Konstruksi Dan Analisis Pustaka Metagenomik Yang Mengekspresikan Senyawa Bioaktif Untuk Mengendalikan Xanthomonas Oryzae Pv Oryzae Pada Tanaman Padi

KONSTRUKSI DAN ANALISIS PUSTAKA METAGENOMIK
YANG MENGEKSPRESIKAN SENYAWA BIOAKTIF
UNTUK MENGENDALIKAN Xanthomonas oryzae pv. oryzae
PADA TANAMAN PADI

TATIT SASTRINI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Konstruksi dan Analisis
Pustaka Metagenomik yang Mengekspresikan Senyawa Bioaktif untuk
Mengendalikan Xanthomonas oryzae pv. oryzae pada Tanaman Padi adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2016
Tatit Sastrini
A352120101

RINGKASAN
TATIT SASTRINI. Konstruksi dan analisis pustaka metagenomik yang
mengekspresikan senyawa bioaktif untuk mengendalikan Xanthomonas oryzae pv.
oryzae pada tanaman padi. Dibimbing oleh GIYANTO dan KIKIN HAMZAH
MUTAQIN.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae penyebab penyakit hawar daun bakteri
merupakan bakteri patogen penting pada pertanaman padi di dunia, termasuk
Indonesia. Berbagai upaya telah dilakukan dalam pengembangan teknologi
pengendalian patogen tersebut seperti eksplorasi agens hayati atau senyawa
bioaktifnya untuk menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae, namun metode
yang digunakan terbatas untuk agens hayati dan senyawa bioaktif dari mikrob
yang dapat dikulturkan pada media buatan. Disisi lain, biosfer didominasi oleh
berbagai jenis mikrob yang tidak dapatdikulturkan pada media buatan. Teknologi

baru yang disebut metagenomika dikembangkan untuk mengatasi keterbatasan
dari metode konvensional. Tujuan penelitian ini adalah mengonstruksi pustaka
metagenomik dari mikrob pada rizosfer tanaman padi, melakukan analisis
fungsional dari klon pustaka metagenomik terhadap X. oryzae pv. oryzae untuk
menghasilkan klon yang mempunyai aktivitas antibiosis terhadap X. oryzae pv.
oryzae, memperoleh informasi tentang DNA sisipan yang mengodekan senyawa
bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae, dan menganalisis potensi senyawa bioaktif dari
pustaka metagenomik dalam menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae.
Pengambilan sampel rizosfer padi dilakukan dengan metode random
purposive sampling dari beberapa daerah, yaitu Sleman, Daerah Istimewa
Yogyakarta; Subang, Jawa Barat; Barito Kuala, Kalimantan Selatan; dan Indragiri
Hilir, Riau. Konstruksi pustaka metagenomik dilakukan melalui tahapan ekstraksi
DNA total secara langsung dari rizosfer tanaman padi yang dilanjutkan dengan
fragmentasi, ligasi DNA sisipan dengan vektor pUC19, transformasi plasmid
rekombinan mengandung DNA sisipan ke dalam sel inang kompeten (E. coli
DH5α), dan seleksi transforman dengan seleksi biru putih. Klon pustaka
metagenomik berupa koloni bakteri berwarna putih dipilih untuk analisis lebih
lanjut.
Analisis fungsional klon pustaka metagenomik terhadap X. oryzae pv.
oryzae dilakukan dengan metode paper disc diffusion assays untuk melihat

aktivitas antibiosis dalam penekanan X. oryzae pv. oryzae secara in-vitro.
Konfirmasi keberadaan DNA sisipan pada klon pustaka metagenomik potensial
dilakukan dengan teknik PCR koloni menggunakan pasangan primer M13F (-20)
(5´- GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´) dan primer M13R (-24) (5´-GGA AAC
AGC TAT GAC CAT G-3´).
Analisis fragmen DNA sisipan dari klon pustaka metagenomik potensial
dilakukan untuk mengetahui tingkat homologi dari fragmen DNA sisipan tersebut
dengan gen lain yang tersedia pada GenBank database. Analisis lebih lanjut
dilakukan untuk melihat potensi senyawa bioaktif dari klon pustaka metagenomik
dalam menekan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae melalui dua macam percobaan.
Percobaan pertama dilakukan dengan menguji senyawa bioaktif yang terdapat
pada substrat cair dari klon pustaka metagenomik menggunakan teknik peracunan
media. Percobaan kedua dilakukan dengan bioassay ekstrak kasar senyawa

bioaktif dari klon pustaka metagenomik menggunakan metode paper disc
diffusion. Ekstrak kasar senyawa bioaktif diperoleh dari hasil ekstraksi
menggunakan pelarut n-heksan, kloroform, dan etil asetat.
Berdasarkan analisis fungsional dari ratusan klon pustaka metagenomik,
diperoleh tujuh klon (2, 10, 52, 63, 72, 77, dan 185) memproduksi senyawa
bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae. Konfirmasi lebih lanjut dengan teknik PCR

menggunakan pasangan primer M13/pUC menunjukkan empat klon pustaka
metagenomik, yaitu klon 52, 72, 77, dan 185 masing-masing mengandung DNA
sisipan berukuran ±600 bp, ±1 500 bp, ±600 bp, dan lebih dari >10 kb. Hal ini
menunjukkan bahwa seluruh atau sebagian dari DNA sisipan yang terdapat di
dalamnya merupakan gen fungsional yang terlibat dalam pengendalian X. oryzae
pv. oryzae.
Analisis urutan nukleotida difokuskan pada dua fragmen DNA sisipan
dengan panjang ±600 bp yang terdapat pada klon 52 dan ±1 500 bp pada klon 72.
Kedua amplikon ini dipilih karena menunjukkan hasil yang konsisten dalam
mempertahankan keberadaan DNA sisipan di dalam selnya. Hasil analisis
homologi menunjukkan bahwa urutan nukleotida dari fragmen DNA sisipan pada
klon pustaka metagenomik 52 dan 72 tidak memiliki kesamaan dengan urutan
DNA gen lain pada GenBank database. Hasil penjajaran hypothetical protein dari
kedua klon pada analisis lanjutan menunjukkan bahwa amplikon dari klon pustaka
metagenomik 52 (±600 bp) memiliki tingkat kesamaan 62%-64% dengan
histidinol dehidrogenase dan amplikon kedua dari klon pustaka metagenomik 72
(±1 500 bp) memiliki tingkat kesamaan 57% dengan enzim 3'-5' eksonuklease.
Hal ini menunjukkan kebaruan dari gen pengkode senyawa bioaktif anti-X. oryzae
pv. oryzae yang diperoleh dengan teknik metagenomik.
Pembacaan nilai OD600 dilakukan untuk melihat pengaruh senyawa bioaktif

