Analisis gen mitokondria penyandi protein pada amphibia
ANALISIS GEN MITOKONDRIA PENYANDI PROTEIN
PADA AMPHIBIA
JOHANSON SIMARMATA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Gen
Mitokondria Penyandi Protein pada Amphibia adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Johanson Simarmata
NIM G34070030
ABSTRAK
JOHANSON SIMARMATA. Analisis Gen Mitokondria Penyandi Protein pada
Amphibia. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan R.R. DYAH
PERWITASARI.
Aktivitas transkripsi gen sebagian besar terjadi pada utas H, terdiri dari 2
gen penyandi rRNA, 14 gen penyandi tRNA dan 12 gen penyandi protein yang
memiliki laju mutasi yang berbeda-beda. Evolusi dan laju mutasi yang berbedabeda dapat menyebabkan penyimpangan pengelompokan taksa. Penelitian ini
bertujuan menganalisis runutan nukleotida gen penyandi protein yang
ditranskripsi dari utas H pada genom mitokondria Amphibia. Data runutan
nukleotida diunduh dari portal data NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Data
diolah menggunakan piranti lunak Textpad dan dianalisis menggunakan MEGA 5.
Hasil analisis menggunakan metode Neighbor-Joining dan Net Between Group
Mean Distances dengan model Kimura 2-parameter dan Number of Differences
menunjukkan bahwa hubungan kekerabatan Ordo Anura-Caudata lebih jauh
dibanding Anura-Gymnophiona maupun Caudata-Gymnophiona. Nilai rasio
transisi-transversi lebih dari 1 menunjukkan bahwa laju mutasi transisi lebih
tinggi dari laju transversi. Kodon awal yang digunakan pada 12 gen penyandi
protein mtDNA Amphibia terdiri dari ATA, ATC, ATG, ATT, GTG dan TTG.
Kodon akhir yang digunakan antara lain AGA, AGG, TAA, TAG, TA- dan T--.
ATG, GTG, TAA dan T-- merupakan kodon awal dan kodon akhir yang lebih
dominan digunakan.
Kata kunci: Amphibia, DNA, gen penyandi protein, mitokondria, mutasi
ABSTRACT
JOHANSON SIMARMATA. Analysis of Mitochondrial Protein-coding Genes on
Amphibian. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and R.R. DYAH
PERWITASARI.
Activity of gene transcription occurs largely in the H-strand, consisting of
two genes coding for rRNA, 14 tRNA-coding and 12 protein-coding that have the
difference of mutation rates. Evolution and difference of mutation rates can lead
to deviations of taxa’s grouping. This study aimed to analyze the nucleotide
sequences of protein-coding genes transcribed from the genome mitochondrial
Amphibians H-strand. Nucleotide sequences were downloaded from NCBI
database. Data were processed using Textpad and analyzed using MEGA 5
software. Results of the analysis using Neighbor-Joining and Net Between Group
Mean Distances method with Kimura 2-parameter and Number of Differences
models indicated that relationship of Order Anura-Caudata was distantly separated
Gymnophiona-Anura and Caudata-Gymnophiona. Number of transitiontransversion ratio more than 1 (>1) revealed that transition rate are higher than
transversion. Start codons used in 12 protein-coding genes consist of ATA, ATC,
ATG, ATT, GTG and TTG. Stop codons are used among others AGA, AGG,
TAA, TAG, TA-and T--. ATG, GTG, TAA and T-- are start codons and stop
codons are used more dominant.
Key words: Amphibia, DNA, protein-coding genes, mitochrondrial, mutation
ANALISIS GEN MITOKONDRIA PENYANDI PROTEIN
PADA AMPHIBIA
JOHANSON SIMARMATA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Analisis Gen Mitokondria Penyandi Protein pada Amphibia
Nama
: Johanson Simarmata
NIM
: G34070030
Disetujui oleh
Dr Ir Achmad Farajallah, MSi
Pembimbing I
Dr Ir R.R. Dyah Perwitasari, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan dalam memenuhi
salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Sains di Departemen Biologi FMIPA
IPB. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober
2013 ini adalah analisis DNA mitokondria, dengan judul Analisis Gen
Mitokondria Penyandi Protein pada Amphibia.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir Achmad Farajallah, MSi
dan Ibu Dr Ir R.R. Dyah Perwitasari, MSc selaku pembimbing yang senantiasa
bersabar dalam membimbing dan memberi arahan. Terima kasih kepada Bapak
Prof Dr Ir Alex Hartana, MSc sebagai penguji karya ilmiah. Terima kasih kepada
seluruh staf Departemen Biologi IPB atas bimbingannya selama penulis menjalani
studi di Departemen Biologi IPB. Terima kasih penulis sampaikan kepada Bunda
beserta seluruh keluarga, yang senantiasa memberi dukungan, doa dan kasih
sayang, terutama kepada Juspen Simarmata, Januardi Simarmata, Onanto Silalahi,
Eva Netty, Marissa Kristina dan Pahotan Simarmata yang tiada hentinya
memberikan semangat dan dukungan materi. Penulis juga sampaikan terima kasih
kepada Bapak Dame RG, Ariston Simarmata, Dewi Putri Basani dan Ika Indah
Sari yang selalu memberikan semangat, dan terlebih kepada teman-teman
angkatan 44 yang telah banyak membantu selama masa studi di IPB.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2014
Johanson Simarmata
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
PENDAHULUAN
Tujuan Penelitian
1
1
METODE
2
Bahan
2
Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Pengunduhan data
3
Analisis laju substitusi
4
Analisis jarak genetik
6
Analisis Neighbor-Joining (NJ)
7
SIMPULAN
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
22
DAFTAR TABEL
1 Hasil seleksi data yang digunakan dalam analisis gen-gen penyandi
protein pada genom mtDNA Amphibia
2 Jenis-jenis kodon awal yang digunakan pada 12 gen penyandi protein
mtDNA Amphibia
3 Jenis-jenis kodon akhir yang digunakan pada 12 gen penyandi
protein mtDNA Amphibia
4 Kode genetik mitokondria vertebrata
5 Hasil analisis laju substitusi pada basa pertama, kedua, dan ketiga
genom penyandi protein pada mtDNA Amphibia menggunakan
Nucleotide Pair Frequencies
6 Analisis jarak genetik antar kelompok ordo Amphibia berdasarkan
basa pertama dan kedua pada 12 gen-gen penyandi protein mtDNA
Amphibia menggunakan model NoD dan K2P
3
4
4
5
6
7
DAFTAR GAMBAR
1 Pohon filogeni hasil analisis Neighbor-joining kelompok ordo Anura,
Caudata dan Gymnophiona menggunakan basa pertama dan kedua
setiap kodon dengan model evolusi K2P dan NoD
2 Pohon filogeni hasil analisis NJ tingkat famili yang tergolong dalam
Kelas Amphibia menggunakan metode K2P dan NoD
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Contoh data runutan nukleotida mtDNA yang diunduh dari portal
data NCBI
13
PENDAHULUAN
Amphibia merupakan hewan vertebrata yang pada saat fase berudu
menetap di dalam air, dan pindah ke daratan pada saat fase dewasa. Amphibia
dikelompokkan ke dalam tiga Ordo, yaitu Anura, Caudata dan Gymnophiona
(Pough et al. 2005). Hubungan filogenetik antar ketiga Ordo tersebut relatif stabil
berdasarkan berbagai jenis data, mulai dari data morfologi, gen-gen fungsional
yang ada di inti sel, sampai data DNA mitokondria (Frost et al. 2006).
