Keragaman Patotipe Xanthomonas Oryzae Pv Oryzae Pada Tanaman Padi Di Beberapa Kabupaten Di Sulawesi Selatan

KERAGAMAN PATOTIPE Xanthomonas oryzae pv. oryzae
PADA TANAMAN PADI DI BEBERAPA KABUPATEN
DI SULAWESI SELATAN

ASYSYUURA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Keragaman Patotipe
Xanthomonas oryzae pv. oryzae di Beberapa Kabupaten di Sulawesi Selatan
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Asysyuura
A352120141

RINGKASAN
ASYSYUURA. Keragaman Patotipe Xanthomonas oryzae pv. oryzae pada
Tanaman Padi di Beberapa Kabupaten di Sulawesi Selatan. Dibimbing oleh
ABDJAD ASIH NAWANGSIH dan KIKIN HAMZAH MUTAQIN.
Sulawesi Selatan (Sulsel) adalah salah satu provinsi di wilayah timur
Indonesia yang menjadi sentra produksi padi dalam mencukupi kebutuhan pangan
nasional termasuk Sulawesi, Maluku dan Papua. Salah satu kendala dalam
produksi padi adalah adanya faktor biotik yang mempengaruhi pertumbuhan
tanaman diantaranya infeksi bakteri patogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae yang
menyebabkan penyakit hawar daun atau kresek. Tingginya kehilangan hasil panen
yang disebabkan oleh bakteri ini mendorong diupayakannya cara pengendalian
yang tepat. Berbagai strategi pengendalian yang telah diupayakan untuk menekan
penyakit ini namun sejauh ini penggunaan varietas tahan masih dianggap lebih

efisien dan relatif lebih mudah.
Informasi tentang perkembangan penyakit dan distribusi patotipe X. oryzae
pv. oryzae dapat membantu dalam pengambilan keputusan tindakan pengendalian
yang tepat, khususnya dalam penentuan varietas yang tahan terhadap bakteri
tersebut untuk digunakan dalam pola tanam. Bakteri ini dilaporkan memiliki
keragaman patotipe yang didasarkan pada kemampuan berbeda dalam
menginfeksi tanaman padi pada berbagai varietas. Bakteri ini dilaporkan memiliki
sifat yang mudah berubah dalam membentuk patotipe baru. Oleh karena itu
pemantauan atau monitoring komposisi dan dominansi patotipe patogen perlu
dilakukan secara teratur. Suatu varietas yang tahan terhadap bakteri X. oryzae pv.
oryzae seringkali dijadikan komponen utama dalam pengendalian dan ditanam
terus menerus yang dapat menjadi salah satu faktor memicu munculnya patotipe
baru. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi sebaran dan keragaman
patotipe X. oryzae pv. oryzae yang berada di area penanaman padi sawah
dibeberapa kabupaten di Sulawesi Selatan.
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yang meliputi pengambilan
sampel tanaman sakit di lapangan yang meliputi Kabupaten Bantaeng, Barru,
Jeneponto, Maros, Pangkep, Bone dan Takalar, isolasi dan pemurnian bakteri,
identifikasi dan deteksi bakteri X. oryzae pv. oryzae hingga pengelompokan
patotipe bakteri yang dilakukan dengan metode Kozaka yang menggunakan lima

varietas tanaman padi diferensial yaitu Tetep, Kogyoku, Waseaikoku, Java14, dan
Kinmase, masing-masing tanaman tersebut akan menunjukkan respon gejala yang
berbeda jika diinokulasi X. oryzae pv. oryzae patotipe berbeda. Deteksi dan
identifikasi dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) menggunakan
pasangan primer spesifik XOR-F(5'GCATGACGTCATCGTCCTGT-3') dan
XOR-R2 (5'-CTCGGAGCTATATGCCGTGC-3') yang mengamplifikasi wilayah
intergenik gen 16S-23S rDNA dengan ukuran DNA sasaran ± 470 pb. Amplikon
DNA hasil PCR dilakukan perunutan dan dianalisis homologinya dengan bakteri
lain yang tersimpan pada data GenBank melalui program BLAST dan dilakukan
analisis kekerabatan menggunakan metode analisis filogenetika.
Dalam penelitian ini diperoleh 29 isolat bakteri yang positif sebagai X.
oryzaepv. oryzae yang terdiri dari patotipe III (6 isolat), patotipe IV (21 isolat),
patotipe XII (2 isolat). Hasil analisis sekuen nukleotida isolat Xo126, Xo129,

Xo118, Xo132, Xo135, Xo131, Xo130, Xo111, Xo137, Xo136, Xo114 dan
Xo127 dengan program BLAST menunjukkan isolat bakteri X. oryzae pv. oryzae
asal Sulawesi Selatan-Indonesia memiliki kekerabatan yang dekat terhadap isolat
dari negara lain seperti Cina, Korea, India, Jepang, dan Amerika dengan tingkat
homologi berkisar 99.5-100%. Patotipe XII merupakan patotipe yang selama ini
belum pernah dilaporkan di Sulawesi Selatan, dalam penelitian ini telah

ditemukan di Kabupaten Pangkep dan Takalar.
Informasi terkini tentang distribusi dan komposisi patotipe X. oryzae pv.
oryzae di wilayah penanaman padi di Sulawesi Selatan ini dapat dimanfaatkan
sebagai dasar pertimbangan menentukan tindakan pengendalian yang akan
digunakan. Penentuan tindakan pengendalian yang tepat dan efisien dapat
menurunkan resiko kerusakan tanaman padi akibat bakteri X. oryzae pv. oryzae.
Kata Kunci: PCR, Patotipe, Tanaman diferensial, Sulawesi Selatan, Xanthomonas
oryzae pv. oryzae

SUMMARY
ASYSYUURA. Diversity of Xanthomonas oryzae pv. oryzae pathotypes from
Rice Fields in Some Districts in South Sulawesi Province. Supervised by
ABDJAD ASIH NAWANGSIH and KIKIN HAMZAH MUTAQIN
South Sulawesi (Sulsel) is one of the provinces that become a main rice
production in the eastern region of Indonesiato support national food sufficiency,
including Sulawesi, Maluku and Papua. One of the constraintsin the production of
rice is biotic factors, including a plant pathogenic bacteria Xanthomonas oryzae
pv. oryzae which causes leaf blight or commonly known as kresek disease. The
high yield losses caused by these bacteria become the consideration of the disease
control priority. Various control strategies have been attempted to minimize the

impact of bacterial infections including the use of resistant varieties, which is
considered to be an efficient and relatively easier control to apply.
X. oryzae pv. oryzae is known to have many pathotypes indicated with the
difference ability to infect different varieties of rice. The knowledge of
distribution of X. oryzae pv. oryzae pathotypes in a certain region is important to
make decision of proper control of the disease, particularly in choosingwhich
varieties whose resistance is suitable to bacterial pathotypes present in the area.
Furthermore, the bacterium are often to form new pathotype therefore, monitoring
the composition and dominance of pathotype in a region is required to conduct
regularly. Once a variety known to be resistant to the pathogenic bacteria, the
variety is usually used as the main component disease controland grown
continously. This research objective was to evaluate the distribution and diversity
of X. oryzae pv. oryzae pathotypes from lowland rice grown in some districts in
South Sulawesi province.
This research was conducted in several phases including rice plant field
sampling from seven districts of Bantaeng, Bone, Barru, Jeneponto, Maros,
Pangkep, and Takalar, bacterial isolation, bacterial detection and identification ,
and bacterial pathotype grouping using Kozaka method involving five differential
rice cultivar plants, i.e. Tetep, Kogyoku, Waseaikoku, Java14, and Kinmase. Each
of those cultivars will show different disease symptom against different bacterial

