunganya yang besar dan berwarna magenta muncul di bulan
Desember sampai April, bunganya unik karena memiliki dua set benang sari yang
berbeda satu dengan yang lain, lima di antaranya panjang berwarna ungu dengan
ujung melengkung sementara lima lainnya lebih pendek dan berwarna kuning
(http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm).
Perbanyakan T. langsdorffiana ini melalui stek secara vegetatif karena
tanaman ini tidak menghasilkan biji. Berbunga melimpah antara bulan Mei
sampai Januari. Spesies T. langsdorffiana biasanya memiliki daun yang berbulu
halus dengan tulang daun yang menonjol dan memperlihatkan warna bunga ungu
menarik sehingga ditanam sebagai hiasan. Nama lokal tanaman ini di kalangan
penjual tanaman hias, dikenal dengan nama violet, tibocina/tebocina (Sunda).
Kedudukan T. langsdorffiana dalam taksonomi adalah sebagai berikut:
Domain
: Eukariota
Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Viridaeplantae
Filum
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Subkelas
: Rosidae
Ordo
: Myrtales
Famili
: Melastomataceae
Genus
: Tibouchina
Spesies
: Tibouchina langsdorffiana Baill
T. langsdorffiana merupakan tanaman perennial, termasuk herba, semak,
atau pohon, tegak, dengan tinggi 0.5 m sampai 25 m (Gambar 1a), daun tunggal
(Gambar 1b), bertangkai, duduk daun berhadapan, pertulangan daun menyirip,
ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, bentuk lanset, permukaan bersisik.
Bunga T. langsdorffiana merupakan bunga terbatas tipe malai rata (corymbiform
cyme) dengan jumlah bunga 5-25 kuntum bunga (Gambar 1c), kelopak (sepal)
berjumlah 5 saling bebas, mahkota (petal) berjumlah 5 saling bebas (Gambar 1d),
simetri bunga beraturan (actinomorph), benang sari berjumlah 10 saling bebas
5
(polyandrous) dengan panjang sama, tipe perlekatan tangkai sari dengan kepala
sari yaitu versatile, tipe putik syncarp karena memiliki 5 buah karpel yang
dipisahkan oleh sekat (septum), tipe kepala putik clavate, sedangkan tipe tangkai
putik geneculate (Gambar 1e). Tipe plasentasi bakal buah axial (Gambar 1f), dan
merupakan bakal buah tenggelam (inferior), tetapi dalam perkembangannya,
bakal buah beserta biji di dalamnya akan gugur sehingga tanaman ini tidak
menghasilkan buah dan biji.
a
20 cm
b
d
2 cm
e
2 cm c
1 mm
f
2 cm
1 mm
Gambar 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana: a. tanaman berupa semak
berkayu; b. daun tunggal; c. tipe malai cabang bunga; d. tipe kelopak
dan mahkota bunga; e. tipe benang sari dan putik bunga; f. plasentasi
bakal buah.
6
Pustaka Genom
Suatu pustaka gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuen (urutan)
DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah di klon ke dalam vektor
tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan dan analisisnya. Pada
dasarnya terdapat dua macam pustaka gen yang dapat dikonstruksi, tergantung
sumber DNA yang digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA
genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut pustaka genom.
Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu
populasi
mRNA,
maka
pustaka
yang
diperoleh
dinamakan
pustaka
complementary DNA (cDNA).
Hasil pengklonan seluruh DNA total dari spesies tertentu disebut dengan
pustaka genom. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan
karakterisasi suatu gen (Cross et al. 1999; Suharsono et al. 2003), dan juga untuk
pemetaan gen secara fisik.
Pustaka genom dapat dibuat melalui sintesis cDNA dari mRNA atau DNA
genom. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa
bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome
(YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), atau kosmid, bergantung pada
ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Pada penelitian ini dipakai vektor
pengklonan yaitu fage lambda (
BlueSTAR-1 (Novagen 1997). Fage
BlueSTAR-1 adalah vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA
dengan efisiensi kloning fragmen DNA berukuran 7-20 kb. Vektor mengandung
gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan untuk
autosubkloning (Novagen 1997).
Konstruksi pustaka genom diawali dengan isolasi DNA total. DNA total
biasanya dipotong secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3AI atau enzim
lain disesuaikan dengan situs yang terdapat pada vektor yang akan digunakan
dalam konstruksi pustaka agar mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar.
Pemotongan parsial ini menghasilkan fragmen berukuran besar karena tidak
semua situs pengenalan suatu enzim restriksi dalam rantai DNA genom terpotong
oleh enzim restriksi yang bersangkutan. Fragmen DNA berukuran besar ini
kemudian disisipkan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi
7
tertentu sehingga hasil potongannya cocok dengan fragmen DNA. Untuk
menghindari adanya penyatuan kembali (religasi) ujung-ujung potongan biasanya
dimodifikasi dengan penambahan nukleotida tertentu (fill-in).
Dalam mengkonstruksi pustaka genom DNA, DNA umumnya dipotong
dengan enzim restriksi yang mengenali situs yang terdiri dari 4 pasang basa (pb)
(contohnya Sau3AI). Pengenalan dan pemotongan sekuen 4 pb yang spesifik ini
akan terjadi rata-rata sekali setiap 44 = 256 pb. Untuk meningkatkan kemungkinan
semua daerah genom berhasil diklonkan dan terkandung dalam pustaka genom,
DNA genom biasanya dipotong secara parsial untuk menghasilkan fragmen
restriksi yang saling tumpang tindih (overlapping) yang berukuran besar, sekitar
20 kb. Vektor fage
dapat menampung sekitar 20 kb.
Bakteriofage Lambda
Bakteriofage (atau fage) adalah virus yang menginfeksi bakteri. Satuan
dasar virus disebut virion. Virion fage
memiliki kepala, yang mengandung
genom DNA virus, dan sebuah ekor, yang berfungsi menginfeksi sel inang
Escherichia coli (E. coli). Virus hanya dapat memperbanyak diri jika berada di
dalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada di luar suatu sistem selular, virus
tidak mampu memperbanyak diri karena tidak mempunyai sistem enzim yang
dapat digunakan untuk mensintesis partikel virus baru. Diameter virus bervariasi
dari 20-300 nm sehingga ukurannya lebih kecil dari sel prokariot yang paling
kecil (Yuwono 2008). Bahan genetik virus ada yang berupa molekul DNA dan
ada yang berupa RNA. Molekul DNA dan RNA tersebut ada yang berupa
molekul untai tunggal dan ada yang berupa molekul untai ganda. Ekspresi genetik
virus dilakukan dengan menggunakan sistem enzim yang ada di dalam sel inang.
Salah satu jenis bakteriofage yang biasa digunakan sebagai vektor
pengklonan adalah bakteriofage . Bakteriofage
merupakan virus bakterial yang
telah banyak diteliti, dan telah diketahui secara luas mengenai genetika dan
biologi molekulernya. Urutan lengkap basa nukleotida bakteriofage
diketahui. Genom bakteriofage
ini sudah
berupa DNA untai ganda linier yang terdiri atas
48502 pb (Chauthaiwale et al. 1992). Molekul DNA bakteriofage ini mempunyai
8
struktur yang unik karena pada kedua ujungnya terdapat 12 basa tambahan berupa
molekul DNA untai tunggal. Kedua ujung molekul DNA tersebut dapat
membentuk ikatan komplementer jika terjadi pelingkaran DNA, sehingga ujungujung DNA tersebut disebut sebagai ujung kohesif (cohesive ends, disingkat COS)
(Chauthaiwale et al. 1992).