DNA mitokondria (mtDNA) merupakan DNA yang hanya diturunkan dari
induk betina tanpa mengalami rekombinasi (Brown 1983). Perbedaan mtDNA
antar individu disebabkan oleh mutasi gen (Nei dan Kumar 2000). DNA
mitokondria memiliki sifat khusus dibandingkan dengan DNA inti, yaitu: jumlah
kopi yang tinggi, ukurannya relatif kecil (14-39 kb), dan memiliki laju kecepatan
evolusi yang tinggi (Kocher et al. 1989). Keunikan lainnya dari mtDNA
dibandingkan dengan DNA inti adalah perbedaan penyandian kode genetik. Kodon
UGA tidak dibaca sebagai kodon akhir melainkan sebagai triptofan, kodon AGA dan
AGG tidak dibaca sebagai arginin melainkan sebagai kodon akhir, dan AUA dibaca
sebagai methionin (Nei dann Kumar 2000). DNA mitokondria sudah dibuktikan dan
diyakini oleh banyak peneliti dapat digunakan sebagai penanda molekuler dalam
mempelajari keragaman genetik, baik pada tingkat individu, populasi, maupun
pada level taksonomi yang lebih tinggi pada hewan (Avise dan Lansman 1983;
Brown 1983). DNA mitokondria merupakan DNA utas ganda yang terdiri dari
utas heavy (H) dan utas light (L). Utas H memiliki berat molekul yang lebih besar
dibanding utas L karena utas H memiliki lebih banyak kandungan basa purin
(Anderson et al. 1981).
Menurut Brown (1983), mtDNA memiliki 13 gen penyandi protein, 2 gen
penyandi rRNA dan 22 gen penyandi tRNA. Sebagian besar gen-gen tersebut
ditranskripsi dari untai H, yaitu 2 gen penyandi rRNA, 14 gen penyandi tRNA,
dan 12 gen penyandi protein. Setiap gen dari genom mitokondria memiliki laju
evolusi yang berbeda-beda. Perbedaan laju evolusi bagian gen tersebut dapat
digunakan untuk mempelajari proses evolusi, hubungan kekerabatan antar
individu atau kelompok taksa. Bagian-bagian gen yang memiliki laju mutasi
tinggi biasanya digunakan untuk menganalisis hubungan intraspesies, misalnya
menguji paternitas dan mempelajari pola penyebaran. Ruas gen-gen yang
memiliki laju mutasi rendah digunakan untuk menganalisis hubungan
interspesifik , misalnya hubungan kekerabatan antar taksa.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis runutan nukleotida gen penyandi
protein yang ditranskripsi dari utas H pada genom mitokondria Amphibia.
2
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah data sekunder berupa runutan nukleotida
DNA mitokondria taksa Amphibia yang diunduh dari portal data nukleotida
National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Portal data NCBI
menyatukan data runutan nukleotida dari DNA Data Bank of Japan (DDBJ) dan
European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Data yang diunduh memuat
informasi tentang kode akses, definisi data, referensi, hirarki taksonomi organisme,
runutan nukleotida, beserta posisi gen-gen penyandi protein, tRNA dan rRNA,
dan beberapa “features” lainnya. (Lampiran 1).
Analisis Data
Data runutan nukleotida mtDNA taksa Amphibia diunduh dari portal data
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pada Oktober 2013. Kata kunci pencarian
yang digunakan pada opsi pencarian nukleotida adalah “amphibia mitochondri*
cytochrome Val Glu”. Penggunaan wildcard “*” bertujuan untuk menentukan
pilihan kata yang diawali oleh “mitochondri”, seperti mitochondria,
mitochondrion dan mitochondrial. Sedangkan “cytochrome Val Glu” untuk
mencakup whole genome mitochondria. Hasil pencarian disimpan dalam bentuk
format “GenBank (full)”.
Data diseleksi berdasarkan kode akses data. Data yang akan digunakan
adalah data dengan kode akses NC. Kode akses NC menunjukkan bahwa data
tersebut telah diverifikasi oleh kurator NCBI. Jika ada lebih dari satu data runutan
lengkap genom mitokondria yang di-upload oleh lebih dari satu penulis atau
lembaga, maka kurator NCBI akan memilih satu data yang dianggap sebagai
referensi data untuk spesies tersebut.
Ruas-ruas gen penyandi protein dipisahkan menggunakan piranti lunak
Textpad v7 berdasarkan informasi batas gen-gen yang tercantum dalam “features”
data. Runutan nukleotida tiap jenis gen disejajarkan (alignment) menggunakan
MUSCLE yang tertanam dalam MEGA5 dengan kode genetik “vertebrate
mitochondrial” (Tamura et al. 2011). Pemeriksaan hasil pensejajaran dilakukan
secara manual dibantu oleh hasil deduksi asam aminonya. Jumlah kodon awal
diperoleh dari hasil pensejajaran yang diedit sedemikian rupa dan dihitung
menggunakan piranti lunak Microsoft Office Excel 2007. Hasil pensejajaran
diubah ke dalam format MEGA (.meg) dan selanjutnya dilakukan analisis
keragaman nukleotida, antara lain analisis laju mutasi menggunakan Nucleotide
Pair Frequencies, jarak genetik dengan metode Net Between Group Mean
Distances dan Neighbor-Joining (NJ) dengan menggunakan model substitusi
Number of Differences (NoD) dan Kimura 2-parameter (K2P), dengan pengujian
topografi pohon filogeni berdasarkan bootstrap 1000 kali pengulangan (Tamura et
al. 2011). Model substitusi Number of Differences memberikan bobot yang sama
(α) antara laju mutasi transisi dan transversi, sedangkan model mutasi Kimura 2Parameter memberikan bobot yang berbeda (α atau ß) antara mutasi transisi dan
transversi (Nei dan Kumar 2000).
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengunduhan data
Jumlah data mitochondrial whole genome taksa Amphibia dari hasil
pencarian data yang tersedia di basis data hingga Oktober 2013 berjumlah 447
entri. Data hasil seleksi yang dianalisis lebih lanjut sebanyak 145 entri (Tabel 1).
Dari hasil seleksi data pengelompokan gen penyandi protein, runutan nukleotida
penyandi gen ND5 pada organisme Hoplobatrachus rugulosus (NC_019615)
mengalami duplikasi. Duplikasi gen merupakan kejadian bergandanya suatu
daerah bagian DNA yang berfungsi sebagai gen. Kopi kedua dari gen sering kali
terbebas dari tekanan seleksi dan tidak memiliki efek negatif terhadap inang.
Runutan nukleotida gen ND5 yang digunakan dari data NC_019615 dipilih salah
satu. Spesies Polipedates megachepalus (NC_006408) tidak memiliki runutan
nukleotida penyandi gen ND5 dan ATP8 di dalam data. Oleh karena itu, data
NC_006408 tidak digunakan lebih lanjut.
Tabel 1 Hasil seleksi data yang digunakan dalam analisis gen-gen penyandi
protein pada genom mtDNA Amphibia
Pemilihan Data
Data yang diunduh dari basis data nukleotida
Seleksi data dengan kode akses NC
Seleksi data setelah diseragamkan untuk masing-masing gen
Jumlah Entri
447
146
145
Penggunaan kodon awal pada runutan nukleotida gen penyandi protein
mtDNA Amphibia bervariasi (Tabel 2), antara lain ATA, ATC, ATG, ATT, GTG
dan TTG. Pada umumnya kodon awal yang paling banyak digunakan adalah ATG
(85,11%), sedangkan kodon awal yang paling sedikit digunakan adalah ATC
(0,35%). Penggunaan kodon awal pada gen Sitokrom C oksidase subunit 1 (CO1)
didominasi oleh kodon GTG (106 kodon), lalu diikuti oleh ATA dan ATG dengan
jumlah masing-masing 28 dan 11 kodon. Penggunaan kodon akhir secara
keseluruhan (Tabel 3) didominasi oleh TAA dan kodon akhir tidak lengkap T--,
dengan jumlah kodon masing-masing 694 dan 711. Kodon akhir TAA dominan
digunakan pada gen ATP6, ATP8, CO1, ND4L dan ND5 sedangkan T-- dominan
digunakan pada gen CO2, CO3, CytB, ND1, ND2, ND3 dan ND4. Adapun kodon
lain yang digunakan sebagai kodon akhir antara lain TA-, TAG, AGA dan AGG
dengan jumlah masing masing 123, 114, 55 dan 43 kodon.
