Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria Penyandi trna Valin (trnaval) Pada Reptilia
KARAKTERISASI URUTAN NUKLEOTIDA DNA MITOKONDRIA
PENYANDI tRNA VALIN (tRNAVal) PADA REPTILIA
NINA RANTI HERMAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
NINA RANTI HERMAN. Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria Penyandi Gen
tRNA Valin (tRNAVal) pada Reptilia. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan BERRY
JULIANDI.
Urutan nukleotida beberapa gen tRNAVal diekstrak dari genom lengkap mitokondria reptilia
yang diambil dari GenBank serta dua genom parsial mitokondria milik Laboratorium Zoologi,
Institut Pertanian Bogor. Urutan nukleotida gen tRNAVal yang diperoleh kemudian dijajarkan
berdasarkan struktur sekundernya. Gen ini terletak tepat di antara gen 12S rRNA dan 16S rRNA
tanpa adanya penataan ulang posisi maupun pseudogen. Komposisi nukleotida didominasi oleh
basa A dan T. Mutasi yang terjadi pada bagian batang kebanyakan adalah substitusi transisi. Gen
ini dapat digunakan dalam analisis filogenetik namun menghasilkan struktur pohon yang kurang
stabil. Selain urutan nukleotida pada bagian batang tRNA, nukleotida pada bagian lainnya (kecuali
bagian simpai D dan T) dapat diikutsertakan di dalam analisis. Pohon filogeni yang dihasilkan
mendukung formasi burung dan crocodilia dalam klad Archosauria, dan juga kecenderungan kurakura terhadap diapsida terutama Archosauria.
ABSTRACT
NINA RANTI HERMAN. Characterization of Mitochondrial DNA Sequence Encoding the tRNA
Valin (tRNAVal) Gene in Reptilia. Under the direction of ACHMAD FARAJALLAH dan BERRY
JULIANDI.
We extracted tRNAVal gene sequences of some reptilians from complete mitochondrial
genome sequences deposited in GenBank and from two partial mitochondrial genome sequences
property of Laboratory of Zoology, Bogor Agricultural University. These mitochondrial tRNAVal
gene sequences were then aligned by virtue of their secondary structure. The gene itself was
located exactly between 12S rRNA and 16S rRNA genes without any rearrangements or
pseudogenes being observed. Nucleotide composition was dominated by A and T bases. Mutations
occurred in the stem region of the sequences were mostly transition kind of substitusion. This gene
was applicable in phylogenetic analysis but resulting less stabile trees. Besides the nucleotide
sequences of the stem region of tRNA, nucleotides in the other parts (except loops D and T) could
also be assigned in the analysis. The inferred trees supported the bird-crocodilian formation of
Archosaurian clade, and also the diapsid affinity of turtles namely to Archosauria.
KARAKTERISASI URUTAN NUKLEOTIDA DNA MITOKONDRIA
PENYANDI tRNA VALIN (tRNAVal) PADA REPTILIA
NINA RANTI HERMAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi
Nama
NRP
: Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria Penyandi
tRNA Valin (tRNAVal) pada Reptilia
: Nina Ranti Herman
: G04400051
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
NIP 131878947
Berry Juliandi, M.Si
NI 3010100093
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
Tanggal lulus: 18 Desember 2007
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat, karunia dan petunjuk-Nya
sehingga karya ilmiah ini dapat terselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah
analisis urutan nukleotida, dengan judul Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria
Penyandi tRNA Valin (tRNAVal) pada Reptilia
Penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan
bapak Berry Juliandi, M.Si atas kepercayaan dan kesabarannya dalam membimbing penulis. Di
samping itu, penghargaan setingginya penulis sampaikan kepada keluarga tercinta; mami dan papi
atas kasih sayang dan doa yang tak pernah putus, serta adik-adik terkasih Rika dan Rudy yang
selalu menghadirkan keceriaan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada para sahabat
penulis: Tanty Indira atas kebersamaannya, Fitria Y. Bahri, S.Si atas motivasinya, D. Kurniawati,
S.Si dan Puji Rianti, S.Si atas inspirasinya, serta rekan-rekan Biopi 37 dan teman-teman TM3 atas
perhatian dan dorongan semangatnya. Penulis juga berterima kasih kepada keluarga besar
Laboratorium Zoologi atas dukungannya.
Karya ini tentu masih jauh dari sempurna. Namun penulis mengharapkan tulisan ini dapat
bermanfaat.
Bogor, November 2007
Nina Ranti Herman
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada 7 Januari 1983 dari pasangan Ir. Herman Sjafei dan Netri
Karmela. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara.
Setelah lulus dari SMU Islam Al-Azhar 1 Jakarta, penulis melanjutkan studinya di Institut
Pertanian Bogor, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi pada
tahun 2000 melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis pernah berpartisipasi
sebagai anggota Tim Soal Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) dalam rangkaian kegiatan Biologi
Interaktif (Bio-In) tahun 2001. Pada tahun 2003 penulis melaksanakan praktik lapang di
Laboratorium Mikrobiologi Rumah Sakit Pusat Pertamina (RSPP) Jakarta dengan judul Analisis
Sperma dalam Kasus Infertilitas Pria.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………………………….
vii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………………..
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ……………………………………………………………………….
1
Tujuan Penelitian ……………………………………………………………………..
2
Waktu dan Tempat …………………………………………………………………...
2
BAHAN DAN METODE
Data Urutan Nukleotida ………………………………………………………………
2
Penjajaran (Alignment) Urutan Nukleotida …………………………………………..
2
Analisis Urutan Nukleotida dan Analisis Filogenetik ………………………………..
2
HASIL
Analisis Urutan Nukleotida …………………………………………………………..
2
Analisis filogenetik …………………………………………………………………...
3
PEMBAHASAN ……………………………………………………………………………
3
KESIMPULAN ...…………………………………………………………………………...
11
SARAN ……………………………………………………………………………………..
11
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………………………
12
LAMPIRAN ………………………………………………………………………………...
13
`
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Skema organisasi genom mitokondria vertebrata secara umum ……………………….....
1
2
Struktur sekunder standar untuk tRNA (kecuali dua isoakseptor serin) …………………………….
2
3
Val
Penjajaran urutan nukleotida gen tRNA
mt menggunakan kriteria seperti yang
dipaparkan di dalam naskah …............................................................................................
4
Urutan nukleotida gen tRNA
Val
mt reptilia setelah menghilangkan semua bagian simpai
dan nukleotida pemisah, menyisakan 42 situs pada bagian batang .....................................
5
5
6
Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Maximum Parsimony (MP)
dengan bootstrap 100x ........................................................................................................
6
7
Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Neighbor Joining (NJ)
dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x ...................................................
7
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
8
Val
tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode Maximum
Parsimony (MP) dengan bootstrap 100x .............................................................................
8
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
9
Val
tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode Neighbor Joining
(NJ) dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x ...........................................
10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Daftar singkatan kode asam amino ………………………………………………………...
14
2
Genom mt hewan yang digunakan dalam analisis dan kode aksesnya pada Genbank .........
15
3
Komposisi basa pada bagian batang, jumlah nukleotida pada simpai D dan simpai T, serta
jumlah nukleotida total dari urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia …………………...
4
Rasio ts/tv dan jarak genetik reptilia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
Val
mt pada
bagian batang (42 basa) .........................................................................................................
5
16
17
Rasio ts/tv dan jarak genetik reptilia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal mt tanpa
simpai D dan T (57 basa) ......................................................................................................
18
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
DNA mitokondria (mtDNA) vertebrata
merupakan genom sirkular utas ganda.
Genom ini menyandikan 13 protein subunit
penyusun enzim-enzim fosforilasi oksidatif
yang berfungsi dalam respirasi selular, dan 2
RNA ribosom (rRNA) serta 22 tRNA yang
diperlukan dalam proses translasi protein
mitokondria (mt). Terdapat pula ruas bukan
penyandi (non-coding region) yang pada
beberapa hewan berfungsi dalam pengaturan
replikasi dan transkripsi (control region).
Gen-gen mt tersebar pada kedua utas DNA,
namun ada juga mtDNA yang seluruh
gennya ditranskripsikan hanya dari satu utas
DNA
Setiap utas DNA ditranskripsikan
sebagai sebuah polisistron. Pada vertebrata,
gen-gen tRNA pada mtDNA merupakan
sinyal untuk pemrosesan polisistron
pascatranskripsi (Ojala et al 1981). Gen-gen
tRNA dalam mitokondria terletak menyebar
di antara gen-gen penyandi protein. Urutan
nukleotida
(nt)
gen-gen
tRNA
memungkinkannya
untuk
membentuk
struktur sekunder yang melipat-lipat. Pada
sebuah polisistron pascatranskripsi, enzim
restriksi akan memotong tRNA dengan
mengenali situs-situs lipatan struktur
sekundernya, dan pada akhirnya memecah
polisistron menjadi pesan-pesan yang
spesifik gen.
Penelitian molekuler telah umum
menggunakan mtDNA dalam analisis
filogenetik. Beberapa karakteristik mtDNA
yang menguntungkan di antaranya adalah
ukuran yang relatif kecil (15-19 kb), susunan
gen yang kompak hampir tanpa intron, dan
sifat pewarisan maternal. Hasil penelitian
Kumazawa
dan
Nishida
(1993)
menyimpulkan bahwa gen-gen tRNA pada
mtDNA dapat digunakan untuk menentukan
filogeni hewan pada percabangan dalam
(deep-branch) yaitu percabangan yang
terjadi 20-600 juta tahun yang lalu. Namun
Springer et al (2001) mengemukakan bahwa
ekson-ekson tertentu pada genom inti
memiliki kinerja yang lebih baik untuk
penentuan cabang dalam pada mamalia
dibandingkan gen-gen pada mtDNA.
Berdasarkan klasifikasi tradisional,
kelas Reptilia terdiri atas ordo Crocodilia
(buaya), Squamata (kadal dan ular),
Sphenodonta/Rhynchocephalia (tuatara), dan
Testudinata
(kura-kura).
Kesemuanya
termasuk ke dalam kelompok amniota
bersama kelas Aves dan Mamalia. Reptilia
modern merupakan gabungan dua jalur
(lineage) dari tiga jalur vertrebrata amniota;
anapsida yang diwakili oleh kelompok kurakura, dan diapsida yang diwakili oleh buaya,
kadal, ular, dan tuatara. Namun kelas Reptilia
mengecualikan burung, yang juga merupakan
keturunan dari leluhur bersama diapsida. Oleh
karena itu reptilia adalah kelompok yang
parafiletik
sehingga
tidak
memenuhi
persyaratan kladistik dan tidak lagi dianggap
sebagai takson yang valid dalam klasifikasi
tradisional (Hickman et al 2000).
Gambar 1
Skema organisasi genom mitokondria
vertebrata secara umum. Gen tRNA
ditampilkan dengan singkatan 3 huruf
untuk asam amino (lihat Lampiran 1).
Gen penyandi protein ditampilkan
sebagai berikut: Cyt b – sitokrom b; CO
I-III – sitokrom oksidase subunit I-III;
ND1-6 – NADH reduktase subunit 1-6
(gambar dari Pereira 2000).
Beberapa ciri morfologi dan pendekatan
molekuler menyiratkan bahwa burung dan
crocodilia merupakan keturunan dari leluhur
yang sama (common ancestor). Dengan kata
lain, burung dan crocodilia termasuk ke dalam
satu kelompok yang monofiletik sehingga harus
ditempatkan pada grup yang terpisah dari
reptilia lainnya. Masalah ini memunculkan
suatu pandangan sistematik terhadap kelompok
reptilia, yang menempatkan burung dan
crocodilia dalam satu klad: Archosauria
(Hickman et al 2000). Analisis berdasarkan
urutan nukleotida gen-gen mt dan gen penyandi
protein inti mendukung pandangan sistematik
Archosauria
ini
(Hedges
1994),
dikonfirmasikan pula oleh Kumazawa dan
Nishida (1995) yang melakukan analisis
2
berdasarkan gen-gen tRNA mt, dan oleh
Janke dan Arnason (1997) yang melakukan
analisis berdasarkan gen-gen penyandi
protein mt.
nukleotida pemisah. Di antara batang AC dan
batang T terdapat satu simpai tambahan
(variabel). Nukleotida pada urutan paling akhir
adalah satu nukleotida diskriminator.
Tujuan Penelitian
Penelitian
ini
dilakukan
untuk
mengetahui variasi basa nukleotida gen
penyandi tRNA Valin (tRNAVal) dalam
mtDNA. Selain itu, keefektifan gen tRNAVal
dalam
penentuan
posisi
filogenetik
kelompok reptilia juga dieksplorasi.
Analisis Urutan Nukleotida dan Analisis
Filogenetik
Seluruh
analisis
dilaksanakan
menggunakan program MEGA 3.1 (Kumar et al
2004). Komposisi nukleotida ditentukan
berdasarkan urutan nukleotida pada bagian
batang gen tRNAVal mt. Perhitungan jarak
genetik
dilakukan
berdasarkan
urutan
nukleotida pada bagian batang gen tRNAVal mt.
Selain itu perhitungan jarak genetik juga
dilakukan berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal mt tanpa simpai D dan T. Konstruksi
pohon filogenetik dilakukan menggunakan
metode Maximum Parsimony (MP) dan
Neighbor Joining (NJ) dengan kriteria Kimura2-Parameter dan bootstrap 100x. Digunakan
pula beberapa spesies burung dan mamalia
sebagai pembanding (lihat Lampiran 2 untuk
rincian data).
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari hingga Juli 2007, bertempat di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
BAHAN DAN METODE
Data Urutan Nukleotida
Data yang digunakan adalah urutan
lengkap mtDNA dari beberapa spesies
reptilia yang diambil dari GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) serta dua data
urutan mtDNA parsial milik Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB
(lihat Lampiran 2 untuk rincian data). Dari
data GenBank dipilih urutan nukleotida
tRNAVal berdasarkan informasi yang
terdapat pada masing-masing entri. Data
urutan nukleotida milik Laboratorium
Zoologi FMIPA IPB dijajarkan dengan salah
satu data urutan nukleotida gen tRNAVal mt
yang telah diketahui kemudian ruas yang
sejajar dipotong. Semua urutan nukleotida
gen tRNAVal mt yang diperoleh selanjutnya
digunakan dalam analisis.
Penjajaran
(Alignment)
Urutan
Nukleotida
Semua data urutan nukleotida tRNAVal
mt dijajarkan secara manual dengan mata
berdasarkan kemampuannya membentuk
struktur sekunder berupa lengan-lengan
yang terdiri atas batang dan simpai (Gambar
2). Batang AA (asam amino) tidak memiliki
simpai, berfungsi untuk membawa asam
amino. Batang D (dihidrouridin) memiliki
satu simpai. Batang AC (antikodon)
memiliki satu simpai yang di dalamnya
terdapat urutan nukleotida antikodon.