Fage
mempunyai gen-gen penyandi protein yang diperlukan dalam
penyusunan kepala dan ekor dan gen-gen yang menyandikan protein yang
diperlukan dalam siklus litik yang terdapat di bagian kedua ujung genomnya
(Gambar 2). Beberapa daerah di bagian tengah dari genom dapat digantikan oleh
DNA eksogen atau dihilangkan tanpa mempengaruhi kemampuan fage λ dalam
menginfeksi sel inang dan menyusun virus baru. DNA eksogen yang menyisip
diantara gen J dan N bisa berukuran lebih dari 25 kb. Terdapat sekitar 60 gen
yang ada di dalam genom λ (Lodish et al. 2000).
Gambar 2 Peta genetik bakteriofage
Bakteriofage
(Lodish et al. 2000).
menginfeksi E. coli dengan cara menempel pada suatu
reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel E. coli, kemudian
menginjeksikan DNAnya (Dale 1994). DNA linier utas ganda diubah menjadi
bentuk sirkuler segera setelah terjadi infeksi. Setelah memasuki sel bakteri, ujung
kohesif mengalami perpasangan basa membentuk molekul DNA sirkuler, dimana
masih terdapat 2 buah nick pada tempat perpasangan basa tersebut. Kedua nick ini
ditutup oleh DNA ligase inang sehingga dihasilkan molekul DNA sirkuler
seutuhnya. DNA sirkuler ini berfungsi sebagai cetakan dalam proses transkripsi
selama fase infeksi awal (Sambrook et al. 1989).
Ketika DNA
selanjutnya DNA fage
memasuki sitoplasma sel inang setelah menginfeksi,
akan mengalami pertumbuhan siklus litik atau lisogenik.
Siklus litik menyebabkan lisisnya sel inang dan menghasilkan partikel fage baru,
sedangkan siklus lisogenik terjadi karena genom bakteriofage terintegrasi dengan
9
genom sel inang sebagai profage. Dalam kondisi cekaman nutrisi dan lingkungan,
DNA
yang terintegrasi dapat dikeluarkan dari kromosom inang dan selanjutnya
memasuki siklus litik (Glick & Pasternak 1994). Ketika bakteriofage
digunakan
sebagai vektor pengklonan, dia mampu mengalami pertumbuhan litik, tetapi
fungsi virus lainnya menjadi tidak relevan. Sebagai akibatnya, gen-gen yang
terlibat dalam jalur lisogenik dan gen-gen virus lainnya yang tidak penting bagi
jalur litik akan dihilangkan dari DNA virus dan digantikan dengan DNA yang
akan diklonkan. Bakteriofage
ini memiliki efisiensi pengemasan sebesar 78-
108% dari ukuran DNA lambda tipe liar (Chauthaiwale et al. 1992). DNA asing
yang berukuran di atas 25 kb dapat disisipkan ke dalam genom , menghasilkan
DNA rekombinan yang dapat dikemas secara in vitro untuk membentuk virusvirus yang mampu bereplikasi dan membentuk plak di dalam sel inang E. coli
(Lodish et al. 2000).
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda
Bakteriofage merupakan salah satu vektor untuk konstruksi pustaka
genom. Replikasi DNA
di dalam sel inang menghasilkan molekul DNA
multimerik, yang disebut concatomers, yang terdiri dari kopi-kopi ganda genom
virus yang bersambungan dari ujung hingga ujung yang dibatasi oleh sekuen
nukleotida spesifik yang disebut situs COS. Dua protein , yaitu Nu 1 dan A,
terikat dengan situs COS dan menyisip secara langsung ke DNA di antara dua
situs COS yang berdekatan kemudian masuk ke dalam kepala yang akan disusun
(Lodish et al. 2000).
Setiap kepala fage mengemas genom
tunggal sebesar 50 kb dari
concatomers multimerik. DNA kromosom sel inang tidak menyisip ke dalam
kepala
karena tidak mengandung kopi dari sekuen COS. Kepala dan ekor yang
kosong disusun dari kopi-kopi ganda dari beberapa protein λ yang berbeda.
Selama fase akhir,
membentuk molekul DNA yang panjang yang disebut
concatomers. Molekul multimerik ini terdiri dari kopi-kopi genom
yang
bersambungan dari ujung ke ujung dan dipisahkan oleh situs COS yang
merupakan sebuah sekuen nukleotida yang dapat mengikat protein. Setiap kopi
10
dari genom λ mengandung COS. Protein λ Nu1 dan A yang menempel pada situs
COS memicu penyisipan DNA diantara dua situs COS yang berdekatan ke dalam
kepala yang kosong. Setelah kepala-kepala terisi DNA, ekor yang siap disusun
akan menempel, menghasilkan virus λ lengkap yang mampu menginfeksi sel-sel
E. coli (Gambar 3).
Gambar 3 Penyusunan virus bakteriofage λ (Lodish et al. 2000).
Berbagai vektor pengklonan turunan dari fage
telah dikonstruksi untuk
berbagai tujuan berdasarkan ukuran fragmen DNA sisipan dan situs penyisipan
(Singer & Berg 1991).
Fage
BlueSTAR-1 merupakan vektor yang didesain untuk membuat
pustaka genom DNA dengan ukuran sisipan sebesar 7-20 kb. Vektor
ini
mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan
untuk autosubkloning (Novagen 1997). Seleksi biru-putih diperoleh karena
adanya gen lacZ E. coli lengkap dan daerah kontrol yang terdapat dalam lengan
11
fragmen yang berukuran 13 kb. Lengan vektor akan bereligasi dengan lengan
DNA genom, menghasilkan fage yang dapat menghasilkan β-galaktosidase aktif
di dalam sel-sel yang terinfeksi. Virus
rekombinan yang diinfeksikan ke bakteri
ini, yang kemudian ditumbuhkan di cawan petri akan menghasilkan plak-plak
rekombinan dalam jumlah besar. Setiap plak yang muncul dari virus rekombinan
tunggal akan menghasilkan turunan fage
yang jika ditumbuhkan akan identik
secara genetik dimana klon yang dibentuk telah membawa insert DNA genomik
khusus. Plak yang berbeda berhubungan dengan klon fage yang dibentuk, setiap
plak membawa DNA insert yang berbeda, dan secara kolektif mereka menyusun
pustaka genom .
Pengemasan DNA Lambda
Untuk menyiapkan virus
yang infektif yang membawa DNA
rekombinan, perakitan fage dilakukan secara in vitro dengan melakukan
pengemasan molekul DNA fage . Salah satu metode untuk memproduksi protein
pengemas fage adalah dengan menumbuhkan dua macam fage mutan secara
terpisah. Kedua macam mutan ini hasil dari mutasi pada gen yang berbeda. Mutan
yang satu tidak dapat mensintesis protein kepala A, dan mutan yang lain tidak
mampu mensintesis protein kepala Nu 1. Dengan mencampur kedua ekstrak ini,
fragmen DNA akan dikemas dalam kepala dan ekor fage akan ditempelkan pada
kepala yang sudah mengandung DNA.
Pengemasan dengan ekstrak protein ini menghasilkan virus-virus
rekombinan dalam jumlah besar yang sangat infektif dan secara efisien dapat
menginfeksi sel-sel E. coli. Setiap partikel virus berikatan dengan reseptor pada
permukaan sel inang dan menginjeksikan DNA rekombinan yang telah dikemas
ke dalam sel (Lodish et al. 2000).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2006 sampai dengan Desember
2008 di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Bahan Penelitian
Daun muda T. langsdorffiana digunakan sebagai bahan tanaman. Fage
BlueSTAR-1 (Novagen) digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 4).
Gambar 4 Vektor pengklonan fage
BlueSTAR-1.