anti patogen pada substrat cair dari pustaka metagenomik 52, 72, dan 185
terhadap pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Hasil analisis menunjukkan bahwa
setiap perlakuan yang diuji memiliki pengaruh yang signifikan terhadap
pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae. Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae paling
rendah diamati pada perlakuan senyawa bioaktif dari klon 72 dengan hasil yang
konsisten dari awal hingga akhir pengamatan. Ekstraksi dilakukan pada senyawa
bioaktif dari klon 52 dan 72. Kedua klon pustaka metagenomik tersebut dipilih
karena menunjukkan hasil yang paling konsisten berdasarkan uji aktivitas
antibiosis dan konfirmasi keberadaan DNA sisipan. Hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa senyawa bioaktif dari klon 52 dapat diekstraksi
menggunakan pelarut etil asetat, senyawa bioaktif dari klon 72 dapat diekstraksi
menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat dengan tingkat penekanan yang
berbeda. Senyawa bioaktif dari klon 72 yang diekstraksi menggunakan pelarut
n-heksan menunjukkan penekanan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae paling baik.
Dengan demikian konstruksi pustaka metagenomik yang mengekspresikan
senyawa bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae telah berhasil dilakukan dan diperoleh
2 klon potensial, yaitu klon 52 dan 72 berdasarkan berbagai tahapan analisis yang
dilakukan.
Kata kunci: antibiosis, hawar daun bakteri, metagenom, dan unculturable
microbes.

SUMMARY
TATIT SASTRINI. Construction and analysis of metagenomic libraries
expressing bioactive compound for controlling Xanthomonas oryzae pv. oryzae on
paddy. Supervised by GIYANTO and KIKIN HAMZAH MUTAQIN.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae causing bacterial leaf blight of rice is an
important plant pathogenic bacterium in the world including Indonesia. Several
attempts has been reported to develop control technologies for bacterial leaf blight
disease, including exploration of biological control agents (BAC) or development
of bioactive compound expressed by BAC to suppress Xanthomonas oryzae pv.
oryzae. However, those methods are limited to the substances conventionally
product by culturable microbes in artificial medium. Whereas, biosphere is
believed to be predominated by unculturable microbes which remain unexplored.
A new technology called metagenomics is developed to overcome the
disadvantage of conventional methods. The objectives of this research are to
construct and analysis of metagenomic libraries from rice rhizosphere that
expressing anti-X. oryzae pv. oryzae bioactive compound. The aim of this research
is to construct of metagenomic libraries from rice rhizosphere microbial
community, conducting a functional analysis of metagenomic library against
X. oryzae pv. oryzae to obtain clones which show antibiosis activity in

suppressing the growth of X. oryzae pv oryzae, this study was also conducted to
obtain information about the DNA insert that expressing anti-X. oryzae pv. oryzae
bioactive compound and analyze the potential of bioactive compound from
metagenomic libraries in suppressing the growth of X. oryzae pv oryzae.
Rice rhizosphere samples were collected with random purposive sampling
method from Sleman, Special Region of Yogyakarta; Subang, West Java; Barito
Kuala, South Kalimantan; and Indragiri Hilir, Riau. Metagenomic library
construction methods consist of direct extraction of total DNA from the paddy
rhizosphere followed by DNA fragmentation, ligation on pUC19 vector, then
introducing them into a host (E. coli DH5α) cell, and selecting transformants by
blue white selection. White colonies (metagenomic library) were selected for
further analysis. Functional analysis of metagenomic library clones of X.oryzae pv.
oryzae was carried out using a paper disc diffusion assays to observe antibiosis
activity of clones inhibit in-vitro growth of X.oryzae pv. oryzae. Subsequently, the
inserted DNA fragment from the metagenomic library which is expressing the
bioactive compound was confirmed by colony PCR using primer pairs: primer
M13F (-20) (5´- GTA AAA CGA CGG CCA GT-3´) and primer M13R (-24)
(5´-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3´).
The result of PCR was further analyzed to determine the nucleotide
sequence and the percentage of inserted DNA homologue with the other encoding

protein genes from GenBank database. Further analysis was performed to
determine potential of bioactive compound from metagenomic libraries in
suppressing the growth of X. oryzae pv oryzae through two experiments. The first
experiment was conducted by testing the bioactive compounds contained in the
liquid substrate of metagenomic library clones using food poisoning technique.
The second experiment conducted by bioassay of crude extract the bioactive
compounds using paper disc diffusion method. Crude extract the bioactive

compounds were extracted with organic solvents i.e. n-hexane, chloroform, and
ethyl acetate.
Based on functional analysis of hundreds selected of metagenomic library
clones, seven metagenomic library have been found such as clones (2, 10, 52, 63,
72, 77, and 185) producing anti-X. oryzae pv. oryzae bioactive compounds.
Further confirmation by PCR using M13/pUC primer pair showed that four
metagenomic clones i.e. 52, 72, 77, and 185 contained ±600, ±1 500, ±600 bp,
and > 10 kb fragment size, respectively. This indicate that the whole or part of
insert DNA in recombinant plamids is functional gene which is responsible for
antibiosis mechanism in controlling of X. oryzae pv oryzae.
Analysis of inserts DNA fragment was focused on the two amplicon i.e.
±600 bp (clone 52) and ±1 500 bp (clone 72). Both of the amplicons were selected

because they still maintaining the presence of insert DNA after cultured in
artificial media for several times. Nucleotide sequence analysis of DNA insert on
clones 52 and 72 showed no similarity to known gene(s) in GenBank database.
Then, we further performed hypothetical protein alignment and indicated that
amplicon obtained from metagenomic libraries clone 52 (±600 bp) has similarity
62%-64% to protein histidinol dehydrogenase and amplicon obtained from
metagenomic libraries clone 72 (± 1 500 bp) has similarity 57% with genes
encoding 3'-5' exonuclease. Indicated that novel gene(s) encoding anti-X. oryzae
pv. oryzae bioactive compound has been obtained with this metagenomics
technique.
There are no any similarities of both DNA sequences to other sequences
available in GenBank database. This data indicated that both DNA insert may be a
novel gene encoding bioactive compound anti-X. oryzae pv. oryzae that never
been characterized yet. Then, we further performed hypothetical protein alignment
and indicated that the first amplicon obtained from metagenomic libraries clone
52 (±600 bp) has a level of similarity 62%-64% to protein histidinol
dehydrogenase which function as a catalyst in the last two steps in the L-histidine
biosynthesis pathway (Marchler-Bauer et al., 2015) as shown on Table 1.
Optical density value have been read to observe the effect of anti-pathogenic
bioactive compounds contained in liquid substrate of 52 and 72 against growth of