Batang T (TψC) memiliki satu simpai. Di
antara batang AA dan batang D serta antara
batang D dan AC terdapat beberapa
Gambar 2 Struktur sekunder standar untuk tRNA
(kecuali
dua
isoakseptor
serin).
Nukleotida conserved ditunjukkan oleh
R (purin), Y (pirimidin), dan V
(nonuridin: A, G, atau C). Digambar
kembali dari Kumazawa dan Nishida
(1993). Sistem penomoran berdasarkan
Sprinzl et al (1997).
HASIL
Analisis urutan nukleotida
Data urutan nukleotida mt reptilia yang
diambil dari GenBank (Lampiran 2) meliputi 35
spesies
yang
telah
diketahui
posisi
filogenetiknya. Ukuran genom mt yang
3
diperoleh berkisar antara 15000 hingga
19000 bp. Data urutan nukleotida mtDNA
parsial reptilia milik Laboratorium Zoologi,
Departemen Biologi, FMIPA IPB berukuran
1330 dan 886 bp.
Semua gen tRNAVal mt yang
teridentifikasi terletak di antara gen
penyandi 12S rRNA dan 16S rRNA, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 1. Tidak
tercatat adanya penataan ulang posisi
maupun kehadiran pseudogen tRNAVal mt.
Rataan komposisi nukleotida gen
tRNAVal mt terdiri atas 57.7% A+T dan
42.3% G+C (Lampiran 3). Jumlah
nukleotida penyusun tRNAVal mt berkisar
antara 63 hingga 73 nt dengan rataan 67.97.
Terdapat 7 bp pada batang AA, 4 bp pada
batang D, masing-masing 5 bp pada batang
AC dan T, 1 nt pemisah antara batang AA
dan batang D, 2 nt pemisah antara batang D
dan AC, dan 4 nt pada simpai variabel.
Jumlah nt pada simpai D dan simpai T
sangat bervariasi. Rataan jumlah nukleotida
pada simpai D dan T adalah 6.0 dan 4.97
(Lampiran 3).
Analisis Filogenetik
Jarak genetik dihitung menggunakan
pilihan Distance – Compute Pairwise pada
program MEGA 3.1 (Lampiran 4).
Berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal
mt pada bagian batang, rataan jarak genetik
yang diperoleh adalah 0.37. Jarak genetik
terkecil adalah 0.00 yang terjadi di antara
tiga pasangan spesies yaitu D. subplana – P.
sinensis, I. elongata – I. forstenii, dan
G.gangeticus – C. niloticus, sedangkan jarak
genetik terbesar adalah 1.97 yang terjadi di
antara pasangan spesies L. dulcis – E.
subglobosa. Berdasarkan urutan nukleotida
gen tRNAVal mt tanpa simpai D dan T
(lampiran 5), rataan jarak genetik yang
diperoleh adalah 0.32. Jarak genetik terkecil
adalah 0.00 yang terjadi di antara pasangan
spesies I. elongata – I. forstenii, sedangkan
jarak genetik terbesar adalah 1.01 yang
terjadi di antara pasangan spesies B.
constrictor – E. subglobosa.
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal
mt pada bagian batang (42 basa) dengan
metode MP dan NJ (Gambar 5 dan 6) serta
berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal
tanpa simpai D dan T (57 basa) dengan
metode MP dan NJ (Gambar 7 dan 8).
Semua pohon yang dihasilkan memiliki
topologi yang mirip; spesies-spesies buaya,
kura-kura dan burung membentuk satu
kelompok yang terpisah dari spesies-spesies
kadal dan ular sedangkan spesies-spesies
mamalia berada di luar sebagai outgroup.
PEMBAHASAN
Gen tRNAVal mt selalu ditemukan sebagai
gen tunggal yang tidak membentuk kumpulan
(cluster) dengan gen-gen tRNA lainnya.
Kumpulan-kumpulan gen tRNA yang telah
diketahui adalah IQM, WANCY, dan HSL
(lihat Lampiran 1 untuk huruf singkatan asam
amino). Posisi gen tRNAVal pada genom
mitokondria adalah di antara gen 12S rRNA dan
16S rRNA, daerah yang memiliki tingkat
keterpeliharaan (conservation rate) yang tinggi
(Saccone et al 1999), dan tidak ditemukan
adanya penataan ulang. Penataan ulang posisi
gen dalam genom dapat menjadi karakter yang
spesifik pada suatu takson. Beberapa penataan
ulang posisi gen di antaranya adalah kumpulan
gen tRNA HSL yang umum terdapat pada
vertebrata mengalami penataan menjadi SHL
pada Crocodilia, dan transposisi gen tRNA
glutamin ke kumpulan gen tRNA lainnya
(IQM-WANCY → IM-WQANCY) pada
spesies ular blindsnake (Kumazawa & Nishida
1995). Selain itu telah ditemukan pula penataan
letak gen pada Plastyternon megacephalum
[Testudinata] berupa transposisi gen protein
ND5 dan lima gen tRNA (H, S, L, T, P) yang
menyisip di antara gen tRNA I dan Q pada
kumpulan gen IQM (Parharn et al 2006).
Ketiadaan penataan ulang gen tRNAVal
kemungkinan disebabkan oleh posisinya di
dalam genom mt. Gen tRNAVal terletak di
antara gen 12S rRNA dan 16S rRNA.
Hilangnya gen tRNAVal dari posisi tersebut
karena mengalami penataan ulang ke posisi lain
akan
mengakibatkan
rusaknya
urutan
nukleotida kedua gen rRNA sehingga proses
translasi protein tidak dapat berjalan. Dengan
kata lain sel akan mengalami kematian.
Tidak ditemukan pseudogen tRNAVal dalam
mtDNA, baik yang berupa duplikasi gen utuh
ataupun sebagian. Kumazawa et al (1996)
menemukan
adanya
pseudogen
urutan
nukleotida control region tersisipkan ke dalam
kumpulan gen IQM pada beberapa famili ular.
Pseudogen lain yang telah diketahui di
antaranya adalah pseudogen tRNA serin pada
Mytilus californianus [Mollusca] (Beagly et al
1999).
Urutan nukleotida gen tRNAVal pada bagian
batang didominasi oleh basa A dan T dengan
rataan komposisi 57.7% A+T dan 42.3% G+C.
Saccone et al (1999) mendapati komposisi G+C
4
pada reptilia sebesar 40.53% (± 2.22).
Asimetri komposisi basa nukleotida ini
terjadi pada semua genom mt Metazoa;
komposisi G+C bernilai sangat rendah pada
genom serangga dan nematoda, dan
meningkat pada genom vertebrata hingga
mencapai nilai tertinggi pada aves, mamalia
(terutama primata) dan teleostei (Saccone et
al 1999). Komposisi G+C berpengaruh
terhadap kekuatan ikatan dan tingkat
kestabilan DNA. Menurut Lynch (1997),
bagian batang tRNA mitokondria hewan
memiliki tingkat kestabilan dupleks yang
rendah dibandingkan dengan tRNA inti,
utamanya disebabkan oleh banyaknya
insiden pasangan basa A-U yang melibatkan
dua ikatan hidrogen daripada G-C yang
melibatkan tiga ikatan hidrogen.
Semua gen tRNAVal mt reptilia dapat
diidentifikasi
berdasarkan
struktur
sekundernya yang berbentuk seperti daun
semanggi (Kumazawa & Nishida 1993,
Sprinzl et al 1997). Penjajaran urutan
nukleotida ditampilkan pada Gambar 3.
Urutan nukleotida gen tRNAVal mt melipat
menjadi empat lengan (AA, D, AC, T) yang
memiliki bentuk batang dan simpai.
Keempat lengan tersebut terdapat secara
utuh pada semua urutan nukleotida gen
tRNAVal. Lengan AA berfungsi sebagai
pembawa asam amino, lengan AC
membawa urutan kodon pada bagian
simpainya, lengan D dan T berperan dalam
interaksi pembentukan struktur tersier yang
menentukan fungsi tRNA. Wolstenholme et
al (1987) mendapati seluruh tRNA pada
Ascaris suum [Nematoda] tidak memiliki
lengan T, namun dapat berfungsi normal
karena adanya modifikasi pascatranskripsi
(Sakurai et al 2005).
Variasi jumlah nukleotida penyusun gen
tRNAVal mt terdapat pada simpai D dan T.
Rataan jumlah nukleotida pada kedua situs
tersebut adalah 6.00 dan 4.97. Lynch (1997)
memperoleh nilai rataan jumlah nukleotida
simpai D dan simpai T untuk reptilia dan
burung sebesar 6.9 dan 7.0.
Beberapa situs tertentu pada simpai D
dan
T
saling
berinteraksi
dalam
pembentukan struktur tersier tRNA sehingga
penjajaran pada kedua simpai tersebut harus
mempertimbangan interaksi yang terjadi
antara unsur-unsurnya. Hal ini, ditambah
jumlah nukleotida yang bervariasi, membuat
simpai D dan simpai T selalu memberikan
hasil penjajaran yang ambigu (Kumazawa &
Nishida 1993).
Jumlah nukleotida pada simpai D, simpai
T, dan simpai variabel tRNA berbeda-beda.
Situs-situs ini, bersama nukleotida-nukleotida
pemisah dan diskriminator, biasanya tidak
diikutsertakan dalam analisis (Kumazawa dan
Nishida
1993).
Pada
penellitian
ini,
penghilangan nukleotida-nukleotida tersebut
menghasilkan 42 basa pada bagian batang
(Gambar 4). Namun spesies-spesies yang
berkerabat dekat umumnya memiliki jumlah
nukleotida yang sama pada simpai variabel,
begitu juga pada nukleotida-nukleotida pemisah
dan diskriminator, serta simpai AC. Oleh
karena itu pada penelitian ini dilakukan analisis
berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal mt
pada bagian batang (42 basa), dan berdasarkan
urutan nukleotida gen tRNAVal mt tanpa simpai
D dan T (57 basa).
Perhitungan jarak genetik berdasarkan 42
maupun 57 basa sama-sama menghasilkan jarak
terkecil pada I. forstenii – I. Elongata.
Berdasarkan 42 basa, jarak terkecil juga tejadi
pada D. subplana – P. sinensis dan G.
gangeticus – C. Niloticus (Lampiran 4). I.
forstenii dan I. elongata merupakan anggota
dari genus yang sama (Indotestudo). D.
subplana dan P. sinensis bukan anggota dari
genus yang sama namun kedua spesies ini
tergabung
dalam
famili
yang
sama
(Trionychidae). Begitu juga G. gangeticus – C.
niloticus yang merupakan anggota dari famili
yang sama (Crocodylidae). Perbedaan hasil
yang diperoleh terutama disebabkan oleh
pengaruh dari nukleotida-nukleotida pemisah
dan diskriminator serta nukleotida-nukleotida
pada simpai variabel yang diikutsertakan di
dalam analisis.
Jarak genetik terbesar dari perhitungan
berdasarkan 42 basa terjadi pada L. dulcis –
E.subglobosa (Lampiran 4). E. subglobosa
merupakan
kura-kura
famili
Chelidae
sedangkan L. dulcis [Leptotyphlopidae]
(blindsnake) dianggap sebagai spesies ular yang
paling awal berkembang dan memiliki laju
evolusi yang lebih besar dari spesies-spesies
ular primitif ataupun modern lainnya. Jarak
genetik terbesar berdasarkan 57 basa terjadi
pada B. constrictor – E. subglobosa (Lampiran
5) yang sebenarnya juga memiliki jarak genetik
yang besar pada perhitungan berdasarkan 42
basa, namun nilainya sedikit di bawah L. dulcis
– E. subglobosa.
Konstruksi pohon filogenetik menghasilkan
topologi yang mirip. Secara garis besar, spesiesspesies burung, buaya dan kura-kura terletak
dalam satu kelompok yang terpisah dari kadal
dan ular, namun letak spesies-spesies dalam
percabangan di dalamnya masih kurang stabil.
5
A.
A.
A.
B.
B.
B.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
D.
D.
D.
E.
E.
G.
G.
G.
I.
I.
L.
L.
L.
M.
M.
O.
P.
P.
R.
T.
T.
T.
X.
mississippiensis
sinensis
schmidti
constrictor
biporus
tridactylus
crocodylus
insculpta
mydas
niloticus
picta
reevesi
ruffus
warreni
semicarinatus
subplana
zarudnyi
egregius
subglobosa
acutus
gangeticus
pardalis
elongata
forstenii
dulcis
flavimaculatum
viridis
tornieri
emys
okinavensis
regius
sinensis
floridana
kleinmanni
graeca
tachydromoides
unicolor
AA
*******
CAAAATG
...G...
.G...A.
.....A.
.....A.
.....A.
...G...
....TAA
.....CA
.......
.....CA
......a
.....A.
.....A.
.....A.
......A
.....A.
....TA.
...GGCA
.....A.
.......
......A
......A
......A
.....A.
.....A.
.....A.
..G...A
.....CA
.....A.
.....A.
......A
.....A.
......A
......A
.....AA
.....A.
TA
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
D
****
GCTT
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
D
****
AAATTTA
AAGC
.......
....
..CAAA
....
.C.CA
....
.CCA
....
.CT
....
...CAC.
G...
..T.AA.
....
..CCAA
....
...CCA
....
..CAAA
....
..TCAA
....
.C.ACA
....
...AC..
....
.C.ACA
....
..CCCA
....
.T.
....
...ACA
....
..C..A
..T.
...
....
..GACA
....
..CCAA.
....
..CCCA.A ....
..CCCA.A ....
...ACA
....
..TAA
....
.T.A
....
..CCCATA ....
..T.AA
....
.T..CA
....
.C.AC..
....
..CC.A
....
..C.A..
....
..TC.ATTA ....
..CCCACA ....
..TA
....
.C.CCA
....
A
T
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AC
*****
TTCAG
.....
....A
...GA
C....
C....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
...GA
....A
C..GA
.....
.....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
.....
.C.G.
C....
CCT..
C....
.....
C..GA
C..GA
.....
.C..A
C....
C....
CCT..
...GA
TTTACAC
C......
C.....A
CC....A
C....G.
.......
CC.....
CC...G.
C......
C......
C......
C......
C......
C.....A
CC.....
.......
C......
C.....A
C......
C.....A
.......
C......
C......
C......
C......
C.....A
C.....A
C......
C......
C......
C......
.......
C.....A
C......
C......
C.....T
C......
AC
*****
CTGAA
.....
T....
TC...
....G
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
TC...
T...T
TC...
.....
.....
T....
.....
T....
.....
.....
.....
.....
.CAG.
.....
..AGG
.....
.....
TC...
TC...
.....
T..G.
.....
.C..G
..AGG
TC...
AAAT
..TG
.G..