Fage ini telah dipotong dengan XhoI dan telah mengalami penyisipan (fill-in)
dengan nukleotida dCTP dan dTTP sehingga menghasilkan potongan vektor
BlueSTAR-1
Pengisi
loxP
Sfi I
Sal I
Ori
Ap
Sac I
Avr II
Xba I
Hind III
Sal I
Xho I
EcoR I
Sma I
BamH I
Sac II
Eag I
Not I
Not I
Eag I
Sac II
BamH I
Sma I
EcoR I
Xho I
Sal I
Hind III
Xba I
Avr I
Sac I
Sal I
Sfi I
loxP
dengan ujung menggantung (overhang) TC pada situs penyisipan (Gambar 5).
lac
Pemotongan dengan Xho I
Penambahan dCTP dan dTTP
Kedua lengan dan pengisi tidak cocok
Gambar 5
BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan.
13
E. coli galur ER1647 digunakan sebagai inang untuk mengamplifikasi fage
rekombinan. E. coli galur BM25.8 digunakan sebagai inang untuk memproses
eksisi dari fage
rekombinan menjadi plasmid rekombinan. E. coli galur DH5
digunakan sebagai inang untuk mendukung replikasi plasmid.
Metode Penelitian
Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu:
isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan DNA
T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA
fage
rekombinan, transveksi
rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis pustaka genom
meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid, transformasi
genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Tahapan
penelitian ini disajikan pada Gambar 6.
Isolasi DNA total
T. langsdorffiana
Pemotongan
parsial DNA
Fragmen DNA
T. langsdorffiana
Vektor fage
terpotong
Penyisipan DNA T. langsdorffiana ke
dalam fage
DNA fage
rekombinan
Pengemasan fage
Analisis pustaka genom:
Transformasi bakteri
Isolasi DNA plasmid
rekombinan
rekombinan
Transveksi fage rekombinan ke
E. coli
Gambar 6 Tahapan konstruksi pustaka genom.
14
Isolasi DNA total tanaman
Isolasi DNA total tanaman dilakukan dengan mengikuti prosedur Chang et
al. (1993) yang dimodifikasi yaitu dengan penggantian LiCl dengan
isopropranol/etanol absolut. Sampel diambil dari daun segar yang masih muda.
Daun muda tersebut dibuang bagian tulang daunnya, dipotong-potong, dan
ditimbang sebanyak 2 g. Selanjutnya potongan daun tersebut ditambah nitrogen
cair secukupnya, dan digerus dengan mortar hingga halus. Bubuk ini kemudian
dilarutkan dalam 6 ml 2x larutan penyangga cetyltrimethyl-ammonium bromide
(CTAB) (2% CTAB, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2%
PVP) lalu ditambahkan 0.2% merkaptoetanol. Larutan dibolak-balik sampai rata,
kemudian diinkubasikan dalam pemanas bergoyang pada suhu 65oC selama 60
menit.
Ke
dalam
larutan
tersebut
ditambahkan
6
ml
larutan
kloroform:isoamilalkohol (CI) (24:1), dibolak-balik selama 1.5 menit, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm dengan swing-out rotor (Jouan, BR4i)
pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah terpisah, cairan di bagian atas
dipindahkan ke tabung baru dan ditambah isopropanol sebanyak 0.7x volume
awal, kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam.
Campuran disentrifugasi pada 4000 rpm, 4 C, selama 20 menit. Setelah
sentrifugasi, endapan kemudian dibilas dengan alkohol 70% lalu disentrifugasi
kembali pada kecepatan 3000 rpm, 4 C, 10 menit. Endapan yang diperoleh lalu
dikeringkan dengan vakum dan disuspensikan dalam TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA, pH 8.0). Suspensi DNA kemudian ditambah RNAse dengan konsentrasi
akhir 100
g/ml dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama minimal dua jam
untuk menghilangkan RNA. Suspensi DNA dicampur secara merata dengan 1x
volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (PCI) (25:24:1), dan disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm dengan fix-angle rotor (Jouan, BR4i) pada suhu ruang
selama 10 menit. Cairan bagian atas diendapkan dengan menambahkan 0.1x
volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut dingin, dibolak-balik
pelan lalu diinkubasi
pada suhu -20 C selama 2 jam. Setelah inkubasi lalu
disentrifugasi kembali pada kecepatan 14000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit.
Endapan DNA dibilas dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kembali pada
15
kecepatan 14000 rpm, 4 C, 30 menit. Endapan DNA tersebut dikeringkan,
kemudian disuspensikan di dalam TE pH 8.
Pemotongan parsial DNA
DNA total tanaman dipotong dengan enzim Sau3AI (Takara) pada suhu
37ºC selama 30 menit dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0.01, 0.015, 0.02 dan
0.04 unit tiap µg DNA.
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA
Setelah dipotong secara parsial kedua ujung fragmen DNA disisipi
terlebih dahulu dengan dua nukleotida untuk mencegah terjadinya penyambungan
kembali di antara fragmen-fragmen tersebut sesuai dengan prosedur Novagen
(1997). Sebanyak 20 g fragmen DNA dicampur dengan larutan penyangga yang
mengand
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
NIM G351040131
ABSTRACT
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of
Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high
aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant
genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant
must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in
maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim
to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial
digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30
minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA :
vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu) per ml was
obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T.
langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the
size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI.
This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding
to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert
DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens
was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family.
By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f =
insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T.
langsdorffiana genom found in genomic library is 17%.
Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage
RINGKASAN
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan
aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al
tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik
tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat
penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu
spesies.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan
yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan
rekombinan,
DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA
transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis
pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid,
transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.
Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g
DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan
hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio
molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu)
tiap ml. Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.
langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan.
Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor
plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang
tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu
pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus
diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran
genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua
spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini,
volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya
adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 10 3 pfu. Dengan
menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f =
rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh
genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini
berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam
pustaka genom adalah 17%.
Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan
tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NIM
: Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill
: Yasinta Ratna Esti Wulandari
: G351040131
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Anggota
Dr. Ir. Suharsono, DEA.
Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Tanggal Ujian: 27 Juli 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
“Allah turut bekerja dalam segala
sesuatu untuk mendatangkan
kebaikan bagi mereka yang
mengasihi Dia”
Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan
kepada...........
Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap
pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah
hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan
dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris
yang tidak lelah mendampingi dan memberiku
semangat.
Segala jerih payahku takkan pernah terwujud
tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan
syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan
anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai
Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi
Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler
Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA
selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran
selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris
Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan
yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005
dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in
the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma”
dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir.
Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir.
Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga
berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan
Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam
pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak
Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan
bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam
kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya
memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas
bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama,
Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah
memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh
keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekanrekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati,
Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken,
Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.
Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah
ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
NIM G351040131
ABSTRACT
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Construction of Genomic Libraries of
Tibouchina langsdorffiana Baill. Under direction of SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Tibouchina langsdorffiana Baill is tolerant plant to low pH and high
aluminum (Al). Due its tolerance, this plant may be used as source of Al tolerant
genes and model for tolerant plant to Al. Therefore genetic material of this plant
must be kept in genomic library. Genomic library plays a crucial role in
maintaining all genetic information belonging to an organism. This research aim
to construct the genomic library of Tibouchina langsdorffiana using BlueSTAR1 phage as a vector. The big fragments of plant DNA were obtained by partial
digestion of total DNA using 0.01 unit Sau3AI per g DNA at 37ºC for 30
minutes. By using 0.5 g insert DNA and the molarity ratio between insert DNA :
vector = 2.9 : 1, the titer of 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu) per ml was
obtained. Analysis of the recombinant rate by blue-white screening showed that T.
langsdorffiana genomic library contains 8% phage recombinant. To determine the
size of insert DNA, pBlueSTAR-1 recombinant plasmid was digested by EcoRI.
This digestion resulted two DNA fragment, one is 2.1 kb fragment corresponding
to pBlueSTAR-1 plasmid, and the other is 10 kb fragment corresponding to insert
DNA. Since the genom size of T. langsdorffiana is unknown, Dissotis canescens
was used as reference, because both species belong to Melastomataceae family.