X. oryzae pv. oryzae. The results showed that each treatment which was tested had
significant influence against growth of X. oryzae pv. oryzae with the lowest
growth came from bioactive compound of clone 72. Extraction performed on
bioactive compounds from clones 52 and 72. Both clones are chosen because they
showed the most consistent results based on antibiosis activity test and confirm
the presence of DNA insert. The results showed that bioactive compound of clone
52 can be extracted using a solvent ethyl acetate, bioactive compounds of clone 72
can be extracted using a solvent n-hexane and ethyl acetate with different
suppression rate. The highest growth suppression of X. oryzae pv. oryzae came
from crude bioactive compound of clone 72 was extracted with n-hexane. Thus,
the construction of metagenomic libraries expressing anti-X. oryzae pv. oryzae
bioactive compounds has been successfully and obtained two potential clones
(clones 52 and 72) based on various stages of analysis performed.
Keywords : antibiosis mechanism, bacterial leaf blight, metagenomic, and
unculturable microbes.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KONSTRUKSI DAN ANALISIS PUSTAKA METAGENOMIK
YANG MENGEKSPRESIKAN SENYAWA BIOAKTIF
UNTUK MENGENDALIKAN Xanthomonas oryzae pv. oryzae
PADA TANAMAN PADI

TATIT SASTRINI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc

Judul Tesis : Konstruksi dan analisis pustaka metagenomik yang
mengekspresikan senyawa bioaktif untuk mengendalikan
Xanthomonas oryzae pv. oryzae pada tanaman padi
Nama
: Tatit Sastrini
NIM
: A352120101

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Giyanto, MSi
Ketua

Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Fitopatologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Ir Sri Hendrastuti H, MSc

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 18 Desember 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
karya ilmiah yang berjudul “Konstruksi dan analisis pustaka metagenomik yang
mengekspresikan senyawa bioaktif untuk mengendalikan Xanthomonas oryzae pv.
oryzae pada tanaman padi”.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggitingginya kepada Dr Ir Giyanto, MSi dan Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi
selaku dosen pembimbing yang telah memberikan pengarahan dan motivasi tiada
henti selama pelaksanaan kegiatan penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Prof Dr Ir Sri Hendrastuti
Hidayat, MSc selaku Ketua Program Studi Fitopatologi yang telah memberikan
pengarahan kepada penulis selama pelaksanaan studi. Penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah
memberikan beasiswa pendidikan melalui program Beasiswa Unggulan Dalam
Negeri 2012. Ucapan terima kasih penulis ucapkan juga kepada Kementrian
Penelitian dan Pengembangan Pertanian Indonesia atas dukungan biaya penelitian
melalui Kemitraan Kolaborasi pada Penelitian dan Pengembangan Pertanian
Nasional Nomor Hibah: 50/PL.220/I.1/3/2014.K tanggal 10 Maret 2014.
Rasa bangga dan ucapan terima kasih yang begitu besar penulis sampaikan
kepada teman-teman Fitopatologi 2012, Mikrobiologi 2012, teman-teman di
Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, dan sahabat-sahabat terbaik atas
kebersamaan yang luar biasa dan sumbangan pemikiran selama menyelesaikan
studi ini.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada
orang tua terbaik yang tiada henti memberikan do'a dan dukungan yang begitu
besar agar penulis memperoleh pendidikan terbaik sebagai bekal masa depan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan
khususnya dalam bidang fitopatologi.

Bogor, Januari 2016

Tatit Sastrini

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xiii

DAFTAR GAMBAR

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

xiii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Penyakit Hawar Daun
Bakteri
Pengendalian Hayati Patogen Tumbuhan
Eksplorasi Potensi Agens Hayati dengan Teknik Konvensional
Eksplorasi Potensi Agens Hayati dengan Teknik Metagenomika

4

3 METODE
Tempat dan Waktu
Bahan dan Alat
Pengambilan Sampel Rizosfer Tanaman Padi
Konstruksi Pustaka Metagenomik
Isolasi DNA Total dari Sampel Rizosfer Padi dan Fragmentasi
DNA
Penyiapan Sel Inang Kompeten (E. coli DH5α)
Penyiapan Vektor (plasmid pUC19)
Ligasi DNA Sisipan pada Plasmid pUC19
Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam Sel Inang Kompeten
(E. coli DH5α)
Seleksi Transforman dengan Metode Seleksi Biru Putih
Analisis Fungsional Klon Pustaka Metagenomik terhadap
X. oryzae pv. oryzae
Penyiapan Patogen Uji
Uji Antibiosis Klon Pustaka Metagenomik terhadap
X. oryzae pv. oryzae
Konfirmasi Klon Pustaka Metagenomik
Analisis Fragmen DNA Sisipan yang Terlibat dalam Penekanan
Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
Pertumbuhan Klon Pustaka Metagenomik Potensial
Isolasi Plasmid Rekombinan Pada Klon Pustaka Metagenomik
Potensial
Amplifikasi Fragmen DNA Sisipan pada Plasmid Rekombina

4
4
5
5
11
11
11
11
12
12
13
13
15
15
16
16
16
17
17
18
18
18
19

Perunutan Nukleotida dan Analisis Homologi Fragmen DNA
Sisipan
19
Analisis Potensi Senyawa Bioaktif dari Klon Pustaka Metagenomik
dalam Menekan Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
19
Analisis Potensi Senyawa Bioaktif yang Terdapat pada Supernatan
dari Klon Pustaka Metagenomik dalam Menekan Pertumbuhan
X. oryzae pv. oryzae
20
Analisis Potensi Ekstrak Kasar Senyawa Bioaktif dari Klon Pustaka
Metagenomik dalam Menekan Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
20
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi Pustaka Metagenomik
Isolasi dan Fragmentasi DNA Sisipan
Sel Inang Kompeten dan Vektor (plasmid pUC19)
Transformasi dan Seleksi Bakteri Transforman
Analisis Fungsional Klon Pustaka Metagenomik terhadap X. oryzae
pv. oryzae
Patogen Uji
Aktivitas Antibiosis Klon Pustaka Metagenomik dalam Menekan
Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
Analisis Fragmen DNA Sisipan yang Terlibat dalam Penekanan
Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
Pengaruh Senyawa Bioaktif dari Pustaka Metagenomik terhadap
Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
Pengaruh Senyawa Bioaktif yang Terdapat pada Supernatan dari
Klon Pustaka Metagenomik terhadap Pertumbuhan X. oryzae
pv. oryzae
Pengaruh Ekstrak Kasar Senyawa Bioaktif dari Klon Pustaka
Metagenomik terhadap Pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae

22
22
22
24
25

5 PEMBAHASAN UMUM

40

6 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

43
43
43

DAFTAR PUSTAKA

44

LAMPIRAN

50

RIWAYAT HIDUP

60

27
27
28
33
36

36
36

DAFTAR TABEL
1
2
3

Konsentrasi dan kemurnian DNA total mikrob hasil isolasi dari
sampel rizosfer pertanaman padi pada beberapa agroekosistem
Tingkat kemiripan urutan asam amino DNA sisipan pada klon 52
dengan database protein di pusat data GenBank
Tingkat kemiripan urutan asam amino DNA sisipan pada klon 72
dengan database protein di pusat data GenBank