CG.C
.G.C
.G.A
....
..C.
.G..
.C..
.G..
.G.C
.G.C
.G.C
CG.C
.T..
.G..
C...
....
.G..
.T..
.G..
.G..
.G..
.G..
.G.C
.G..
....
.G..
CG..
CG..
.C..
CC..
.G.C
.G.C
.G..
CG.C
T
*****
GCCCA
TT.AC
....C
ATTAC
.....
....T
AT...
.T.T.
.T...
.TTT.
.T.T.
.TA..
ATT..
.TTA.
ATTAC
A....
.TT.C
.TTAG
.....
.T.TT
.TTT.
.T.T.
.TT..
.TT..
AT.AC
.T...
...G.
.T...
.T...
ATTA.
.TTA.
A....
....C
.T..G
.T..G
.T.A.
ATTA.
T
*****
CCAT
CGGAC
.AC
..A..
AT.AT
AA.G.
A..
ATA.T
...A
G..G.
TACA
...G.
.A.C
T...T
TT.AAT
AA...
.T.AAC
.....
.TTAAA
TAA..
TT.AAC
AA...
TT.AAAC
A....
AA
TAA.T
T..CAC
TTA..
.
ATA.T
...AACA
A..GT
.TCAAAC
A.A..
TA.AAAC
.TA..
AT.AAC
A..G.
.AC
.A...
TTTAAA
TAA..
.T.AAAC
A....
TT.AAAC
AA...
TT.AAAC
AA...
.A
.CA.T
AA
G.A..
.ACA
AC...
T..AAAC
AA...
TT.AAAC
A....
TA
TTA.T
A
ATA..
...AACC
A..GT
A.CACCCAT T..G.
TT.AA
AC...
TT.AA
AC...
A..ACC
.A...
A..
.TA.T
AA
*******
CATTTTG
....C..
.T..CC.
.T.....
.T.....
.T.....
..CC...
T......
T......
.......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T......
.T.....
.T.....
TGCC...
.T.....
.......
T......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T...C..
T......
.T.....
.T.....
T......
.T.C...
T......
T......
TT.....
.T.....
A
.
C
.
C
C
.
.
.
.
.
.
.
C
.
.
C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Gambar 3 Hasil penjajaran urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia secara manual dengan mata berdasarkan kemampuannya membentuk struktur sekunder. Nukleotida pada posisi
simpai tidak dijajarkan. Hanya urutan nukleotida A. mississippiensis yang ditampilkan lengkap; tanda titik menunjukkan basa yang sama dengan urutan A. mississippiensis
sedangkan huruf menunjukkan basa yang berbeda. Posisi batang ditunjukkan dengan tanda (*) dan kodon ditunjukkan dengan garis bawah.
6
A.
A.
A.
B.
B.
B.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
D.
D.
D.
E.
E.
G.
G.
G.
I.
I.
L.
L.
L.
M.
M.
O.
P.
P.
P.
T.
T.
T.
X.
mississippiensis
sinensis
schmidti
constrictor
biporus
tridactylus
crocodylus
insculpta
mydas
niloticus
picta
reevesi
ruffus
warreni
semicarinatus
subplana
zarudnyi
egregius
subglobosa
acutus
gangeticus
pardalis
elongata
forstenii
dulcis
flavimaculatum
viridis
tornieri
emys
okinavensis
regius
sinensis
floridana
kleinmanni
graeca
tachydromoides
unicolor
CAAAATG
...G...
.G...A.
.....A.
.....A.
.....A.
...G...
....TAA
.....CA
.......
.....CA
......A
.....A.
.....A.
.....A.
......A
.....A.
....TA.
...GGCA
.....A.
.......
......A
......A
......A
.....A.
.....A.
.....A.
..G...A
.....CA
.....A.
.....A.
......A
.....A.
......A
......A
.....AA
.....A.
GCTT
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
AAGC
....
....
....
....
....
G...
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
..T.
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
TTCAG
.....
....A
...GA
C....
C....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
...GA
....A
C..GA
.....
.....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
.....
.C.G.
C....
CCT..
C....
.....
C..GA
C..GA
.....
.C..A
C....
C....
CCT..
...GA
CTGAA
.....
T....
TC...
....G
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
TC...
T...T
TC...
.....
.....
T....
.....
T....
.....
.....
.....
.....
.CAG.
.....
..AGG
.....
.....
TC...
TC...
.....
T..G.
.....
.C..G
..AGG
TC...
GCCCA
TT.AC
....C
ATTAC
.....
....T
AT...
.T.T.
.T...
.TTT.
.T.T.
.TA..
ATT..
.TTA.
ATTAC
A....
.TT.C
.TTAG
.....
.T.TT
.TTT.
.T.T.
.TT..
.TT..
AT.AC
.T...
...G.
.T...
.T...
ATTA.
.TTA.
A....
....C
.T..G
.T..G
.T.A.
ATTA.
CGGAC
..A..
AA.G.
ATA.T
G..G.
...G.
T...T
AA...
.....
TAA..
AA...
A....
TAA.T
TTA..
ATA.T
A..GT
A.A..
.TA..
A..G.
.A...
TAA..
A....
AA...
AA...
.CA.T
G.A..
AC...
AA...
A....
TTA.T
ATA..
A..GT
T..G.
AC...
AC...
.A...
.TA.T
CATTTTG
....C..
.T..CC.
.T.....
.T.....
.T.....
..CC...
T......
T......
.......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T......
.T.....
.T.....
TGCC...
.T.....
.......
T......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T...C..
T......
.T.....
.T.....
T......
.T.C...
T......
T......
TT.....
.T.....
Gambar 4 Urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia setelah menghilangkan semua bagian simpai
dan nukleotida pemisah, menyisakan 42 situs pada bagian batang.
7
27
C.insculpta
M.tornieri
29
T.kleinmanni
9
79
T.graeca
I.forstenii
5
67
I.elongata
22
C.reevesi
Kura-kura
G.pardalis
16
C.picta
2
C.mydas
21
37
M.emys
D.subplana
93
P.sinensis
25
E.subglobosa
2
C.casuarius
9
Archosauria
S.camelus
37
30
A.hastii
G.gallus
41
6
Burung
C.columbianus
43
56
13
C.aura
C.crocodylus
A.sinensis
A.mississippiensis
G.gangeticus
6
36
98
C.niloticus
54
B.tridactylus
26
Buaya
B.biporus
4
L.flavimaculatum
D.zarudnyi
G.acutus
3
71
45
36
6
E.egregius
C.warreni
P.regius
31
51
41
100
R.floridana
A.schmidti
14
Kadal dan Ular
D.semicarinatus
B.constrictor
X.unicolor
30
O.okinavensis
25
27
C.ruffus
T.tachydromoides
76
L.viridis
L.dulcis
M.musculus
Mamalia
R.norvegicus
Gambar 5 Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Maximum Parsimony
(MP) dengan bootstrap 100x.
8
35
C.insculpta
M.tornieri
30
T.kleinmanni
10
80
5
T.graeca
G.pardalis
C.picta
15
C.mydas
25
40
Kura-kura
M.emys
C.reevesi
35
I.forstenii
40
70
10
I.elongata
D.subplana
95
5
P.sinensis
A.mississippiensis
Archosauria
G.gangeticus
30
95
C.niloticus
Buaya
A.sinensis
C.crocodylus
20
E.subglobosa
60
C.casuarius
50
20
30
40
S.camelus
A.hastii
Burung
C.columbianus
5
G.gallus
30
50
C.aura
85
R.floridana
A.schmidti
30
B.tridactylus
15
35
B.biporus
G.acutus
10
L.flavimaculatum
40
D.zarudnyi
5
E.egregius
15
C.warreni
45
Kadal dan Ular
P.regius
50
C.ruffus
35
100
65
35
D.semicarinatus
B.constrictor
35
O.okinavensis
35
X.unicolor
T.tachydromoides
90
L.viridis
L.dulcis
M.musculus
Mamalia
R.norvegicus
Gambar 6 Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Neighbor Joining (NJ)
dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x. Pohon NJ digambarkan
secara rooted.
9
40
19
C.mydas
M.emys
4
C.picta
G.pardalis
2
C.reevesi
T.kleinmanni
36
6
90
T.graeca
56
C.insculpta
Kura-kura
M.tornieri
14
6
I.forstenii
64
I.elongata
D.subplana
2
98
P.sinensis
15
A.mississippiensis
A.sinensis
7
6
C.niloticus
92
Archosauria
Buaya
G.gangeticus
C.crocodylus
A.hastii
26
S.camelus
22
24
18
26
E.subglobosa
C.casuarius
Burung
G.gallus
9
C.aura
43
49
C.columbianus
L.flavimaculatum
24
B.biporus
6
64
B.tridactylus
D.zarudnyi
63
3
14
R.floridana
A.schmidti
38
G.acutus
E.egregius
12
C.warreni
22
C.ruffus
26
27
50
Kadal dan Ular
O.okinavensis
P.regius
100
X.unicolor
24
D.semicarinatus
18
73
B.constrictor
T.tachydromoides
70
L.viridis
L.dulcis
M.musculus
R.norvegicus
Gambar 7
Mamalia
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode
Maximum Parsimony (MP) dengan bootstrap 100x.
10
63
C.insculpta
M.tornieri
6
86
I.elongata
I.forstenii
C.reevesi
13
4
T.graeca
32
91
10
T.kleinmanni
Kura-kura
C.picta
15
20
G.pardalis
C.mydas
48
M.emys
D.subplana
6
96
P.sinensis
46
C.aura
53
G.gallus
17
Archosauria
C.columbianus
C.casuarius
19
14
26
15
Burung
S.camelus
E.subglobosa
A.hastii
26
C.crocodylus
9
A.mississippiensis
A.sinensis
7
C.niloticus
96
Buaya
G.gangeticus
L.flavimaculatum
28
B.biporus
6
70
B.tridactylus
D.zarudnyi
65
8
17
R.floridana
A.schmidti
G.acutus
E.egregius
17
C.warreni
45
P.regius
46
Kadal dan Ular
C.ruffus
53
O.okinavensis
40
X.unicolor
54
D.semicarinatus
51
92
B.constrictor
78
T.tachydromoides
L.viridis
L.dulcis
42
M.musculus
54
98
Gambar 8
R.norvegicus
Mamalia
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode
Neighbor Joining (NJ) dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x.
Pohon NJ digambarkan secara rooted.
11
Semua
pohon
filogenetik
dapat
memisahkan kura-kura D. subplana dan P.
sinensis yang tergabung dalam subordo
Pleurodira (kura-kura cangkang lunak) dari
spesies kura-kura lainnya yang merupakan
anggota subordo Cryptodira (kura-kura
cangkang keras). Namun beberapa spesies
buaya (C.crocodylus dan A. sinensis) dan
spesies kura-kura E. subglobosa cenderung
bergabung dalam percabangan spesies-spesies
burung. Ketidakstabilan juga terjadi dalam
kelompok kadal. Spesies-spesies A. schmidti,
B. biporus, B. tridactylus, D. zarudnyi, G.
acutus, dan R. floridana dari superfamili
Amphisbaenia cenderung bergabung, namun
terpisah dari T. tachydromoides yang juga
merupakan anggotanya.
Ketidakstabilan yang terjadi mungkin
disebabkan oleh analisis yang hanya
didasarkan pada satu gen saja. Cao et al
(1994) telah menunjukkan bahwa set data
yang besar, seperti serangkaian gen-gen yang
berurutan, memberikan hasil yang lebih kuat
dibandingkan dengan analisis yang didasarkan
pada gen tunggal. Gen tRNAVal merupakan
gen tunggal dengan urutan nt yang fungsional
dan dapat digunakan dalam analisis filogeni,
namun untuk memperoleh hasil yang lebih
optimal masih diperlukan analisis bersama
gen-gen lain.
Hal yang patut diperhatikan adalah posisi
kura-kura di dalam pohon filogenetik yang
dihasilkan. Kura-kura pada dasarnya adalah
reptilia anapsida yang dicirikan oleh tidak
adanya bukaan di belakang tulang orbit
tengkorak, sedangkan buaya termasuk ke
dalam reptilia diapsida yang memiliki dua
bukaan di belakang tulang orbit tengkorak
(Hickman et al 2000), begitu juga dengan
burung. Topologi sister group kura-kura,
buaya
dan
burung
menyiratkan
kecenderungan diapsida dari kura-kura dan
afinitasnya terhadap kelompok diapsida
archosauria. Penelitian-penelitian terdahulu
juga sudah mengungkapkan afinitas kura-kura
terhadap reptilia diapsida (Zardoya dan Meyer
1998), terutama Archosauria (Kumazawa dan
Nishida 1999, Iwabe et al 2005).
Kecenderungan kura-kura kepada reptilia
diapsida membuat pengelompokan lineage
amniota (anapsida, diapsida, sinapsida)
menjadi rancu. Hal ini disebabkan oleh
reptilia yang tidak memiliki lubang di
belakang orbit tengkorak (anapsida) dan
reptilia yang memiliki dua lubang di belakang
orbit tengkorak (diapsida) memiliki hubungan
yang lebih dekat daripada spesies-spesies
yang memiliki satu lubang di belakang orbit
tengkorak (sinapsida). Dengan demikian perlu
dipertimbangkan
kemungkinan
bahwa
karakter anapsida merupakan ciri sekunder
dari diapsida. Selanjutnya perlu dikaji apakah
pengelompokan anapsida, diapsida dan
sinapsida masih relevan untuk digunakan.
KESIMPULAN
Gen tRNAVal mt reptilia yang terletak di
antara gen 12S rRNA dan 16S rRNA tidak
memiliki penataan ulang maupun pseudogen.
Ukuran gen ini berkisar antara 63 hingga 73 nt
dengan variasi pada jumlah nukleotida di
posisi simpai D dan simpai T. Asimetri basa
nukleotida terjadi dengan rataan komposisi
A+T 57.7% dan G+C 42.3%.
Urutan nukleotida gen tRNAVal mt dapat
digunakan dalam analisis filogenetik, namun
perlu didukung oleh gen-gen lain untuk
memperoleh hasil yang lebih baik. Analisis
berdasarkan gen tRNAVal mt mendukung
pandangan sistematik penggabungan burung
dan buaya dalam klad Archosauria. Selain itu
juga mendukung afinitas kura-kura terhadap
diapsida, terutama Archosauria.
SARAN
Dalam analisis filogenetik terhadap
spesies-spesies yang berkerabat dekat
menggunakan pendekatan gen tRNA mt, perlu
dipertimbangkan
penggunaan
urutan
nukleotida tRNA tanpa simpai D dan T, selain
urutan nukleotida tRNA yang terbatas pada
bagian batang. Diperlukan penelitian dengan
set data yang lebih besar untuk lebih
memastikan keefektifannya.