By using formula N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = number of phage recombinant, f =
insert DNA length ratio against genom length, so the probability (P) of all T.
langsdorffiana genom found in genomic library is 17%.
Keywords: Tibouchina langsdorffiana, DNA, libraries, genomic, phage
RINGKASAN
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI. Konstruksi Pustaka Genom
Tibouchina langsdorffiana Baill. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
T. langsdorffiana adalah tumbuhan yang toleran terhadap pH rendah dan
aluminium (Al) tinggi. Oleh sebab itu tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
sumber gen dan tumbuhan model toleransi terhadap pH rendah dan Al tinggi.
Untuk memanfaatkan toleransi T. langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al
tinggi dan kemampuannya dalam mengakumulasi Al, maka bahan genetik
tumbuhan ini harus disimpan di dalam pustaka genom. Pustaka genom sangat
penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh suatu
spesies.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana. Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan
yaitu: isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan
rekombinan,
DNA T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA
transveksi fage rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis
pustaka genom meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid,
transformasi genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.
Ukuran 7-20 kb DNA T. langsdorffiana didapat dari pemotongan 1 g
DNA dengan 0.01 unit Sau3AI (Takara) pada 37ºC selama 30 menit. Pengemasan
hasil ligasi 0.5 g DNA T. langsdorffiana dengan BlueSTAR-1 dengan rasio
molaritas 2.9 : 1 menghasilkan titer sebesar 1.7 x 105 plaque forming unit (pfu)
tiap ml. Hasil seleksi biru-putih menunjukkan bahwa pustaka genom T.
langsdorffiana yang dikonstruksi mengandung rata-rata 8% fage rekombinan.
Untuk mengetahui ukuran sisipan, plasmid pBlueSTAR-1 rekombinan dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI yang menghasilkan dua fragmen DNA yaitu vektor
plasmid pBlueSTAR-1 yang berukuran 2.1 kb dan DNA T. langsdorffiana yang
tersisip yang berukuran 10 kb. Untuk mengetahui derajat kelengkapan suatu
pustaka genom, maka informasi ukuran genom dari suatu organisme harus
diketahui. Karena ukuran genom T. langsdorffiana belum diketahui, maka ukuran
genom Dissotis canescens digunakan sebagai dasar perhitungan karena kedua
spesies tersebut termasuk dalam famili Melastomataceae. Pada penelitian ini,
volume fage yang disintesis adalah 500 µl, sedangkan titer fage rekombinannya
adalah 8% sehingga jumlah total fage rekombinan adalah 6.8 x 10 3 pfu. Dengan
menggunakan rumus N = (ln (1-P))/( ln (1-f)), N = jumlah fage rekombinan, f =
rasio ukuran DNA sisipan terhadap ukuran genom, maka peluang (P) seluruh
genom T. langsdorffiana terdapat dalam pustaka genom adalah 17%. Hal ini
berarti bahwa peluang untuk mendapatkan sembarang potongan DNA di dalam
pustaka genom adalah 17%.
Kata kunci: Tibouchina langsdorffiana, DNA, pustaka, genom, fage
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan
tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KONSTRUKSI PUSTAKA GENOM
Tibouchina langsdorffiana Baill
YASINTA RATNA ESTI WULANDARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NIM
: Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill
: Yasinta Ratna Esti Wulandari
: G351040131
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si.
Anggota
Dr. Ir. Suharsono, DEA.
Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Tanggal Ujian: 27 Juli 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
“Allah turut bekerja dalam segala
sesuatu untuk mendatangkan
kebaikan bagi mereka yang
mengasihi Dia”
Roma 8:28
Setitik usaha dan upaya kupersembahkan
kepada...........
Suamiku Herdamon Budianto dengan segenap
pengorbanan waktu dan kesabarannya, Buah
hatiku Dimas dan Michelle dengan segala keluguan
dan kepolosannya, Papa dan Mama serta Dek’ Aris
yang tidak lelah mendampingi dan memberiku
semangat.
Segala jerih payahku takkan pernah terwujud
tanpa andil karya Maha Agung Allah Bapa. Puji dan
syukur ke Hadirat-Mu..........Amin.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada „Bapa‟ oleh karena kasih dan
anugerah-Nya maka penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2006 sampai
Desember 2008 adalah Konstruksi Pustaka Genom Tibouchina langsdorffiana
Baill. Penelitian ini bertempat di Laboratorium Pusat Kerjasama Bioteknologi
Indonesia-Belanda (BIORIN) dan Laboratorium Genetika Molekuler dan Seluler
Tanaman, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA
selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran
selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta Dr. Ir. Aris
Tjahjoleksono, DEA selaku penguji yang telah banyak memberikan masukan
yang berguna dalam penyelesaian penulisan karya ilmiah ini.
Terima kasih atas dana penelitian Proyek DIPA BIOTROP Tahun 2005
dengan judul “Construction of genomic Library and Isolation of Gene Involved in
the Plant Tolerant to Low pH and High Solubility of Aluminium from Melastoma”
dengan contract agreement No. 13.1/PSRP/SP-PEN/IV/2005 atas nama Dr. Ir.
Suharsono, DEA. Terima kasih pula kepada rekan satu tim penulis yaitu Bapak Ir.
Hadisunarso yang telah bersama-sama melakukan penelitian dari awal hingga
berakhirnya penelitian ini. Terima kasih kepada Laboratorium BIORIN dan
Laboratorium PPSHB IPB yang telah menyediakan tempat dan fasilitas dalam
pelaksanaan penelitian. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Bapak
Abdul Mulya dan Mbak Pepi Elvavina, serta Bapak Adi atas kerjasama dan
bantuannya di laboratorium dan di rumah kaca.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam
kepada suami tercinta Herdamon Budianto atas pengertian dan kesabarannya
memperhatikan anak-anak saat penulis berada di laboratorium dan atas
bantuannya dalam membantu mengedit tulisan karya ilmiah ini, Papa & Mama,
Enpa & Enma atas dukungan semangat dan doanya, dek Aris yang telah
memudahkan transportasi penulis pada masa-masa penulisan, serta seluruh
keluarga dan kerabat atas doa, semangat dan kasih sayangnya, juga buat rekanrekan yang berjuang bersama di Laboratorium BIORIN yaitu Ibu Sri Listyowati,
Bu Ratna Yuniati, Pak Ulung, Pak Muzuni, Mbak Hanum, Bu Yohana, Niken,
Pak Azis, Pak Neo, Rizky, Mbak Emma, Goto, dan Lulu.
Semoga Allah Bapa membalas kebaikan mereka dan semoga karya ilmiah
ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Yasinta Ratna Esti Wulandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jayapura pada tanggal 2 Januari 1981 dari ayah Drs.
F.X. Soewarto Citrotaruno, M.S. dan ibu M.G. Soewarti Pujirahayu, S.E., M.M.
Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Pada tahun 2005, penulis
menikah dengan Hugo Herdamon Budianto, SP. dan saat ini telah dikaruniai dua
orang buah hati yaitu Alexander Dimas Raditya dan Brigita Michelle Radisti.
Tahun 1999 penulis lulus dari SMU Stella Duce I Yogyakarta dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan seleksi masuk
IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Biologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis pernah menjadi panitia Biologi
Interaktif dalam rangka Dies Natalis IPB ke-36, dan menjadi pengurus Organisasi
Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2001/2002 dan 2002/2003.
Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester
ganjil tahun ajaran 2002/2003 dan semester genap tahun ajaran 2002/2003, mata
kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada semester ganjil tahun ajaran
2002/2003, serta mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada semester genap tahun
ajaran 2002/2003. Pada bulan Juni hingga Juli 2002, penulis melaksanakan
praktik lapangan di Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik
Pertanian (BB-BIOGEN) Cimanggu, Bogor. Makalah penulis yang merupakan
bagian dari skripsi yang berjudul Growth and Development of Plant Studies in
Mango using Paclobutrazol and KNO3 Application menjadi Supporting Paper
pada Seminar Nasional X PERSADA di Jakarta pada bulan Juli 2003. Pada tahun
2004, penulis melanjutkan pendidikan strata-2 pada Program Studi Biologi, Sub
Program Studi Fisiologi, Genetika dan Biologi Molekuler Tanaman, Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa pascasarjana,
penulis juga aktif mengikuti simposium-simposium dan seminar-seminar yang
berkaitan dengan bioteknologi.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR...............................................................................................xi
PENDAHULUAN
Latar Belakang................................................................................................. 1
Tujuan........................................................................................................... 2
KAJIAN PUSTAKA
Karakter Tibouchina......................................................................................
Pustaka Genom.............................................................................................
Bakteriofage Lambda.....................................................................................
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda ...................................................
Pengemasan DNA Lambda...........................................................................
3
6
7
9
11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian...................................................................... 123
Bahan Penelitian........................................................................................... 123
Metode Penelitian............................................................................................13
Isolasi DNA total tanaman..................................................................... 143
Pemotongan parsial DNA...................................................................... 154
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA.................................. 15
4
Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor............................................ 154
12
Pengemasan fage rekombinan............................................................. 16
Transveksi fage ke dalam E. coli…………......................................... 16
12
Eksisi plasmid dari fage ...................................................................... 16
Isolasi DNA plasmid rekombinan…...................................................... 17
12
Transformasi bakteri.............................................................................. 174
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI............................. 18
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemotongan Parsial dan Penyisipan Nukleotida pada Ujung Fragmen
DNA............................................................................................................ 19
Konstruksi Fage Rekombinan...................................................................... 20
Ukuran DNA Sisipan................................................................................... 23
Ukuran Pustaka Genom............................................................................... 25
SIMPULAN DAN SARAN..............................................................................
27
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................... 28
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana……..................................................... 5
2 Peta genetik bakteriofage ............................................................................. 8
3 Penyusunan virus bakteriofage λ.................................................................... 10
4 Vektor pengklonan fage
BlueSTAR-1......................................................... 12
BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan…………...........
12
6 Tahapan konstruksi pustaka genom..............................................................
13
5
7 Fragmen DNA T. langsdorffiana hasil pemotongan parsial dengan
Sau3AI........................................................................................................... 19
8 Seleksi biru-putih terhadap plak.................................................................... 21
9 DNA T. langsdorffiana menggantikan daerah lacZ, lambda, EMC, lambda,
EMC dari vektor fage .................................................................................. 23
10 Plasmid rekombinan yang dipotong dengan EcoRI...................................... 24
xi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tibouchina
langsdorffiana
Baill
termasuk
ke
dalam
famili
Melastomataceae. Tumbuhan ini berbunga ungu cerah dan merupakan tumbuhan
hutan hujan di Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan (Faravani & Bakar
2007).
T. langsdorffiana toleran terhadap pH rendah dan aluminium (Al) tinggi.
Tumbuhan ini dapat tumbuh dengan baik pada pH 3. Tumbuhan ini juga toleran
terhadap Al hingga konsentrasi 0.8 mM baik pada pH 4 maupun pada pH 3. Pada
1.6 mM Al atau lebih dalam lingkungan pH 4, pertumbuhan panjang akar T.
langsdorffiana
terhambat
walaupun batang
dan tunas tidak
terhambat
pertumbuhannya (Muhaemin 2008). Tumbuhan ini memiliki toleransi terhadap
pH rendah dan Al tinggi sehingga tumbuhan ini dapat digunakan sebagai sumber
gen toleransi tumbuhan terhadap pH rendah dan Al tinggi. Selain sebagai sumber
gen, tumbuhan ini juga dapat digunakan sebagai model toleransi terhadap pH
rendah dan Al tinggi. Gen yang diduga bertanggungjawab terhadap toleransi
terhadap pH rendah dan Al tinggi dapat diuji di tumbuhan ini dengan metode gene
silencing.
Analisis akumulasi Al menunjukkan bahwa tumbuhan ini mampu
mengakumulasi 4.5 mg Al tiap gram bobot kering daun dan akar setelah mendapat
perlakuan 3.2 mM Al selama dua bulan (Mutiasari 2008). Kemampuannya dalam
mengakumulasi Al memungkinkan tumbuhan ini dapat digunakan sebagai
fitoremediasi terutama pada lahan yang mempunyai kandungan Al tinggi.
Untuk
memanfaatkan
gen-gen
yang
mengendalikan
toleransi
T.
langsdorffiana terhadap pH rendah dan Al tinggi dan kemampuannya dalam
mengakumulasi Al, maka bahan genetik tumbuhan ini harus disimpan di dalam
pustaka genom. Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA
genom total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung
seluruh sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Pustaka genom
sangat penting untuk menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh
suatu spesies. Selain sebagai penyimpan bahan genetik, pustaka genom juga
2
sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang mengandung promoter,
terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi gen. Peta fisik suatu
genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka genom merupakan
bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman, baik melalui
teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan konvensional (Suharsono
2002).
Pustaka genom manusia dan beberapa hewan mamalia, ikan, dan
tumbuhan sudah dikonstruksi. Beberapa pustaka genom telah dikonstruksi, seperti
pustaka genom kedelai kultivar Slamet yang toleran Al (Suharsono 2002) dan
kultivar Lumut yang peka terhadap Al (Suharsono 2007) dalam rangka
menyimpan seluruh informasi genetik yang dimiliki oleh kedelai lokal Indonesia.
Dari pustaka genom kedelai kultivar Lumut, penapisan dengan pelacak gen
penyandi peroksidase dari Arabidopsis telah dilakukan untuk mendapatkan gen
utuh penyandi peroksidase dari kedelai (Suharsono et al. 2003). Miftahudin et al.
(1998) telah mengkonstruksi pustaka cDNA dari kedelai (MLG3474) melalui
mRNA yang diisolasi dari tanaman yang mendapat cekaman kekeringan. Elvawati
(1999) telah mengkonstruksi pustaka cDNA tanaman kedelai yang diinduksi
cekaman Al. Kurnia (2005) juga telah berhasil mengisolasi gen penyandi
glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Dari
pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang mengandung
gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh Rachman (2005).
Kurniawan (2005), telah berhasil mengisolasi fragmen DNA yang mengandung
gen penyandi glutathione S-transferase dari pustaka genom kedelai kultivar
Lumut. Dari pustaka genom varietas tanaman yang sama, fragmen DNA yang
mengandung gen penyandi peroksidase juga telah berhasil diisolasi oleh
Rahmawati (2005).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan konstruksi pustaka genom T.
langsdorffiana.
KAJIAN PUSTAKA
Karakter Tibouchina
Genus Tibouchina (sinonim dengan Chaetogastra, Hephestionia, Itatiaia,
Lasiandra, Micranthella, Oreocosmus, Pleroma, Purpurella) terdiri dari 300
spesies (Faravani & Bakar 2007). Tibouchina biasa dikenal dengan nama
“princess flower”, “glory bushes” atau kadang-kadang “glory trees” (Judd et al.
2005; Faravani & Bakar 2007). Tanaman ini merupakan tanaman asli di hutan
hujan Mexico, Hindia barat dan Amerika Selatan, terutama Brazil. Namanya
berasal dari adaptasi tempat asalnya yaitu “Guiana” (Faravani & Bakar 2007).
Tibouchina merupakan anggota famili Melastomaceae (di dalam literatur
biasa ditulis Melastomataceae), merupakan tanaman dikotil berbunga, berbiji
tertutup (angiospermae). Famili melastomataceae terdiri dari 3000 spesies di
neotropika, 1000 di Asia tropis, 240 di Afrika, 225 di Madagaskar (150-166
genus), dan 70 di Thailand (15 genus) (Renner et al. 2001). Melastomataceae
kemudian menyebar di India, Australia, Sri Lanka, Asia Tenggara termasuk
Filipina dan Taiwan, sampai Papua New Guinea, Pulau Pasifik, Mauritius,
Jamaica, dan Amerika Serikat (Renner 1993).
