37± 2°C selama 24 jam. Kultur yang tumbuh selanjutnya dijadikan sebagai inokula untuk pengujian biokimia pada tahap konfirmasi koloni tipikal.
Identifikasi V. parahaemolyticus pada Udang Tambak
Identifikasi V.parahaemolyticus
dilakukan berdasarkan karakterisasi sifat fenotipik isolat secara biokimiawi. Identifikasi ini diawali dengan uji biokimia
pendahuluan merupakan uji presumtif V. parahaemolyticus. Pengujian ini meliputi pewarnaan gram, uji motilitas, uji oksidase, dan pertumbuhan pada media
agar triple sugar iron TSI. Hasil uji biokimia pendahuluan selanjutnya dilakukan uji biokimia lanjutan dengan API 20E biochemical test kit.
Uji biokimia pendahuluan Presumtif 1.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram merupakan uji awal untuk identifikasi bakteri. Tahapan ini diawali dengan fiksasi inokulum V. parahaemolyticus yang berasal dari
TSA+2.5NaCl. Preparat yang sudah kering kemudian ditambahkan pewarna crystal violet-ammonium oxalat
dan dilakukan pencucian pada air mengalir serrta dikeringkan. Preparat ditambahkan iodin selama 1 menit dan dilakukan
pencucian. Tahap berikutnya adalah dekolorisasi dengan penambahan etanol 95 pada preparat untuk menghilangkan warna biru hilang ± 30 detik. Tahap akhir
preparat diberikan safranin, pencucian dan dilakukan pengamatan di bawah mikroskop. V. parahaemolyticus merupakan gram negatif yang ditandai dengan
warna merah muda, berbentuk batang curve atau straight, dan membentuk koloni sel tunggal.
2. Uji moltilitas
Uji motilitas
V. parahaemolyticus dilakukan dengan cara inokulum dari
TSA+2.5NaCl diinokulasikan ke dalam media motility test medium MTM dengan kedalaman 23 dari ketinggian media MTM dan diinkubasikan pada suhu
37±2°C selama 18-24 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan bakteri yang berdifusi secara sirkular dari garis tusukan.
Uji oksidase
Uji oksidase dilakukan dengan cara sebanyak 1ose inokulum dari TSA+2.5NaCl diinokulasikan ke cawan petri yang mengandung media
TSA+2.5NaCl dan diinkubasi pada suhu 37±2°C selama 18-24 jam. Selanjutnya koloni diberikan 2-3 tetes pereaksi oksidase dan dilakukan
pengamatan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua pada koloni.
3. Pertumbuhan pada media agar triple sugar iron TSI
Koloni dari media TSA+2.5NaCl diinokulasikan pada media agar triple sugar iron
TSI dengan cara digoreskan pada agar miring dan ditusukkan pada agar tegak kemudian diinkubasikan pada suhu 37±2°C selama 18-24 jam.
Pertumbuhan V. parahaemolyticus akan menghasilkan warna merah alkalin pada agar miring dan asam warna kuning pada agar tegak serta tidak menghasilkan
gas dan H
2
S.
Uji biokimia lanjutan Konfirmasi
Koloni yang menunjukkan karakter biokimia sesuai dengan uji biokimia pendahuluan presumtif, selanjutnya dilakukan uji biokimia lanjutan dengan API
20E biochemical test kit. Pengujian ini dilakukan berdasarkan pengamatan
terhadap produksi metabolisme isolat pada media uji yang ditandai dengan perubahan warna. Hasil pengamatan kemudian dibaca menggunakan tabel
pembacaan reading table dan identifikasi bakteri berdasarkan Analytical Profile Index API
atau menggunakan identification software. Konfirmasi
V. parahaemolyticus dengan API 20E biochemical test kit
diawali dengan tahap preparasi suspensi isolat yaitu dengan cara homogenisasi isolat dari media TSA+2.5 NaCl yang telah diinkubasi pada 37± 2°C; 24 jam ke
dalam larutan NaCl 0.85. Selanjutnya suspensi isolat diinokulasikan ke dalam masing-masing sumur media uji yang berisi reagen-reagen dalam bentuk kering.
Inokulasi suspensi isolat pada masing-masing media uji dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut :
• Suspensi isolat diinokulasikan penuh ke dalam microtube media uji ONPG, TDA, IND dan gula-gula pereduksi.
• Suspensi isolat diinokulasikan di bawah garis tes microtube pada media uji LDC, ODC, ADH, H
2
S, dan URE dan ditambahkan mineral oil. • Suspensi isolat diinokulasikan penuh ke dalam microtube dan sumur pada
media uji CIT, VP, dan GEL. Media uji selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37 ± 2°C selama 18-24
jam. Hasil metabolisme ditandai dengan adanya perubahan warna pada masing- masing media uji, dimana untuk media uji indol, VP dan TDA masing-masing
dilakukan penambahan reagen yaitu : • Untuk pengujian indol ditambahkan 1 tetes reagen kovac’s dan pembacaan
dilakukan beberapa menit setelah penambahan reagen. • Untuk pengujian VP ditambahkan masing-masing 1 tetes reagen barritt’s
A dan B dan pembacaan dilakukan maksimal 10 menit setelah penambahan reagen.