23
34
35

DAFTAR GAMBAR
1

Diagram alir penelitian konstruksi dan analisis pustaka metagenomik
yang mengekspresikan senyawa bioaktif untuk mengendalikan X. oryzae
pv. oryzae pada tanaman padi

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

14

Peta struktur dan genetik plasmid pUC19
Visualisasi sampel DNA total asal rizosfer diikuti hasil pemotongan
secara parsial dengan enzim restriksi HindIII
Perbanyakan plasmid pada sel kompeten E. coli DH5α
Konfirmasi DNA plasmid dengan pemotongan menggunakan enzim
restriksi HindIII dan DNA plasmid hasil defosforilasi
Hasil seleksi pustaka metagenomik dengan metode seleksi biru-putih
Konfirmasi X. oryzae pv. oryzae
Seleksi aktivitas antibiosis pustaka metagenomik terhadap
penekanan X. oryzae pv. oryzae
Penghambatan pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae oleh beberapa
klon pustaka metagenomik
Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA sisipan dengan teknik
PCR pada pustaka metagenomik potensial
Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA pada pustaka
metagenomik 2, 10, dan 63 dengan teknik long PCR
Pengaruh senyawa bioaktif klon pustaka metagenomik 52, 72, dan
185 terhadap pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
Hasil bioassay ekstrak kasar senyawa bioaktif dari klon pustaka
metagenomik dengan pelarut n-heksan, kloroform, dan etil asetat
terhadap X. oryzae pv. oryzae
Pengaruh ekstrak kasar senyawa bioaktif dari klon pustaka
metagenomik 52 dan 72 terhadap X. oryzae pv. oryzae

3
7
22
24
25
26
27
28
30
31
32
36

37
38

DAFTAR LAMPIRAN
1
2

3

Urutan nukleotida fragmen DNA sisipan pada klon pustaka
metagenomik 52
Urutan nukleotida fragmen DNA sisipan pada klon pustaka
metagenomik 72
Perbandingan urutan asam amino DNA sisipan dari klon pustaka
metagenomik 52 dengan histidinol dehydrogenase [Candidatus

50
51

4

5

6

7
8

9
10
11

Koribacter versetilis] (WP 011524483.1)
Perbandingan urutan asam amino DNA sisipan dari klon pustaka
metagenomik 52 dengan histidinol dehydrogenase [Acidobacteria
bacterium KBS146] (WP 026387161.1)
Perbandingan urutan asam amino DNA sisipan dari klon pustaka
metagenomik 72 dengan hypotetical protein [Pedoshaera parvula]
(WP 040550142.1)
Perbandingan urutan asam amino DNA sisipan dari klon pustaka
metagenom 72 dengan 3'-5' exonuclease [bacterium Ellin514]
[Pedosphere parvula Ellin514] (EEF58269.1)
Pengaruh senyawa bioaktif klon pustaka metagenomik 52, 72, dan
185 terhadap pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae
Analisis ragam pengaruh senyawa bioaktif klon pustaka
metagenomik 52, 72, dan 185 terhadap pertumbuhan
X. oryzae pv. oryzae
Ekstrak kasar masing-masing senyawa bioaktif dari klon pustaka
metagenomik 52 dan 72
Analisis ragam pengaruh ekstrak kasar senyawa bioaktif dari klon
pustaka metagenomik 52 dan 72 terhadap X. oryzae pv. oryzae
Pengaruh ekstrak kasar senyawa bioaktif dari klon pustaka
metagenomik 52 dan 72 terhadap X. oryzae pv. oryzae

52

53

54

55
56

57
58
58
59

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan oleh X. oryzae pv.
oryzae merupakan salah satu penyakit penting pada pertanaman padi di dunia,
termasuk Indonesia. Luas pertanaman padi di Indonesia sampai tahun 2012 adalah
13 445 524 ha dan sebesar 43 719 ha terserang penyakit HDB (Ditjen Tanaman
Pangan 2013). Di Indonesia, dilaporkan terdapat 12 patotipe X. oryzae pv. oryzae
yang menyerang pertanaman padi. Tingginya kemampuan patogen untuk
membentuk patotipe baru menjadi salah satu tantangan dalam upaya pengendalian
(Suparyono et al. 2004). Menurut Suparyono dan Sudir (1992) serta BB Padi
(2013), penurunan hasil produksi padi di Indonesia akibat serangan patogen
tersebut sebesar 35.8%-60%. Teknik pengendalian yang dapat digunakan untuk
penyakit ini adalah dengan penerapan praktik budi daya yang baik termasuk
penggunaan benih sehat, penggunaan varietas tahan, pengendalian kimia, dan
pengendalian hayati (Nino-Liu et al. 2006). Pengendalian kimia yang dilakukan
dengan penggunaan bakterisida sintetik menjadi salah satu teknik pengendalian
yang banyak digunakan, namun kenyataannya berbahaya bagi keseimbangan
ekosistem. Dengan demikian pengendalian hayati mulai banyak dikaji karena
dinilai lebih ramah terhadap lingkungan dan kesehatan manusia dibandingkan
dengan pengendalian kimia, serta tidak menyebabkan resistensi patogen sasaran.
Pengendalian hayati dilakukan dengan memanfaatkan agens hayati atau senyawa
bioaktif yang dihasilkannya untuk mengendalikan patogen. Potensi agens hayati
dapat dieksplorasi dari mikrob pada sampel lingkungan. Berbagai penelitian
tentang komunitas mikrob pada sampel lingkungan menunjukkan bahwa 1% dari
komunitas mikrob tersebut merupakan kelompok mikrob yang dapat dikulturkan
(culturable microbes), sedangkan sebagian besarnya yaitu 99% merupakan
kelompok mikrob yang tidak dapat dikulturkan (unculturable microbes)
(Borneman et al. 1996; Torsvik dan Ovreas 2002). Berdasarkan studi Torsvik dan
Ovreas (2002) dalam 1 gram tanah terdapat kurang lebih 4 000 spesies mikrob dan
hanya 1% yang dapat dikulturkan pada media buatan.
Eksplorasi agens hayati atau senyawa bioaktifnya dari kelompok mikrob
yang dapat dikulturkan dapat dilakukan menggunakan teknik konvensional
dengan mengisolasi mikrob agens hayati menggunakan media artifisial untuk
selanjutnya dilakukan serangkaian pengujian sebagai agens hayati. Potensi agens
hayati yang lebih besar terdapat pada kelompok mikrob unculturable dapat
dieksplorasi menggunakan teknik metagenomika. Metagenomika merupakan
analisis keseluruhan genom mikrob baik yang dapat dikulturkan maupun yang
tidak dapat dikulturkan dari suatu sampel lingkungan (Schlos dan Handelsman
2003; Handelsman 2004). Perkembangan teknik metagenomika didasari oleh
pengetahuan bahwa biosfer didominasi oleh mikrob yang tidak dapat dikulturkan.
Teknik metagenomika dilakukan dengan mengekstraksi DNA total dari suatu
sampel lingkungan secara langsung, hal ini memungkinkan didapatkannya semua
DNA baik dari mikrob yang dapat dikulturkan maupun yang tidak dapat
dikulturkan. DNA tersebut kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi,
diligasikan pada suatu vektor, dan ditransformasikan pada sel inang. Sel hasil