T. langsdorffiana digunakan sebagai tanaman hias karena nilai estetikanya
yaitu warna bunga ungu cerah yang sangat menarik. Sebagian besar
Melastomataceae dan Memecylaceae memiliki warna bunga ungu, bervariasi dari
merah muda sampai magenta. Sebagai contoh, warna bunga ungu umumnya
ditemui pada Dichaetanthera, Meriania, Mouriri, Rhynchanthera dan Tibouchina,
dimana kebanyakan merupakan akumulator Al (Jansen et al. 2002).
Tanaman ini tumbuh dengan baik pada tanah yang bersifat asam. Jika
tanah tidak cukup asam, ujung daun akan seperti terbakar, kemudian menjadi
coklat atau bahkan daun akan mati. Jika hal itu terjadi, keasaman tanah dibuat
dengan menambahkan sulfur ke tanah di sekitar akar, atau menggunakan pupuk
yang bersifat asam. Tanaman ini tidak perlu dipangkas, karena dapat tumbuh
menjadi pohon besar (http://www.abc.net.au/gardening/stories/s2040246.htm).
Tibouchina yang berupa semak cantik yang banyak tumbuh di daerah
tropis Amerika latin mirip sekali dengan Dissotis canescens yang masih sekerabat
4
yaitu memiliki ciri-ciri semak berkayu lembut, mencapai tinggi 1.5 m dengan
lebar tajuk 1 m, bunganya yang besar dan berwarna magenta muncul di bulan
Desember sampai April, bunganya unik karena memiliki dua set benang sari yang
berbeda satu dengan yang lain, lima di antaranya panjang berwarna ungu dengan
ujung melengkung sementara lima lainnya lebih pendek dan berwarna kuning
(http://www.plantzafrica.com/plantcd/dissotiscanes.htm).
Perbanyakan T. langsdorffiana ini melalui stek secara vegetatif karena
tanaman ini tidak menghasilkan biji. Berbunga melimpah antara bulan Mei
sampai Januari. Spesies T. langsdorffiana biasanya memiliki daun yang berbulu
halus dengan tulang daun yang menonjol dan memperlihatkan warna bunga ungu
menarik sehingga ditanam sebagai hiasan. Nama lokal tanaman ini di kalangan
penjual tanaman hias, dikenal dengan nama violet, tibocina/tebocina (Sunda).
Kedudukan T. langsdorffiana dalam taksonomi adalah sebagai berikut:
Domain
: Eukariota
Kingdom
: Plantae
Subkingdom
: Viridaeplantae
Filum
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Subkelas
: Rosidae
Ordo
: Myrtales
Famili
: Melastomataceae
Genus
: Tibouchina
Spesies
: Tibouchina langsdorffiana Baill
T. langsdorffiana merupakan tanaman perennial, termasuk herba, semak,
atau pohon, tegak, dengan tinggi 0.5 m sampai 25 m (Gambar 1a), daun tunggal
(Gambar 1b), bertangkai, duduk daun berhadapan, pertulangan daun menyirip,
ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, bentuk lanset, permukaan bersisik.
Bunga T. langsdorffiana merupakan bunga terbatas tipe malai rata (corymbiform
cyme) dengan jumlah bunga 5-25 kuntum bunga (Gambar 1c), kelopak (sepal)
berjumlah 5 saling bebas, mahkota (petal) berjumlah 5 saling bebas (Gambar 1d),
simetri bunga beraturan (actinomorph), benang sari berjumlah 10 saling bebas
5
(polyandrous) dengan panjang sama, tipe perlekatan tangkai sari dengan kepala
sari yaitu versatile, tipe putik syncarp karena memiliki 5 buah karpel yang
dipisahkan oleh sekat (septum), tipe kepala putik clavate, sedangkan tipe tangkai
putik geneculate (Gambar 1e). Tipe plasentasi bakal buah axial (Gambar 1f), dan
merupakan bakal buah tenggelam (inferior), tetapi dalam perkembangannya,
bakal buah beserta biji di dalamnya akan gugur sehingga tanaman ini tidak
menghasilkan buah dan biji.
a
20 cm
b
d
2 cm
e
2 cm c
1 mm
f
2 cm
1 mm
Gambar 1 Morfologi tanaman T. langsdorffiana: a. tanaman berupa semak
berkayu; b. daun tunggal; c. tipe malai cabang bunga; d. tipe kelopak
dan mahkota bunga; e. tipe benang sari dan putik bunga; f. plasentasi
bakal buah.
6
Pustaka Genom
Suatu pustaka gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuen (urutan)
DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah di klon ke dalam vektor
tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan dan analisisnya. Pada
dasarnya terdapat dua macam pustaka gen yang dapat dikonstruksi, tergantung
sumber DNA yang digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA
genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut pustaka genom.
Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi balik suatu
populasi
mRNA,
maka
pustaka
yang
diperoleh
dinamakan
pustaka
complementary DNA (cDNA).
Hasil pengklonan seluruh DNA total dari spesies tertentu disebut dengan
pustaka genom. Pustaka genom sangat bermanfaat dalam usaha isolasi dan
karakterisasi suatu gen (Cross et al. 1999; Suharsono et al. 2003), dan juga untuk
pemetaan gen secara fisik.
Pustaka genom dapat dibuat melalui sintesis cDNA dari mRNA atau DNA
genom. Vektor yang diperlukan dalam pembuatan pustaka genom dapat berupa
bakteriofage, P1 artificial chromosome (PAC), yeast artificial chromosome
(YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), atau kosmid, bergantung pada
ukuran panjang fragmen DNA (Wahyudi 2001). Pada penelitian ini dipakai vektor
pengklonan yaitu fage lambda (
BlueSTAR-1 (Novagen 1997). Fage
BlueSTAR-1 adalah vektor yang didesain untuk membuat pustaka genom DNA
dengan efisiensi kloning fragmen DNA berukuran 7-20 kb. Vektor mengandung
gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan untuk
autosubkloning (Novagen 1997).
Konstruksi pustaka genom diawali dengan isolasi DNA total. DNA total
biasanya dipotong secara parsial menggunakan enzim restriksi Sau3AI atau enzim
lain disesuaikan dengan situs yang terdapat pada vektor yang akan digunakan
dalam konstruksi pustaka agar mendapatkan fragmen DNA yang berukuran besar.
Pemotongan parsial ini menghasilkan fragmen berukuran besar karena tidak
semua situs pengenalan suatu enzim restriksi dalam rantai DNA genom terpotong
oleh enzim restriksi yang bersangkutan. Fragmen DNA berukuran besar ini
kemudian disisipkan ke dalam vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi
7
tertentu sehingga hasil potongannya cocok dengan fragmen DNA. Untuk
menghindari adanya penyatuan kembali (religasi) ujung-ujung potongan biasanya
dimodifikasi dengan penambahan nukleotida tertentu (fill-in).
Dalam mengkonstruksi pustaka genom DNA, DNA umumnya dipotong
dengan enzim restriksi yang mengenali situs yang terdiri dari 4 pasang basa (pb)
(contohnya Sau3AI). Pengenalan dan pemotongan sekuen 4 pb yang spesifik ini
akan terjadi rata-rata sekali setiap 44 = 256 pb. Untuk meningkatkan kemungkinan
semua daerah genom berhasil diklonkan dan terkandung dalam pustaka genom,
DNA genom biasanya dipotong secara parsial untuk menghasilkan fragmen
restriksi yang saling tumpang tindih (overlapping) yang berukuran besar, sekitar
20 kb. Vektor fage
dapat menampung sekitar 20 kb.