Sebagian besar kodon awal pada 13 gen penyandi protein mtDNA
Amphibia menggunakan kodon awal ATG (Roe et al. 1985), namun penggunaan
kodon awal ATG tidak dominan pada gen CO1. Gen CO1 pada Chordata (kecuali
Mamalia) dominan menggunakan GTG sebagai kodon awal (Zardoya dan Meyer
2000)
4
Tabel 2 Jenis-jenis kodon awal yang digunakan pada 12 gen penyandi protein
mtDNA Amphibia
Gen
ATP6
ATP8
ND1
ND2
ND3
ND4
ND4L
ND5
CO1
CO2
CO3
CytB
Total
Persentase (%)
ATA
ATC
3
1
6
8
14
2
2
5
28
1
0
1
71
4,08
0
0
1
3
0
0
0
2
0
0
0
0
6
0,35
Kodon awal
ATG
ATT
136
142
113
113
118
142
139
134
11
114
145
144
1481
85,11
0
0
6
19
4
0
0
1
0
0
0
0
30
1,72
GTG
TTG
5
2
10
2
9
1
4
3
106
0
0
0
142
8,16
1
0
9
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
0,58
Tabel 3 Jenis-jenis kodon akhir yang digunakan pada 12 gen penyandi protein
mtDNA Amphibia
Gen
AGA
AGG
0
1
13
2
0
5
1
5
0
6
1
21
55
3,16
0
0
35
0
0
0
0
3
0
1
0
4
43
2,47
ATP6
ATP8
CO1
CO2
CO3
CytB
ND1
ND2
ND3
ND4
ND4L
ND5
Total
Persentase (%)
Kodon akhir
TAA
TAG
102
137
66
11
2
29
13
50
48
18
138
80
694
39,89
2
7
22
1
1
6
20
18
17
2
4
14
114
6,55
TA-1
T--1
13
0
2
7
24
21
43
3
3
0
2
5
123
7,07
28
0
7
124
118
84
68
66
77
118
0
21
711
40,86
1
Incomplete stop codon
Analisis laju substitusi
Mutasi yang terjadi pada basa pertama dan kedua dari setiap kodon akan
menyebabkan peluang perubahan jenis asam amino yang ditranslasi menjadi lebih
besar. Namun jika mutasi terjadi pada basa ketiga setiap kodon, seringkali kodon
yang baru tetap menyandikan protein yang sama dengan kodon awal sebelum
mutasi. Hal tersebut disebabkan oleh adanya kesamaan asam amino yang dibawa
oleh tRNA meskipun basa ketiga berbeda (Tabel 4). Kodon-kodon yang
5
menghasilkan jenis asam amino yang sama dinamakan kodon sinonim (Nei dan
Kumar 2000).
Perubahan asam amino disebabkan oleh perubahan urutan basa nukleotida,
akan tetapi perubahan sebuah basa nukleotida pada DNA tidak selamanya
mengubah asam amino karena satu asam amino dapat disandikan lebih dari satu
jenis kodon. Mutasi gen terjadi karena perubahan susunan asam amino akibat
terjadinya penambahan (insersi) atau kehilangan (delesi) pasangan basa, atau
pergantian pasangan basa (substitusi) yang satu dengan jenis basa yang lain.
Insersi dan delesi menghasilkan dampak yang signifikan terhadap produksi
polipeptida. Kehilangan atau penambahan nukleotida pada suatu titik akan
mengubah kerangka baca (frameshift) seluruh kodon yang berada di belakang
titik tersebut. Dengan demikian, polipeptida yang dihasilkan akan menyimpang
dari polipeptida yang seharusnya disintesis (Griffiths et al. 2000). Mutasi akibat
pergantian pasangan basa dibedakan menjadi 2 jenis, yakni transisi dan transversi.
Transisi merupakan mutasi yang terjadi akibat substitusi basa purin (Adenin,
Guanin) dengan purin lainnya, atau basa pirimidin (Sitosin, Timin) dengan
pirimidin lainnya. Sedangkan transversi merupakan mutasi akibat substitusi purin
dengan pirimidin atau sebaliknya (Nei dan Kumar 2000).
Tabel 4 Kode genetik mitokondria vertebrata1
1
Kodon
Hasil
Kodon Hasil
Kodon Hasil
Kodon Hasil
UUU
UUC
UUA
UUG
Phe
Phe
Leu
Leu
UCU
UCC
UCA
UCG
Ser
Ser
Ser
Ser
UAU
UAC
UAA
UAG
Tyr
Tyr
Ter
Ter
UGU
UGC
UGA
UGG
Cys
Cys
Trp (Ter2)
Trp
CUU
CUC
CUA
CUG
Leu
Leu
Leu
Leu
CCU
CCC
CCA
CCG
Pro
Pro
Pro
Pro
CAU
CAC
CAA
CAG
His
His
Gln
Gln
CGU
CGC
CGA
CGG
Arg
Arg
Arg
Arg
AUU
AUC
AUA
AUG
Ile
Ile
Met (Ile2)
Met
ACU
ACC
ACA
ACG
Thr
Thr
Thr
Thr
AAU
AAC
AAA
AAG
Asn
Asn
Lys
Lys
AGU
AGC
AGA
AGG
Ser
Ser
Ter (Arg2)
Ter (Arg2)
GUU
GUC
GUA
GUG
Val
Val
Val
Val
GCU
GCC
GCA
GCG
Ala
Ala
Ala
Ala
GAU
GAC
GAA
GAG
Asp
Asp
Glu
Glu
GGU
GGC
GGA
GGG
Gly
Gly
Gly
Gly
Tabel kode genetik mitokondria Vertebrata Nei dan Kumar (2000); 2 Hasil asam amino pada
DNA inti
6
Tabel 5 Hasil analisis laju substitusi pada basa pertama, kedua dan ketiga setiap kodon
genom penyandi protein pada mtDNA Amphibia menggunakan Nucleotide
Pair Frequencies
Gen
CO1
Basa ke-
Si
Sv
Rasio(R)
1
40,0
16,0
2
7,0
7,0
3
136,0 134,0
total
183,0 158,0
CO2 1
24,0
16,0
2
9,0
6,0
3
55,0
55,0
total
89,0
77,0
CO3 1
24,0
16,0
2
10,0
5,0
3
61,0
69,0
total
95,0
90,0
CytB 1
38,0
39,0
2
17,0
11,0
3
95,0 107,0
total
150,0 156,0
ND1 1
40,0
37,0
2
17,0
12,0
3
67,0
97,0
total
124,0 146,0
ND2 1
45,0
74,0
2
37,0
25,0
3
66,0 122,0
total
147,0 221,0
Si: Lajutransisi; Sv: Laju transversi; R: Si/Sv
2,5
0,9
1,0
1,2
1,5
1,5
1,0
1,1
1,5
1,9
0,9
1,1
1,0
1,6
0,9
1,0
1,1
1,4
0,7
0,9
0,6
1,5
0,5
0,7
Gen
ND3
ND4L
ND4
ND5
ATP6
ATP8
Basa ke1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
Si
Sv
Rasio(R)
16,0
9,0
25,0
50,0
16,0
8,0
20,0
44,0
68,0
45,0
98,0
211,0
75,0
54,0
136,0
265,0
35,0
18,0
48,0
100,0
8,0
6,0
9,0
24,0
17,0
5,0
37,0
59,0
18,0
7,0
32,0
57,0
89,0
38,0
158,0
285,0
112,0
55,0
196,0
363,0
31,0
9,0
78,0
117,0
12,0
9,0
18,0
39,0
0,9
1,8
0,7
0,8
0,9
1,2
0,6
0,8
0,8
1,2
0,6
0,7
0,7
1,0
0,7
0,7
1,1
2,1
0,6
0,9
0,7
0,7
0,5
0,6
Analisis laju substitusi (Tabel 5) berdasarkan basa nukleotida pertama,
kedua dan ketiga dari setiap kodon menunjukkan bahwa rentang nilai rasio (R)
antara laju transisi (Si) dengan laju transversi (Sv) berkisar antara 0,5-2,5.
Aktifitas mutasi transisi maupun transversi paling sedikit terjadi pada basa kedua.