pathotypes which artificially inoculated. Detection and identification of the
bacteria used in this work as X. oryzae pv. oryzae were also carried out with
polymerase chain reaction (PCR) techniques using specific primer pair.The primer
pair used is XOR-F(5'-GCATGACGTCATCGTCCTGT-3') and XOR-R2 (5'CTCGGAGCTATATGCCGTGC-3')to amplify bacterial intergenic region of 16S23S rDNA genes with the DNA amplicon target in a size of ± 470 bp.
In this study, it is found 29 bacterial isolates which were positively
confirmed as X. oryzaepv. oryzae. Those bacterial isolates were consisting of
pathotype III (6 isolates), pathotype IV (21 isolates), pathotype XII (2 isolates).
The results analysis of nucleotide sequences of isolates Xo126, Xo129, Xo118,
Xo132, Xo135, Xo131, Xo130, Xo111, Xo137, Xo136, Xo114 and Xo127 with
the BLAST sequences showed that X. oryzae pv. oryzae isolates from South
Sulawesi-Indonesia were closely related to isolates from China, Korea, India,
Japan, and USA with a degree of homology ranges from 99.5-100%. X. oryzae pv.

oryzae pathotype XII is newly reported in this research to be present in this
Southern Sulawesi region, i.e. in Pangkep and Takalar Districts.
This recent information about distribution and composition of X. oryzae pv.
oryzae’s patotypes present in rice growing area in South Sulawesi from this study
could be used as consideration for proper control of the disease. Better control
strategy would save rice production from yield loss due to the pathogen supported
by this study.

Keywords:

PCR, Pathotype, Differential plants, South Sulawesi, Xanthomonas
oryzae pv. oryzae

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

1

KERAGAMAN PATOTIPE Xanthomonas oryzae pv. oryzae
PADA TANAMAN PADI DI BEBERAPA KABUPATEN
DI SULAWESI SELATAN

ASYSYUURA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

2

Penguji pada Ujian Tesis :

Dr Ir Abdul Munif, MScAgr

4

5

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2014 ini berjudul “Keragaman Patotipe
Xanthomonas oryzae pv. oryzae pada Tanaman Padi di Beberapa Kabupaten di
Sulawesi Selatan”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada IbuDr Ir Abdjad Asih Nawangsih,
MSi dan Bapak Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi selaku pembimbing dalam
penelitian dan penulisan karya ilmiah ini, Dr Ir Abdul Munif, MScAgr selaku
Penguji Luar Komisi dan Prof Dr Sri Hendrastuti Hidayat, MSc selaku Ketua
Program Studi Fitopatologi IPB. Tidak lupa pula penulis ucapkan terima kasih
kepada Bapak Ir Rinaldi Sjahril, MAgr PhD dosen Agronomi Universitas
Hasanuddin Makassar yang telah memberikan kesempatan untuk menggunakan
laboratorium dalam pelaksanaan penelitian yang penulis lakukan. Di samping itu,
penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Ir Sudir dari Balai Besar Penelitian
Tanaman Padi yang telah membantu memberikan informasi dan menyediakan

benih varietas diferensial Kinmase, Kogyoku, Java 14, Tetep, Waseaikuko sejak
penelitian ini dilaksanakan. Terimakasih juga disampaikan kepada Bapak Dr Ir
Daniel Rahim, MSc dan Prof Dr Ir Baharuddin, Dipl.Ing. Agr dosen ilmu hama
dan penyakit tumbuhan dari Universitas Hasanuddin Makassar atas saran dan
nasihat yang sangat berharga. Penulis juga berterima kasih kepada teman-teman
seangkatan yang namanya tidak dapat penulis sebutkan satu persatu untuk
meluangkan waktunya dalam memberikan saran dan masukan agar penulisan
karya ilmiah ini dapat diselesaikan.
Ungkapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga disampaikan kepada
ayah, ibu, dan adikku terkasih yang senantiasa memberikan semangat dan doa
yang tidak pernah terputus serta seluruh keluarga dan teman terdekatlainnya yang
turut mendoakan penulis sehingga penulis mampu menyelesaikan studi untuk
mendapatkan pendidikan terbaik.
Manusia tak luput dari berbagai kesalahan sehingga kiranya penulisan karya
tulis ini masih terus membutuhkan saran dan masukan agar menjadi jauh lebih
baik.

Bogor, Juni 2016
Asysyuura

6

7

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
2
2

2TINJAUAN PUSTAKA

3

Tanaman Padi

3

Penyakit Hawar Daun Bakteri pada Padi

3

Gejala Penyakit

5

Siklus Penyakit

6

Identifikasi dan Analisis DNA Xanthomonas oryzae pv. oryzae

7

Identifikasi dengan Teknik Molekuler

7

Analisis Runutan Nukleotida

8

3METODE
Tempat dan Waktu
Bahan dan Alat
Metode
Pengambilan Sampel
Isolasi dan Pemurnian Bakteri
Identifikasi Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan Teknik PCR
Uji Keragaman Patotipe Xanthomonas oryzae pv. oryzae

9
9
9
9
9
10
10
12

4HASIL DAN PEMBAHASAN

13

Isolasi dan Konfirmasi DNA Bakteri X. oryzae pv. oryzae
Isolat Bakteri X. oryzae pv. oryzae

13
13

Deteksi DNA bakteri X. oryzae pv. oryzae dari Jaringan
Tanaman Sakit

16

Identifikasi Bakteri X. oryzae pv. oryzae dengan PCR Koloni

17

Keragaman dan Distribusi Kelompok Patotipe Xanthomonas oryzae pv.
oryzaeAsal Sulawesi Selatan

19

Filogenetika Xanthomonas oryzae pv. oryzae berdasarkan
Runutan Nukleotida

22

8
5SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

24
24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

DAFTAR TABEL
1 Acuan pengelompokan patotipe dengan menggunakan varietas tanaman
diferensial
2 Program amplifikasi
3 Ciri morfologi koloni bakteri dan identifikasi molekuler
4 Kelompok patotipe X. oryzaepv. oryzae asal Sulawesi Selatan

4
11
13
21

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5

Gejala hawar daun bakteri di lahan pertanaman padi
Daerah sekuen intergenik prokariot 16S-23S rDNA
Isolat bakteri dari tanaman padi
Amplifikasi DNA bakteri X. oryzae pv. oryzae dari jaringan tanaman
Amplifikasi PCR koloni positif bakteri X. oryzae pv. oryzae
menggunakanprimer XOR-R2/XOR
6 Peta sebaran patotipe X. oryzae pv. oryzae di beberapa kabupaten di
Sulawesi Selatan
7 Pohon filogenetika bakteri X. oryzaepv. oryzae asal Sulawesi Selatan

DAFTAR LAMPIRAN
1 Nilai homologi runutan nukleotida X. oryzae pv. oryzae asal Sulawesi
Selatan
2 Hasil alignment runutan nukleotida

