Mutagenesis dengan Transposon pada Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Hawar Daun Padi

MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON PADA Xanthomonas
oryzae pv. oryzae PENYEBAB HAWAR DAUN PADI

YANI MULYANI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Mutagenesis dengan
Transposon pada Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Hawar Daun Padi
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, November 2013
Yani Mulyani
NIM G34090039

2

ABSTRAK
YANI MULYANI. Mutagenesis dengan Transposon pada Xanthomonas
oryzaepv. oryzae Penyebab Hawar Daun Padi. Dibimbing oleh ARIS TRI
WAHYUDI dan ALINA AKHDIYA
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) merupakan bakteri yang
menyebabkan penyakit hawar daun bakteri (HDB) pada padi sehingga dapat
menurunkan produktivitasnya. Penggunaan agens biokontrol dianggap sebagai
solusi yang efektif. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan
mutan
Xanthomonas oryzae pv. oryzae melalui mutagenesis dengan transposon.
Introduksi transposon mini-Tn5Km1 yang dibawa oleh E.coli S-17-1(λ pir) ke
dalam isolat Xoo STG21 dilakukan dengan teknik konjugasi diparental mating.
Mutagenesis dengan transposon dilakukan dengan tiga perbandingan donor dan

resipien 1:1, 1:10, dan 10:1. Frekuensi konjugasi rata-rata secara berurutan, yaitu
2.7×10-6; 1.1×10-6; 2.4×10-6. Lima mutan (M93, M99, M107, M112, dan M120)
dari 300 mutan yang diujikan tidak menyebabkan reaksi hipersensitif pada
tanaman tembakau. Uji yang dilakukan pada tanaman padi IR64 menunjukkan
kelima mutan tersebut mampu menurunkan gejala HDB dengan presentase secara
berturut-turut 96%; 94%; 94%; 91%; dan 92%.
Kata kunci: HDB, mutagenesis, transposon, Xanthomonas

ABSTRACT
YANI MULYANI. Transposon Mutagenesis of Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Caused Agent of Bacterial Leaf Blight of Rice. Supervised by ARIS TRI
WAHYUDI and ALINA AKHDIYA
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) causes bacterial leaf blight (BLB)
disease of rice that can reduce rice productivity. The use of biocontrol agents is
an effective solution to solve this problem. The aim of this study was to obtain
mutants of Xanthomonas oryzae pv oryzae through transposon mutagenesis.
Transposon mini-Tn5Km1 carried by E.coli S-17-1 (λ pir) was introduced into
Xanthomonas oryzae pv oryzae STG21 by conjugation diparental mating.
Frequency of tranconjugation obtained from this study was about 2.7×10-6,
1.1×10-6, dan 2.4×10-6 at the ratios of 1:1, 1:10, and 10:1 respectively. Five

mutants (M93, M99, M107, M112, and M120) out of 300 mutants tested did not
cause a hypersensitive reaction on tobacco plants. However, on rice IR64 plants
showed that those mutants could reduce the symptoms of BLB with presentage of
96%, 94%, 94%, 91% and 92% respectively.
Keywords: HDB, mutagenesis, transposon, Xanthomonas

3

MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON PADA Xanthomonas
oryzae pv. oryzae PENYEBAB HAWAR DAUN PADI

YANI MULYANI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

4

Judul Skripsi : Mutagenesis dengan Transposon pada Xanthomonas oryzae pv.
oryzae Penyebab Hawar Daun Padi
Nama
: Yani Mulyani
NIM
: G34090039

Disetujui oleh

Prof Dr Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I

Alina Akhdiya, MSi

Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen

Tanggal Lulus: (tanggal penandatanganan skripsi oleh ketua departemen)