Hal tersebut dapat dilihat dari nilai Si dan Sv basa kedua yang lebih kecil dari
nilai Si dan Sv pada basa pertama maupun ketiga. Nilai R rata-rata pada basa
pertama adalah 1,108; pada basa kedua R rata-rata 1,401 dan pada basa ketiga
nilai R rata-rata 0,725. Hasil nilai rata-rata R setiap kodon menandakan bahwa
laju transisi lebih tinggi dibanding laju transversi pada basa pertama dan kedua,
sedangkan pada basa ketiga laju transversi lebih tinggi dibanding laju transisi.
Nilai rata-rata rasio laju transisi dengan transversi sebesar 1,053. Hal tersebut
menandakan bahwa laju transisi lebih dominan dibanding laju translasi (Nei dan
Kumar 2000). Dengan demikian, pada umumnya mutasi transisi lebih sering
terjadi pada runutan nukleotida penyandi protein mtDNA Amphibia.
Analisis jarak genetik
Jarak genetik digunakan untuk melihat kedekatan hubungan genetik antar
Ordo. Tabel 6 merupakan hasil analisis jarak genetik antara Ordo Anura, Caudata
7
dan Gymnophiona menggunakan metode Net Between Group Mean Distances,
model Kimura 2-Parameter dan Number of Differences dengan bootstrap 1000
kali pengulangan. Analisis melibatkan 145 runutan nukleotida. Posisi basa yang
digunakan adalah basa pertama dan kedua setiap kodon. Semua posisi yang
mengandung kesenjangan dan data yang hilang telah dieliminasi. Total posisi basa
dalam data akhir berjumlah 6700. Perkiraan standard error ditunjukkan oleh angka
di belakang tanda ±. Analisis jarak genetik dilakukan menggunakan MEGA5.
Tabel 6 Hasil analisis jarak genetik antar kelompok ordo Amphibia menggunakan
Net Between Mean Group Distances berdasarkan basa pertama dan kedua
setiap kodon pada 12 gen-gen penyandi protein mtDNA Amphibia
menggunakan model K2P dan NoD
Anura
Caudata
Gymnophiona
Anura
0,056±0,002
0,052±0,002
Caudata
293,276±9,010
0,053±0,002
Gymnophiona
266,094±9,471
283,065±11,745
-
Angka di atas diagonal: Hasil analisis jarak genetik menggunakan model NoD
Angka di bawah diagonal: Hasil analisis jarak genetik menggunakan model K2P
Hasil perhitungan Analisis jarak genetik berdasarkan basa pertama dan
kedua dari setiap kodon (Tabel 6) menggunakan model K2P menunjukkan bahwa
jarak genetik antar kelompok Ordo berkisar antara 0,052 hingga 0,056. Jarak
genetik antara Ordo Anura dengan Caudata adalah 0,056 dengan simpangan baku
sebesar 0,002; Anura-Gymnophiona dan Caudata-Gymnophiona berturut-turut
adalah 0,052 dan 0,053 dengan masing-masing simpangan baku 0,002. Analisis
jarak genetik menggunakan model NoD juga menunjukkan perbandingan nilai
jarak genetik yang sama dengan perhitungan menggunakan model K2P.
Nilai jarak genetik terbesar terdapat pada Ordo Anura-Caudata, yaitu
sebesar 0,056 dengan model K2P dan 293,276 dengan model NoD. Nilai tersebut
lebih tinggi dibanding nilai jarak genetik Anura-Gymnophiona dan CaudataGymnophiona. Semakin besar nilai jarak genetik, maka semakin besar jumlah
perbedaan basa nukleotidanya. Semakin besar jumlah perbedaan basa nukleotida,
maka hubungan kekerabatan semakin jauh. Sebaliknya, semakin kecil nilai jarak
genetik maka semakin sedikit perbedaan basa nukleotidanya sehingga hubungan
kekerabatannya semakin dekat (Febriana 2011). Dengan demikian, Ordo Caudata
dan Gymnophiona memiliki hubungan kekerabatan yang lebih dekat dibanding
Anura-Caudata maupun Anura-Gymnophiona.
Analisis Neighbor-Joining (NJ)
Analisis Neighbor-Joining digunakan untuk mengelompokkan individuindividu berdasarkan kemiripan genetik. Berdasarkan pohon filogeni hasil analisis
NJ (Gambar 1), diperoleh bahwa 67 spesies kelompok Ordo Caudata berada
dalam satu kelompok dengan 20 spesies kelompok Ordo Gymnophiona. Dengan
demikian, kelompok Ordo Caudata memiliki kekerabatan lebih dekat dengan
Gymnophiona.
8
Ordo Anura terbagi ke dalam dua kelompok cabang. Sebagian besar (36
spesies) membentuk kelompok tersendiri yang terpisah dari kelompok Caudata
dan Gymnophiona, sedangkan 22 spesies berada dalam satu kelompok cabang
dengan kelompok ordo Caudata dan Gymnophiona. Topografi pohon filogeni
analisis NJ dengan model mutasi K2P dan NoD yang lebih rinci mengelompokan
organisme dalam tingkat famili beserta jumlah individu dapat dilihat dalam
gambar 2. Angka yang terdapat dalam tanda [ ] merupakan jumlah spesies dari
masing-masing famili.
Gambar 1 Pohon filogeni Neighbor-joining kelompok ordo Anura, Caudata dan
Gymnophiona menggunakan basa pertama dan kedua setiap kodon
dengan model mutasi K2P dan NoD
Analisis NJ dengan model mutasi K2P dan NoD menghasilkan struktur
pohon filogeni yang sama (Gambar 1 dan 2). Masing-masing famili (Gambar 2)
menempati posisi yang sama pada pohon filogeni baik pada Analisis NJ
menggunakan model K2P maupun NoD. Perbedaan hasil analisis dari kedua
model tersebut hanya terdapat pada nilai persentase keakuratan pengelompokan
individu. Nilai persentase keakuratan pengelompokan tersebut ditunjukkan oleh
angka yang terdapat di setiap percabangan.
9
Gambar 2 Pohon filogeni hasil analisis NJ tingkat famili yang tergolong ke dalam
Kelas Amphibia menggunakan model mutasi K2P dan NoD
Jika dibandingkan dengan informasi taksa masing-masing individu yang
tercantum pada bagian “ORGANISM” dari data yang diunduh, topografi pohon
filogeni NJ tersebut mengalami penyimpangan. Penyimpangan tersebut
disebabkan oleh ketidaksesuaian hubungan kekerabatan ketiga Ordo berdasarkan
topografi pohon filogeni NJ dan hubungan kekerabatan berdasarkan kelompok
taksa. Pengelompokan Ordo Anura dan Caudata seharusnya memiliki hubungan
10
kekerabatan yang lebih dekat karena berada dalam satu kelompok Superordo,
yakni Batrachia. Menurut Zardoya dan Meyer (1996), gen mitokondria berpotensi
menyesatkan hasil pengelompokan taksa karena tidak semua gen-gen dalam
genom mitokondria dapat merepresentasikan seluruh genom mitokondria. Oleh
karena itu, kualitas representasi gen tunggal terhadap total genom mitokondria
dikelompokkan menjadi tiga kelompok (Zardoya dan Meyer 1996), yaitu:
1. Baik
(ND2, ND4, ND5, CytB dan COI)
2. Menengah (CO2, CO3, ND1 dan ND6)
3. Buruk
(ND3, ND4L, ATP6 dan ATP8).
SIMPULAN
Analisis yang dilakukan terhadap runutan nukleotida gen penyandi protein
pada mtDNA Amphibia menunjukkan bahwa Ordo Caudata memiliki hubungan
kekerabatan yang lebih dekat dengan Gymnophiona dibanding Ordo Anura. Nilai
rasio transisi-transversi lebih besar dari 1 (R>1) yang terdapat pada basa pertama
dan kedua setiap kodon menunjukkan bahwa laju mutasi transisi lebih tinggi dari
laju transversi. Pada basa ketiga laju mutasi transisi lebih rendah dari laju
transversi (R
PADA AMPHIBIA
JOHANSON SIMARMATA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Gen
Mitokondria Penyandi Protein pada Amphibia adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Johanson Simarmata
NIM G34070030
ABSTRAK
JOHANSON SIMARMATA. Analisis Gen Mitokondria Penyandi Protein pada
Amphibia. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan R.R. DYAH
PERWITASARI.