2
transformasi ini disebut transforman. Kumpulan transforman yang mengandung
vektor dengan fragmen DNA sisipan (gen sisipan) yang berbeda disebut pustaka
metagenomik (Rondon et al. 2000; Daniel 2004; Liles et al. 2003; Amorim et al.
2008; Donato et al. 2010). Terdapat dua pendekatan dalam analisis pustaka
metagenomik, yaitu analisis fungsional (function-driven analysis) dan analisis
berdasarkan urutan nukleotida (sequence-driven analysis).
Teknik metagenomika dapat digunakan untuk mengeksplorasi potensi
genetik yang belum diketahui. Teknik ini sangat potensial untuk mempelajari gengen fungsional yang berasal dari sampel lingkungan (Shen et al. 2007).
Pendekatan teknik metagenomika juga dapat digunakan untuk studi pengendalian
patogen tumbuhan. Van Elsas et al. (2011) menggunakan pendekatan teknik
metagenomika untuk mempelajari komunitas mikrob tanah yang dapat
mengendalikan penyakit tumbuhan. Sessitsch et al. (2012) juga menggunakan
pendekatan metagenomika untuk analisis peranan bakteri endofit yang berasosiasi
dengan akar tanaman padi termasuk salah satunya sebagai agens biokontrol
terhadap patogen.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah mengonstruksi pustaka metagenomik dari mikrob
pada rizosfer tanaman padi, melakukan analisis fungsional dari klon pustaka
metagenomik untuk menghasilkan klon yang mempunyai aktivitas antibiosis
terhadap X. oryzae pv. oryzae, memperoleh informasi tentang DNA sisipan yang
mengodekan senyawa bioaktif anti-X. oryzae pv. oryzae, dan menganalisis potensi
senyawa bioaktif dari pustaka metagenomik dalam menekan pertumbuhan
X. oryzae pv. oryzae.

Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini meliputi kegiatan pengambilan sampel rizosfer
padi pada beberapa lokasi dengan beberapa tipe agroekosistem sawah, konstruksi
pustaka metagenomik, analisis fungsional klon pustaka metagenomik terhadap
X. oryzae pv. oryzae, analisis fragmen DNA sisipan yang terlibat dalam
penekanan pertumbuhan X. oryzar pv. oryzae, dan analisis potensi senyawa
bioaktif dari klon pustaka metagenomik dalam menekan pertumbuhan X. oryzae
pv. oryzae (Gambar 1).

3

Gambar 1 Diagram alir penelitian Konstruksi dan Analisis Pustaka Metagenomik
yang Mengekspresikan Senyawa Bioaktif untuk Mengendalikan
X. oryzae pv. oryzae pada Tanaman Padi

4

2 TINJAUAN PUSTAKA
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Penyakit Hawar Daun Bakteri
Xanthomonas oryzae pv. oryzae merupakan bakteri patogen tanaman yang
menyebabkan penyakit hawar daun bakteri (HDB) pada padi. Koloni bakteri
X. oryzae pv. oryzae yang tumbuh pada media Yeast Extract-Dextrose-Calcium
Carbonate Agar (YDCA) biasanya berwarna kuning, cembung, dan mukoid.
Warna kuning pada koloni bakteri terbentuk karena bakteri tersebut memproduksi
pigmen xanthomonadin (Swings et al. 1990; Schaad et al. 2000). X. oryzae pv.
oryzae bersifat aerobik, berbentuk batang, dan tergolong Gram negatif. Bakteri
tersebut masuk ke daun melalui hidatoda pada ujung dan tepi daun (Schaad et al.
2000; Nino-Liu et al. 2006; Wahyudi et al. 2011). Gejala penyakit yang
disebabkan oleh bakteri patogen ini diawali dengan bintik-bintik berwarna kuning
yang berkembang dan bergabung menjadi klorotik kemudian menjadi nekrotik,
daun berwarna putih keabuan pada ujung dan tepi daun. Patogen bersifat tular
benih sehingga benih merupakan sumber inokulum primer. Hal tersebut
menunjukkan bahwa desinfeksi benih penting dilakukan sebagai salah satu teknik
pengendalian X. oryzae pv. oryzae. Di lapangan, eksudat patogen menyebar
karena angin atau melalui gesekan antara daun dari tanaman sakit ke tanaman
sehat dan melaui percikan air hujan (Suparyono dan Sudir 1992; Nino-Liu et al.
2006).
X. oryzae pv. oryzae menyebabkan kerugian yang tinggi pada usaha
produksi padi di Indonesia. Tingginya kemampuan patogen dalam membentuk
patotipe baru merupakan salah satu tantangan dalam upaya pengendaliannya. Di
Indonesia, dilaporkan terdapat 12 patotipe X. oryzae pv. oryzae berdasarkan
virulensinya terhadap tanaman padi diferensial. Di Pulau Jawa terutama Jawa
Barat, Jawa Tengah, dan Yogyakarta pada umumnya didominasi oleh patotipe
VIII dan IV, sedangkan patotipe III rata-rata kurang dari 10%. X. oryzae pv.
oryzae patotipe III dan IV hanya berkembang di daerah dataran rendah.
Penurunan hasil produksi padi di Indonesia akibat serangan X. oryzae pv. oryzae
cukup besar. Hal tersebut terjadi karena sebagian besar varietas padi komersial
yang ada rentan terhadap patotipe VIII dan VI yang mendominasi daerah sentra
produksi padi di Indonesia terutama di Jawa Barat, Jawa Tengah, dan Yogyakarta
(Suparyono et al. 2004; BB Padi 2013).