• Untuk pengujian TDA ditambahkan 1 tetes reagen FeCl
3
. Seluruh hasil reaksi metabolisme kemudian dilakukan pembacaan untuk
penentuan reaksi positif dan negatif. Hasil reaksi dikelompokkan pada tiap 3 reaksi dengan nilai pada tiap reaksi positif adalah 1, 2, dan 4 sehingga dihasilkan
7 digit angka dan selanjutnya dilakukan pembacaan pada Analytical Profile Index API
atau menggunakan identification software. Hasil uji biochemical test kit
dicatat dan dilanjutkan dengan identifikasi V. parahaemolyticus patogenik berdasarkan gen penyandi tdh dan trh menggunakan metode PCR
Identifikasi V. parahaemolyticus Patogenik dari Isolat yang Berasal dari
Udang Tambak 1.
Isolasi DNA genom bakteri Ausubel et al. 1987; Brown, 1992
Isolat V. parahaemolyticus dari TSA+2.5NaCl diinokulasikan ke dalam 5ml TSB+2.5NaCl dan diinkubasikan di dalam shaker waterbath dengan
kecepatan 130 rpm pada suhu 37±2°C; 18-24 jam. Kultur sel dari TSB+2.5NaCl selanjutnya dilakukan isolasi DNA genom. Sebanyak 3ml sel
bakteri yang kompeten OD600 = 0.4-0.5 dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 13500 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensikan
dengan 250µl bufer TE menggunakan vorteks. Selanjutnya ditambahkan 50µl SDS 10 dan dihomogenisasi perlahan-lahan dengan cara membalikkan tabung
beberapa kali sampai suspensi terlihat jernih. Sejumlah 3µl proteinase-K 20mgml ditambahkan dan diinkubasi pada 37
°C selama 1 jam. Setelah 1 jam, ditambahkan 10µl RNase, 80µl CTABNaCl 10 CTAB dalam 0.7 M NaCl,
dan 100µl NaCl 5M, kemudian diinkubasi pada 65 °C selama 10-20 menit.
Campuran fenol : kloroform : isoamilalkohol 25:24:1 ditambahkan ke dalam volume campuran dengan rasio 1:1 dan dihomogenisasi menggunakan vorteks
selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada 13500 rpm selama 10 menit untuk memisahkan fase campuran. Fase cairan top layer dipindahkan ke
tabung mikroeppendorf 1.5 ml yang baru, lalu ditambahkan dengan kloroform dengan volume yang sama. Pencampuran dilakukan dengan membolak-balikkan
tabung beberapa kali, kemudian disentrifugasi kembali pada 13500 rpm selama 10 menit hingga diperoleh kembali fase terpisah. Fase cairan top layer dipindahkan
kembali ke tabung mikroeppendorf 1.5 ml yang baru. Selanjutnya ditambahkan 0.1 volume sodium asetat 3M dan 0.6 volume isopropanol dan dilakukan
pencampuran dengan membolak-balikkan tabung beberapa kali. Tabung diinkubasi pada -20
°C selama 1 jam atau pada -80°C selama 15 menit, selanjutnya presipitasi DNA dilakukan dengan sentrifugasi pada 13500 rpm selama 10 menit.
Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, kemudian ditambahkan 500µl etanol 70 dan tabung dibolak-balikkan beberapa kali. Setelah itu dilakukan sentrifugasi
kembali pada 13500 rpm selama 10 menit. Pelet DNA dikeringkan dengan meletakkannya dalam kondisi tabung terbuka pada laminar air flow selama 15
menit, kemudian diresuspensi dalam 100µl TE atau akuades steril. Untuk penyimpanan jangka panjang, larutan DNA disimpan pada suhu -20
°C. Verifikasi DNA genom bakteri dilakukan dengan elektroforesis
menggunakan gel agarosa 2 TBE1X pada 100V selama 45 menit. DNA merupakan molekul bermuatan negatif sehingga bila diletakkan di medan listrik
maka DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan DNA tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan gel dan arus
listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA dicampur dengan penyangga muatan berwarna
loading dye yang berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA berada di bagian bawah sumur. Pewarna loading dye ditambahkan untuk memudahkan
peletakan sampel DNA ke dalam sumur. Loading dye juga berfungsi agar DNA dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang diperkirakan sehingga dapat
sebagai tanda migrasi DNA Brown, 1992. Visualisasi DNA dilakukan dengan pewarnaan DNA pada gel agarosa
yang ditambahkan pewarna sybr safe gold. Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan sybr safe gold selama 30 menit dan selanjutnya gel diamati di
bawah sinar ultraviolet dengan menggunakan UV transillumination. Sybr safe gold
dapat berinteraksi diantara pasangan basa pada DNA dan menangkap sinar ultraviolet sehingga pendaran dari ultraviolet dapat terlihat. Pita DNA dapat
dilihat karena gel disinari oleh sinar ultraviolet pada UV transiluminator Brown, 1992.
DNA genom selanjutnya diukur tingkat kemurniannya dan dikuantifikasi untuk mengetahui konsentrasi mengunakan DNARNAprotein Analyser. Tingkat
kemurnian DNA dihitung berdasarkan rasio absorbansi yang diukur pada panjang gelombang 260nm dan 280nm dimana tingkat kemurnian DNA dianggap cukup
baik jika memiliki rentang nilai rasio 1.8-2.0. Konsentrasi DNA genom dihitung berdasarkan rumus : [DNA] = OD 260 X 50 X FP; dimana FP adalah faktor
pengenceran Ausubel et al. 1987.
2. Amplifikasi gen tdh dan trh Tada et al. 1992