5
8
15
17
18
19
23

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Produksi beras di Indonesia menunjukkan fluktuasi dari waktu ke waktu
yang dapat disebabkan oleh berbagai faktor. Salah satu faktor biotik yang
berpengaruh adalah infeksi bakteri patogen pada tanaman padi Xanthomonas
oryzae pv. oryzae yang merupakan penyebab penyakit hawar daun bakteri (HDB)
atau kresek. Bakteri ini menjadi salah satu patogen utama pada pertanaman padi di
sentra produksi padi Indonesia termasuk Sulawesi Selatan. BPTPH (2008)
melaporkan bahwa salah satu faktor dominan dalam menurunkan hasil panen padi
di daerah Sulawesi Selatan adalah infeksi bakteri X. oryzae pv. oryzae. Saat ini
kerugian yang disebabkan oleh bakteri tersebut dapat mencapai 50-70% bahkan
diatas 80% yang dapat dikategorikan dalam kondisi puso, hal ini bergantung pada
stadia tanam saat penyakit tersebut timbul (Mew et al. 1982; Mew 1988,Reddy &
Shang-Zhi 1989, Suparyono & Sudir 1992, Narasimhan & Kareem 1994, Lalitha
et al. 2010).
Perkembangan suatu penyakit tumbuhan ditentukan oleh setidaknya tiga hal,
yaitu kerentanan tanaman inang, virulensi patogen dan dukungan faktor
lingkungan. Menurut Ou (1985), faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap
perkembangan penyakit HDB terutama adalah kelembapan, suhu, dan cara
budidaya tanaman padi, khususnya dalam penentuan varietas dan teknik
pemupukan. Berbagai strategi pengendalian terus diupayakan dalam menekan
perkembangan bakteri patogen tersebut. Sejauh ini penggunaan varietas tahan
terhadap infeksi bakteri tersebut menjadi komponen utama dalam teknik
pengendalian karena dianggap lebih mudah dan efisien dari segi ekonomi
meskipun teknik pengendalian yang lain terus dilakukan. Keefektifan penggunaan
varietas tahan tentunya memiliki kendala karena sifat bakteri X. oryzaepv. Oryzae
yang mudah mengalami perubahan dalam membentuk patotipe baru yang lebih
virulen dan mematahkan gen ketahanan tanaman (Suparyono et al. 2004; Sudir et
al. 2006; Sudir et al. 2009). Varietas tertentu dapat hanya efektif terhadap patotipe
tertentu dan cocok pada wilayah tertentu (Sudir & Suprihanto 2006) sehingga
pengembangan dan penanaman varietas tahan juga perlu disesuaikan dengan
patotipe yang ada di suatu wilayah pertanaman untuk mengoptimalkan keefektifan
pengendalian penyakit HDB (Ponciano et al. 2003).
Resistensi tanaman secara vertikal yaitu ketahanan tanaman tertentu
terhadap satu jenis atau ras patogen dan hal tersebut banyak terjadi pada varietas
tanaman padi saat ini, menjadi salah satu masalah serius dalam peningkatan hasil
produksi padi karena akan memudahkan tanaman terinfeksi oleh jenis patogen
lain atau terserang patogen yang sama namun dengan patotipe yang berbeda.
Tingginya kemampuan pathogen X. oryzae pv. oryzae dalam membentuk patotipe
baru yang dipengaruhi oleh faktor gen virulennya (Qi & Mew 1989). Pemantauan
sebaran dan perkembangan patotipe X. oryzaepv. oryzae yang terdapatdi wilayah
penanaman padi perlu dilakukan secara terus-menerus. Selama ini penentuan
patotipe bakteri, termasuk X. oryzae pv. oryzae, didasarkan atas tingkat
virulensinya yang berbeda ketika diinfeksikan ke suatu seri varietas tanaman padi
differensial. Untuk mengenali bakteri dan patotipenya yang menginfeksi tanaman

2
dibutuhkan teknik identifikasi yang dapat dilakukan dalam waktu relatif lebih
cepat dengan tingkat akurasi yang tinggi. Teknik deteksi dan identifikasi
menggunakan metode molekuler seperti polymerase chain reaction (PCR) telah
banyak dilaporkan mampu memberikan hasil yang lebih akurat dan efisien
Pemantauan pergeseran patotipe dilakukan untuk mengetahui patotipe yang
dominan pada suatu wilayah pertanaman padi yang selanjutnya dapat dijadikan
dasar untuk mengambil keputusan teknik pengendalian melalui rekomendasi
varietas tahan yang memiliki gen ketahanan sesuai dengan gen virulen patotipe
patogen yang ada di lapangan.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah mengevaluasi sebaran dan keragaman patotipe X.
oryzae pv. oryzae yang berkembang pada area penanaman padi sawah daerah
Sulawesi Selatan, melakukan identifikasi dengan teknik molekuler untuk
mengonfirmasi kesamaan isolat bakteri yang berasal dari Sulawesi Selatan dengan
isolat bakteri yang telah ada dan berkembang di daerah atau negara yang lain.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini perlu dilakukan untuk memberikan informasi lebih lanjut
tentang sebaran, komposisi dan perkembangan patotipe X. oryzae pv. oryzae yang
menyebabkan penyakit kresek di lapangan. Hasil evaluasi perkembangan patotipe
bakteri ini dapat menjadi acuan bagi berbagai pihak dalam menetukan tindakan
pengendalian agar lebih efektif.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA

Tanaman Padi
Berdasarkan habitatnya, tanaman padi dapat digolongkan menjadi beberapa
jenis yaitu padi gogo, padi sawah dan padi rawa. Padi dengan nama ilmiah Oryza
sativa L. termasuk dalam kingdom Plantae, divisi Spermatophyta, subdivisi
Angiospermae, kelas Monocotyledoneae, ordo Poales dan famili Poaceae.
Menurut Silitonga (2004) sebelum masuknya padi keIndonesia pada tahun
1500 SM, tanaman ini terlebih dahulu tersebar di wilayah Indochina. Selanjutnya
tanaman ini dikembangkan hingga pada akhirnya jenis padi javanica hanya ada di
Indonesia. Perkembangan budidaya tanaman padi saat ini terjadi seiring tingkat
kebutuhan pangan yang bertambah sehingga keragaman varietas padi terus
dikembangkan guna memenuhi tingkat kebutuhan masyarakat. Keragaman
varietas padi yang dikembangkan memiliki konsekuensi munculnya masalah yang
berkaitan dengan resistensi tanaman terhadap patogen penyebab penyakit
diantaranya bakteri X. oryzae pv. Oryzae penyebab penyakit hawar daun bakteri
(HDB). Resistensi tanaman yang menjadi sifat dari suatu varietas yang
dikembangkan dapat menjadi faktor seleksi terhadap patogen untuk berkoevolusi
memunculkan varian-varian patogen baru yang memiliki tingkat virulensi berbeda
atau sering disebut sebagai pathotype.
Menurut Sudir et al. (2009) varietas padi IR 20 merupakan varietas modern
yang pertama kali ditemukan di Asia yang memiliki gen ketahanan terhadap
penyakit HDB. Suatu varietas tahan hanya efektif terhadap X. oryzae pv. oryzae
dari patotipe tertentu dan juga hanya di lokasi tertentu sehingga dapat diasumsikan
bahwa pada daerah yang berbeda, tindakan penanaman varietas padi yang sama
dapat dilakukan atau justru tidak dianjurkan berdasarkan alasan tertentu terkait
dengan perkembangan patogen yang mampu membentuk patotipe dalam
menginfeksi tanaman inangnya (padi). Leach et al. (1990) dan George et al.
(1996) mengelompokkan setiap patotipe berdasarkan karakter fenotipik maupun
genotipiknya yang berasal dari wilayah geografi yang berbeda.
Penyakit Hawar Daun Bakteri pada Padi
Penyakit HDB merupakan penyakit utama padi sawah di Indonesia yang
disebabkan oleh bakteri X. oryzae pv. oryzae. Perkembangan patogen ini pertama
kali ditemukan di Indonesia pada tahun 1949 pada musin hujan dan dikenal
sebagai penyakit kresek (Ou 1985; Mew 1988).
Terdapat dua jenis gejala yang ditimbulkan akibat infeksi X. oryzae pv.
oryzae yaitu kresek dan hawar. Kresek merupakan gejala penyakit yang paling
destruktif sedangkan hawar adalah gejala yang lebih umum.Infeksi terjadi pada
tanaman padi setelah pembibitan hingga dewasa yang ditandai dengan watersoaked greyish atau corak keabu-abuan selama 1 – 2 minggu. Bagian ujung daun
padi yang terinfeksi akan meluas hingga pelepah daun (Mew et al. 1993; Ou
1985).
Kerusakan yang disebabkan oleh penyakit HDB secara kualitatif dapat
berupa penurunan kualitas gabah karena gangguan pemasakan (Kadir et al. 2009).
Direktorat Perlindungan Pangan (2011) melaporkan bahwa di tahun 2010 luas