2

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
kasih sayang-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari sampai Juli 2013
ini ialah agens biokontrol, dengan judul Mutagensesis dengan Transposon pada
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Hawar Daun Bakteri.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Aris Tri Wahyudi dan
Ibu Alina Akhdiya MSi selaku pembimbing serta Prof Dr Alex Hartana selaku

anggota tim penguji skripsi. Seluruh biaya penelitian ini didanai oleh pembimbing
utama, untuk itu saya mengucapkan terima kasih. Terima kasih juga diucapkan
pada Bapak Jaka, Ibu Heni, dan Mas Aldian selaku teknisi laboratorium
Mikrobologi yang telah banyak membantu. Ucapan terima kasih secara khusus
penulis juga sampaikan pada Siti Meliah, SSi MSi yang telah memberikan saran
dan bantuan pada penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2013
Yani Mulyani

3

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

DAFTAR TABEL

4

DAFTAR GAMBAR

4

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan

2

BAHAN DAN METODE

2

Waktu dan Tempat

2

Galur Bakteri, Kondisi Pertumbuhan, Media dan Antibiotik

2

Mutagenesis Xoo dengan Transposon

3

Uji Hipersensitivitas

4

Uji Patogenisitas

4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4

SIMPULAN

10

DAFTAR PUSTAKA

10

RIWAYAT HIDUP

12

4

DAFTAR TABEL
1 Galur bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian
2 Karakteristik mutan Xoo hasil mutagenesis dengan transposon
3 Frekuensi konjugasi pada mutagenesis dengan transposon pada
berbagai perbandingan konsentrasi sel donor dan resipien
4 Hasil reaksi hipersensitivitas yang dilakukan pada daun tembakau
dari mutan hasil mutagenesis dengan transposon
5 Perbandingan panjang gejala HDB tipe liar terhadap mutan

2
5
6

7
8

DAFTAR GAMBAR
1 Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1 (7.055 kb)
2 Koloni mutan hasil mutagenesis transposon pada media LA + Rif
(50µg/ml) + Km (50 µg/ml ) setelah diinkubasi 24-120 jam pada suhu
ruang
3 Respon pada daun tembakau yang dinokulasikan dengan isolat E.coli
DH5α (A), akuades steril (B), STG 21(C), mutan hasil transposon
hipersensitif positif (D) dan mutan hipersensitif negatif (E) . Bagian
yang disuntik ditunjukan dengan anak panah
4 Koloni isolat M93 dan M99 pada media LA+Kan Rif (50 µg mL-1)
setelah diinkubasi 48 jam pada suhu ruang
5 Penampilan daun padi yang diinfeksi mutan M93, M99 dan M107,
M112, M120, akuades steril (K-) dan STG 21 (K+)