Aktivitas transkripsi gen sebagian besar terjadi pada utas H, terdiri dari 2
gen penyandi rRNA, 14 gen penyandi tRNA dan 12 gen penyandi protein yang
memiliki laju mutasi yang berbeda-beda. Evolusi dan laju mutasi yang berbedabeda dapat menyebabkan penyimpangan pengelompokan taksa. Penelitian ini
bertujuan menganalisis runutan nukleotida gen penyandi protein yang
ditranskripsi dari utas H pada genom mitokondria Amphibia. Data runutan
nukleotida diunduh dari portal data NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Data
diolah menggunakan piranti lunak Textpad dan dianalisis menggunakan MEGA 5.
Hasil analisis menggunakan metode Neighbor-Joining dan Net Between Group
Mean Distances dengan model Kimura 2-parameter dan Number of Differences
menunjukkan bahwa hubungan kekerabatan Ordo Anura-Caudata lebih jauh
dibanding Anura-Gymnophiona maupun Caudata-Gymnophiona. Nilai rasio
transisi-transversi lebih dari 1 menunjukkan bahwa laju mutasi transisi lebih
tinggi dari laju transversi. Kodon awal yang digunakan pada 12 gen penyandi
protein mtDNA Amphibia terdiri dari ATA, ATC, ATG, ATT, GTG dan TTG.
Kodon akhir yang digunakan antara lain AGA, AGG, TAA, TAG, TA- dan T--.
ATG, GTG, TAA dan T-- merupakan kodon awal dan kodon akhir yang lebih
dominan digunakan.
Kata kunci: Amphibia, DNA, gen penyandi protein, mitokondria, mutasi
ABSTRACT
JOHANSON SIMARMATA. Analysis of Mitochondrial Protein-coding Genes on
Amphibian. Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and R.R. DYAH
PERWITASARI.
Activity of gene transcription occurs largely in the H-strand, consisting of
two genes coding for rRNA, 14 tRNA-coding and 12 protein-coding that have the
difference of mutation rates. Evolution and difference of mutation rates can lead
to deviations of taxa’s grouping. This study aimed to analyze the nucleotide
sequences of protein-coding genes transcribed from the genome mitochondrial
Amphibians H-strand. Nucleotide sequences were downloaded from NCBI
database. Data were processed using Textpad and analyzed using MEGA 5
software. Results of the analysis using Neighbor-Joining and Net Between Group
Mean Distances method with Kimura 2-parameter and Number of Differences
models indicated that relationship of Order Anura-Caudata was distantly separated
Gymnophiona-Anura and Caudata-Gymnophiona. Number of transitiontransversion ratio more than 1 (>1) revealed that transition rate are higher than
transversion. Start codons used in 12 protein-coding genes consist of ATA, ATC,
ATG, ATT, GTG and TTG. Stop codons are used among others AGA, AGG,
TAA, TAG, TA-and T--. ATG, GTG, TAA and T-- are start codons and stop
codons are used more dominant.
Key words: Amphibia, DNA, protein-coding genes, mitochrondrial, mutation
ANALISIS GEN MITOKONDRIA PENYANDI PROTEIN
PADA AMPHIBIA
JOHANSON SIMARMATA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Analisis Gen Mitokondria Penyandi Protein pada Amphibia
Nama
: Johanson Simarmata
NIM
: G34070030
Disetujui oleh
Dr Ir Achmad Farajallah, MSi
Pembimbing I
Dr Ir R.R. Dyah Perwitasari, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan dalam memenuhi
salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Sains di Departemen Biologi FMIPA
IPB. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober
2013 ini adalah analisis DNA mitokondria, dengan judul Analisis Gen
Mitokondria Penyandi Protein pada Amphibia.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir Achmad Farajallah, MSi
dan Ibu Dr Ir R.R. Dyah Perwitasari, MSc selaku pembimbing yang senantiasa
bersabar dalam membimbing dan memberi arahan. Terima kasih kepada Bapak
Prof Dr Ir Alex Hartana, MSc sebagai penguji karya ilmiah. Terima kasih kepada
seluruh staf Departemen Biologi IPB atas bimbingannya selama penulis menjalani
studi di Departemen Biologi IPB. Terima kasih penulis sampaikan kepada Bunda
beserta seluruh keluarga, yang senantiasa memberi dukungan, doa dan kasih
sayang, terutama kepada Juspen Simarmata, Januardi Simarmata, Onanto Silalahi,
Eva Netty, Marissa Kristina dan Pahotan Simarmata yang tiada hentinya
memberikan semangat dan dukungan materi. Penulis juga sampaikan terima kasih
kepada Bapak Dame RG, Ariston Simarmata, Dewi Putri Basani dan Ika Indah
Sari yang selalu memberikan semangat, dan terlebih kepada teman-teman
angkatan 44 yang telah banyak membantu selama masa studi di IPB.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2014
Johanson Simarmata
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
PENDAHULUAN
Tujuan Penelitian
1
1
METODE
2
Bahan
2
Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Pengunduhan data
3
Analisis laju substitusi
4
Analisis jarak genetik
6
Analisis Neighbor-Joining (NJ)
7
SIMPULAN
10
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
22
DAFTAR TABEL
1 Hasil seleksi data yang digunakan dalam analisis gen-gen penyandi
protein pada genom mtDNA Amphibia
2 Jenis-jenis kodon awal yang digunakan pada 12 gen penyandi protein
mtDNA Amphibia
3 Jenis-jenis kodon akhir yang digunakan pada 12 gen penyandi
protein mtDNA Amphibia
4 Kode genetik mitokondria vertebrata
5 Hasil analisis laju substitusi pada basa pertama, kedua, dan ketiga
genom penyandi protein pada mtDNA Amphibia menggunakan
Nucleotide Pair Frequencies
6 Analisis jarak genetik antar kelompok ordo Amphibia berdasarkan
basa pertama dan kedua pada 12 gen-gen penyandi protein mtDNA
Amphibia menggunakan model NoD dan K2P
3
4
4
5
6
7
DAFTAR GAMBAR
1 Pohon filogeni hasil analisis Neighbor-joining kelompok ordo Anura,
Caudata dan Gymnophiona menggunakan basa pertama dan kedua
setiap kodon dengan model evolusi K2P dan NoD
2 Pohon filogeni hasil analisis NJ tingkat famili yang tergolong dalam
Kelas Amphibia menggunakan metode K2P dan NoD
8
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Contoh data runutan nukleotida mtDNA yang diunduh dari portal
data NCBI
13
PENDAHULUAN
Amphibia merupakan hewan vertebrata yang pada saat fase berudu
menetap di dalam air, dan pindah ke daratan pada saat fase dewasa. Amphibia
dikelompokkan ke dalam tiga Ordo, yaitu Anura, Caudata dan Gymnophiona
(Pough et al. 2005). Hubungan filogenetik antar ketiga Ordo tersebut relatif stabil
berdasarkan berbagai jenis data, mulai dari data morfologi, gen-gen fungsional
yang ada di inti sel, sampai data DNA mitokondria (Frost et al. 2006).