4
lahan yang terserang penyakit HDB sebesar 54 796 ha dan terus meningkat di
masa tanam 2010 – 2011 yaitu sebesar 64 123 ha di seluruh Indonesia. Tinggi dan
rendahnya data tersebut disebabkan oleh tingkat perubahan strain atau patotipe
pada X. oryzae pv. oryzae yang cukup tinggi. Di Indonesia terdapat 12 kelompok
patotipe yang telah diidentifikasi berdasarkan metode Kozaka. Pengelompokan 12
patotipe dapat dilakukan dengan melihat respons gejala pada 5 varietas yang
berbeda (Tabel 1).
Tabel 1 Acuan pengelompokan patotipe X. oryzae pv. oryzae berdasarkan respon
gejala pada varietas tanaman padi diferensial
Kelompok
patotipe
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII

Reaksi ketahanan varietas tanaman diferensial
Kinmase

Kogyoku

Tetep

R
R
R
R
R
T
R
R
R
R
R
T

T
R
R
R
T
T
R
R
R
T
R
T

T
T
R
R
T
R
R
R
T
R
T
T

Wase
Aikoku
T
T
T
R
R
T
T
R
R
R
R
R

Java 14
T
T
T
R
T
T
R
T
T
T
R
T

Keterangan: T = Tahan, keparahan penyakit 11%

Pengembangan tindakan pengendalian terhadap patogen penyebab HDB
masih terus dilakukan. Sudir et al. (2009) menyatakan bahwa sampai saat ini
penggunaan varietas tahan masih cukup populer dalam pengendalian serangan X.
oryzae pv. oryzae. Sejauh ini, perkembangan teknik pengendalian dalam bentuk
eksplorasi agens biokontrol terus dilakukan dan menunjukkan hasil yang optimal
sebatas percobaan rumah kaca sehingga membutuhkan kajian yang lebih spesifik
yang melibatkan gen ketahanan tanaman dan gen virulensi yang dimiliki patogen
yang dalam kaitan ini mudah berubah membetuk patotipe baru.
Gejala Penyakit
Penyebab penyakit yang disebabkan oleh bakteri X. oryzae pv. oryzae ini
dapat dikenali dengan adanya perubahan warna yang tampak pada bagian ujung
daun yang kemudian bertambah lebar hingga menyebabkan tepi daun berombak
dan kering (Gambar 1). Meskipun secara umum gejala penyakit HDB ini dapat
dikenali, pada tanaman dipersemaian dan gejala awal sulit untuk diamati.

5

Gambar 1 Gejala HDB di lahan pertanaman padi. Daun tanaman
berwarna kuning kecoklatan hingga putih keabu-abuan
dan tepi daun berombak (bagian yang diberi tanda panah)
Penyakit hawar daun bakteri ini dapat terjadi pada setiap fase pertumbuhan
tanaman padi. Gejala yang muncul pada tanaman muda berumur kurang dari 30
hari setelah tanam disebut kresek, sedangkan gejala yang timbul pada tanaman
mencapai masa stadia anakan hingga pemasakan disebut hawar (blight).
Terjadinya penyakit pada tanaman masih berumur muda dapat menyebabkan
penurunan produksi padi yang lebih besar. IRRI (2009) mengungkapkan bahwa
kresek merupakan gejala yang paling merusak dari penyakit HDB, sedangkan
umumnya penyakit ini dapat dijumpai dengan gejala hawar. Disamping itu,
penurunan hasil juga dapat terjadi berdasarkan tingkat keparahan penyakit yang
ditimbulkan oleh bakteri patogen dan stadia infeksi tanaman yang dapat mencapai
50-70% bahkan diatas 80% dan dikategorikan dalam kondisi puso, hal ini
bergantung pada stadia tanam saat penyakit tersebut timbul. Suparyono et al.
(2003) melaporkan bahwa ambang kerusakan penyakit HDB pada tanaman padi
stadia dewasa berkisar pada keparahan penyakit sebesar 20%, setiap keparahan
penyakit naik sebanyak 10% dari ambang tersebut dapat menimbulkan kehilangan
hasil yang meningkat antara 4-6%. Di Indonesia sendiri kehilangan hasil yang
dapat terjadi sangat fluktuatif.
Proses infeksi bakteri X. oryzae pv. oryzae hingga menimbulkan gejala
pada daun tanaman padi masuk melalui luka maupun hidatoda yang berada pada
samping dan ujung daun melalui proses gutasi. Bakteri ini akan masuk secara
pasif pada daun melalui larutan gutasi yang terbentuk. Selanjutnya bakteri akan
memperbanyak diri di dalam ruang interseluler, dan menyebar ke bagian tanaman
lainnya melalui xilem (Nino-Liuet al. 2006). Setelah beberapa hari sel bakteri
mengisi pembuluh xilem hingga akhirnya terdapat bintik-bintik dan bergaris
menyerupai benang pada daun. Proses ini menjadi karakteristik utama bahwa
tanaman padi telah terinfeksi HDB (Mew et al. 1993). Penyebaran X. oryzae pv.
oryzae dari tanaman sakit ke tanaman sehat dapat terjadi melalui angin, hujan, air
irigasi, dan adanya singgungan antar daun padi, petani, dan hama (Nyvall 1999).