Pengendalian Hayati Patogen Tumbuhan
Pengendalian hayati merupakan suatu teknik yang dapat menekan atau
mengurangi kepadatan inokulum atau aktivitas patogen dalam menimbukan
penyakit oleh satu atau lebih organisme hidup (agens antagonis) (Cook dan Baker
1996; Pal dan Gardener 2006). Teknik ini mulai banyak dikaji ketika
pengendalian yang memanfaatkan bahan-bahan kimia sintetik mulai banyak
mendapat kritikan karena berbahaya bagi lingkungan dan kesehatan manusia,
serta dapat menyebabkan resistensi patogen sasaran. Teknik pengendalian ini
telah memperoleh banyak perhatian karena prinsip pengendalian yang dilakukan

5
lebih mengarah kepada menjaga keseimbangan lingkungan, sehingga dapat
menciptakan pertanian yang berkelanjutan (Munif et al. 2012).
Pengendalian hayati mengacu pada pemanfaatan secara sengaja organisme
lokal atau yang diintroduksi untuk pengendalian patogen tumbuhan. Salah satu hal
penting dalam praktik pengendalian hayati adalah manipulasi lingkungan untuk
meningkatkan aktivitas agens hayati sehingga secara tidak langsung dapat
menekan patogen. Pengendalian hayati penyakit tanaman dengan menggunakan
mikrob antagonis bertumpu pada mekanisme antibiosis, kompetisi,
hiperparasitisme, dan induksi resistensi pada tanaman inang (Sigee 1993; Cook
dan Baker 1996; Pal dan Gardener 2006; Suryanto et al. 2010). Eksplorasi agens
hayati merupakan salah satu komponen utama pada studi pengendalian hayati.
Dengan demikian, pemahaman tentang prinsip dan metode dalam isolasi dan
seleksi agens hayati menjadi salah satu hal yang penting dalam penerapan teknik
ini. Baker dan Cook (1974) menjelaskan bahwa agens hayati harus dicari pada
area dimana penyakit yang disebabkan oleh patogen tidak ada, menurun, atau
tidak dapat berkembang walaupun tanamannya rentan.
Eksplorasi Potensi Agens Hayati dengan Teknik Konvensional
Eksplorasi potensi agens hayati dengan teknik konvensional telah banyak
dilakukan dan dikembangkan. Teknik konvensional dilakukan dengan mengisolasi
mikrob calon agens hayati dari suatu sampel pada media biakan untuk selanjutnya
dilakukan seleksi, karakterisasi, dan uji potensi agens hayati dengan metode
standar yang lebih sederhana (Wahyudi et al. 2011; Munif et al. 2012). Berbagai
penelitian mengenai eksplorasi dan karakterisasi agens hayati telah dilakukan.
Hastuti et al. (2012) menemukan 10 isolat Streptomyces spp. yang juga efektif
menekan patogen tersebut berdasarkan pengujian in planta dan in-vitro.
Berdasarkan hasil uji in-vitro, dua isolat diantaranya (LBR02 dan AB131-1)
memiliki kemampuan memproduksi kitinase, fosfatase, dan siderofor yang
merupakan karakteristik dari agens biokontrol. Menurut Alabouvette et al. (2006),
agens hayati yang melakukan pengendalian patogen melalui mekanisme antibiosis
memiliki kemampuan untuk menghasilkan suatu senyawa bioaktif antipatogen.
Cao et al. (2004) dan Verma et al. (2009) menjelaskan bahwa penelitian tentang
eksplorasi agens hayati juga dapat digunakan untuk mengeksplorasi berbagai
senyawa bioaktif alami baru yang dapat mengendalikan patogen.
Penelitian-penelitian yang dilakukan telah berhasil mengeksplorasi berbagai
agens hayati dan senyawa bioaktif yang dihasilkannya untuk berbagai patogen
tumbuhan menggunakan teknik konvensional. Teknik konvensional hanya dapat
digunakan untuk mengeksplorasi potensi agens hayati dari mikroorganisme yang
dapat dikulturkan pada media buatan. Berdasarkan hasil penelitian tentang
keragaman mikrob, diketahui bahwa hanya 0.1-10% dari seluruh mikrob di alam
yang dapat dikulturkan dibawah kondisi laboratorium. Dengan demikian, sebagian
besar dari potensi mikrob lingkungan tidak dapat dipelajari dan dieksplorasi
menggunakan teknik konvensional (Borneman et al. 1996; Torsvik dan Ovreas
2002; Zeyaullah et al. 2009).
Eksplorasi Potensi Agens Hayati dengan Teknik Metagenomika
Berbagai hasil penelitian yang menunjukkan bahwa organisme yang hidup
di biosfer didominasi oleh mikrob yang tidak dapat dikulturkan menjadi alasan

6
dikembangkannya suatu teknik penelitian baru yang disebut teknik metagenomika.
Metagenomika adalah analisis keseluruhan genom mikrob dari suatu sampel
lingkungan (Rondon et al. 2000; Schlos dan Handelsman 2003; Handelsman
2004). Teknik ini banyak digunakan untuk mempelajari fisiologi dan ekologi
mikrob pada sampel lingkungan dan mulai diperkenalkan pada akhir tahun 1990
(Rondon et al. 2000; Schlos dan Handelsman 2003; Handelsman 2004; Ghazanfar
et al. 2010).
Teknik metagenomika dapat digunakan untuk mengeksplorasi potensi
genetik yang belum diketahui dan dimanfaatkan. Proses kultivasi bakteri tidak
diperlukan dalam teknik metagenomika karena sasaran analisis bukan sel hidup
melainkan molekul DNA. Hal ini memungkinkan diperolehnya gen-gen
fungsional baru yang terlibat dalam pengendalian patogen tumbuhan seperti gen
pengkode antibiotik, enzim, atau senyawa volatil antimikrob dari kelompok
mikroorganisme yang tidak dapat dibiakkan pada media buatan (Schloss dan
Handelsman 2003; Van Elsas et al. 2011; Sessitsch et al. 2012). Teknik ini terdiri
atas tahapan konstruksi pustaka metagenomik dan analisis pustaka metagenomik.
Konstruksi pustaka metagenomik. Konstruksi pustaka metagenomik
dilakukan dengan mengekstraksi DNA total mikrob secara langsung dari suatu
sampel lingkungan, penyiapan vektor, ligasi DNA sisipan pada vektor, kloning
DNA dan transformasi pada sel kompeten, serta seleksi transforman (Sabree et al.
2009). Daniel (2004) menjelaskan bahwa keberhasilan dari teknik metagenomika
sangat berhubungan dengan kualitas DNA yang dipengaruhi pula oleh metode
ekstraksi DNA. Oleh sebab itu, penelitian tentang metode ekstraksi atau isolasi
DNA secara langsung dari sampel lingkungan mulai banyak dikembangkan.
Miller et al. (1999) melakukan evaluasi sembilan prosedur metode ekstraksi dan
jenis sampel yang berbeda. Pada teknik metagenomik, DNA total mikrob dari
suatu sampel lingkungan diekstraksi secara langsung sehingga memungkinkan
didapatkannya sumber daya genetik baik dari mikroba yang dapat dikulturkan
maupun yang tidak dapat dikulturkan sebagai bahan analisis (Rondon et al. 2000;
Sabree et al. 2009).
Vektor adalah molekul DNA yang digunakan untuk mentransfer dan
memperbanyak fragmen DNA atau gen target yang diinginkan. Salah satu jenis
vektor yang sering digunakann pada bidang bioteknologi molekuler adalah
plasmid. Plasmid adalah molekul DNA ekstrakromosom, berbentuk sirkuler, dan
berukuran relatif kecil. Penggunaan plasmid sebagai vektor dalam DNA
rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting
untuk DNA kloning, yaitu replication origin yang berperan dalam proses replikasi
DNA, penanda (marker) yang memungkinkan adanya seleksi (gen resistensi
antibiotik), dan daerah yang dapat disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Multiple
cloning site) (Brown 1991; Sambrook dan Russell 2001; Dale dan Park 2010).
Plasmid pUC19 merupakan salah satu plasmid yang dapat digunakan sebagai
vektor kloning dan vektor ekspesi pada sel E.coli DH5α (Liaw dan Srinivasan
et al. 1989; Chow 2005). Plasmid pUC19 memiliki replication origin, situs
pemotongan berbagai jenis enzim restriksi, gen resistensi terhadap ampisilin (gen
bla), dan memiliki gen pelapor (gen LacZ) (Gambar 2).