Bakteriofage Lambda
Bakteriofage (atau fage) adalah virus yang menginfeksi bakteri. Satuan
dasar virus disebut virion. Virion fage
memiliki kepala, yang mengandung
genom DNA virus, dan sebuah ekor, yang berfungsi menginfeksi sel inang
Escherichia coli (E. coli). Virus hanya dapat memperbanyak diri jika berada di
dalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada di luar suatu sistem selular, virus
tidak mampu memperbanyak diri karena tidak mempunyai sistem enzim yang
dapat digunakan untuk mensintesis partikel virus baru. Diameter virus bervariasi
dari 20-300 nm sehingga ukurannya lebih kecil dari sel prokariot yang paling
kecil (Yuwono 2008). Bahan genetik virus ada yang berupa molekul DNA dan
ada yang berupa RNA. Molekul DNA dan RNA tersebut ada yang berupa
molekul untai tunggal dan ada yang berupa molekul untai ganda. Ekspresi genetik
virus dilakukan dengan menggunakan sistem enzim yang ada di dalam sel inang.
Salah satu jenis bakteriofage yang biasa digunakan sebagai vektor
pengklonan adalah bakteriofage . Bakteriofage
merupakan virus bakterial yang
telah banyak diteliti, dan telah diketahui secara luas mengenai genetika dan
biologi molekulernya. Urutan lengkap basa nukleotida bakteriofage
diketahui. Genom bakteriofage
ini sudah
berupa DNA untai ganda linier yang terdiri atas
48502 pb (Chauthaiwale et al. 1992). Molekul DNA bakteriofage ini mempunyai
8
struktur yang unik karena pada kedua ujungnya terdapat 12 basa tambahan berupa
molekul DNA untai tunggal. Kedua ujung molekul DNA tersebut dapat
membentuk ikatan komplementer jika terjadi pelingkaran DNA, sehingga ujungujung DNA tersebut disebut sebagai ujung kohesif (cohesive ends, disingkat COS)
(Chauthaiwale et al. 1992).
Fage
mempunyai gen-gen penyandi protein yang diperlukan dalam
penyusunan kepala dan ekor dan gen-gen yang menyandikan protein yang
diperlukan dalam siklus litik yang terdapat di bagian kedua ujung genomnya
(Gambar 2). Beberapa daerah di bagian tengah dari genom dapat digantikan oleh
DNA eksogen atau dihilangkan tanpa mempengaruhi kemampuan fage λ dalam
menginfeksi sel inang dan menyusun virus baru. DNA eksogen yang menyisip
diantara gen J dan N bisa berukuran lebih dari 25 kb. Terdapat sekitar 60 gen
yang ada di dalam genom λ (Lodish et al. 2000).
Gambar 2 Peta genetik bakteriofage
Bakteriofage
(Lodish et al. 2000).
menginfeksi E. coli dengan cara menempel pada suatu
reseptor spesifik yang terdapat pada permukaan sel E. coli, kemudian
menginjeksikan DNAnya (Dale 1994). DNA linier utas ganda diubah menjadi
bentuk sirkuler segera setelah terjadi infeksi. Setelah memasuki sel bakteri, ujung
kohesif mengalami perpasangan basa membentuk molekul DNA sirkuler, dimana
masih terdapat 2 buah nick pada tempat perpasangan basa tersebut. Kedua nick ini
ditutup oleh DNA ligase inang sehingga dihasilkan molekul DNA sirkuler
seutuhnya. DNA sirkuler ini berfungsi sebagai cetakan dalam proses transkripsi
selama fase infeksi awal (Sambrook et al. 1989).
Ketika DNA
selanjutnya DNA fage
memasuki sitoplasma sel inang setelah menginfeksi,
akan mengalami pertumbuhan siklus litik atau lisogenik.
Siklus litik menyebabkan lisisnya sel inang dan menghasilkan partikel fage baru,
sedangkan siklus lisogenik terjadi karena genom bakteriofage terintegrasi dengan
9
genom sel inang sebagai profage. Dalam kondisi cekaman nutrisi dan lingkungan,
DNA
yang terintegrasi dapat dikeluarkan dari kromosom inang dan selanjutnya
memasuki siklus litik (Glick & Pasternak 1994). Ketika bakteriofage
digunakan
sebagai vektor pengklonan, dia mampu mengalami pertumbuhan litik, tetapi
fungsi virus lainnya menjadi tidak relevan. Sebagai akibatnya, gen-gen yang
terlibat dalam jalur lisogenik dan gen-gen virus lainnya yang tidak penting bagi
jalur litik akan dihilangkan dari DNA virus dan digantikan dengan DNA yang
akan diklonkan. Bakteriofage
ini memiliki efisiensi pengemasan sebesar 78-
108% dari ukuran DNA lambda tipe liar (Chauthaiwale et al. 1992). DNA asing
yang berukuran di atas 25 kb dapat disisipkan ke dalam genom , menghasilkan
DNA rekombinan yang dapat dikemas secara in vitro untuk membentuk virusvirus yang mampu bereplikasi dan membentuk plak di dalam sel inang E. coli
(Lodish et al. 2000).
Vektor Pengklonan Bakteriofage Lambda
Bakteriofage merupakan salah satu vektor untuk konstruksi pustaka
genom. Replikasi DNA
di dalam sel inang menghasilkan molekul DNA
multimerik, yang disebut concatomers, yang terdiri dari kopi-kopi ganda genom
virus yang bersambungan dari ujung hingga ujung yang dibatasi oleh sekuen
nukleotida spesifik yang disebut situs COS. Dua protein , yaitu Nu 1 dan A,
terikat dengan situs COS dan menyisip secara langsung ke DNA di antara dua
situs COS yang berdekatan kemudian masuk ke dalam kepala yang akan disusun
(Lodish et al. 2000).
Setiap kepala fage mengemas genom
tunggal sebesar 50 kb dari
concatomers multimerik. DNA kromosom sel inang tidak menyisip ke dalam
kepala
karena tidak mengandung kopi dari sekuen COS. Kepala dan ekor yang
kosong disusun dari kopi-kopi ganda dari beberapa protein λ yang berbeda.
Selama fase akhir,
membentuk molekul DNA yang panjang yang disebut
concatomers. Molekul multimerik ini terdiri dari kopi-kopi genom
yang
bersambungan dari ujung ke ujung dan dipisahkan oleh situs COS yang
merupakan sebuah sekuen nukleotida yang dapat mengikat protein. Setiap kopi
10
dari genom λ mengandung COS. Protein λ Nu1 dan A yang menempel pada situs
COS memicu penyisipan DNA diantara dua situs COS yang berdekatan ke dalam
kepala yang kosong. Setelah kepala-kepala terisi DNA, ekor yang siap disusun
akan menempel, menghasilkan virus λ lengkap yang mampu menginfeksi sel-sel
E. coli (Gambar 3).
Gambar 3 Penyusunan virus bakteriofage λ (Lodish et al. 2000).
Berbagai vektor pengklonan turunan dari fage
telah dikonstruksi untuk
berbagai tujuan berdasarkan ukuran fragmen DNA sisipan dan situs penyisipan
(Singer & Berg 1991).
Fage
BlueSTAR-1 merupakan vektor yang didesain untuk membuat
pustaka genom DNA dengan ukuran sisipan sebesar 7-20 kb. Vektor
ini
mengandung gen untuk seleksi biru/putih yang unik dan cre-loxP yang digunakan
untuk autosubkloning (Novagen 1997). Seleksi biru-putih diperoleh karena
adanya gen lacZ E. coli lengkap dan daerah kontrol yang terdapat dalam lengan
11
fragmen yang berukuran 13 kb. Lengan vektor akan bereligasi dengan lengan
DNA genom, menghasilkan fage yang dapat menghasilkan β-galaktosidase aktif
di dalam sel-sel yang terinfeksi. Virus
rekombinan yang diinfeksikan ke bakteri
ini, yang kemudian ditumbuhkan di cawan petri akan menghasilkan plak-plak
rekombinan dalam jumlah besar. Setiap plak yang muncul dari virus rekombinan
tunggal akan menghasilkan turunan fage
yang jika ditumbuhkan akan identik
secara genetik dimana klon yang dibentuk telah membawa insert DNA genomik
khusus. Plak yang berbeda berhubungan dengan klon fage yang dibentuk, setiap
plak membawa DNA insert yang berbeda, dan secara kolektif mereka menyusun
pustaka genom .