12
DAFTAR PUSTAKA
Beagly CT, Okimoto R, Wolstenholme DR.
1999. Mytilus mitochondrial DNA
contains a functional gene for a
tRNASer(UCN) with a dihydrouridine armreplacement loop and a pseudotRNASer(UCN) gene. Genetics 152:641-652.
Cao Y, Adachi A, Janke A, Paabo S,
Hasegawa M. 1994. Phylogenetic
relationships among eutherian orders
estimated from inferred protein sequnces
of mitochondrial proteins: instability of a
tree based on a single gene. J Mol Evol
39:519-527.
Hickman CP Jr, Roberts LS, Larson A. 2000.
Integrated Principles of Zoology. Boston:
McGraw-Hill.
Hedges SB. 1994. Molecular evidence for the
origin of birds. Proc Natl Acad Sci USA
91:2621-2624.
Iwabe et al. 2005. Sister group relationship of
turtles to the bird-crocodilian clade
revealed by nuclear DNA-coded proteins.
Mol Biol Evol 22(4):810-813.
Janke A, Arnason U. 1997. The complete
mitochondrial genome of Alligator
mississippiensis and the separation
between recent Archosauria (birds and
crocodiles). Mol Biol Evol 14:1266-1272.
Kumar S, Tamura K, Nei M. 2004. MEGA 3:
Integrated software for molecular
evolutionary genetics analysis and
sequence
alignment.
Briefings
in
Bioinformatics 5:150-163.
Kumazawa Y, Nishida M. 1993. Sequence
evolution of mitochondrial tRNA genes
and deep-branch animal phylogenetics. J
Mol Evol 37:380-389.
Kumazawa Y, Nishida M. 1995. Variations in
mitochondrial tRNA gene organization of
reptiles as phylogenetic markers. Mol
Biol Evol 12(5):759-772.
Kumazawa Y. Nishida M. 1999. Complete
mitochondrial DNA sequences of the
green turtle and blue-tailed mole skink:
statistical evidence for archosaurian
affinity of turtles. Mol Biol Evol
16(6):784-792.
Kumazawa Y, Ota H, Nishida M, Ozawa T.
1996. Gene rearrangements in snake
mitochondrial genomes: highly concerted
evolution
of
control-region-like
sequences duplicate and inserted into a
tRNA gene cluster. Mol Biol Evol
13(9):1242-1254.
Lynch M. 1997. Mutation accumulation in
nuclear, organelle, and prokaryotic
transfer RNA genes. Mol Biol Evol
14(9):914-925.
Ojala D, Montoya J, Attardi G. 1981. tRNA
punctuation model of RNA processing in
human mitochondria. Nature 290:470474.
Parharn JF, Feldman CR, Boore JL. 2006. The
complete mitochondrial genome of the
enigmatic
bigheaded
turtle
(Plastyternon): description of unusual
genomic features and the reconciliation of
phylogenetic hypotheses based on
mitochondrial and nuclear DNA. BMC
Evolutionary Biology 6(11). [terhubung
berkala]. http://www.biomedcentral.com/
147-2148/6/11 [4 Mei 2007].
Pereira SL. 2000. Mitochondrial genome
organization
and
vertebrate
phylogenetics. Genetics and Molecular
Biology 23(4):742-752.
Puspa CS. 2005. Posisi filogenetik kura-kura
Carettochelys
insculpta
(Reptilia:
Testudinata) [Skripsi]. Bogor: Institut
Pertanian Bogor.
Saccone C, De Giorgi C, Gissi C, Pesole G,
Reyes A. 1999. Evolutionary genomics in
Metazoa: the mitochondrial DNA as a
model system. Gene 238:195-209.
Sakurai M, Ohtsuki T. Watanabe K. 2005.
Modification at position 9 with 1methyladenosine is crucial for structure
and function of nematode mitochondrial
tRNAs lacking the entire T-arm. Nucleic
Acids Res 33:1653-1661.
Springer MS et al. 2001. Mitochondrial versus
nuclear gene sequences in deep-level
mammalian phylogeny rescontruction.
Mol Biol Evol 18:132-143.
Sprinzl M, Horn C, Brown M, Ioudovitch A,
Steinberg S. 1997. Compilation of tRNA
sequences and sequences of tRNA genes.
Nucleic Acids Res 26:148-153
Wolstenholme DR, MacFarlane JL, Okimoto
R, Clary DO, Wahlethner JA. 1987.
Bizarre tRNAs inferred from DNA
sequences of mitochondrial genomes of
nematode worms. Proc Natl Acad Sci
USA 84:1324-1328.
Zardoya R. Meyer A. 1998. Complete
mitochondrial genome suggests diapsid
affinities of turtles. Proc Natl Acad Sci
USA 95:14226-14231.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Daftar singkatan kode asam amino
Singkatan satu huruf
Singkatan tiga huruf
Asam amino
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L1
L2
M
N
P
Q
R
S1
S2
T
V
W
Y
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu(CUN)
Leu(UUR)
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser(AGN)
Ser(UCN)
Thr
Val
Trp
Tyr
Alanin
Sistein
Aspartat
Glutamat
Fenilalanin
Glisin
Histidin
Isoleusin
Lisin
Leusin (CUN)
Leusin (UUR)
Metionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Arginin
Serin (AGN)
Serin (UCN)
Treonin
Valin
Triptofan
Tirosin
Keterangan: asam amino leusin dan serin masing-masing memiliki dua isoakseptor yang
dibedakan berdasarkan kodonnya.
15
Lampiran 2 Genom mt hewan yang digunakan dalam analisis dan kode aksesnya pada Genbank
Kelompok
REPTILIA
Anapsida
Archosauria
AVES
Lepidosauria
Neognatha
MAMALIA
Paleognatha
Nama Spesies
Kode Akses Genbank
Carettochelys insculpta
Chelonia mydas
Chrysemys picta
Chinemys reevesi
Dogania subplana
Emydura subglobosa
Geochelone pardalis
Indotestudo elongata
Indotestudo forstenii
Malacochresus tornieri
Manouria emys
Pelodiscus sinensis
Testudo graeca
Testudo kleinmanni
Alligator mississippiensis
Alligator sinensis
Caiman crocodylus
Crocodylus niloticus
Gavialis gangeticus
Amphisbaena schmidti
Bipes biporus
Bipes tridactylus
Boa constrictor
Cordylus warreni
Cylindrophis ruffus
Dinodon semicarinatus
Diplometopon zarudnyi
Eumeces egregius
Geocalamus acutus
Lacerta viridis
Lepidophyma flavimaculatum
Leptotyphlops dulcis
Ovopis okinavensis
Phyton regius
Rhineura floridana
Takydromus tachydromoides
Xenopeltis unicolor
Cathartes aura
Cygnus columbianus
Gallus gallus
Apteryx hastii
Casuarius casuarius
Struthio camelus
(*)
AB012104
AF069423
AY676201
AF366350
(*)
DQ080041
DQ656607
DQ080044
DQ080042
DQ080040
AY962573
DQ080050
DQ080048
AF069428
AF511507
AJ404872
AJ810452
AB079596
AY605475
AY605480
AY605477
AB177354
AB079613
AB179619
AB008539
AY605474
AB016606
AB162909
AM176577
AB162908
AB079242
AB175670
AB177878
AY605473
AB080237
AB179620
AY463690
DQ083161
AB086102
AF338708
AF338713
AF338715
Rattus norvegicus
AJ428514
Mus musculus domesticus
AB042432
Rodentia
* Data C. insculpta (Puspa 2005) dan E. subglobosa (tidak dipublikasikan) merupakan urutan
nukleotida parsial pada ruas gen 12S rRNA sampai 16S rRNA milik Laboratorium Zoologi,
Departemen Biologi, FMIPA IPB.
16
Lampiran 3 Komposisi basa pada bagian batang, jumlah nukleotida pada simpai D dan simpai T,
serta jumlah nukleotida total dari urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia
Nama Spesies
Carettochelys insculpta
Chelonia mydas
Chrysemys picta
Chinemys reevesi
Dogania subplana
Emydura subglobosa
Geochelone pardalis
Indotestudo elongata
Indotestudo forstenii
Malacochresus tornieri
Manouria emys
Pelodiscus sinensis
Testudo graeca
Testudo kleinmanni
Alligator mississippiensis
Alligator sinensis
Caiman crocodylus
Crocodylus niloticus
Gavialis gangeticus
Amphisbaena schmidti
Bipes biporus
Bipes tridactylus
Boa constrictor
Cordylus warreni
Cylindrophis ruffus
Dinodon semicarinatus
Diplometopon zarudnyi
Eumeces egregius
Geocalamus acutus
Lacerta viridis
Lepidophyma flavimaculatum
Leptotyphlops dulcis
Ovopis okinavensis
Phyton regius
Rhineura floridana
Takydromus tachydromoides
Xenopeltis unicolor
Rataan
Komposisi basa (%)
pada bagian batang
T
C
A
G
28.6
26.2
28.6
28.6
28.6
19.0
31.0
31.0
31.0
23.8
26.2
28.6
23.8
26.2
23.8
26.2
26.2
35.7
35.7
21.4
28.0
21.4
33.3
38.1
33.3
31.0
28.6
35.7
33.3
21.4
23.8
23.8
33.3
28.6
23.8
26.2
33.3
27.1
19.0
23.8
19.0
16.7
19.0
31.0
16.7
16.7
16.7
23.8
21.4
19.0
26.2
23.8
26.2
26.2
23.8
16.7
16.7
28.6
21.4
26.2
16.7
14.3
16.7
19.0
21.4
16.7
19.0
26.2
23.8
28.6
16.7
19.0
28.6
21.4
16.7
22.2
35.7
31.0
35.7
35.7
33.3
23.8
33.3
35.7
35.7
33.3
33.3
33.3
28.6
31.0
28.6
28.6
26.2
31.0
31.0
28.6
31.6
23.8
35.7
33.3
35.7
35.7
31.0
28.6
28.6
28.6
31.0
31.0
35.7
35.7
23.8
33.3
35.7
30.6
16.7
19.0
16.7
19.0
19.0
26.2
19.0
16.7
16.7
19.0
19.0
19.0
21.4
19.0
21.4
19.0
23.8
16.7
16.7
21.4
19.0
28.6
14.3
14.3
14.3
14.3
19.0
19.0
19.0
23.8
21.4
16.7
14.3
16.7
23.8
19.0
14.3
20.1
Jumlah nukleotida
pada simpai
D
T
7
6
6
6
6
6
7
8
8
8
6
6
8
9
7
5
7
6
6
6
4
3
5
7
6
6
3
6
3
4
5
6
6
7
7
4
6
6.00
6
6
6
7
7
6
7
7
7
7
7
7
5
5
4
3
4
6
6
5
4
4
3
6
2
1
7
7
3
4
2
2
2
1
9
6
3
4.97
Jumlah
nukleotida
total
70
69
69
70
70
69
71
72
72
72
70
70
70
71
68
65
68
69
69
68
65
64
65
70
65
64
67
70
63
65
64
65
65
65
73
67
66
67.97
17
Lampiran 4 Rasio ts/tv dan jarak genetik reptilia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
SEQUENCE
1
1 A.mississippiensis
2
3
4
5
6
14
15
16
17
19
20
21
24
25
26
27
29
30
32
33
34
35
36
1.33
1
1.5
0.67
∞
6
∞
6
6
1.5
5.5
1.2
1.67
5
0.75
1
2
1.3
6
4
5
5
1.8
1
1.2
4
7
2.75
1.6
5
2.33
2.5
3.5
3.33
2.25
1.8
9
5.5
8
3.5
3.67
2.5
2
3.33
2.5
5.5
1.4
6
3.3
∞
1.6
3.25
8
2
3.67
3.33
3.33
5
11
4
3.33
3.33
3
3.33
3.33
7
2.5
3
5
2.75
1.6
1.75
2.33
1.75
2
1.25
1.75
1
2
1
1.8
2
0.6
0.67
2.4
1.5
1.25
1.25
1.75
1.75
2
0.5
1.83
1.5
1.75
2
1.33
2
2.75
1.2
1.6
3
1.6
4.33
0.5
3.33
4
2
2
4.5
2.33
13
1.75
4
3.5
7
2
2.67
3.5
2
4
4.5
4.5
3
∞
3
3.5
4.5
2.67
5
3.5
3.5
2.33
2.33
4.5
4
4
1.67
2.2
1.67
0.71
2
1.5
0
1.33
∞
2
3
1.67
2.83
2.67
0.71
2
4.5
4.5
7
3
17
2
2.6
0.5
3
2
3.67
3
3
5.33
0
3.33
1.5
1.67
2
1.75
1
13
2
3.67
1.25
6
1.5
1.2
∞
2
1.5
1.75
1.75
6
1.5
1.5
1.25
1.75
3.67
2
1.25
∞
0.8
1.2
5
3.67
11
∞
10
11
4
5.5
2
1.8
8
2
2.2
2.2
3.33
10
9
10
10
2.2
2.67
2.6
9
12
2.75
2.6
8
3.67
5
6
5.33
2.75
4
2.5
∞
3
4
1.17
2
∞
2.33
1.17
10
1
2.5
∞
∞
∞
1.83
3
2
∞
∞
2
2
∞
3
2
4
1.25
2.2
8
2
0.5
6
1.4
1.83
5
1
1.2
4
1.67
8
2
3
3
2
1.33
4.5
0
5
3
1.8
5
3.33
1.5
2.5
2.33
2.5
2.5
1.67
2
0.33
0.86
5
0.4
0.5
5
1
∞
2.5
2
2
1.22
1
1.5
3.5
4
1.2
0.67
5
2.75
2.33
3
2.75
1.2
3
3.67
1
2.2
∞
2
1
10
0.75
2.5
∞
∞
∞
1.67
3.5
2.25
∞
∞
2.2
2.25
∞
2.75
4
6
1.5
2
2.5
0.71
1.67
4
0.75
0.71
4.5
1
1.67
1
1
1
1.43
1.67
1.8
1
4
1.67
1.6
4
1.8
1
2
1.4
1.5
0.5
0.33
3 A.sinensis
0.19
0.46
4 B.biporus
0.16
0.31
0.41
5 B.constrictor
0.51
0.45
0.41
1.17
0.62
6 B.tridactylus
0.13
0.27
0.33
0.08
0.55
7 C.crocodylus
0.24
0.77
0.3
0.44
0.57
8 C.insculpta
9 C.mydas
0.44
0.2
0.49
0.33
0.3
0.58
0.29
0.41
0.11
0.48
0.26
0.26
0.57
0.22
0.32
8
9
PENYANDI tRNA VALIN (tRNAVal) PADA REPTILIA
NINA RANTI HERMAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
NINA RANTI HERMAN. Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria Penyandi Gen
tRNA Valin (tRNAVal) pada Reptilia. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan BERRY
JULIANDI.