3

5

7
8
9

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) merupakan bakteri Gram negatif
dengan ciri-ciri morfologi sel berbentuk batang, serta memiliki panjang sekitar
0.7-2.0 µm dan lebar 0.4-0.7 µm. Selnya motil dengan flagela kutub tunggal.
Koloni pada media padat yang mengandung glukosa berbentuk bulat, cembung,
berlendir, dan berwarna kuning disebabkan pigmen xanthomonadin (Muneer
2007).
Infeksi Xoo pada tanaman padi menimbulkan penyakit hawar daun bakteri
(HDB). Menurut Gnamanickam et al. (1999), hawar daun bakteri merupakan
penyakit yang menginfeksi secara sistemik dengan gejala berupa bercak berwarna
abu-abu putih di sepanjang tulang daun. Gejala ini tampak jelas pada stadia
pembentukan anakan, dan kejadian penyakit meningkat seiring dengan
pertumbuhan tanaman yang memuncak pada stadia pembungaan. HDB
merupakan salah satu penyakit padi yang penting di Indonesia. Serangan HDB di
Indonesia pada periode bulan Oktober 2011 – Maret 2012 mencapai 98%
(DITJEN TP 2012).
Saat ini, kebutuhan akan pengendalian organisme pengganggu tanaman
(OPT) yang ramah lingkungan dan efisien menjadi suatu tantangan. Pengendalian
penyakit HDB yang umum dilakukan adalah dengan menggunakan varietas padi
tahan penyakit (Herlina dan Silitonga 2011). Namun, penggunaan varietas ini
kurang efektif karena Xanthomonas oryzae pv. oryzae mudah membentuk patotipe
baru. Sebagaimana yang dilaporkan Hoang et al. (2008) bahwa masing-masing
varietas padi hanya tahan terhadap gen tertentu, contohnya varietas IRBB 51
hanya tahan terhadap gen Xa-4 + xa-13, varietas IRBB54 tahan terhadap gen xa-5
+ Xa-21, dan varietas IRBB 63 tahan terhadap gen xa-5 +Xa-7 + xa-13.
Pengendalian secara kimia yang tidak proporsional dikhawatirkan akan merusak
lingkungan dan memerlukan biaya cukup mahal (BB PADI 2012). Oleh karena
itu, pengendalian biologis dengan agens biokontrol menjadi solusi alternatif yang
menjanjikan untuk mengendalikan HDB.
Beberapa spesies bakteri yang umum hidup pada tanaman berpotensi
sebagai agens biokontrol. Namun, bakteri antagonis ini dikhawatirkan akan
kehilangan kemampuan sebagai agens biokontrol jika lingkungan berubah.
Menurut Rukayadi et al. (2000) bakteri isogenik nonpatogen dapat digunakan
sebagai agens biokontrol. Galur bakteri ini dapat dihasilkan melalui mutagenesis
dengan transposon. Transposon merupakan elemen genetik yang dapat berpindah
dari satu lokasi ke lokasi lain dalam genom. Transposon akan menyisip pada
genom secara random.
Mutan Xoo dapat dikonstruksi dengan transposon mini-Tn5Km1 yang
dibawa E.coli S-17-1(λ pir). Mutan Xoo tersebut dilaporkan tidak menginduksi
reaksi hipersensitivitas dan dapat mengurangi gejala HDB sebesar 80% (Meliah
2010). Oleh karena itu, mutan isogenik yang nonpatogen berpotensi sebagai
agens biokontrol. Mutan yang isogenik diperkirakan dapat mereduksi populasi
tipe liar Xanthomonas oryzae pv. oryzae dalam relung yang sama dengan cara

2
berkompetisi. Berdasarkan pada penelitian Lindow (1987) bahwa dua strain
bakteri berbeda yang terdapat pada permukaan daun yang sama mempunyai
kebutuhan nutrisi dan habitat yang sama.
Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan
oryzae pv.oryzae melalui mutagenesis dengan transposon.

mutan Xanthomonas

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Februari-Juli 2013 di Laboratorium
Mikrobiologi dan rumah kaca mikrobiologi Departemen Biologi IPB.
Galur Bakteri, Kondisi Pertumbuhan, Media dan Antibiotik
Plasmid dan bakteri yang digunakan dalam penelitian ini dicantumkan
pada Tabel 1. Xanthomonas oryzae pv. oryzae ditumbuhkan pada media
Xanthomonas Agar (XA: CaCO3 30 g/L, glukosa 10 g/L, yeast extract 5 g/L, dan
agar 15 g/L ) pada suhu ruang, Escherichia coli S-17 (λ pir) dan DH5α ditumbuhkan
pada media Luria Agar (LA: tryptone 10 g/L, NaCl 10 g/L, yeast extract 5 g/L, dan
agar 15 g/L), dan Luria Bertani Broth (LB) pada suhu 37˚ C. Antibiotik yang
digunakan terdiri dari Rifampisin (Rif), Ampisilin (Amp) dan Kanamisin (Km)
(Sigma) dengan konsentrasi yang digunakan sebesar 50 µg/mL. Tanaman
tembakau dan benih padi IR64 berturut-turut digunakan untuk uji hipersensitivitas
dan patogenitas. Alat yang digunakan adalah syringe, cawan, Laminar Air Flow
Cabinet (LAFC) dan alat laboratorium umumnya.
Tabel 1 Galur bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian
Galur bakteri atau plasmid
Galur Xanthomonas oryzae pv. oryzae
STG 21
MSTG 21
M93
M99
M107
M112
M120
Galur Escherichia coli
S-17 (λ pir)
DH5α
Plasmid
pUTmini-Tn5Km1