Pengemasan DNA Lambda
Untuk menyiapkan virus
yang infektif yang membawa DNA
rekombinan, perakitan fage dilakukan secara in vitro dengan melakukan
pengemasan molekul DNA fage . Salah satu metode untuk memproduksi protein
pengemas fage adalah dengan menumbuhkan dua macam fage mutan secara
terpisah. Kedua macam mutan ini hasil dari mutasi pada gen yang berbeda. Mutan
yang satu tidak dapat mensintesis protein kepala A, dan mutan yang lain tidak
mampu mensintesis protein kepala Nu 1. Dengan mencampur kedua ekstrak ini,
fragmen DNA akan dikemas dalam kepala dan ekor fage akan ditempelkan pada
kepala yang sudah mengandung DNA.
Pengemasan dengan ekstrak protein ini menghasilkan virus-virus
rekombinan dalam jumlah besar yang sangat infektif dan secara efisien dapat
menginfeksi sel-sel E. coli. Setiap partikel virus berikatan dengan reseptor pada
permukaan sel inang dan menginjeksikan DNA rekombinan yang telah dikemas
ke dalam sel (Lodish et al. 2000).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2006 sampai dengan Desember
2008 di Laboratorium Kerjasama Bioteknologi Indonesia-Belanda (BIORIN) dan
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Bahan Penelitian
Daun muda T. langsdorffiana digunakan sebagai bahan tanaman. Fage
BlueSTAR-1 (Novagen) digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 4).
Gambar 4 Vektor pengklonan fage
BlueSTAR-1.
Fage ini telah dipotong dengan XhoI dan telah mengalami penyisipan (fill-in)
dengan nukleotida dCTP dan dTTP sehingga menghasilkan potongan vektor
BlueSTAR-1
Pengisi
loxP
Sfi I
Sal I
Ori
Ap
Sac I
Avr II
Xba I
Hind III
Sal I
Xho I
EcoR I
Sma I
BamH I
Sac II
Eag I
Not I
Not I
Eag I
Sac II
BamH I
Sma I
EcoR I
Xho I
Sal I
Hind III
Xba I
Avr I
Sac I
Sal I
Sfi I
loxP
dengan ujung menggantung (overhang) TC pada situs penyisipan (Gambar 5).
lac
Pemotongan dengan Xho I
Penambahan dCTP dan dTTP
Kedua lengan dan pengisi tidak cocok
Gambar 5
BlueSTAR-1 (Novagen) yang dipotong dengan XhoI dan mengalami
pengisian dengan dCTP dan dTTP pada situs pengklonan.
13
E. coli galur ER1647 digunakan sebagai inang untuk mengamplifikasi fage
rekombinan. E. coli galur BM25.8 digunakan sebagai inang untuk memproses
eksisi dari fage
rekombinan menjadi plasmid rekombinan. E. coli galur DH5
digunakan sebagai inang untuk mendukung replikasi plasmid.
Metode Penelitian
Konstruksi pustaka genom dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu:
isolasi DNA total tanaman, pemotongan parsial DNA tanaman, penyisipan DNA
T. langsdorffiana ke dalam fage , pengemasan DNA
fage
rekombinan, transveksi
rekombinan ke E. coli dan analisis pustaka genom. Analisis pustaka genom
meliputi eksisi dari fage menjadi plasmid, isolasi DNA plasmid, transformasi
genetik dan pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Tahapan
penelitian ini disajikan pada Gambar 6.
Isolasi DNA total
T. langsdorffiana
Pemotongan
parsial DNA
Fragmen DNA
T. langsdorffiana
Vektor fage
terpotong
Penyisipan DNA T. langsdorffiana ke
dalam fage
DNA fage
rekombinan
Pengemasan fage
Analisis pustaka genom:
Transformasi bakteri
Isolasi DNA plasmid
rekombinan
rekombinan
Transveksi fage rekombinan ke
E. coli
Gambar 6 Tahapan konstruksi pustaka genom.
14
Isolasi DNA total tanaman
Isolasi DNA total tanaman dilakukan dengan mengikuti prosedur Chang et
al. (1993) yang dimodifikasi yaitu dengan penggantian LiCl dengan
isopropranol/etanol absolut. Sampel diambil dari daun segar yang masih muda.
Daun muda tersebut dibuang bagian tulang daunnya, dipotong-potong, dan
ditimbang sebanyak 2 g. Selanjutnya potongan daun tersebut ditambah nitrogen
cair secukupnya, dan digerus dengan mortar hingga halus. Bubuk ini kemudian
dilarutkan dalam 6 ml 2x larutan penyangga cetyltrimethyl-ammonium bromide
(CTAB) (2% CTAB, 0.1 M Tris-HCl pH 9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2%
PVP) lalu ditambahkan 0.2% merkaptoetanol. Larutan dibolak-balik sampai rata,
kemudian diinkubasikan dalam pemanas bergoyang pada suhu 65oC selama 60
menit.
Ke
dalam
larutan
tersebut
ditambahkan
6
ml
larutan
kloroform:isoamilalkohol (CI) (24:1), dibolak-balik selama 1.5 menit, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm dengan swing-out rotor (Jouan, BR4i)
pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah terpisah, cairan di bagian atas
dipindahkan ke tabung baru dan ditambah isopropanol sebanyak 0.7x volume
awal, kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam.
Campuran disentrifugasi pada 4000 rpm, 4 C, selama 20 menit. Setelah
sentrifugasi, endapan kemudian dibilas dengan alkohol 70% lalu disentrifugasi
kembali pada kecepatan 3000 rpm, 4 C, 10 menit. Endapan yang diperoleh lalu
dikeringkan dengan vakum dan disuspensikan dalam TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA, pH 8.0). Suspensi DNA kemudian ditambah RNAse dengan konsentrasi
akhir 100
g/ml dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama minimal dua jam
untuk menghilangkan RNA. Suspensi DNA dicampur secara merata dengan 1x
volume fenol:kloroform:isoamilalkohol (PCI) (25:24:1), dan disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm dengan fix-angle rotor (Jouan, BR4i) pada suhu ruang
selama 10 menit. Cairan bagian atas diendapkan dengan menambahkan 0.1x
volume 3 M Na-asetat pH 5.2 dan 2x volume etanol absolut dingin, dibolak-balik
pelan lalu diinkubasi
pada suhu -20 C selama 2 jam. Setelah inkubasi lalu
disentrifugasi kembali pada kecepatan 14000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit.
Endapan DNA dibilas dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kembali pada
15
kecepatan 14000 rpm, 4 C, 30 menit. Endapan DNA tersebut dikeringkan,
kemudian disuspensikan di dalam TE pH 8.
Pemotongan parsial DNA
DNA total tanaman dipotong dengan enzim Sau3AI (Takara) pada suhu
37ºC selama 30 menit dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0.01, 0.015, 0.02 dan
0.04 unit tiap µg DNA.
Penyisipan nukleotida pada ujung fragmen DNA
Setelah dipotong secara parsial kedua ujung fragmen DNA disisipi
terlebih dahulu dengan dua nukleotida untuk mencegah terjadinya penyambungan
kembali di antara fragmen-fragmen tersebut sesuai dengan prosedur Novagen
(1997). Sebanyak 20 g fragmen DNA dicampur dengan larutan penyangga yang
mengand