6
Bakteri X. oryzae pv. oryzae diketahui merupakan bakteri yang memiliki
viabilitas patotipe yang tinggi. Telah dilaporkan bahwa saat ini terdapat 30 strain
X. oryzae pv. oryzae yang berbeda dari beberapa negara (Adhikari et al. 1999;
Mew 1988; Noda et al. 1996) sedangkan di Indonesia sendiri terdapat 12 strain
yang tersebar di berbagai wilayah penghasil padi (Sudir 2003; Triny 2000).
Bakteri X. oryzae pv. oryzae ini memiliki tingkat perbedaan genetik yang tinggi
diantara perbedaan isolat lain yang berasal dari lingkungan yang berbeda
khususnya isolat yang berasal dari asia (Adhikari et al. 1995). Tingginya
variabilitas tersebut disebabkan adanya interaksi antara inang (Oryza sativa),
bakteri X. oryzae pv. oryzae, lingkungan abiotik dan juga biotiknya. Perubahan
dari salah satu komponen tersebut akan mempengaruhi patogenitas X. oryzae pv.
oryzae (Kadir 2009).
Siklus Penyakit
Mekanisme infeksi yang dilakukan oleh bakteri penyebab penyakit (X.
oryzae pv. oryzae) dapat terjadi melalui hidatoda yang terdapat pada daun atau
dapat pula melalui luka pada daun dan bagian tanaman lainnya. Bakteri X. oryzae
pv. oryzae juga dapat menginfeksi pada bagian akar tanaman. Bahkan Murty &
Devadath (1984) menyatakan bahwa bakteri X. oryzae pv. oryzae dapat terbawa
benih padi meskipun tidak berdampak terhadap perkembangan penyakit HDB
yang tinggi, namun benih dapat menjadi tempat dorman bagi bakteri hingga
mendapatkan inang yang tepat dan sesuai. Ou (1985); Brar dan Thind (1994)
menyatakan bahwa bakteri X. oryzae pv. oryzae dapat bertahan hidup pada biji
(benih), jerami dan serasah tanaman padi, gulma yang dapat berperan sebagai
inang, dan bahkan dalam tanah dan air irigasi.
Penyebaran patogen pada tanaman padi dapat terjadi melalui angin
kencang yang dapat menimbulkan luka pada tanaman dan dapat menyebabkan
bakteri menyebar dari satu tanaman ke tanaman lainnya. Saat ini perkembangan
serta distribusi bekteri melalui benih sangat berpeluang. Kejadian penyakit yang
disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae yang terdapat dilapangan dapat mencapai
13-37% karena berasal dari benih yang digunakan (Shivalingaiah et al.2012).
Perkembangan penyakit HDB juga dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor
seperti gesekan daun tanaman yang memiliki jarak tanam yang dekat (Khaeruni
2001). Adanya gulma di area sekitar tanaman serta jerami padi yang terinfeksi
bakteri dapat memicu kelangsungan hidup penyakit. Pengaruh lingkungan abiotik
yang dapat menyebabkan perkembangan populasi bakteri adalah adanya faktor
suhu, kelembaban, angin dan pengaruh cahaya. Suhu hangat (25-30 oC) serta
kelembaban dan curah hujan yang tinggi dapat mendukung perkembangan
penyakit.
Identifikasi dan Analisis DNA Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Identifikasi dengan Teknik Molekuler
Identifikasi suatu bakteri patogen tumbuhan dapat dilakukan melalui metode
berdasarkan simtomatologi pada tanaman inang, ciri dan sifat morfologi sel dan
koloni yang ditumbuhkan pada media agar, fisiologi dan biokimia, ciri dan sifat
protein dan asam nukleat. Metode hanya berdasarkan morfologi sel dan koloni
pada medium kurang meyakinkan mengingat seringkali bahwa morfologi sel atau
koloni bakteri yang tumbuh hampir tidak dapat dibedakan dari koloni bakteri satu

7
dengan yang lainnya. Bakteri X. oryzae pv. oryzycola memiliki beberapa
kesamaan dengan bakteri X. oryzae pv. oryzae khususnya pada media agar yakni
memiliki warna koloni yang berwarna kuning karena mengandung pigmen
Xanthomonadin (Liu2006). Salah satu ciri yang khas dari bakteri genus
Xanthomonas adalah menghasilkan koloni yang berwarna kuning (Nino-Liu et al.
2006).
Bakteri X. oryzae pv. oryzae tergolong bakteri gram negatif yang
menyebabkan penyakit hawar daun pada tanaman padi (Swings et al. 1990).
Bentuk bakteri X. oryzae pv. oryzae dideskripsikan berupa bentuk batang
(bacillus) dan memiliki flagela. Ukuran sel yang dimiliki bakteri ini 1.2 x 0.3-0.5
m dan bersel tunggal. Selain itu, bakteri ini tidak membentuk spora dan tanpa
kapsul. Apabila ditumbuhkan pada media nutrisi, koloni yang dihasilkan akan
berwarna kuning pucat (Ou 1985; Lang et al. 2010). Pada awal pertumbuhannya
(dalam waktu 2-4 hari) untuk varietas yang rentan dan tahan, sel bakteri
berkembangbiak dari 103-104 menjadi 107-108 sel/ml. Selanjutnya
perkembangbiakan X. oryzae pv. oryzae pada varietas tahan akan lebih lambat
dibandingkan dengan varietas yang rentan.
Identifikasi bakteri X. oryzaepv. oryzae dengan teknik molekuler dapat
menggunakan berbagai jenis primer yang menyandikan karakter spesifik dari
bakteri tersebut. Fungsi utama penggunaan primer adalah menyediakan ujung 3’OH yang akan digunakan untuk menempelkan molekul DNA pertama dalam
proses polimerisasi (Yuwono 2008). Daerah intergenik 16S-23S rDNA
merupakan bagian spesifik dalam mengidentifikasi bakteri X. oryzae pv. oryzae
yang ditunjukkan pada skematik (Gambar 2) dalam penggunaan salah satu primer
spesifik untuk mengidentifikasi bakteri tersebut.
Daerah perantara pada lokus genetik prokariotik yang disebut internal
transcribed spacer (ITS) merupakan daerah yang istimewa dalam menunjukkan
polimorfisme tingkat tinggi dengan variasi spesies yang besar sehingga berguna
untuk mengidentifikasi bakteri secara spesifik. Daerah ITS lebih informatif dari
pada analisis 16S rDNA terutama pada strain typing.

5’

16S rDNA

23S rDNA

3’

Gambar 2 Daerah sekuen intergenik prokariot 16S-23S rDNA (daerah
yang dilingkari). (Adachi & Oku, 2000)
Analisis Runutan Nukleotida
Perkembangan ilmu dan pengetahuan dalam biologi molekuler, khususnya
pada pengkajian karakter bahan genetik telah menghasilkan kemajuan yang sangat
pesat bagi perkembangan penelaahan suatu organisme. Beragam teknik analisis
DNA yang dapat dilakukan seperti random amplified polymorphic (RAPD),
restrictionfragment length polymorphism (RFLP), dan degradative gradient gel
electrophoresis (DGGE) serta berbagai bentuk metode lainnya yang akan selalu
berkembang. Pada dasarnya teknik-teknik tersebut memanfaatkan teknik PCR
yang mengamplifikasi sekuen DNA untuk melipat gandakan sekuen nukleotida