Urutan nukleotida beberapa gen tRNAVal diekstrak dari genom lengkap mitokondria reptilia
yang diambil dari GenBank serta dua genom parsial mitokondria milik Laboratorium Zoologi,
Institut Pertanian Bogor. Urutan nukleotida gen tRNAVal yang diperoleh kemudian dijajarkan
berdasarkan struktur sekundernya. Gen ini terletak tepat di antara gen 12S rRNA dan 16S rRNA
tanpa adanya penataan ulang posisi maupun pseudogen. Komposisi nukleotida didominasi oleh
basa A dan T. Mutasi yang terjadi pada bagian batang kebanyakan adalah substitusi transisi. Gen
ini dapat digunakan dalam analisis filogenetik namun menghasilkan struktur pohon yang kurang
stabil. Selain urutan nukleotida pada bagian batang tRNA, nukleotida pada bagian lainnya (kecuali
bagian simpai D dan T) dapat diikutsertakan di dalam analisis. Pohon filogeni yang dihasilkan
mendukung formasi burung dan crocodilia dalam klad Archosauria, dan juga kecenderungan kurakura terhadap diapsida terutama Archosauria.
ABSTRACT
NINA RANTI HERMAN. Characterization of Mitochondrial DNA Sequence Encoding the tRNA
Valin (tRNAVal) Gene in Reptilia. Under the direction of ACHMAD FARAJALLAH dan BERRY
JULIANDI.
We extracted tRNAVal gene sequences of some reptilians from complete mitochondrial
genome sequences deposited in GenBank and from two partial mitochondrial genome sequences
property of Laboratory of Zoology, Bogor Agricultural University. These mitochondrial tRNAVal
gene sequences were then aligned by virtue of their secondary structure. The gene itself was
located exactly between 12S rRNA and 16S rRNA genes without any rearrangements or
pseudogenes being observed. Nucleotide composition was dominated by A and T bases. Mutations
occurred in the stem region of the sequences were mostly transition kind of substitusion. This gene
was applicable in phylogenetic analysis but resulting less stabile trees. Besides the nucleotide
sequences of the stem region of tRNA, nucleotides in the other parts (except loops D and T) could
also be assigned in the analysis. The inferred trees supported the bird-crocodilian formation of
Archosaurian clade, and also the diapsid affinity of turtles namely to Archosauria.
KARAKTERISASI URUTAN NUKLEOTIDA DNA MITOKONDRIA
PENYANDI tRNA VALIN (tRNAVal) PADA REPTILIA
NINA RANTI HERMAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi
Nama
NRP
: Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria Penyandi
tRNA Valin (tRNAVal) pada Reptilia
: Nina Ranti Herman
: G04400051
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
NIP 131878947
Berry Juliandi, M.Si
NI 3010100093
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
Tanggal lulus: 18 Desember 2007
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat, karunia dan petunjuk-Nya
sehingga karya ilmiah ini dapat terselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah
analisis urutan nukleotida, dengan judul Karakterisasi Urutan Nukleotida DNA Mitokondria
Penyandi tRNA Valin (tRNAVal) pada Reptilia
Penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan
bapak Berry Juliandi, M.Si atas kepercayaan dan kesabarannya dalam membimbing penulis. Di
samping itu, penghargaan setingginya penulis sampaikan kepada keluarga tercinta; mami dan papi
atas kasih sayang dan doa yang tak pernah putus, serta adik-adik terkasih Rika dan Rudy yang
selalu menghadirkan keceriaan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada para sahabat
penulis: Tanty Indira atas kebersamaannya, Fitria Y. Bahri, S.Si atas motivasinya, D. Kurniawati,
S.Si dan Puji Rianti, S.Si atas inspirasinya, serta rekan-rekan Biopi 37 dan teman-teman TM3 atas
perhatian dan dorongan semangatnya. Penulis juga berterima kasih kepada keluarga besar
Laboratorium Zoologi atas dukungannya.
Karya ini tentu masih jauh dari sempurna. Namun penulis mengharapkan tulisan ini dapat
bermanfaat.
Bogor, November 2007
Nina Ranti Herman
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada 7 Januari 1983 dari pasangan Ir. Herman Sjafei dan Netri
Karmela. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara.
Setelah lulus dari SMU Islam Al-Azhar 1 Jakarta, penulis melanjutkan studinya di Institut
Pertanian Bogor, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi pada
tahun 2000 melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis pernah berpartisipasi
sebagai anggota Tim Soal Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB) dalam rangkaian kegiatan Biologi
Interaktif (Bio-In) tahun 2001. Pada tahun 2003 penulis melaksanakan praktik lapang di
Laboratorium Mikrobiologi Rumah Sakit Pusat Pertamina (RSPP) Jakarta dengan judul Analisis
Sperma dalam Kasus Infertilitas Pria.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………………………….
vii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………………..
vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ……………………………………………………………………….
1
Tujuan Penelitian ……………………………………………………………………..
2
Waktu dan Tempat …………………………………………………………………...
2
BAHAN DAN METODE
Data Urutan Nukleotida ………………………………………………………………
2
Penjajaran (Alignment) Urutan Nukleotida …………………………………………..
2
Analisis Urutan Nukleotida dan Analisis Filogenetik ………………………………..
2
HASIL
Analisis Urutan Nukleotida …………………………………………………………..
2
Analisis filogenetik …………………………………………………………………...
3
PEMBAHASAN ……………………………………………………………………………
3
KESIMPULAN ...…………………………………………………………………………...
11
SARAN ……………………………………………………………………………………..
11
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………………………
12
LAMPIRAN ………………………………………………………………………………...
13
`
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Skema organisasi genom mitokondria vertebrata secara umum ……………………….....
1
2
Struktur sekunder standar untuk tRNA (kecuali dua isoakseptor serin) …………………………….
2
3
Val
Penjajaran urutan nukleotida gen tRNA
mt menggunakan kriteria seperti yang
dipaparkan di dalam naskah …............................................................................................
4
Urutan nukleotida gen tRNA
Val
mt reptilia setelah menghilangkan semua bagian simpai
dan nukleotida pemisah, menyisakan 42 situs pada bagian batang .....................................
5
5
6
Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Maximum Parsimony (MP)
dengan bootstrap 100x ........................................................................................................
6
7
Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Neighbor Joining (NJ)
dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x ...................................................
7
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
8
Val
tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode Maximum
Parsimony (MP) dengan bootstrap 100x .............................................................................
8
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
9
Val
tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode Neighbor Joining
(NJ) dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x ...........................................
10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Daftar singkatan kode asam amino ………………………………………………………...
14
2
Genom mt hewan yang digunakan dalam analisis dan kode aksesnya pada Genbank .........
15
3
Komposisi basa pada bagian batang, jumlah nukleotida pada simpai D dan simpai T, serta
jumlah nukleotida total dari urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia …………………...
4
Rasio ts/tv dan jarak genetik reptilia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
Val
mt pada
bagian batang (42 basa) .........................................................................................................
5
16
17
Rasio ts/tv dan jarak genetik reptilia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal mt tanpa
simpai D dan T (57 basa) ......................................................................................................
18
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
DNA mitokondria (mtDNA) vertebrata
merupakan genom sirkular utas ganda.
Genom ini menyandikan 13 protein subunit
penyusun enzim-enzim fosforilasi oksidatif
yang berfungsi dalam respirasi selular, dan 2
RNA ribosom (rRNA) serta 22 tRNA yang
diperlukan dalam proses translasi protein
mitokondria (mt). Terdapat pula ruas bukan
penyandi (non-coding region) yang pada
beberapa hewan berfungsi dalam pengaturan
replikasi dan transkripsi (control region).
Gen-gen mt tersebar pada kedua utas DNA,
namun ada juga mtDNA yang seluruh
gennya ditranskripsikan hanya dari satu utas
DNA
Setiap utas DNA ditranskripsikan
sebagai sebuah polisistron. Pada vertebrata,
gen-gen tRNA pada mtDNA merupakan
sinyal untuk pemrosesan polisistron
pascatranskripsi (Ojala et al 1981). Gen-gen
tRNA dalam mitokondria terletak menyebar
di antara gen-gen penyandi protein. Urutan
nukleotida
(nt)
gen-gen
tRNA
memungkinkannya
untuk
membentuk
struktur sekunder yang melipat-lipat. Pada
sebuah polisistron pascatranskripsi, enzim
restriksi akan memotong tRNA dengan
mengenali situs-situs lipatan struktur
sekundernya, dan pada akhirnya memecah
polisistron menjadi pesan-pesan yang
spesifik gen.
Penelitian molekuler telah umum
menggunakan mtDNA dalam analisis
filogenetik. Beberapa karakteristik mtDNA
yang menguntungkan di antaranya adalah
ukuran yang relatif kecil (15-19 kb), susunan
gen yang kompak hampir tanpa intron, dan
sifat pewarisan maternal. Hasil penelitian
Kumazawa
dan
Nishida
(1993)
menyimpulkan bahwa gen-gen tRNA pada
mtDNA dapat digunakan untuk menentukan
filogeni hewan pada percabangan dalam
(deep-branch) yaitu percabangan yang
terjadi 20-600 juta tahun yang lalu. Namun
Springer et al (2001) mengemukakan bahwa
ekson-ekson tertentu pada genom inti
memiliki kinerja yang lebih baik untuk
penentuan cabang dalam pada mamalia
dibandingkan gen-gen pada mtDNA.
Berdasarkan klasifikasi tradisional,
kelas Reptilia terdiri atas ordo Crocodilia
(buaya), Squamata (kadal dan ular),
Sphenodonta/Rhynchocephalia (tuatara), dan
Testudinata
(kura-kura).
Kesemuanya
termasuk ke dalam kelompok amniota
bersama kelas Aves dan Mamalia. Reptilia
modern merupakan gabungan dua jalur
(lineage) dari tiga jalur vertrebrata amniota;
anapsida yang diwakili oleh kelompok kurakura, dan diapsida yang diwakili oleh buaya,
kadal, ular, dan tuatara. Namun kelas Reptilia
mengecualikan burung, yang juga merupakan
keturunan dari leluhur bersama diapsida. Oleh
karena itu reptilia adalah kelompok yang
parafiletik
sehingga
tidak
memenuhi
persyaratan kladistik dan tidak lagi dianggap
sebagai takson yang valid dalam klasifikasi
tradisional (Hickman et al 2000).
Gambar 1
Skema organisasi genom mitokondria
vertebrata secara umum. Gen tRNA
ditampilkan dengan singkatan 3 huruf
untuk asam amino (lihat Lampiran 1).
Gen penyandi protein ditampilkan
sebagai berikut: Cyt b – sitokrom b; CO
I-III – sitokrom oksidase subunit I-III;
ND1-6 – NADH reduktase subunit 1-6
(gambar dari Pereira 2000).
Beberapa ciri morfologi dan pendekatan
molekuler menyiratkan bahwa burung dan
crocodilia merupakan keturunan dari leluhur
yang sama (common ancestor). Dengan kata
lain, burung dan crocodilia termasuk ke dalam
satu kelompok yang monofiletik sehingga harus
ditempatkan pada grup yang terpisah dari
reptilia lainnya. Masalah ini memunculkan
suatu pandangan sistematik terhadap kelompok
reptilia, yang menempatkan burung dan
crocodilia dalam satu klad: Archosauria
(Hickman et al 2000). Analisis berdasarkan
urutan nukleotida gen-gen mt dan gen penyandi
protein inti mendukung pandangan sistematik
Archosauria
ini
(Hedges
1994),
dikonfirmasikan pula oleh Kumazawa dan
Nishida (1995) yang melakukan analisis
2
berdasarkan gen-gen tRNA mt, dan oleh
Janke dan Arnason (1997) yang melakukan
analisis berdasarkan gen-gen penyandi
protein mt.
nukleotida pemisah. Di antara batang AC dan
batang T terdapat satu simpai tambahan
(variabel). Nukleotida pada urutan paling akhir
adalah satu nukleotida diskriminator.
Tujuan Penelitian
Penelitian
ini
dilakukan
untuk
mengetahui variasi basa nukleotida gen
penyandi tRNA Valin (tRNAVal) dalam
mtDNA. Selain itu, keefektifan gen tRNAVal
dalam
penentuan
posisi
filogenetik
kelompok reptilia juga dieksplorasi.
Analisis Urutan Nukleotida dan Analisis
Filogenetik
Seluruh
analisis
dilaksanakan
menggunakan program MEGA 3.1 (Kumar et al
2004). Komposisi nukleotida ditentukan
berdasarkan urutan nukleotida pada bagian
batang gen tRNAVal mt. Perhitungan jarak
genetik
dilakukan
berdasarkan
urutan
nukleotida pada bagian batang gen tRNAVal mt.
Selain itu perhitungan jarak genetik juga
dilakukan berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal mt tanpa simpai D dan T. Konstruksi
pohon filogenetik dilakukan menggunakan
metode Maximum Parsimony (MP) dan
Neighbor Joining (NJ) dengan kriteria Kimura2-Parameter dan bootstrap 100x. Digunakan
pula beberapa spesies burung dan mamalia
sebagai pembanding (lihat Lampiran 2 untuk
rincian data).
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Januari hingga Juli 2007, bertempat di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
BAHAN DAN METODE
Data Urutan Nukleotida
Data yang digunakan adalah urutan
lengkap mtDNA dari beberapa spesies
reptilia yang diambil dari GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) serta dua data
urutan mtDNA parsial milik Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB
(lihat Lampiran 2 untuk rincian data). Dari
data GenBank dipilih urutan nukleotida
tRNAVal berdasarkan informasi yang
terdapat pada masing-masing entri. Data
urutan nukleotida milik Laboratorium
Zoologi FMIPA IPB dijajarkan dengan salah
satu data urutan nukleotida gen tRNAVal mt
yang telah diketahui kemudian ruas yang
sejajar dipotong. Semua urutan nukleotida
gen tRNAVal mt yang diperoleh selanjutnya
digunakan dalam analisis.
Penjajaran
(Alignment)
Urutan
Nukleotida
Semua data urutan nukleotida tRNAVal
mt dijajarkan secara manual dengan mata
berdasarkan kemampuannya membentuk
struktur sekunder berupa lengan-lengan
yang terdiri atas batang dan simpai (Gambar
2). Batang AA (asam amino) tidak memiliki
simpai, berfungsi untuk membawa asam
amino. Batang D (dihidrouridin) memiliki
satu simpai. Batang AC (antikodon)
memiliki satu simpai yang di dalamnya
terdapat urutan nukleotida antikodon.
Batang T (TψC) memiliki satu simpai. Di
antara batang AA dan batang D serta antara
batang D dan AC terdapat beberapa
Gambar 2 Struktur sekunder standar untuk tRNA
(kecuali
dua
isoakseptor
serin).