DNA mitokondria (mtDNA) merupakan DNA yang hanya diturunkan dari
induk betina tanpa mengalami rekombinasi (Brown 1983). Perbedaan mtDNA
antar individu disebabkan oleh mutasi gen (Nei dan Kumar 2000). DNA
mitokondria memiliki sifat khusus dibandingkan dengan DNA inti, yaitu: jumlah
kopi yang tinggi, ukurannya relatif kecil (14-39 kb), dan memiliki laju kecepatan
evolusi yang tinggi (Kocher et al. 1989). Keunikan lainnya dari mtDNA
dibandingkan dengan DNA inti adalah perbedaan penyandian kode genetik. Kodon
UGA tidak dibaca sebagai kodon akhir melainkan sebagai triptofan, kodon AGA dan
AGG tidak dibaca sebagai arginin melainkan sebagai kodon akhir, dan AUA dibaca
sebagai methionin (Nei dann Kumar 2000). DNA mitokondria sudah dibuktikan dan
diyakini oleh banyak peneliti dapat digunakan sebagai penanda molekuler dalam
mempelajari keragaman genetik, baik pada tingkat individu, populasi, maupun
pada level taksonomi yang lebih tinggi pada hewan (Avise dan Lansman 1983;
Brown 1983). DNA mitokondria merupakan DNA utas ganda yang terdiri dari
utas heavy (H) dan utas light (L). Utas H memiliki berat molekul yang lebih besar
dibanding utas L karena utas H memiliki lebih banyak kandungan basa purin
(Anderson et al. 1981).
Menurut Brown (1983), mtDNA memiliki 13 gen penyandi protein, 2 gen
penyandi rRNA dan 22 gen penyandi tRNA. Sebagian besar gen-gen tersebut
ditranskripsi dari untai H, yaitu 2 gen penyandi rRNA, 14 gen penyandi tRNA,
dan 12 gen penyandi protein. Setiap gen dari genom mitokondria memiliki laju
evolusi yang berbeda-beda. Perbedaan laju evolusi bagian gen tersebut dapat
digunakan untuk mempelajari proses evolusi, hubungan kekerabatan antar
individu atau kelompok taksa. Bagian-bagian gen yang memiliki laju mutasi
tinggi biasanya digunakan untuk menganalisis hubungan intraspesies, misalnya
menguji paternitas dan mempelajari pola penyebaran. Ruas gen-gen yang
memiliki laju mutasi rendah digunakan untuk menganalisis hubungan
interspesifik , misalnya hubungan kekerabatan antar taksa.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis runutan nukleotida gen penyandi
protein yang ditranskripsi dari utas H pada genom mitokondria Amphibia.
2
METODE
Bahan
Bahan yang digunakan adalah data sekunder berupa runutan nukleotida
DNA mitokondria taksa Amphibia yang diunduh dari portal data nukleotida
National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Portal data NCBI
menyatukan data runutan nukleotida dari DNA Data Bank of Japan (DDBJ) dan
European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Data yang diunduh memuat
informasi tentang kode akses, definisi data, referensi, hirarki taksonomi organisme,
runutan nukleotida, beserta posisi gen-gen penyandi protein, tRNA dan rRNA,
dan beberapa “features” lainnya. (Lampiran 1).
Analisis Data
Data runutan nukleotida mtDNA taksa Amphibia diunduh dari portal data
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pada Oktober 2013. Kata kunci pencarian
yang digunakan pada opsi pencarian nukleotida adalah “amphibia mitochondri*
cytochrome Val Glu”. Penggunaan wildcard “*” bertujuan untuk menentukan
pilihan kata yang diawali oleh “mitochondri”, seperti mitochondria,
mitochondrion dan mitochondrial. Sedangkan “cytochrome Val Glu” untuk
mencakup whole genome mitochondria. Hasil pencarian disimpan dalam bentuk
format “GenBank (full)”.
Data diseleksi berdasarkan kode akses data. Data yang akan digunakan
adalah data dengan kode akses NC. Kode akses NC menunjukkan bahwa data
tersebut telah diverifikasi oleh kurator NCBI. Jika ada lebih dari satu data runutan
lengkap genom mitokondria yang di-upload oleh lebih dari satu penulis atau
lembaga, maka kurator NCBI akan memilih satu data yang dianggap sebagai
referensi data untuk spesies tersebut.
Ruas-ruas gen penyandi protein dipisahkan menggunakan piranti lunak
Textpad v7 berdasarkan informasi batas gen-gen yang tercantum dalam “features”
data. Runutan nukleotida tiap jenis gen disejajarkan (alignment) menggunakan
MUSCLE yang tertanam dalam MEGA5 dengan kode genetik “vertebrate
mitochondrial” (Tamura et al. 2011). Pemeriksaan hasil pensejajaran dilakukan
secara manual dibantu oleh hasil deduksi asam aminonya. Jumlah kodon awal
diperoleh dari hasil pensejajaran yang diedit sedemikian rupa dan dihitung
menggunakan piranti lunak Microsoft Office Excel 2007. Hasil pensejajaran
diubah ke dalam format MEGA (.meg) dan selanjutnya dilakukan analisis
keragaman nukleotida, antara lain analisis laju mutasi menggunakan Nucleotide
Pair Frequencies, jarak genetik dengan metode Net Between Group Mean
Distances dan Neighbor-Joining (NJ) dengan menggunakan model substitusi
Number of Differences (NoD) dan Kimura 2-parameter (K2P), dengan pengujian
topografi pohon filogeni berdasarkan bootstrap 1000 kali pengulangan (Tamura et
al. 2011). Model substitusi Number of Differences memberikan bobot yang sama
(α) antara laju mutasi transisi dan transversi, sedangkan model mutasi Kimura 2Parameter memberikan bobot yang berbeda (α atau ß) antara mutasi transisi dan
transversi (Nei dan Kumar 2000).
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengunduhan data
Jumlah data mitochondrial whole genome taksa Amphibia dari hasil
pencarian data yang tersedia di basis data hingga Oktober 2013 berjumlah 447
entri. Data hasil seleksi yang dianalisis lebih lanjut sebanyak 145 entri (Tabel 1).
Dari hasil seleksi data pengelompokan gen penyandi protein, runutan nukleotida
penyandi gen ND5 pada organisme Hoplobatrachus rugulosus (NC_019615)
mengalami duplikasi. Duplikasi gen merupakan kejadian bergandanya suatu
daerah bagian DNA yang berfungsi sebagai gen. Kopi kedua dari gen sering kali
terbebas dari tekanan seleksi dan tidak memiliki efek negatif terhadap inang.
Runutan nukleotida gen ND5 yang digunakan dari data NC_019615 dipilih salah
satu. Spesies Polipedates megachepalus (NC_006408) tidak memiliki runutan
nukleotida penyandi gen ND5 dan ATP8 di dalam data. Oleh karena itu, data
NC_006408 tidak digunakan lebih lanjut.
Tabel 1 Hasil seleksi data yang digunakan dalam analisis gen-gen penyandi
protein pada genom mtDNA Amphibia
Pemilihan Data
Data yang diunduh dari basis data nukleotida
Seleksi data dengan kode akses NC
Seleksi data setelah diseragamkan untuk masing-masing gen
Jumlah Entri
447
146
145
Penggunaan kodon awal pada runutan nukleotida gen penyandi protein
mtDNA Amphibia bervariasi (Tabel 2), antara lain ATA, ATC, ATG, ATT, GTG
dan TTG. Pada umumnya kodon awal yang paling banyak digunakan adalah ATG
(85,11%), sedangkan kodon awal yang paling sedikit digunakan adalah ATC
(0,35%). Penggunaan kodon awal pada gen Sitokrom C oksidase subunit 1 (CO1)
didominasi oleh kodon GTG (106 kodon), lalu diikuti oleh ATA dan ATG dengan
jumlah masing-masing 28 dan 11 kodon. Penggunaan kodon akhir secara
keseluruhan (Tabel 3) didominasi oleh TAA dan kodon akhir tidak lengkap T--,
dengan jumlah kodon masing-masing 694 dan 711. Kodon akhir TAA dominan
digunakan pada gen ATP6, ATP8, CO1, ND4L dan ND5 sedangkan T-- dominan
digunakan pada gen CO2, CO3, CytB, ND1, ND2, ND3 dan ND4. Adapun kodon
lain yang digunakan sebagai kodon akhir antara lain TA-, TAG, AGA dan AGG
dengan jumlah masing masing 123, 114, 55 dan 43 kodon.