8
secara eksponensial. Pelipat gandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan sebesar
200 000 kali setelah dilakukan reaksi 20 siklus selama 220 menit (Mullis &
Faloona 1989). Diketahui perkembangan teknik-teknik analisis DNA berdasarkan
pada dua macam metode yang mampu menentukan runutan nukleotida suatu DNA
(DNA sequencing) yaitu metode Maxam-Gilbert dan metode SangerCaulson.Pemotongan basa-basa DNA yang menggunakan regensia tertentu
dialakukan pada metode Maxam-Gilbert sedangkan metode Sanger-Caulson
didasarkan atas metode enzimatik menggunakan DNA polimerase (Yuwono
2006).
Amplifikasi fragmen DNA membutuhkan primer untuk menyandi daerah
target. Primer spesifik (sekuen oligonukleotida khusus) menyandi daerah tertentu
yang biasanya terdiri atas 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah
konservatif dalam genom tertentu (Suryanto 2003). Perkembangan pengetahuan
tentang keragaman genetik menjadi perkembangan ilmu yang semakin maju
dalam bidang biologi molekuler. Untuk menunjang pengetahuan klasik tentang
keragaman genetik suatu mikroorganisme, pendekatan dengan keragaman genetik
yang dilakukan berdasarkan susunan nukleotida suatu DNA perlu unutk dilakukan
sehingga pemanfaatannya dapat digunakan dengan tujuan konservatif bahkan
dalam merancang tindakan pengendalian berbasis genetika dalam bidang ilmu
penyakit tumbuhan.
Analisis runutan nukleotida juga mampu digunakan sebagai bahan
filogenetika molekuler. Pemikiran dasar penggunaan runutan nukleotida suatu
DNA dalam studi konstruksi filogenetika adalah basa nukleotida mampu
mengalami perubahan menurut waktu sehingga akandapat diperkirakan kecepatan
evolusi yang terjadi dan kejadian hubungan evolusi antar satu kelompok
organisme dengan organisme yang lain dapat digambarkan (Felsenstein 1981).

9

3 METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan IPB,
Laboratotium Biosains Reproduksi Tanaman dan Pustlibang Bioteknologi
Pertanian Universitas Hasanuddin Makassar pada bulan Desember 2014 - Juli
2015.
Bahan dan Alat
Isolat bakteri X. oryzae pv. oryzae yang diidentifikasi berasal dari isolasi
sampel tanaman padi yang diambil dari lapangan dengan menunjukkan gejala
hawar daun bakteri (HDB). Tahap ini dilakukan di laboratorium dengan teknik
aseptik dalam laminar air flow.
Media biakan yang digunakan dalam pembiakan bakteri tersebut adalah
wakimoto agar (WA). Penenetuan patotipe bakteri penyebab HDB dilakukan
dengan clip methode pada tanaman padi diferensial dengan ketahanan genetik
terhadap bakteri X. oryzae pv. oryzae yang telah diketahui.
Identifikasi dan karakterisasi molekuler dilakukan dengan teknik PCR yang
menggunakan mesin thermocycler. Adapun visualisasi DNA yang muncul
mengunakan elektroforesis dengan 1.5% gel agarose.
Metode
Penelitian ini dilaksanakan dengan beberapa tahap. Tahap awal adalah
pengambilan sampel tanaman padi yang terserang HDB pada beberapa daerah
sentra tanaman padi di Sul-Sel seperti Bantaeng, Jeneponto, Takalar, Maros,
Pangkep, Barru dan Bone. Tahap selanjutnya adalah proses isolasi dan pemurnian
bakteri target kemudian identifikasi koloni bakteri berdasarkan karakter morfologi
serta identifikasi bakteri dengan teknik PCR, setelah itu pengelompokan patotipe
dari isolat bakteri yang positif dengan menggunakan tanaman diferensial. Tahap
terakhir adalah analisis sekuen DNA dari bakteri X. oryzae pv. oryzae yang
dihasilkan pada tahap identifikasi yang selanjutnya disekuen berdasarkan program
sekuen BLAST yang bertujuan untuk melihat kekerabatan bakteri tersebut sebagai
konfirmasi kesamaan bakteri dengan negara ataupun daerah lain.
Pengambilan sampel
Penentuan daerah sampling dan pengambilan sampel dilakukan dengan
teknik purposive sampling dengan acuan dari data hasil analisa Balai Proteksi
Tanaman Pangan dan Hortikultura UPTD SulSel terhadap daerah yang berpotensi
secara endemik terserang bakteri X. oryzae pv. oryzae, yaitu Kabupaten Bantaeng,
Barru, Jeneponto, Maros, Pangkep, Bone dan Takalar. Pengambilan tanaman
bergejala dilakukan secara acak sesuai dengan jenis varietas padi yang ditanam
pada MT1 2014-2015. Pengambilan sampel dilakukan pada umur tanaman berada
pada fase generatif. Daun tanaman bergejala yang diambil kemudian dimasukkan
pada plastik dan diberikan label identitas berupa jenis varietas, daerah/lokasi, dan
tanggal pengambilan untuk keperluan penyimpanan. Selanjutnya dibawa ke
laboratorium untuk proses isolasi dan identifikasi bakteri X. oryzae pv. oryzae.

10
Isolasi dan Pemurnian Bakteri X. oryzae pv. oryzae
Pembuatan Media Wakimoto Agar (WA) Modifikasi IRRI (1996)
Pembuatan media biakan bakteri tersebut disiapkan dalambotol Schott 1000
ml dengan ekstrak kentang yang telah direbus pada 300 g kentang bersih yang
dipotong dadu, dicampurkan 17 g sukrosa, 7 g pepton, 0.5 g Ca(NO3)2 4H2O, 1 g
Na2.HPO4.12H2O, 17 g bakto agar, dalam 1 L H2O destilata, diaduk dengan
magnetic stirrer diatas hot plate kemudian diautoklaf selama 30 menit pada suhu
121 oC, selanjutnya media didinginkan beberapa saat untuk selanjutnya dituang
pada cawan petri, media yang telah dituang kembali didiamkan hingga menjadi
padat. Proses penuangan media dilakukan dalam laminar air flow cabinet.
Isolasi Bakteri X. oryzae pv. oryzae (IRRI 1996)
Daun yang mengalami gejala HDB dicuci dengan air, dipotong kecil
berkisar 1 x 1 cm, direndam dengan etanol 70% selama 3 menit. Selanjutnya
dibilas dengan air steril sebanyak dua kali selama 2 menit. Setelah itu, daun
digores dengan menggunakan bantuan pinset, dan digoreskan kembali ke media
cawan wakimoto agar (WA) yang telah diberi label sesuai kode sampel. Cawan
Petri yang digoreskan daun bergejala disimpan selama 48 jam pada suhu ruang.
Proses ini dilakukan dalam laminar air flow cabinet.
Pemurnian Bakteri X. oryzae pv. oryzae (IRRI 1996).
Media cawan yang telah ditumbuhi koloni bakteri ditandai dengan koloni
kuning keputihan hal ini merupakan ciri spesifik koloni bakteri X. oryzae pv.
oryzae pada media Wakimoto. Satu ose koloni dari cawan diambil dengan
mengunakan tusuk sate dan digoreskan kembali pada media WA yang telah
diberikan tanda berdasarkan penomoran isolat bakteri yang tumbuh pada tahap
awal, kemudian disimpan pada suhu ruang untuk keperluan uji selanjutnya. Setiap
proses isolasi dilakukan di dalam laminar air flow cabinet.
Identifikasi X. oryzae pv. oryzae dengan teknik PCR
Penyiapan template DNA untuk PCR dari koloni Bakteri X. oryzae pv.
oryzae
Identifikasi bakteri dengan teknik PCR koloni yang dilakukan dengan
modifikasi metode Dafa’alla et al. (2000) memerlukan penyiapan DNA template
langsung dari koloni bakteri. Satu lup koloni bakteri dimasukkan ke dalam air
destilata dengan volume 100 µl pada tabung eppendorf 1.5 ml, inkubasi dalam
waterbath dengan suhu 65 oC selama 2 jam (setiap 10 menit dibolak-balik),
supernatan yang telah ada digunakan sebagai template DNA.
Ekstraksi DNA Total dari Daun yang Terinfeksi Bakteri X. oryzae pv. oryzae
Penyiapan DNA template untuk reaksi dalam deteksi PCR terhadap bakteri
dari tanaman sakit dilakukan dengan Ekstraksi DNA total metode modifikasi
Zouhar et al.(2000). Daun tanaman bergejala diambil sebanyak 0.1g kemudian
digerus dengan mortar yang ditambahkan dengan buffer ekstrak Carlson lysis
buffer(CLB). Diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 oC selama 2 jam (setiap
10 menit dibolak-balik). Setelah 2 jam inkubasi, sampel didinginkan pada suhu
ruang selama 3-5 menit. Tambahkan larutan kloroform:isoamil alkohol (24:1)
sebanyak 500 µl dan vortex selama 3-5 menit. Selanjutnya sentrifius selama 20