Nukleotida conserved ditunjukkan oleh
R (purin), Y (pirimidin), dan V
(nonuridin: A, G, atau C). Digambar
kembali dari Kumazawa dan Nishida
(1993). Sistem penomoran berdasarkan
Sprinzl et al (1997).
HASIL
Analisis urutan nukleotida
Data urutan nukleotida mt reptilia yang
diambil dari GenBank (Lampiran 2) meliputi 35
spesies
yang
telah
diketahui
posisi
filogenetiknya. Ukuran genom mt yang
3
diperoleh berkisar antara 15000 hingga
19000 bp. Data urutan nukleotida mtDNA
parsial reptilia milik Laboratorium Zoologi,
Departemen Biologi, FMIPA IPB berukuran
1330 dan 886 bp.
Semua gen tRNAVal mt yang
teridentifikasi terletak di antara gen
penyandi 12S rRNA dan 16S rRNA, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 1. Tidak
tercatat adanya penataan ulang posisi
maupun kehadiran pseudogen tRNAVal mt.
Rataan komposisi nukleotida gen
tRNAVal mt terdiri atas 57.7% A+T dan
42.3% G+C (Lampiran 3). Jumlah
nukleotida penyusun tRNAVal mt berkisar
antara 63 hingga 73 nt dengan rataan 67.97.
Terdapat 7 bp pada batang AA, 4 bp pada
batang D, masing-masing 5 bp pada batang
AC dan T, 1 nt pemisah antara batang AA
dan batang D, 2 nt pemisah antara batang D
dan AC, dan 4 nt pada simpai variabel.
Jumlah nt pada simpai D dan simpai T
sangat bervariasi. Rataan jumlah nukleotida
pada simpai D dan T adalah 6.0 dan 4.97
(Lampiran 3).
Analisis Filogenetik
Jarak genetik dihitung menggunakan
pilihan Distance – Compute Pairwise pada
program MEGA 3.1 (Lampiran 4).
Berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal
mt pada bagian batang, rataan jarak genetik
yang diperoleh adalah 0.37. Jarak genetik
terkecil adalah 0.00 yang terjadi di antara
tiga pasangan spesies yaitu D. subplana – P.
sinensis, I. elongata – I. forstenii, dan
G.gangeticus – C. niloticus, sedangkan jarak
genetik terbesar adalah 1.97 yang terjadi di
antara pasangan spesies L. dulcis – E.
subglobosa. Berdasarkan urutan nukleotida
gen tRNAVal mt tanpa simpai D dan T
(lampiran 5), rataan jarak genetik yang
diperoleh adalah 0.32. Jarak genetik terkecil
adalah 0.00 yang terjadi di antara pasangan
spesies I. elongata – I. forstenii, sedangkan
jarak genetik terbesar adalah 1.01 yang
terjadi di antara pasangan spesies B.
constrictor – E. subglobosa.
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal
mt pada bagian batang (42 basa) dengan
metode MP dan NJ (Gambar 5 dan 6) serta
berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal
tanpa simpai D dan T (57 basa) dengan
metode MP dan NJ (Gambar 7 dan 8).
Semua pohon yang dihasilkan memiliki
topologi yang mirip; spesies-spesies buaya,
kura-kura dan burung membentuk satu
kelompok yang terpisah dari spesies-spesies
kadal dan ular sedangkan spesies-spesies
mamalia berada di luar sebagai outgroup.
PEMBAHASAN
Gen tRNAVal mt selalu ditemukan sebagai
gen tunggal yang tidak membentuk kumpulan
(cluster) dengan gen-gen tRNA lainnya.
Kumpulan-kumpulan gen tRNA yang telah
diketahui adalah IQM, WANCY, dan HSL
(lihat Lampiran 1 untuk huruf singkatan asam
amino). Posisi gen tRNAVal pada genom
mitokondria adalah di antara gen 12S rRNA dan
16S rRNA, daerah yang memiliki tingkat
keterpeliharaan (conservation rate) yang tinggi
(Saccone et al 1999), dan tidak ditemukan
adanya penataan ulang. Penataan ulang posisi
gen dalam genom dapat menjadi karakter yang
spesifik pada suatu takson. Beberapa penataan
ulang posisi gen di antaranya adalah kumpulan
gen tRNA HSL yang umum terdapat pada
vertebrata mengalami penataan menjadi SHL
pada Crocodilia, dan transposisi gen tRNA
glutamin ke kumpulan gen tRNA lainnya
(IQM-WANCY → IM-WQANCY) pada
spesies ular blindsnake (Kumazawa & Nishida
1995). Selain itu telah ditemukan pula penataan
letak gen pada Plastyternon megacephalum
[Testudinata] berupa transposisi gen protein
ND5 dan lima gen tRNA (H, S, L, T, P) yang
menyisip di antara gen tRNA I dan Q pada
kumpulan gen IQM (Parharn et al 2006).
Ketiadaan penataan ulang gen tRNAVal
kemungkinan disebabkan oleh posisinya di
dalam genom mt. Gen tRNAVal terletak di
antara gen 12S rRNA dan 16S rRNA.
Hilangnya gen tRNAVal dari posisi tersebut
karena mengalami penataan ulang ke posisi lain
akan
mengakibatkan
rusaknya
urutan
nukleotida kedua gen rRNA sehingga proses
translasi protein tidak dapat berjalan. Dengan
kata lain sel akan mengalami kematian.
Tidak ditemukan pseudogen tRNAVal dalam
mtDNA, baik yang berupa duplikasi gen utuh
ataupun sebagian. Kumazawa et al (1996)
menemukan
adanya
pseudogen
urutan
nukleotida control region tersisipkan ke dalam
kumpulan gen IQM pada beberapa famili ular.
Pseudogen lain yang telah diketahui di
antaranya adalah pseudogen tRNA serin pada
Mytilus californianus [Mollusca] (Beagly et al
1999).
Urutan nukleotida gen tRNAVal pada bagian
batang didominasi oleh basa A dan T dengan
rataan komposisi 57.7% A+T dan 42.3% G+C.
Saccone et al (1999) mendapati komposisi G+C
4
pada reptilia sebesar 40.53% (± 2.22).
Asimetri komposisi basa nukleotida ini
terjadi pada semua genom mt Metazoa;
komposisi G+C bernilai sangat rendah pada
genom serangga dan nematoda, dan
meningkat pada genom vertebrata hingga
mencapai nilai tertinggi pada aves, mamalia
(terutama primata) dan teleostei (Saccone et
al 1999). Komposisi G+C berpengaruh
terhadap kekuatan ikatan dan tingkat
kestabilan DNA. Menurut Lynch (1997),
bagian batang tRNA mitokondria hewan
memiliki tingkat kestabilan dupleks yang
rendah dibandingkan dengan tRNA inti,
utamanya disebabkan oleh banyaknya
insiden pasangan basa A-U yang melibatkan
dua ikatan hidrogen daripada G-C yang
melibatkan tiga ikatan hidrogen.
Semua gen tRNAVal mt reptilia dapat
diidentifikasi
berdasarkan
struktur
sekundernya yang berbentuk seperti daun
semanggi (Kumazawa & Nishida 1993,
Sprinzl et al 1997). Penjajaran urutan
nukleotida ditampilkan pada Gambar 3.
Urutan nukleotida gen tRNAVal mt melipat
menjadi empat lengan (AA, D, AC, T) yang
memiliki bentuk batang dan simpai.
Keempat lengan tersebut terdapat secara
utuh pada semua urutan nukleotida gen
tRNAVal. Lengan AA berfungsi sebagai
pembawa asam amino, lengan AC
membawa urutan kodon pada bagian
simpainya, lengan D dan T berperan dalam
interaksi pembentukan struktur tersier yang
menentukan fungsi tRNA. Wolstenholme et
al (1987) mendapati seluruh tRNA pada
Ascaris suum [Nematoda] tidak memiliki
lengan T, namun dapat berfungsi normal
karena adanya modifikasi pascatranskripsi
(Sakurai et al 2005).
Variasi jumlah nukleotida penyusun gen
tRNAVal mt terdapat pada simpai D dan T.
Rataan jumlah nukleotida pada kedua situs
tersebut adalah 6.00 dan 4.97. Lynch (1997)
memperoleh nilai rataan jumlah nukleotida
simpai D dan simpai T untuk reptilia dan
burung sebesar 6.9 dan 7.0.
Beberapa situs tertentu pada simpai D
dan
T
saling
berinteraksi
dalam
pembentukan struktur tersier tRNA sehingga
penjajaran pada kedua simpai tersebut harus
mempertimbangan interaksi yang terjadi
antara unsur-unsurnya. Hal ini, ditambah
jumlah nukleotida yang bervariasi, membuat
simpai D dan simpai T selalu memberikan
hasil penjajaran yang ambigu (Kumazawa &
Nishida 1993).
Jumlah nukleotida pada simpai D, simpai
T, dan simpai variabel tRNA berbeda-beda.
Situs-situs ini, bersama nukleotida-nukleotida
pemisah dan diskriminator, biasanya tidak
diikutsertakan dalam analisis (Kumazawa dan
Nishida
1993).
Pada
penellitian
ini,
penghilangan nukleotida-nukleotida tersebut
menghasilkan 42 basa pada bagian batang
(Gambar 4). Namun spesies-spesies yang
berkerabat dekat umumnya memiliki jumlah
nukleotida yang sama pada simpai variabel,
begitu juga pada nukleotida-nukleotida pemisah
dan diskriminator, serta simpai AC. Oleh
karena itu pada penelitian ini dilakukan analisis
berdasarkan urutan nukleotida gen tRNAVal mt
pada bagian batang (42 basa), dan berdasarkan
urutan nukleotida gen tRNAVal mt tanpa simpai
D dan T (57 basa).
Perhitungan jarak genetik berdasarkan 42
maupun 57 basa sama-sama menghasilkan jarak
terkecil pada I. forstenii – I. Elongata.
Berdasarkan 42 basa, jarak terkecil juga tejadi
pada D. subplana – P. sinensis dan G.
gangeticus – C. Niloticus (Lampiran 4). I.
forstenii dan I. elongata merupakan anggota
dari genus yang sama (Indotestudo). D.
subplana dan P. sinensis bukan anggota dari
genus yang sama namun kedua spesies ini
tergabung
dalam
famili
yang
sama
(Trionychidae). Begitu juga G. gangeticus – C.
niloticus yang merupakan anggota dari famili
yang sama (Crocodylidae). Perbedaan hasil
yang diperoleh terutama disebabkan oleh
pengaruh dari nukleotida-nukleotida pemisah
dan diskriminator serta nukleotida-nukleotida
pada simpai variabel yang diikutsertakan di
dalam analisis.
Jarak genetik terbesar dari perhitungan
berdasarkan 42 basa terjadi pada L. dulcis –
E.subglobosa (Lampiran 4). E. subglobosa
merupakan
kura-kura
famili
Chelidae
sedangkan L. dulcis [Leptotyphlopidae]
(blindsnake) dianggap sebagai spesies ular yang
paling awal berkembang dan memiliki laju
evolusi yang lebih besar dari spesies-spesies
ular primitif ataupun modern lainnya. Jarak
genetik terbesar berdasarkan 57 basa terjadi
pada B. constrictor – E. subglobosa (Lampiran
5) yang sebenarnya juga memiliki jarak genetik
yang besar pada perhitungan berdasarkan 42
basa, namun nilainya sedikit di bawah L. dulcis
– E. subglobosa.
Konstruksi pohon filogenetik menghasilkan
topologi yang mirip. Secara garis besar, spesiesspesies burung, buaya dan kura-kura terletak
dalam satu kelompok yang terpisah dari kadal
dan ular, namun letak spesies-spesies dalam
percabangan di dalamnya masih kurang stabil.
5
A.
A.
A.
B.
B.
B.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
D.
D.
D.
E.
E.
G.
G.
G.
I.
I.
L.
L.
L.
M.
M.
O.
P.
P.
R.
T.
T.
T.
X.
mississippiensis
sinensis
schmidti
constrictor
biporus
tridactylus
crocodylus
insculpta
mydas
niloticus
picta
reevesi
ruffus
warreni
semicarinatus
subplana
zarudnyi
egregius
subglobosa
acutus
gangeticus
pardalis
elongata
forstenii
dulcis
flavimaculatum
viridis
tornieri
emys
okinavensis
regius
sinensis
floridana
kleinmanni
graeca
tachydromoides
unicolor
AA
*******
CAAAATG
...G...
.G...A.
.....A.
.....A.
.....A.
...G...
....TAA
.....CA
.......
.....CA
......a
.....A.
.....A.
.....A.
......A
.....A.
....TA.
...GGCA
.....A.
.......
......A
......A
......A
.....A.
.....A.
.....A.
..G...A
.....CA
.....A.
.....A.
......A
.....A.
......A
......A
.....AA
.....A.
TA
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
..
D
****
GCTT
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
D
****
AAATTTA
AAGC
.......
....
..CAAA
....
.C.CA
....
.CCA
....
.CT
....
...CAC.
G...
..T.AA.
....
..CCAA
....
...CCA
....
..CAAA
....
..TCAA
....
.C.ACA
....
...AC..
....
.C.ACA
....
..CCCA
....
.T.
....
...ACA
....
..C..A
..T.
...
....
..GACA
....
..CCAA.
....
..CCCA.A ....
..CCCA.A ....
...ACA
....
..TAA
....
.T.A
....
..CCCATA ....
..T.AA
....
.T..CA
....
.C.AC..
....
..CC.A
....
..C.A..
....
..TC.ATTA ....
..CCCACA ....
..TA
....
.C.CCA
....
A
T
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AC
*****
TTCAG
.....
....A
...GA
C....
C....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
...GA
....A
C..GA
.....
.....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
.....
.C.G.
C....
CCT..
C....
.....
C..GA
C..GA
.....
.C..A
C....
C....
CCT..
...GA
TTTACAC
C......
C.....A
CC....A
C....G.
.......
CC.....
CC...G.
C......
C......
C......
C......
C......
C.....A
CC.....
.......
C......
C.....A
C......
C.....A
.......
C......
C......
C......
C......
C.....A
C.....A
C......
C......
C......
C......
.......
C.....A
C......
C......
C.....T
C......
AC
*****
CTGAA
.....
T....
TC...
....G
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
TC...
T...T
TC...
.....
.....
T....
.....
T....
.....
.....
.....
.....
.CAG.
.....
..AGG
.....
.....
TC...
TC...
.....
T..G.
.....
.C..G
..AGG
TC...
AAAT
..TG
.G..
CG.C
.G.C
.G.A
....
..C.
.G..
.C..
.G..
.G.C
.G.C
.G.C
CG.C
.T..
.G..
C...
....
.G..
.T..
.G..
.G..
.G..
.G..
.G.C
.G..
....
.G..
CG..
CG..