Sebagian besar kodon awal pada 13 gen penyandi protein mtDNA
Amphibia menggunakan kodon awal ATG (Roe et al. 1985), namun penggunaan
kodon awal ATG tidak dominan pada gen CO1. Gen CO1 pada Chordata (kecuali
Mamalia) dominan menggunakan GTG sebagai kodon awal (Zardoya dan Meyer
2000)
4
Tabel 2 Jenis-jenis kodon awal yang digunakan pada 12 gen penyandi protein
mtDNA Amphibia
Gen
ATP6
ATP8
ND1
ND2
ND3
ND4
ND4L
ND5
CO1
CO2
CO3
CytB
Total
Persentase (%)
ATA
ATC
3
1
6
8
14
2
2
5
28
1
0
1
71
4,08
0
0
1
3
0
0
0
2
0
0
0
0
6
0,35
Kodon awal
ATG
ATT
136
142
113
113
118
142
139
134
11
114
145
144
1481
85,11
0
0
6
19
4
0
0
1
0
0
0
0
30
1,72
GTG
TTG
5
2
10
2
9
1
4
3
106
0
0
0
142
8,16
1
0
9
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
0,58
Tabel 3 Jenis-jenis kodon akhir yang digunakan pada 12 gen penyandi protein
mtDNA Amphibia
Gen
AGA
AGG
0
1
13
2
0
5
1
5
0
6
1
21
55
3,16
0
0
35
0
0
0
0
3
0
1
0
4
43
2,47
ATP6
ATP8
CO1
CO2
CO3
CytB
ND1
ND2
ND3
ND4
ND4L
ND5
Total
Persentase (%)
Kodon akhir
TAA
TAG
102
137
66
11
2
29
13
50
48
18
138
80
694
39,89
2
7
22
1
1
6
20
18
17
2
4
14
114
6,55
TA-1
T--1
13
0
2
7
24
21
43
3
3
0
2
5
123
7,07
28
0
7
124
118
84
68
66
77
118
0
21
711
40,86
1
Incomplete stop codon
Analisis laju substitusi
Mutasi yang terjadi pada basa pertama dan kedua dari setiap kodon akan
menyebabkan peluang perubahan jenis asam amino yang ditranslasi menjadi lebih
besar. Namun jika mutasi terjadi pada basa ketiga setiap kodon, seringkali kodon
yang baru tetap menyandikan protein yang sama dengan kodon awal sebelum
mutasi. Hal tersebut disebabkan oleh adanya kesamaan asam amino yang dibawa
oleh tRNA meskipun basa ketiga berbeda (Tabel 4). Kodon-kodon yang
5
menghasilkan jenis asam amino yang sama dinamakan kodon sinonim (Nei dan
Kumar 2000).
Perubahan asam amino disebabkan oleh perubahan urutan basa nukleotida,
akan tetapi perubahan sebuah basa nukleotida pada DNA tidak selamanya
mengubah asam amino karena satu asam amino dapat disandikan lebih dari satu
jenis kodon. Mutasi gen terjadi karena perubahan susunan asam amino akibat
terjadinya penambahan (insersi) atau kehilangan (delesi) pasangan basa, atau
pergantian pasangan basa (substitusi) yang satu dengan jenis basa yang lain.
Insersi dan delesi menghasilkan dampak yang signifikan terhadap produksi
polipeptida. Kehilangan atau penambahan nukleotida pada suatu titik akan
mengubah kerangka baca (frameshift) seluruh kodon yang berada di belakang
titik tersebut. Dengan demikian, polipeptida yang dihasilkan akan menyimpang
dari polipeptida yang seharusnya disintesis (Griffiths et al. 2000). Mutasi akibat
pergantian pasangan basa dibedakan menjadi 2 jenis, yakni transisi dan transversi.
Transisi merupakan mutasi yang terjadi akibat substitusi basa purin (Adenin,
Guanin) dengan purin lainnya, atau basa pirimidin (Sitosin, Timin) dengan
pirimidin lainnya. Sedangkan transversi merupakan mutasi akibat substitusi purin
dengan pirimidin atau sebaliknya (Nei dan Kumar 2000).
Tabel 4 Kode genetik mitokondria vertebrata1
1
Kodon
Hasil
Kodon Hasil
Kodon Hasil
Kodon Hasil
UUU
UUC
UUA
UUG
Phe
Phe
Leu
Leu
UCU
UCC
UCA
UCG
Ser
Ser
Ser
Ser
UAU
UAC
UAA
UAG
Tyr
Tyr
Ter
Ter
UGU
UGC
UGA
UGG
Cys
Cys
Trp (Ter2)
Trp
CUU
CUC
CUA
CUG
Leu
Leu
Leu
Leu
CCU
CCC
CCA
CCG
Pro
Pro
Pro
Pro
CAU
CAC
CAA
CAG
His
His
Gln
Gln
CGU
CGC
CGA
CGG
Arg
Arg
Arg
Arg
AUU
AUC
AUA
AUG
Ile
Ile
Met (Ile2)
Met
ACU
ACC
ACA
ACG
Thr
Thr
Thr
Thr
AAU
AAC
AAA
AAG
Asn
Asn
Lys
Lys
AGU
AGC
AGA
AGG
Ser
Ser
Ter (Arg2)
Ter (Arg2)
GUU
GUC
GUA
GUG
Val
Val
Val
Val
GCU
GCC
GCA
GCG
Ala
Ala
Ala
Ala
GAU
GAC
GAA
GAG
Asp
Asp
Glu
Glu
GGU
GGC
GGA
GGG
Gly
Gly
Gly
Gly
Tabel kode genetik mitokondria Vertebrata Nei dan Kumar (2000); 2 Hasil asam amino pada
DNA inti
6
Tabel 5 Hasil analisis laju substitusi pada basa pertama, kedua dan ketiga setiap kodon
genom penyandi protein pada mtDNA Amphibia menggunakan Nucleotide
Pair Frequencies
Gen
CO1
Basa ke-
Si
Sv
Rasio(R)
1
40,0
16,0
2
7,0
7,0
3
136,0 134,0
total
183,0 158,0
CO2 1
24,0
16,0
2
9,0
6,0
3
55,0
55,0
total
89,0
77,0
CO3 1
24,0
16,0
2
10,0
5,0
3
61,0
69,0
total
95,0
90,0
CytB 1
38,0
39,0
2
17,0
11,0
3
95,0 107,0
total
150,0 156,0
ND1 1
40,0
37,0
2
17,0
12,0
3
67,0
97,0
total
124,0 146,0
ND2 1
45,0
74,0
2
37,0
25,0
3
66,0 122,0
total
147,0 221,0
Si: Lajutransisi; Sv: Laju transversi; R: Si/Sv
2,5
0,9
1,0
1,2
1,5
1,5
1,0
1,1
1,5
1,9
0,9
1,1
1,0
1,6
0,9
1,0
1,1
1,4
0,7
0,9
0,6
1,5
0,5
0,7
Gen
ND3
ND4L
ND4
ND5
ATP6
ATP8
Basa ke1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
1
2
3
total
Si
Sv
Rasio(R)
16,0
9,0
25,0
50,0
16,0
8,0
20,0
44,0
68,0
45,0
98,0
211,0
75,0
54,0
136,0
265,0
35,0
18,0
48,0
100,0
8,0
6,0
9,0
24,0
17,0
5,0
37,0
59,0
18,0
7,0
32,0
57,0
89,0
38,0
158,0
285,0
112,0
55,0
196,0
363,0
31,0
9,0
78,0
117,0
12,0
9,0
18,0
39,0
0,9
1,8
0,7
0,8
0,9
1,2
0,6
0,8
0,8
1,2
0,6
0,7
0,7
1,0
0,7
0,7
1,1
2,1
0,6
0,9
0,7
0,7
0,5
0,6
Analisis laju substitusi (Tabel 5) berdasarkan basa nukleotida pertama,
kedua dan ketiga dari setiap kodon menunjukkan bahwa rentang nilai rasio (R)
antara laju transisi (Si) dengan laju transversi (Sv) berkisar antara 0,5-2,5.
Aktifitas mutasi transisi maupun transversi paling sedikit terjadi pada basa kedua.