7

Gambar 2 Peta struktur dan genetic plasmid pUC19 (http://www.snapgene.com
/resources/ plasmid_files/basic_cloning_vectors/pUC19)
Proses ligasi merupakan penggabungan fragmen DNA yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi untuk menghasilkan suatu molekul DNA
rekombinan. Pada teknik metagenomika, DNA total dari sampel lingkungan
dipotong menggunakan enzim restriksi endonuklease tipe II. Menurut Old dan
Primrose (2003), enzim ini memotong ikatan fosfodiester pada situs pengenalan
yang bersifat spesifik dari suatu molekul DNA sehingga digunakan dalam teknik
rekayasa genetika. Fragmen DNA tersebut kemudian digabungkan dengan vektor
yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai. Proses
penggabungan ini melibatkan enzim ligase. Sambrook dan Russell (2001)
menjelaskan bahwa enzim ligase dapat mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester diantara ujung 3'-hidroksil dan 5'-fosforil DNA pada saat proses
replikasi DNA di dalam sel inang.
Studi genetika bakteri dan biologi molekuler diprakarsai dengan adanya
percobaan transformasi yang dilakukan oleh Fred Griffith pada tahun 1928.
Transformasi adalah suatu proses pengambilan dan penggabungan molekul DNA
oleh sel bakteri dari media sekitarnya. Transformasi memiliki peranan penting
dalam analisis genetik karena peran kuncinya dalam kloning gen (Dale dan Park
2010). Dasar dari proses transformasi yang kaitannya dengan modifikasi genetik
bakteri secara artifisial adalah kemampuan dari bakteri dalam mengambil molekul
DNA dari lingkungan sekitarnya. Pada proses ini diperlukan suatu sel kompeten,
yaitu sel yang memiliki kemampuan efisien dalam mengambil DNA. Perlakuan
kalsium klorida (CaCl2) pada E.coli dapat membuat sel tersebut memiliki
kemampuan yang baik dalam mengambil DNA asing (Mendel dan Higa 1970,

8
Cohen et al. 1972). Bakteri biasanya mengandung sistem restriksi yang berperan
dalam pengenalan dan pendegradasian DNA asing. Hal tersebut dapat
mempengaruhi efisiensi proses transformasi. Oleh karena itu biasanya digunakan
sel kompeten (E. coli) hasil mutasi yang tidak mengandung restriksi sebagai sel
inang (Old dan Primrose 2003). Berbagai penelitian telah dilakukan untuk
mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi transformasi. Hasil yang
diperoleh menunjukkan bahwa E.coli dan DNA plasmid melakukan interaksi
secara produktif pada kondisi dimana ion kalsium tersedia, temperatur rendah (0-5
o
C), dan adanya kejutan panas pada suhu 37-45 oC. Pengujian keberhasilan
transformasi dan stabilitas plasmid di dalam sel inang (sel kompeten) penting
dilakukan karena dalam transformasi biasanya jumlah sel yang berhasil
ditransformasi lebih sedikit dari pada jumlah sel yang tidak berhasil
ditransformasi (Old dan Primrose (2003).
Seleksi bakteri transforman yang mengandung vektor rekombinan atau
disebut pustaka metagenomik dalam teknik metagenomika merupakan salah satu
tahap penting. Plasmid yang digunakan sebagai vektor biasanya mengandung gen
resisten terhadap antibiotik tertentu seperti ampisilin, tetrasiklin, atau
kloramfenikol sebagai penanda seleksi sehingga sel-sel yang tidak mengandung
plasmid akan mati ketika ditumbuhkan pada media yang mengandung ampisilin
(Old dan Primrose 2003). Seleksi tranforman juga dapat dilakukan dengan
pengamatan ekspresi dari gen pelapor yang dimiliki oleh vektor seperti gel LacZ
untuk seleksi biru-putih (Dale dan Park 2010).
Pada vektor seperti plasmid pUC19, terdapat gen bla dan lacZ yang
memegang peranan penting dalam proses seleksi transforman. Pengamatan
aktivitas kedua gen tersebut akan memberikan hasil yang akurat pada tahapan
seleksi transforman. Gen bla mengodekan sintesis enzim β-laktamase yang
berperan dalam degradasi antibiotik ampisilin sehingga sel bakteri yang berhasil
ditransformasi memiliki sifat resistensi terhadap antibiotik tersebut. Seleksi
transforman dengan pengamatan aktivitas gen bla saja hanya mampu
membedakan bakteri yang berhasil menerima plasmid, namun tidak dapat
membedakan apakah plasmid tersebut mengandung DNA sisipan atau tidak (Dale
dan Park 2010). Gen lacZ mengodekan sintesis enzim β-galaktosidase. Induser
kimia untuk mengaktifkan transkripsi gen lacZ adalah isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG). Enzim β-galaktosidase dapat memecah substrat
laktosa atau 5-bromo-4-cloro-3-indolylbeta-D-galactopyranocide (X-gal).
Pewarna biru dilepaskan pada proses hidrolisis X-gal oleh β-galaktosidase,
penambahan IPTG dan X-gal pada media tumbuh menyebabkan β-galaktosidase
mengubah molekul X-gal menjadi galaktosa dan 5.5'-dibromo-4.4'-dichloroindigo sehingga menghasilkan koloni bakteri berwarna biru. Seleksi transforman
dengan pengamatan aktivitas gen lacZ juga dapat membedakan apakah plasmid
yang diterima oleh sel inang mengandung DNA sisipan atau tidak. Sel inang yang
mengandung plasmid tanpa DNA sisipan akan membentuk koloni berwarna biru,
sedangakan sel inang yang mengandung plasmid dengan DNA sisipan akan
membentuk koloni berwarna putih. Pembentukan koloni berwarna putih terjadi
karena penyisipan DNA asing atau gen yang akan dianalisis terjadi pada daerah
MCS yang berada di dalam gen lacZ. Penyisipan ini menyebabkan gen tersebut
menjadi tidak terekspresi. Seleksi transforman dengan pengamatan aktivitas gen
lacZ disebut seleksi biru-putih (Kobolak dan Muller 2003; Dale dan Park 2010).