.C..
CC..
.G.C
.G.C
.G..
CG.C
T
*****
GCCCA
TT.AC
....C
ATTAC
.....
....T
AT...
.T.T.
.T...
.TTT.
.T.T.
.TA..
ATT..
.TTA.
ATTAC
A....
.TT.C
.TTAG
.....
.T.TT
.TTT.
.T.T.
.TT..
.TT..
AT.AC
.T...
...G.
.T...
.T...
ATTA.
.TTA.
A....
....C
.T..G
.T..G
.T.A.
ATTA.
T
*****
CCAT
CGGAC
.AC
..A..
AT.AT
AA.G.
A..
ATA.T
...A
G..G.
TACA
...G.
.A.C
T...T
TT.AAT
AA...
.T.AAC
.....
.TTAAA
TAA..
TT.AAC
AA...
TT.AAAC
A....
AA
TAA.T
T..CAC
TTA..
.
ATA.T
...AACA
A..GT
.TCAAAC
A.A..
TA.AAAC
.TA..
AT.AAC
A..G.
.AC
.A...
TTTAAA
TAA..
.T.AAAC
A....
TT.AAAC
AA...
TT.AAAC
AA...
.A
.CA.T
AA
G.A..
.ACA
AC...
T..AAAC
AA...
TT.AAAC
A....
TA
TTA.T
A
ATA..
...AACC
A..GT
A.CACCCAT T..G.
TT.AA
AC...
TT.AA
AC...
A..ACC
.A...
A..
.TA.T
AA
*******
CATTTTG
....C..
.T..CC.
.T.....
.T.....
.T.....
..CC...
T......
T......
.......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T......
.T.....
.T.....
TGCC...
.T.....
.......
T......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T...C..
T......
.T.....
.T.....
T......
.T.C...
T......
T......
TT.....
.T.....
A
.
C
.
C
C
.
.
.
.
.
.
.
C
.
.
C
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Gambar 3 Hasil penjajaran urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia secara manual dengan mata berdasarkan kemampuannya membentuk struktur sekunder. Nukleotida pada posisi
simpai tidak dijajarkan. Hanya urutan nukleotida A. mississippiensis yang ditampilkan lengkap; tanda titik menunjukkan basa yang sama dengan urutan A. mississippiensis
sedangkan huruf menunjukkan basa yang berbeda. Posisi batang ditunjukkan dengan tanda (*) dan kodon ditunjukkan dengan garis bawah.
6
A.
A.
A.
B.
B.
B.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
C.
D.
D.
D.
E.
E.
G.
G.
G.
I.
I.
L.
L.
L.
M.
M.
O.
P.
P.
P.
T.
T.
T.
X.
mississippiensis
sinensis
schmidti
constrictor
biporus
tridactylus
crocodylus
insculpta
mydas
niloticus
picta
reevesi
ruffus
warreni
semicarinatus
subplana
zarudnyi
egregius
subglobosa
acutus
gangeticus
pardalis
elongata
forstenii
dulcis
flavimaculatum
viridis
tornieri
emys
okinavensis
regius
sinensis
floridana
kleinmanni
graeca
tachydromoides
unicolor
CAAAATG
...G...
.G...A.
.....A.
.....A.
.....A.
...G...
....TAA
.....CA
.......
.....CA
......A
.....A.
.....A.
.....A.
......A
.....A.
....TA.
...GGCA
.....A.
.......
......A
......A
......A
.....A.
.....A.
.....A.
..G...A
.....CA
.....A.
.....A.
......A
.....A.
......A
......A
.....AA
.....A.
GCTT
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
AAGC
....
....
....
....
....
G...
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
..T.
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
....
TTCAG
.....
....A
...GA
C....
C....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
...GA
....A
C..GA
.....
.....
.....
C....
.....
...T.
.....
.....
.....
.C.G.
C....
CCT..
C....
.....
C..GA
C..GA
.....
.C..A
C....
C....
CCT..
...GA
CTGAA
.....
T....
TC...
....G
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
TC...
T...T
TC...
.....
.....
T....
.....
T....
.....
.....
.....
.....
.CAG.
.....
..AGG
.....
.....
TC...
TC...
.....
T..G.
.....
.C..G
..AGG
TC...
GCCCA
TT.AC
....C
ATTAC
.....
....T
AT...
.T.T.
.T...
.TTT.
.T.T.
.TA..
ATT..
.TTA.
ATTAC
A....
.TT.C
.TTAG
.....
.T.TT
.TTT.
.T.T.
.TT..
.TT..
AT.AC
.T...
...G.
.T...
.T...
ATTA.
.TTA.
A....
....C
.T..G
.T..G
.T.A.
ATTA.
CGGAC
..A..
AA.G.
ATA.T
G..G.
...G.
T...T
AA...
.....
TAA..
AA...
A....
TAA.T
TTA..
ATA.T
A..GT
A.A..
.TA..
A..G.
.A...
TAA..
A....
AA...
AA...
.CA.T
G.A..
AC...
AA...
A....
TTA.T
ATA..
A..GT
T..G.
AC...
AC...
.A...
.TA.T
CATTTTG
....C..
.T..CC.
.T.....
.T.....
.T.....
..CC...
T......
T......
.......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T......
.T.....
.T.....
TGCC...
.T.....
.......
T......
T......
T......
.T.....
.T.....
.T.....
T...C..
T......
.T.....
.T.....
T......
.T.C...
T......
T......
TT.....
.T.....
Gambar 4 Urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia setelah menghilangkan semua bagian simpai
dan nukleotida pemisah, menyisakan 42 situs pada bagian batang.
7
27
C.insculpta
M.tornieri
29
T.kleinmanni
9
79
T.graeca
I.forstenii
5
67
I.elongata
22
C.reevesi
Kura-kura
G.pardalis
16
C.picta
2
C.mydas
21
37
M.emys
D.subplana
93
P.sinensis
25
E.subglobosa
2
C.casuarius
9
Archosauria
S.camelus
37
30
A.hastii
G.gallus
41
6
Burung
C.columbianus
43
56
13
C.aura
C.crocodylus
A.sinensis
A.mississippiensis
G.gangeticus
6
36
98
C.niloticus
54
B.tridactylus
26
Buaya
B.biporus
4
L.flavimaculatum
D.zarudnyi
G.acutus
3
71
45
36
6
E.egregius
C.warreni
P.regius
31
51
41
100
R.floridana
A.schmidti
14
Kadal dan Ular
D.semicarinatus
B.constrictor
X.unicolor
30
O.okinavensis
25
27
C.ruffus
T.tachydromoides
76
L.viridis
L.dulcis
M.musculus
Mamalia
R.norvegicus
Gambar 5 Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Maximum Parsimony
(MP) dengan bootstrap 100x.
8
35
C.insculpta
M.tornieri
30
T.kleinmanni
10
80
5
T.graeca
G.pardalis
C.picta
15
C.mydas
25
40
Kura-kura
M.emys
C.reevesi
35
I.forstenii
40
70
10
I.elongata
D.subplana
95
5
P.sinensis
A.mississippiensis
Archosauria
G.gangeticus
30
95
C.niloticus
Buaya
A.sinensis
C.crocodylus
20
E.subglobosa
60
C.casuarius
50
20
30
40
S.camelus
A.hastii
Burung
C.columbianus
5
G.gallus
30
50
C.aura
85
R.floridana
A.schmidti
30
B.tridactylus
15
35
B.biporus
G.acutus
10
L.flavimaculatum
40
D.zarudnyi
5
E.egregius
15
C.warreni
45
Kadal dan Ular
P.regius
50
C.ruffus
35
100
65
35
D.semicarinatus
B.constrictor
35
O.okinavensis
35
X.unicolor
T.tachydromoides
90
L.viridis
L.dulcis
M.musculus
Mamalia
R.norvegicus
Gambar 6 Pohon konsensus reptilia, burung, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal pada bagian batang (42 basa) menggunakan metode Neighbor Joining (NJ)
dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x. Pohon NJ digambarkan
secara rooted.
9
40
19
C.mydas
M.emys
4
C.picta
G.pardalis
2
C.reevesi
T.kleinmanni
36
6
90
T.graeca
56
C.insculpta
Kura-kura
M.tornieri
14
6
I.forstenii
64
I.elongata
D.subplana
2
98
P.sinensis
15
A.mississippiensis
A.sinensis
7
6
C.niloticus
92
Archosauria
Buaya
G.gangeticus
C.crocodylus
A.hastii
26
S.camelus
22
24
18
26
E.subglobosa
C.casuarius
Burung
G.gallus
9
C.aura
43
49
C.columbianus
L.flavimaculatum
24
B.biporus
6
64
B.tridactylus
D.zarudnyi
63
3
14
R.floridana
A.schmidti
38
G.acutus
E.egregius
12
C.warreni
22
C.ruffus
26
27
50
Kadal dan Ular
O.okinavensis
P.regius
100
X.unicolor
24
D.semicarinatus
18
73
B.constrictor
T.tachydromoides
70
L.viridis
L.dulcis
M.musculus
R.norvegicus
Gambar 7
Mamalia
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode
Maximum Parsimony (MP) dengan bootstrap 100x.
10
63
C.insculpta
M.tornieri
6
86
I.elongata
I.forstenii
C.reevesi
13
4
T.graeca
32
91
10
T.kleinmanni
Kura-kura
C.picta
15
20
G.pardalis
C.mydas
48
M.emys
D.subplana
6
96
P.sinensis
46
C.aura
53
G.gallus
17
Archosauria
C.columbianus
C.casuarius
19
14
26
15
Burung
S.camelus
E.subglobosa
A.hastii
26
C.crocodylus
9
A.mississippiensis
A.sinensis
7
C.niloticus
96
Buaya
G.gangeticus
L.flavimaculatum
28
B.biporus
6
70
B.tridactylus
D.zarudnyi
65
8
17
R.floridana
A.schmidti
G.acutus
E.egregius
17
C.warreni
45
P.regius
46
Kadal dan Ular
C.ruffus
53
O.okinavensis
40
X.unicolor
54
D.semicarinatus
51
92
B.constrictor
78
T.tachydromoides
L.viridis
L.dulcis
42
M.musculus
54
98
Gambar 8
R.norvegicus
Mamalia
Pohon konsensus reptilia, aves, dan mamalia berdasarkan urutan nukleotida gen
tRNAVal tanpa bagian simpai D dan simpai T (57 basa) menggunakan metode
Neighbor Joining (NJ) dengan kriteria Kimura 2-Parameter dan bootstrap 100x.
Pohon NJ digambarkan secara rooted.
11
Semua
pohon
filogenetik
dapat
memisahkan kura-kura D. subplana dan P.
sinensis yang tergabung dalam subordo
Pleurodira (kura-kura cangkang lunak) dari
spesies kura-kura lainnya yang merupakan
anggota subordo Cryptodira (kura-kura
cangkang keras). Namun beberapa spesies
buaya (C.crocodylus dan A. sinensis) dan
spesies kura-kura E. subglobosa cenderung
bergabung dalam percabangan spesies-spesies
burung. Ketidakstabilan juga terjadi dalam
kelompok kadal. Spesies-spesies A. schmidti,
B. biporus, B. tridactylus, D. zarudnyi, G.
acutus, dan R. floridana dari superfamili
Amphisbaenia cenderung bergabung, namun
terpisah dari T. tachydromoides yang juga
merupakan anggotanya.
Ketidakstabilan yang terjadi mungkin
disebabkan oleh analisis yang hanya
didasarkan pada satu gen saja. Cao et al
(1994) telah menunjukkan bahwa set data
yang besar, seperti serangkaian gen-gen yang
berurutan, memberikan hasil yang lebih kuat
dibandingkan dengan analisis yang didasarkan
pada gen tunggal. Gen tRNAVal merupakan
gen tunggal dengan urutan nt yang fungsional
dan dapat digunakan dalam analisis filogeni,
namun untuk memperoleh hasil yang lebih
optimal masih diperlukan analisis bersama
gen-gen lain.
Hal yang patut diperhatikan adalah posisi
kura-kura di dalam pohon filogenetik yang
dihasilkan. Kura-kura pada dasarnya adalah
reptilia anapsida yang dicirikan oleh tidak
adanya bukaan di belakang tulang orbit
tengkorak, sedangkan buaya termasuk ke
dalam reptilia diapsida yang memiliki dua
bukaan di belakang tulang orbit tengkorak
(Hickman et al 2000), begitu juga dengan
burung. Topologi sister group kura-kura,
buaya
dan
burung
menyiratkan
kecenderungan diapsida dari kura-kura dan
afinitasnya terhadap kelompok diapsida
archosauria. Penelitian-penelitian terdahulu
juga sudah mengungkapkan afinitas kura-kura
terhadap reptilia diapsida (Zardoya dan Meyer
1998), terutama Archosauria (Kumazawa dan
Nishida 1999, Iwabe et al 2005).
Kecenderungan kura-kura kepada reptilia
diapsida membuat pengelompokan lineage
amniota (anapsida, diapsida, sinapsida)
menjadi rancu. Hal ini disebabkan oleh
reptilia yang tidak memiliki lubang di
belakang orbit tengkorak (anapsida) dan
reptilia yang memiliki dua lubang di belakang
orbit tengkorak (diapsida) memiliki hubungan
yang lebih dekat daripada spesies-spesies
yang memiliki satu lubang di belakang orbit
tengkorak (sinapsida). Dengan demikian perlu
dipertimbangkan
kemungkinan
bahwa
karakter anapsida merupakan ciri sekunder
dari diapsida. Selanjutnya perlu dikaji apakah
pengelompokan anapsida, diapsida dan
sinapsida masih relevan untuk digunakan.
KESIMPULAN
Gen tRNAVal mt reptilia yang terletak di
antara gen 12S rRNA dan 16S rRNA tidak
memiliki penataan ulang maupun pseudogen.
Ukuran gen ini berkisar antara 63 hingga 73 nt
dengan variasi pada jumlah nukleotida di
posisi simpai D dan simpai T. Asimetri basa
nukleotida terjadi dengan rataan komposisi
A+T 57.7% dan G+C 42.3%.
Urutan nukleotida gen tRNAVal mt dapat
digunakan dalam analisis filogenetik, namun
perlu didukung oleh gen-gen lain untuk
memperoleh hasil yang lebih baik. Analisis
berdasarkan gen tRNAVal mt mendukung
pandangan sistematik penggabungan burung
dan buaya dalam klad Archosauria. Selain itu
juga mendukung afinitas kura-kura terhadap
diapsida, terutama Archosauria.
SARAN
Dalam analisis filogenetik terhadap
spesies-spesies yang berkerabat dekat
menggunakan pendekatan gen tRNA mt, perlu
dipertimbangkan
penggunaan
urutan
nukleotida tRNA tanpa simpai D dan T, selain
urutan nukleotida tRNA yang terbatas pada
bagian batang. Diperlukan penelitian dengan
set data yang lebih besar untuk lebih
memastikan keefektifannya.