11
menit pada kecepatan 11000 rpm. Supernatan yang terbentuk dipindahkan pada
tabung eppendorf yang baru. Supernatan ditambahkan larutan kloroform sebanyak
300 µl dan dibolak-balik selama 3 menit. Disentrifius kembali dengan kecepatan
14000 rpm selama 15 menit, supernatan yang dihasilkan dipindahkan lagi pada
tabung ependorf yang baru.Supernatan kembali ditambahkan dengan larutan NaAcetat 3 M sebanyak 40 µl dan dibolak-balik selama 5 menit.Selanjutnya
diinkubasikan pada suhu -20 oC selama 24 jam. Supernatan yang telah
diinkubasikan kembali disentrifius pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit.
Setelah itu, supernatan dibuang dengan hati-hati. Pelet yang tertingal pada tabung
eppendorf ditambahkan kembali dengan etanol 80% untuk proses pembersihan
pelet sebanyak 400 µl kemudian disentrifius pada kecepatan 12000 rpm selama 3
menit. Buang supernatan yang dihasilkan kemudian keringkan pelet yang
dihasilkan pada tabung eppendorf. Terakhir, dalam proses penyimpanan untuk
keperluan identifikasi DNA dalam jangka waktu dekat ditambahkan ddH2O 40-50
µl sesuai dengan ketebalan dari endapan pelet yang dihasilkan.
Amplifikasi DNA X. oryzae pv. oryzae.
Tahap identifikasi molekuler dilakukan dengan menggunakan teknik PCR
yang menggunakan satu pasang primer spesifik yakni primer XOR-F (5'GCATGACGTCATCGTCCTGT-3') dan XOR-R2 (5'-CTCGGAGCTATATGCCGTGC-3') (Adachi & Oku, 2000). Pasangan primer ini dapat digunakan dalam
memperjelas keberadaan DNA X. oryzae pv. oryzae pada ukuran 470 pb. Reaksi
PCR tediri atas10.5µLGo Taq® green Master Mix (Promega), 9.5 µLddH2O, 2
µLDNA template, 1.5 µLprimerforward XOR-F pada 10 pM, 1.5 µLprimer
reverse XOR-R2 pada 10 pM. Program PCR dengan tahap amplifikasi yang
digunakan dapat dilihat pada Tabel 2 berikut :
Tabel 2 Program amplifikasi PCR menggunakan primer XOR-F/XOR-R2 untuk
X. oryzae pv. oryzae
Fase
Denaturasi awal
Denaturasi
Penempelan primer
Sintesis DNA
Sintesis DNA akhir

Temperatur (oC)
95
95
63
72
72

Waktu
2 menit
30 detik
30 detik
1 menit
7 menit

Siklus
1 kali
29 kali
1 kali

Elektroforesis.
Elektroforesis DNA dilakukan dengan 1.5% gel agarosa yang diberikan
penanda DNA pada salah satu sumurnya, bufer Tris Asetat EDTA (TAE) dan
proses elektroforesis pada tegangan 100 Volt DC selama 30 menit. Selanjutnya
hasil elektroforesis divisualisasi menggunakan menggunakan ethidium bromida
dan didokumentasikan menggunakan gel doc UVITEC Cambridge.
Analisis sekuen DNA.
DNA bakteri hasil amplifikasi PCR yang positif X. oryzae pv. Oryzae
selanjutnya dilakukan perunutan dengan mengirimkannya ke Laboratorium First
Base Asia, Malaysia. Kemudian runutan nukleotidanya dianalisis dengan metode
sekuensing dengan bantuan program BLAST pada situs NCBI.

12
Uji keragaman patotipe berdasarkan tanaman diferensial dengan
metode Kozaka (1969)
Hasil identifikasi X. oryzae pv. oryzae dengan teknik PCR yang
menunjukkan reaksi positif Xanthomonas dilanjutkan dengan uji pada tanaman
diferensial dengan metode Kozaka yang menggunakan 5 varietas sebagai tanaman
indikator untuk menunjukkan pengelompokan patotipe X. oryzae pv. oryzae.
Tanaman diferensial ini penting dilakukan untuk mendapatkan kelompok patotipe
yang menginfeksi tanaman karena diketahui tanaman ini mengandung gen
ketahanan tertentu terhadap infeksi bakteri X. oryzae pv. oryzae. Tanaman
diferensial yang digunakan adalah varietas Kinmase, Kogyoku, Tetep,
Waseaikoku, dan Java 14.
Inokulasi bakteri dilakukan dengan caraclip-method yakni dengan
menggunting atau memotong ujung daun padi sekitar 2-3 cm dengan
menggunakan gunting yang telah dicelupkan dalam suspensi X. oryzae pv. Oryzae
yang berumur 48 jam, kemudian tanaman yang telah diinokulasikan bakteri
tersebut disungkupkan dengan plastik kemudian diinkubasikan. Pengamatan
penyakit yang telah diinokulasi dilakukan dengan cara mengukur panjang gejala
yang muncul pada daun tanaman selama 14 hari setelah inokulasi. Rasio
keparahan penyakit ditunjukkan berdasarkan panjang gejala yang ada dan
perhitungan keparahan penyakit berdasarkan rasio gejala tersebut. Parameter
pengamatan keparahan penyakit yaitu gejala yang kurang dari 11% tergolong
tahan sedangkan yang lebih dari 11% tergolong rentan. Untuk menentukan jenis
patotipe bakteri ini maka intensitas penyakit yang ditunjukan dihitung berdasarkan
rumus berikut.
a
IP =
x 100%
b
Keterangan : IP = Intensitas penyakit
a = Panjang gejala HDB pada tanaman (cm)
b = Panjang daun secara keseluruhan (cm)

13

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan Konfirmasi DNABakteri X. oryzae pv. oryzae
IsolatBakteri X. oryzae pv. oryzae
Isolasi bakteri X. oryzae pv. oryzae dari tanaman padi di tujuh kabupaten di
Sulawesi Selatan diperoleh 75 isolat bakteri yang ditumbuhkan pada media agar
Wakimoto (Tabel 3) yang terdiri atas 33 isolat bakteri dengan koloni berwarna
putih, 3 isolat berwarna oranye, dan 39 isolat berwarna kuning. Hasil isolat yang
berbeda menunjukkan bahwa beberapa isolat tidak termasuk bakteri X. oryzae pv.
oryzae yang ditunjukkan dengan hasil negatif pada proses identifikasi secara
molekuler.
Tabel 3 Morfologi koloni bakteri dan identifikasi molekuler
No