Karakteristik

Sumber atau referensi

Hrp+
Rifr, Hrp+
Rifr, Kmr, HrRifr, Kmr, HrRifr, Kmr, HrRifr, Kmr, HrRifr, Kmr, Hr-

Meliah (2010)
Meliah (2010)
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini

Ampr, Kmr
Hrp-

Herrero et al. 1990
Koleksi Lab
Mikrobiologi IPB
Herrero et al. 1990

mini-Tn5Km1:
Ampr, Kanr

Keterangan: rresisten –reaksi hipersensitif negatif +reaksi hipersensitif positif

3
Mutagenesis Xoo dengan Transposon
Mutagenesis transposon dilakukan dengan teknik konjugasi diparental
mating antara E.coli S17-1 (λ pir) pembawa plasmid pUTmini-Tn5Km1 (donor)
dengan Xanthomonas oryzae pv. oryzae (resipien). Resipien ditumbuhkan pada 50
mL media Xanthomonas Agar (XA) cair + Rif 50 µg mL-1. Kultur diinkubasi pada
mesin bergoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang sampai mencapai
populasi sel 108 sel mL-1 (± 20 jam). Donor ditumbuhkan pada 50 mL media LB +
Kanamisin (Km) 50 µg mL-1 dalam erlenmeyer 250 mL lalu diinkubasi pada
mesin bergoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 37°C sampai diperoleh
populasi sel yang sama dengan resipien (± 20 jam). Konjugasi dilakukan dengan
perbandingan jumlah sel donor : resipien, yaitu 1:1, 10:1, dan 1:10. Jumlah sel
yang digunakan pada penelitian ini adalah 108:108, 107:108, dan 108:107 untuk
masing-masing perbandingan donor dengan resipien secara berurut. Sebelum
dilakukan konjugasi kultur sel dihitung dengan menggunakan hemasitometer.
Selanjutnya, untuk mendapatkan sel 107 sel mL-1 dilakukan pengenceran dari
kultur sel berjumlah 108 sel mL-1 dengan menggunakan NaCl 0.85 % dan
dipatikan kembali jumlah selnya dengan dihitung menggunakan hemasitometer.
Kultur sel donor sebanyak 1 mL disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama
5 menit sedangkan resipien sebanyak 1 mL disentrifugasikan pada kecepatan
10.000 rpm selama 10 menit. Pelet sel yang terbentuk dicuci sebanyak 2-3 kali
lalu diresuspensi dalam larutan NaCl 0.85 %. Pelet sel resipien kemudian
diresuspensikan dalam 40 µL LB. Selanjutnya suspensi sel resipien dipindahkan
ke dalam tabung mikro berisi pelet sel donor, kemudian dicampurkan
menggunakan pipet mikro secara perlahan. Suspensi campuran dipindahkan ke
membran filter milipore steril yang berada di atas media LA. Sebagai kontrol
negatif, ke atas membran filter juga diteteskan suspensi sel donor dan resipien
secara terpisah. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang, masingmasing membran filter diangkat lalu dimasukkan ke dalam 1 mL larutan NaCl
0.85% steril pada tabung mikro, kemudian divorteks untuk melepaskan sel yang
terdapat pada membran filter. Selanjutnya sebanyak 100 µL masing-masing
suspensi disebar pada media selektif LA + Km 50 µg mL-1 + Rif 50 µg mL-1 lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Berikut ini peta plasmid pUTminiTn5Km1 yang disisipkan pada genom Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Gambar
1).