12
DAFTAR PUSTAKA
Beagly CT, Okimoto R, Wolstenholme DR.
1999. Mytilus mitochondrial DNA
contains a functional gene for a
tRNASer(UCN) with a dihydrouridine armreplacement loop and a pseudotRNASer(UCN) gene. Genetics 152:641-652.
Cao Y, Adachi A, Janke A, Paabo S,
Hasegawa M. 1994. Phylogenetic
relationships among eutherian orders
estimated from inferred protein sequnces
of mitochondrial proteins: instability of a
tree based on a single gene. J Mol Evol
39:519-527.
Hickman CP Jr, Roberts LS, Larson A. 2000.
Integrated Principles of Zoology. Boston:
McGraw-Hill.
Hedges SB. 1994. Molecular evidence for the
origin of birds. Proc Natl Acad Sci USA
91:2621-2624.
Iwabe et al. 2005. Sister group relationship of
turtles to the bird-crocodilian clade
revealed by nuclear DNA-coded proteins.
Mol Biol Evol 22(4):810-813.
Janke A, Arnason U. 1997. The complete
mitochondrial genome of Alligator
mississippiensis and the separation
between recent Archosauria (birds and
crocodiles). Mol Biol Evol 14:1266-1272.
Kumar S, Tamura K, Nei M. 2004. MEGA 3:
Integrated software for molecular
evolutionary genetics analysis and
sequence
alignment.
Briefings
in
Bioinformatics 5:150-163.
Kumazawa Y, Nishida M. 1993. Sequence
evolution of mitochondrial tRNA genes
and deep-branch animal phylogenetics. J
Mol Evol 37:380-389.
Kumazawa Y, Nishida M. 1995. Variations in
mitochondrial tRNA gene organization of
reptiles as phylogenetic markers. Mol
Biol Evol 12(5):759-772.
Kumazawa Y. Nishida M. 1999. Complete
mitochondrial DNA sequences of the
green turtle and blue-tailed mole skink:
statistical evidence for archosaurian
affinity of turtles. Mol Biol Evol
16(6):784-792.
Kumazawa Y, Ota H, Nishida M, Ozawa T.
1996. Gene rearrangements in snake
mitochondrial genomes: highly concerted
evolution
of
control-region-like
sequences duplicate and inserted into a
tRNA gene cluster. Mol Biol Evol
13(9):1242-1254.
Lynch M. 1997. Mutation accumulation in
nuclear, organelle, and prokaryotic
transfer RNA genes. Mol Biol Evol
14(9):914-925.
Ojala D, Montoya J, Attardi G. 1981. tRNA
punctuation model of RNA processing in
human mitochondria. Nature 290:470474.
Parharn JF, Feldman CR, Boore JL. 2006. The
complete mitochondrial genome of the
enigmatic
bigheaded
turtle
(Plastyternon): description of unusual
genomic features and the reconciliation of
phylogenetic hypotheses based on
mitochondrial and nuclear DNA. BMC
Evolutionary Biology 6(11). [terhubung
berkala]. http://www.biomedcentral.com/
147-2148/6/11 [4 Mei 2007].
Pereira SL. 2000. Mitochondrial genome
organization
and
vertebrate
phylogenetics. Genetics and Molecular
Biology 23(4):742-752.
Puspa CS. 2005. Posisi filogenetik kura-kura
Carettochelys
insculpta
(Reptilia:
Testudinata) [Skripsi]. Bogor: Institut
Pertanian Bogor.
Saccone C, De Giorgi C, Gissi C, Pesole G,
Reyes A. 1999. Evolutionary genomics in
Metazoa: the mitochondrial DNA as a
model system. Gene 238:195-209.
Sakurai M, Ohtsuki T. Watanabe K. 2005.
Modification at position 9 with 1methyladenosine is crucial for structure
and function of nematode mitochondrial
tRNAs lacking the entire T-arm. Nucleic
Acids Res 33:1653-1661.
Springer MS et al. 2001. Mitochondrial versus
nuclear gene sequences in deep-level
mammalian phylogeny rescontruction.
Mol Biol Evol 18:132-143.
Sprinzl M, Horn C, Brown M, Ioudovitch A,
Steinberg S. 1997. Compilation of tRNA
sequences and sequences of tRNA genes.
Nucleic Acids Res 26:148-153
Wolstenholme DR, MacFarlane JL, Okimoto
R, Clary DO, Wahlethner JA. 1987.
Bizarre tRNAs inferred from DNA
sequences of mitochondrial genomes of
nematode worms. Proc Natl Acad Sci
USA 84:1324-1328.
Zardoya R. Meyer A. 1998. Complete
mitochondrial genome suggests diapsid
affinities of turtles. Proc Natl Acad Sci
USA 95:14226-14231.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Daftar singkatan kode asam amino
Singkatan satu huruf
Singkatan tiga huruf
Asam amino
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L1
L2
M
N
P
Q
R
S1
S2
T
V
W
Y
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu(CUN)
Leu(UUR)
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser(AGN)
Ser(UCN)
Thr
Val
Trp
Tyr
Alanin
Sistein
Aspartat
Glutamat
Fenilalanin
Glisin
Histidin
Isoleusin
Lisin
Leusin (CUN)
Leusin (UUR)
Metionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Arginin
Serin (AGN)
Serin (UCN)
Treonin
Valin
Triptofan
Tirosin
Keterangan: asam amino leusin dan serin masing-masing memiliki dua isoakseptor yang
dibedakan berdasarkan kodonnya.
15
Lampiran 2 Genom mt hewan yang digunakan dalam analisis dan kode aksesnya pada Genbank
Kelompok
REPTILIA
Anapsida
Archosauria
AVES
Lepidosauria
Neognatha
MAMALIA
Paleognatha
Nama Spesies
Kode Akses Genbank
Carettochelys insculpta
Chelonia mydas
Chrysemys picta
Chinemys reevesi
Dogania subplana
Emydura subglobosa
Geochelone pardalis
Indotestudo elongata
Indotestudo forstenii
Malacochresus tornieri
Manouria emys
Pelodiscus sinensis
Testudo graeca
Testudo kleinmanni
Alligator mississippiensis
Alligator sinensis
Caiman crocodylus
Crocodylus niloticus
Gavialis gangeticus
Amphisbaena schmidti
Bipes biporus
Bipes tridactylus
Boa constrictor
Cordylus warreni
Cylindrophis ruffus
Dinodon semicarinatus
Diplometopon zarudnyi
Eumeces egregius
Geocalamus acutus
Lacerta viridis
Lepidophyma flavimaculatum
Leptotyphlops dulcis
Ovopis okinavensis
Phyton regius
Rhineura floridana
Takydromus tachydromoides
Xenopeltis unicolor
Cathartes aura
Cygnus columbianus
Gallus gallus
Apteryx hastii
Casuarius casuarius
Struthio camelus
(*)
AB012104
AF069423
AY676201
AF366350
(*)
DQ080041
DQ656607
DQ080044
DQ080042
DQ080040
AY962573
DQ080050
DQ080048
AF069428
AF511507
AJ404872
AJ810452
AB079596
AY605475
AY605480
AY605477
AB177354
AB079613
AB179619
AB008539
AY605474
AB016606
AB162909
AM176577
AB162908
AB079242
AB175670
AB177878
AY605473
AB080237
AB179620
AY463690
DQ083161
AB086102
AF338708
AF338713
AF338715
Rattus norvegicus
AJ428514
Mus musculus domesticus
AB042432
Rodentia
* Data C. insculpta (Puspa 2005) dan E. subglobosa (tidak dipublikasikan) merupakan urutan
nukleotida parsial pada ruas gen 12S rRNA sampai 16S rRNA milik Laboratorium Zoologi,
Departemen Biologi, FMIPA IPB.
16
Lampiran 3 Komposisi basa pada bagian batang, jumlah nukleotida pada simpai D dan simpai T,
serta jumlah nukleotida total dari urutan nukleotida gen tRNAVal mt reptilia
Nama Spesies
Carettochelys insculpta
Chelonia mydas
Chrysemys picta
Chinemys reevesi
Dogania subplana
Emydura subglobosa
Geochelone pardalis
Indotestudo elongata
Indotestudo forstenii
Malacochresus tornieri
Manouria emys
Pelodiscus sinensis
Testudo graeca
Testudo kleinmanni
Alligator mississippiensis
Alligator sinensis
Caiman crocodylus
Crocodylus niloticus
Gavialis gangeticus
Amphisbaena schmidti
Bipes biporus
Bipes tridactylus
Boa constrictor
Cordylus warreni
Cylindrophis ruffus
Dinodon semicarinatus
Diplometopon zarudnyi
Eumeces egregius
Geocalamus acutus
Lacerta viridis
Lepidophyma flavimaculatum
Leptotyphlops dulcis
Ovopis okinavensis
Phyton regius
Rhineura floridana
Takydromus tachydromoides
Xenopeltis unicolor
Rataan
Komposisi basa (%)
pada bagian batang
T
C
A
G
28.6
26.2
28.6
28.6
28.6
19.0
31.0
31.0
31.0
23.8
26.2
28.6
23.8
26.2
23.8
26.2
26.2
35.7
35.7
21.4
28.0
21.4
33.3
38.1
33.3
31.0
28.6
35.7
33.3
21.4
23.8
23.8
33.3
28.6
23.8
26.2
33.3
27.1
19.0
23.8
19.0
16.7
19.0
31.0
16.7
16.7
16.7
23.8
21.4
19.0
26.2
23.8
26.2
26.2
23.8
16.7
16.7
28.6
21.4
26.2
16.7
14.3
16.7
19.0
21.4
16.7
19.0
26.2
23.8
28.6
16.7
19.0
28.6
21.4
16.7
22.2
35.7
31.0
35.7
35.7
33.3
23.8
33.3
35.7
35.7
33.3
33.3
33.3
28.6
31.0
28.6
28.6
26.2
31.0
31.0
28.6
31.6
23.8
35.7
33.3
35.7
35.7
31.0
28.6
28.6
28.6
31.0
31.0
35.7
35.7
23.8
33.3
35.7
30.6
16.7
19.0
16.7
19.0
19.0
26.2
19.0
16.7
16.7
19.0
19.0
19.0
21.4
19.0
21.4
19.0
23.8
16.7
16.7
21.4
19.0
28.6
14.3
14.3
14.3
14.3
19.0
19.0
19.0
23.8
21.4
16.7
14.3
16.7
23.8
19.0
14.3
20.1
Jumlah nukleotida
pada simpai
D
T
7
6
6
6
6
6
7
8
8
8
6
6
8
9
7
5
7
6
6
6
4
3
5
7
6
6
3
6
3
4
5
6
6
7
7
4
6
6.00
6
6
6
7
7
6
7
7
7
7
7
7
5
5
4
3
4
6
6
5
4
4
3
6
2
1
7
7
3
4
2
2
2
1
9
6
3
4.97
Jumlah
nukleotida
total
70
69
69
70
70
69
71
72
72
72
70
70
70
71
68
65
68
69
69
68
65
64
65
70
65
64
67
70
63
65
64
65
65
65
73
67
66
67.97
17
Lampiran 4 Rasio ts/tv dan jarak genetik reptilia berdasarkan urutan nukleotida gen tRNA
SEQUENCE
1
1 A.mississippiensis
2
3
4
5
6
14
15
16
17
19
20
21
24
25
26
27
29
30
32
33
34
35
36
1.33
1
1.5
0.67
∞
6
∞
6
6
1.5
5.5
1.2
1.67
5
0.75
1
2
1.3
6
4
5
5
1.8
1
1.2
4
7
2.75
1.6
5
2.33
2.5
3.5
3.33
2.25
1.8
9
5.5
8
3.5
3.67
2.5
2
3.33
2.5
5.5
1.4
6
3.3
∞
1.6
3.25
8
2
3.67
3.33
3.33
5
11
4
3.33
3.33
3
3.33
3.33
7
2.5
3
5
2.75
1.6
1.75
2.33
1.75
2
1.25
1.75
1
2
1
1.8
2
0.6
0.67
2.4
1.5
1.25
1.25
1.75
1.75
2
0.5
1.83
1.5
1.75
2
1.33
2
2.75
1.2
1.6
3
1.6
4.33
0.5
3.33
4
2
2
4.5
2.33
13
1.75
4
3.5
7
2
2.67
3.5
2
4
4.5
4.5
3
∞
3
3.5
4.5
2.67
5
3.5
3.5
2.33
2.33
4.5
4
4
1.67
2.2
1.67
0.71
2
1.5
0
1.33
∞
2
3
1.67
2.83
2.67
0.71
2
4.5
4.5
7
3
17
2
2.6
0.5
3
2
3.67
3
3
5.33
0
3.33
1.5
1.67
2
1.75
1
13
2
3.67
1.25
6
1.5
1.2
∞
2
1.5
1.75
1.75
6
1.5
1.5
1.25
1.75
3.67
2
1.25
∞
0.8
1.2
5
3.67
11
∞
10
11
4
5.5
2
1.8
8
2
2.2
2.2
3.33
10
9
10
10
2.2
2.67
2.6
9
12
2.75
2.6
8
3.67
5
6
5.33
2.75
4
2.5
∞
3
4
1.17
2
∞
2.33
1.17
10
1
2.5
∞
∞
∞
1.83
3
2
∞
∞
2
2
∞
3
2
4
1.25
2.2
8
2
0.5
6
1.4
1.83
5
1
1.2
4
1.67
8
2
3
3
2
1.33
4.5
0
5
3
1.8
5
3.33
1.5
2.5
2.33
2.5
2.5
1.67
2
0.33
0.86
5
0.4
0.5
5
1
∞
2.5
2
2
1.22
1
1.5
3.5
4
1.2
0.67
5
2.75
2.33
3
2.75
1.2
3
3.67
1
2.2
∞
2
1
10
0.75
2.5
∞
∞
∞
1.67
3.5
2.25
∞
∞
2.2
2.25
∞
2.75
4
6
1.5
2
2.5
0.71
1.67
4
0.75
0.71
4.5
1
1.67
1
1
1
1.43
1.67
1.8
1
4
1.67
1.6
4
1.8
1
2
1.4
1.5
0.5
0.33
3 A.sinensis
0.19
0.46
4 B.biporus
0.16
0.31
0.41
5 B.constrictor
0.51
0.45
0.41
1.17
0.62
6 B.tridactylus
0.13
0.27
0.33
0.08
0.55
7 C.crocodylus
0.24
0.77
0.3
0.44
0.57
8 C.insculpta
9 C.mydas
0.44
0.2
0.49
0.33
0.3
0.58
0.29
0.41
0.11
0.48
0.26
0.26
0.57
0.22
0.32
8
9