9
Analisis klon pustaka metagenomik. Analisis pustaka metagenomik
dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu analisis berdasarkan urutan nukleotida
(sequence-driven analysis) dan analisis fungsional (function-driven analysis).
Sequence-driven analysis biasanya digunakan dalam penelitian yang bertujuan
untuk mengetahui keragaman organisme dan filogeni dari suatu sampel
lingkungan. Function-driven analysis digunakan dalam penelitian yang bertujuan
untuk mengetahui peranan berbagai mikrob pada sampel lingkungan dan untuk
memperoleh klon yang mengekspresikan sifat yang diinginkan. Analisis
dilakukan berdasarkan sifat fenotipik yang diekspresikan oleh klon pustaka
metagenomik, diikuti analisis urutan DNA sisipan, dan alisis biokimia (Schloss
dan Handelsman 2003). Pendekatan ini baik digunakan untuk menghasilkan klon
atau produk alami seperti protein yang bermanfaat dalam pengendalian patogen
tumbuhan (Van Elsas et al. 2011; Sessitsch et al. 2012).
Ekspresi gen merupakan salah satu hal yang perlu difahami dalam teknik
metagenomika terutama untuk analisis pustaka metagenomik menggunakan
pendekatan function-driven analysis (Rondon et al. 2000; MacNeil et al. 2001;
Schloss dan Handelsman 2003). Ekspresi gen membahas tentang bagaimana
informasi genetik dikendalikan dan digunakan oleh sel (Paolella 1998). Ekspresi
sifat genetik pada organisme termasuk prokariot diawali suatu proses yang disebut
transkripsi. Transkripsi adalah proses penyalinan kode genetik yang ada pada
urutan DNA menjadi RNA (mRNA, tRNA, dan rRNA). Berbeda dengan replikasi
yang terjadi pada keseluruha DNA, transkripsi hanya terjadi pada segmen DNA
yang mengandung kelompok gen tertentu saja (unit transkripsi). Gen yang
lengkap terdiri atas tiga komponen utama, yaitu promoter sebagai pengendali
proses transkripsi, bagian struktural yang mengandung informasi genetik, dan
terminator yang berperan dalam pengakhiran proses transkripsi. Pada proses
selanjutnya yaitu translasi, mRNA yang membawa informasi genetik kemudian
diterjemahkan menjadi asam amino penyusun suatu polipeptida atau protein
tertentu (Paolella 1998; Yuwono 2005).
E. coli yang biasa digunakan sebagai sel inang dalam rekayasa genetik
memiliki operon lac yang mengendalikan metabolisme laktosa. Operon lac ini
terdiri atas tiga gen structural, yaitu gen lacZ, lacY, dan lacA. Pada vektor
ekspresi seperti plasmid pUC19, daerah penyisipan DNA atau gen asing (MCS)
berada pada gen lacZ. Dengan demikian proses ekspresi gen asing pada sel inang
E. coli terjadi dibawah kendali Promotor lac (Plac) yang terdapat pada vektor
tersebut. Promotor ini merupakan situs yang dikenali oleh RNA polimerase sel
inang untuk memulai proses transkripsi (Liaw dan Srinivasan et al. 1989; Paolella
1998; Yuwono 2005; Dale dan Park 2010).
Teknik PCR dapat digunakan untuk menganalisis fragmen DNA sisipan
pada pustaka metagenomik baik untuk mengetahui ukuran maupun konfirmasi
keberdaan fragmen DNA sisipan. Selain itu, dalam teknik metagenomika biasanya
dilakukan analisis urutan nukleotida dari fragmen DNA sisipan. Perunutan
nukleotida DNA sisipan dilakukan untuk memperoleh informasi lebih lanjut
tentang gen-gen dengan aktivitas yang diinginkan. Dalam analisis urutan DNA ini
tentunya diperlukan fragmen DNA dalam jumlah yang cukup. Polymerase chain
reaction (PCR) merupakan suatu teknik yang dapat digunakan untuk
memperbanyak fragmen DNA yang akan dianalisis. PCR merupakan teknik yang
memungkinkan proses pelipatgandaan fragmen DNA secara eksponensial. Proses

10
tersebut dilakukan di luar sel dengan bantuan dari berbagai macam komponen
berupa enzim DNA polimerase, nukleotida, dan primer. Prinsip kerja dari proses
amplifikasi DNA secara artifisial ini sesuai dengan proses replikasi DNA yang
biasa terjadi pada organisme hidup. Proses PCR memerlukan sejumlah siklus
untuk mengamplifikasi suatu fragmen DNA spesifik. Setiap siklus terdiri atas tiga
tahap, yaitu denaturasi, annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerasi). Teknik
ini merupakan teknik dalam membuat salinan DNA (Mullis dan Faloona 1989;
Yuwono 2006). Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in-vitro yang
digunakan untuk mensintesis urutan DNA tertentu dengan menggunakan dua
primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit
dua target DNA.

11

3 METODE

Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan serta di
Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman,
Institut Pertanian Bogor pada bulan Mei 2013 sampai Juli 2015.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah sampel
rizosfer pertanaman padi, PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO-BIO), GeneJET
Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific), bakteri kompeten Eschericia coli
DH5α, enzim restriksi HindIII (Thermo Scientific), vektor transformasi berupa
plasmid pUC19 (Thermo Scientific), T4 DNA Ligase (Thermo Scientific),
5-bromo-4-cloro-3-indolylbeta-D-galactopyranocide atau X-gal (Thermo
Scientific), isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside atau IPTG (Thermo Scientific),
Dream Taq Green PCR Master Mix 2X (Thermo Scientific), Dream Taq KAPA
HiFi HotStart PCR Kit (Kapabiosystems), primer M13F (-20) (5'- GTA AAA
CGA CGG CCA GT-3') dan primer M13R (-24) (5'-GGA AAC AGC TAT GAC
CAT G-3'), GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific), GeneRuler 100 bp
DNA Ladder (Thermo Scientific), bakteri patogen tumbuhan Xanthomonas
oryzae pv. oryzae patotipe IV, n-heksan, etil asetat, kloroform, aseton, dan
sebagainya. Alat yang diperlukan dalam penelitian adalah sentrifuge (Hettich
Mikro 200R Centrifuge), shaker waterbath (Advantec TBK202AA), Nanodrop
2000 (Thermo Scientific), alat elektroforesis, transilluminator UV, mesin PCR
(GeneAmp PCR System 9700), syringe-filter 0.20 µm (Sartorius Stendim
Biotech), corong pisah, rotary evaporator, dan sebagainya.

Pengambilan Sampel Rizosfer Tanaman Padi
Pengambilan sampel rizosfer padi dilakukan pada beberapa area pertanaman
padi dengan jenis agroekosistem sawah yang berbeda, yaitu di Desa
Widodomartani, Kecamatan Ngemplak dan Desa Harjobinangun, Kecamatan
Tratas, Kabupaten Sleman, Yogyakarta yang dijadikan satu contoh komposit
(sawah tadah hujan); Desa Gempol Sari, Kecamatan Patok Beusi, Ka