Kode
isolat

Varietas
padi

Asal
varietas

Ciri
morfologi

Hasil
identifikasi PCR

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28

Xo050
Xo051
Xo052
Xo053
Xo054
Xo055
Xo056
Xo057
Xo058
Xo059
Xo060
Xo061
Xo062
Xo063
Xo064
Xo065
Xo066
Xo067
Xo068
Xo069
Xo070
Xo071
Xo072
Xo073
Xo074
Xo075
Xo076
Xo077

IR 64
Inpari 9
Ciliwung
Ciliwung
Inpari 9
Cigeulis
Cigeulis
Cigeulis
Ciherang
Ciherang
Membramo
Membramo
Cisadane
Cisantana
Cisantana
Cisanatana
Ciliwung
Ciliwung
Camindi
Camindi
Camindi
Camindi
Cigeulis
Cigeulis
Cisantana
Membramo
Inpari 4
Inpari 4

Takalar
Takalar
Takalar
Takalar
Takalar
Jeneponto
Jeneponto
Jeneponto
Jeneponto
Jeneponto
Jeneponto
Jeneponto
Pangkep
Barru
Barru
Barru
Barru
Barru
Bone
Bone
Bone
Bone
Bone
Bone
Takalar
Bantaeng
Bantaeng
Bantaeng

Putih
Putih
Oranye
Kuning
Putih
Putih
Putih
Putih
Kuning
Putih
Oranye
Putih
Putih
Kuning
Putih
Putih
Kuning
Kuning
Kuning
Putih
Putih
Putih
Putih
Putih
Putih
Putih
Putih
Oranye

negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif

14
Tabel 3 (Lanjutan) Morfologi koloni bakteri dan identifikasi molekuler
No

Kode
isolat

Varietas
padi

Asal
varietas

Ciri
morfologi

Hasil
identifikasi PCR

29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70

Xo078
Xo079
Xo080
Xo081
Xo082
Xo083
Xo090
Xo091
Xo092
Xo101
Xo102
Xo103
Xo104
Xo105
Xo106
Xo107
Xo108
Xo109
Xo110
Xo111
Xo112
Xo113
Xo114
Xo115
Xo116
Xo117
Xo118
Xo119
Xo120
Xo121
Xo122
Xo123
Xo124
Xo125
Xo126
Xo127
Xo128
Xo129
Xo130
Xo131
Xo132
Xo133

Inpari 4
Inpari 4
Inpari 4
Ciliwung
Inpari 9
Camindi
Cisadane
Ketan
Ketan
Inpari 31
Cigeulis
Ciliwung
Inpari 23
Inpari 3
Cisadane
Inpari 4
Inpari 28
Inpari 28
Cisadane
Cisantana
Cisantana
Ciliwung
Cisadane
Cisadane
Ketan
Cisaane
Inpari 31
Inpari 4
Inpari 28
Cigeulis
Ciliwung
Inpari 3
Inpari 23
Inpari 9
Ciliwung
Inpari 9
Cisantana
IR 64
Camindi
Cigeulis
Membramo
Ciherang

Bantaeng
Bantaeng
Bantaeng
Takalar
Takalar
Bone
Pangkep
Pangkep
Jeneponto
Maros
Maros
Maros
Maros
Maros
Barru
Maros
Maros
Maros
Barru
Barru
Barru
Barru
Pangkep
Pangkep
Pangkep
Pangkep
Maros
Maros
Maros
Maros
Maros
Maros
Maros
Takalar
Takalar
Takalar
Takalar
Takalar
Bone
Bone
Jeneponto
Jeneponto

Putih
Putih
Kuning
Putih
Putih
Putih
Putih
Putih
Kuning
Kuning
Putih
Putih
Putih
Kuning
Putih
Putih
Putih
Putih
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning

negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
negatif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif
positif

15
Tabel 3 (Lanjutan) Morfologi koloni bakteri dan identifikasi molekuler
No

Kode
isolat

Varietas
padi

Asal
varietas

Ciri
morfologi

Hasil
identifikasiPCR

71
72
73
74
75

Xo134
Xo135
Xo136
Xo137
Xo138

Ketan
Cigeulis
Membramo
Inpari 4
Inpari 4

Jeneponto
Jeneponto
Bantaeng
Bantaeng
Bantaeng

Kuning
Kuning
Kuning
Kuning
Kuning

positif
positif
positif
positif
positif

Keragaman bentuk koloni yang dihasilkan pada proses isolasi menunjukkan
bahwa media wakimoto yang digunakan menunjukkan hasil spesifik dalam
menumbuhkan bakteri X. oryzae pv. oryzae dengan ciri morfologi kuning dengan
elevasi bulat cembung dan memiliki lendir berwarna putih, selain itu pertumbuhan
bakteri X. oryzae pv. oryzae pada media wakimoto akan tumbuh lebih subur jika
dibandingkan dengan pertumbuhan pada media yang lain. Adapun jenis koloni
bakteri yang berbeda akan tetap tumbuh pada media tersebut. Hal tersebut diduga
disebabkan oleh berbagai jenis bahan yang digunakan memiliki nutrisi yang sama
untuk menumbuhkan jenis bakteri yang lain meskipun ciri morfologi yang
dihasilkan akan tetap berbeda. Adapun keragaman jenis koloni bakteri yang
dihasilkan pada media Wakimoto yang digunakan ditunjukan pada Gambar 3.

A
B
C
Gambar 3 Isolat bakteri dari tanaman padi : Isolat berwarna putih Xo069
(A), Isolat berwarna oranye Xo052 (B), Isolat berwarna
kuning Xo137 (C).
Isolat bakteri yang tumbuh pada media agar Wakimoto memiliki perbedaan
secara morfologi (Tabel 3). Bentuk koloni yang positif X. oryzae pv. oryzae
berwarna kuning muda dengan sedikit lendir yang berwarna putih, hal tersebut
juga ditunjang dengan hasil yang positif dengan teknik identifikasi molekuler
yang dilakukan. Diperoleh isolat yang berwarna oranye diduga berasal dari
spesies Xanthomonas spp. namun pathovar yang berbeda karena isolat yang
tumbuh menunjukkan kecenderungan berwarna kuning yang lebih terang hal ini
diduga karena isolat tersebut juga mengandung pigmen Xanthomonadin.
Hasil pengamatan di lahan pertanaman menunjukkan tanaman padi yang
terinfeksi bakteri X. oryzae pv. oryzae dan menyebabkan penyakit HDB. Kondisi
tanaman yang terinfeksi HDB terlihat pada fase generative berada pada umur 7580 hari setelah tanam (hst) hal tersebut berkaitan dengan jenis atau varietas padi
yang ditanam. Secara umum daun tanaman yang terinfeksi menunjukkan gejala
daun yang terlihat kering berwarna keabu-abuan pada bagian tepinya selanjutnya
menyisir pada bagian tengah daun.

16
Bentuk gejala tanaman yang terinfeksi bakteri X. oryzae pv. oryz