Hal tersebut dapat dilihat dari nilai Si dan Sv basa kedua yang lebih kecil dari
nilai Si dan Sv pada basa pertama maupun ketiga. Nilai R rata-rata pada basa
pertama adalah 1,108; pada basa kedua R rata-rata 1,401 dan pada basa ketiga
nilai R rata-rata 0,725. Hasil nilai rata-rata R setiap kodon menandakan bahwa
laju transisi lebih tinggi dibanding laju transversi pada basa pertama dan kedua,
sedangkan pada basa ketiga laju transversi lebih tinggi dibanding laju transisi.
Nilai rata-rata rasio laju transisi dengan transversi sebesar 1,053. Hal tersebut
menandakan bahwa laju transisi lebih dominan dibanding laju translasi (Nei dan
Kumar 2000). Dengan demikian, pada umumnya mutasi transisi lebih sering
terjadi pada runutan nukleotida penyandi protein mtDNA Amphibia.
Analisis jarak genetik
Jarak genetik digunakan untuk melihat kedekatan hubungan genetik antar
Ordo. Tabel 6 merupakan hasil analisis jarak genetik antara Ordo Anura, Caudata
7
dan Gymnophiona menggunakan metode Net Between Group Mean Distances,
model Kimura 2-Parameter dan Number of Differences dengan bootstrap 1000
kali pengulangan. Analisis melibatkan 145 runutan nukleotida. Posisi basa yang
digunakan adalah basa pertama dan kedua setiap kodon. Semua posisi yang
mengandung kesenjangan dan data yang hilang telah dieliminasi. Total posisi basa
dalam data akhir berjumlah 6700. Perkiraan standard error ditunjukkan oleh angka
di belakang tanda ±. Analisis jarak genetik dilakukan menggunakan MEGA5.
Tabel 6 Hasil analisis jarak genetik antar kelompok ordo Amphibia menggunakan
Net Between Mean Group Distances berdasarkan basa pertama dan kedua
setiap kodon pada 12 gen-gen penyandi protein mtDNA Amphibia
menggunakan model K2P dan NoD
Anura
Caudata
Gymnophiona
Anura
0,056±0,002
0,052±0,002
Caudata
293,276±9,010
0,053±0,002
Gymnophiona
266,094±9,471
283,065±11,745
-
Angka di atas diagonal: Hasil analisis jarak genetik menggunakan model NoD
Angka di bawah diagonal: Hasil analisis jarak genetik menggunakan model K2P
Hasil perhitungan Analisis jarak genetik berdasarkan basa pertama dan
kedua dari setiap kodon (Tabel 6) menggunakan model K2P menunjukkan bahwa
jarak genetik antar kelompok Ordo berkisar antara 0,052 hingga 0,056. Jarak
genetik antara Ordo Anura dengan Caudata adalah 0,056 dengan simpangan baku
sebesar 0,002; Anura-Gymnophiona dan Caudata-Gymnophiona berturut-turut
adalah 0,052 dan 0,053 dengan masing-masing simpangan baku 0,002. Analisis
jarak genetik menggunakan model NoD juga menunjukkan perbandingan nilai
jarak genetik yang sama dengan perhitungan menggunakan model K2P.
Nilai jarak genetik terbesar terdapat pada Ordo Anura-Caudata, yaitu
sebesar 0,056 dengan model K2P dan 293,276 dengan model NoD. Nilai tersebut
lebih tinggi dibanding nilai jarak genetik Anura-Gymnophiona dan CaudataGymnophiona. Semakin besar nilai jarak genetik, maka semakin besar jumlah
perbedaan basa nukleotidanya. Semakin besar jumlah perbedaan basa nukleotida,
maka hubungan kekerabatan semakin jauh. Sebaliknya, semakin kecil nilai jarak
genetik maka semakin sedikit perbedaan basa nukleotidanya sehingga hubungan
kekerabatannya semakin dekat (Febriana 2011). Dengan demikian, Ordo Caudata
dan Gymnophiona memiliki hubungan kekerabatan yang lebih dekat dibanding
Anura-Caudata maupun Anura-Gymnophiona.
Analisis Neighbor-Joining (NJ)
Analisis Neighbor-Joining digunakan untuk mengelompokkan individuindividu berdasarkan kemiripan genetik. Berdasarkan pohon filogeni hasil analisis
NJ (Gambar 1), diperoleh bahwa 67 spesies kelompok Ordo Caudata berada
dalam satu kelompok dengan 20 spesies kelompok Ordo Gymnophiona. Dengan
demikian, kelompok Ordo Caudata memiliki kekerabatan lebih dekat dengan
Gymnophiona.
8
Ordo Anura terbagi ke dalam dua kelompok cabang. Sebagian besar (36
spesies) membentuk kelompok tersendiri yang terpisah dari kelompok Caudata
dan Gymnophiona, sedangkan 22 spesies berada dalam satu kelompok cabang
dengan kelompok ordo Caudata dan Gymnophiona. Topografi pohon filogeni
analisis NJ dengan model mutasi K2P dan NoD yang lebih rinci mengelompokan
organisme dalam tingkat famili beserta jumlah individu dapat dilihat dalam
gambar 2. Angka yang terdapat dalam tanda [ ] merupakan jumlah spesies dari
masing-masing famili.
Gambar 1 Pohon filogeni Neighbor-joining kelompok ordo Anura, Caudata dan
Gymnophiona menggunakan basa pertama dan kedua setiap kodon
dengan model mutasi K2P dan NoD
Analisis NJ dengan model mutasi K2P dan NoD menghasilkan struktur
pohon filogeni yang sama (Gambar 1 dan 2). Masing-masing famili (Gambar 2)
menempati posisi yang sama pada pohon filogeni baik pada Analisis NJ
menggunakan model K2P maupun NoD. Perbedaan hasil analisis dari kedua
model tersebut hanya terdapat pada nilai persentase keakuratan pengelompokan
individu. Nilai persentase keakuratan pengelompokan tersebut ditunjukkan oleh
angka yang terdapat di setiap percabangan.
9
Gambar 2 Pohon filogeni hasil analisis NJ tingkat famili yang tergolong ke dalam
Kelas Amphibia menggunakan model mutasi K2P dan NoD
Jika dibandingkan dengan informasi taksa masing-masing individu yang
tercantum pada bagian “ORGANISM” dari data yang diunduh, topografi pohon
filogeni NJ tersebut mengalami penyimpangan. Penyimpangan tersebut
disebabkan oleh ketidaksesuaian hubungan kekerabatan ketiga Ordo berdasarkan
topografi pohon filogeni NJ dan hubungan kekerabatan berdasarkan kelompok
taksa. Pengelompokan Ordo Anura dan Caudata seharusnya memiliki hubungan
10
kekerabatan yang lebih dekat karena berada dalam satu kelompok Superordo,
yakni Batrachia. Menurut Zardoya dan Meyer (1996), gen mitokondria berpotensi
menyesatkan hasil pengelompokan taksa karena tidak semua gen-gen dalam
genom mitokondria dapat merepresentasikan seluruh genom mitokondria. Oleh
karena itu, kualitas representasi gen tunggal terhadap total genom mitokondria
dikelompokkan menjadi tiga kelompok (Zardoya dan Meyer 1996), yaitu:
1. Baik
(ND2, ND4, ND5, CytB dan COI)
2. Menengah (CO2, CO3, ND1 dan ND6)
3. Buruk
(ND3, ND4L, ATP6 dan ATP8).
SIMPULAN
Analisis yang dilakukan terhadap runutan nukleotida gen penyandi protein
pada mtDNA Amphibia menunjukkan bahwa Ordo Caudata memiliki hubungan
kekerabatan yang lebih dekat dengan Gymnophiona dibanding Ordo Anura. Nilai
rasio transisi-transversi lebih besar dari 1 (R>1) yang terdapat pada basa pertama
dan kedua setiap kodon menunjukkan bahwa laju mutasi transisi lebih tinggi dari
laju transversi. Pada basa ketiga laju mutasi transisi lebih rendah dari laju
transversi (R