Gambar 1 Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1 (7.055 kb)

4

Uji Hipersensitivitas
Uji hipersensitivitas mutan Xoo pada tanaman tembakau dilakukan
berdasarkan metode yang dipaparkan Zou et al.(2006). Suspensi sel mutan (±108
sel/mL) dalam LB + Km 50 µg mL-1 + Rif 50 µg mL-1 disuntikkan ke daun
tanaman tembakau menggunakan syringe 1 mL (tanpa jarum). Tipe liar (Wild type
[Wt]) Xanthomonas oryzae pv. oryzae digunakan sebagai kontrol positif dan
akuades steril serta E.coli DH5α digunakan sebagai kontol negatif. Pengamatan
munculnya respon hipersensitif dilakukan setiap hari selama 14 hari.
Uji Patogenisitas
Benih padi IR64 disterilkan menggunakan Natrium-hipokrit 2% selama 1020 menit, dibilas dengan alkohol 70%, kemudian dibilas dengan air steril dan
direndam dengan air steril selama 24 jam. Benih padi ditumbuhkan pada tanah
yang sudah disteril hingga berusia dua minggu.Selanjutnya, daun padi digunting
untuk dilukai dan dicelupkan ke dalam suspensi bakteri (±108 sel mL-1) selama
±10 detik. Setelah itu, tanaman disungkup dengan plastik bening. Pengamatan
gejala penyakit dilakukan pada hari ke-3 dan ke-14 hari setelah inokulasi.
Konfirmasi penyebab gejala HDB dilakukan dengan cara reisolasi Xoo STG 21
dan mutan dari daun yang bergejala. Hasil uji patogenisitas yang positif dianggap
sah bila hasil reisolasi menunjukkan adanya koloni Xoo.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Mutagenesis dengan transposon merupakan salah satu cara untuk
mengontruksi mutan yang diharapkan bersifat nonpatogen sebagai upaya
pengendalian HDB. Mutan tersebut ditujukan untuk menjadi kompetitor nutrisi
pada relung yang sama dengan tipe liarnya sehingga dapat menjadi agens
biokontrol yang baik.
Seleksi mutan hasil konjugasi dilakukan pada media LA + Rif (50 µg/ml) +
Km (50 µg/ml ). Sifat seleksi media tersebut disebabkan oleh antibiotik rifamfisin
dan kanamisin yang terkandung di dalamnya. Xoo STG 21 merupakan produk
mutasi spontan pada media yang mengandung rifamfisin sehingga resisten
terhadap antibiotik ini (Meliah 2010). Mutagenesis dengan transposon yang
dilakukan dalam penelitian ini menghasilkan Xoo yang resisten terhadap
rifamfisin dan kanamisin, yang menunjukkan bahwa gen resisten kanamisin yang
terdapat pada plasmid pUTmini-Tn5Km1 yang dibawa oleh E.coli S17-1(λ pir)
berhasil diinsersikan ke dalam genom Xoo melalui proses konjugasi. Berikut
merupakan koloni mutan yang tumbuh pada media selektif dengan perbandingan
donor : resipien 1:1, 1:10, dan 10:1 (Gambar 2).

5

0, 33 mm

M 1:1

0, 5 mm

M 1:10

0, 33 mm

M 10:1

Gambar 2 Koloni mutan hasil mutagenesis transposon pada media LA + Rif (50µg/ml) +
Km (50 µg/ml ) setelah diinkubasi 24-120 jam pada suhu ruang

Pertumbuhan koloni mutan pada media selektif mulai teramati setelah
diinkubasi selama 24 sampai 120 jam. Salah satu sifat mutan yang dihasilkan
melalui mutagenesis dengan transposon adalah pertumbuhannya lambat (slow
growth) jika dibandingkan tipe liarnya. Seperti pada mutan Xanthomonas
campestris pv. campestris yang dihasilkan melalui mutagenesis transposon
menunjukkan fenotipe yang bervariasi, diantaranya variasi fenotipe tersebut
adalah pertumbuhan yang lambat dan bersifat non mukoid (Shaw et al. 1988).
Selain itu, berdasar pada penelitian Ray et al. (2000) karakter lain pada mutan
(BXO803) adalah aktivitas xylanase-nya rendah pada fraksi ekstraselular
sedangkan pada periplasmik dan fraksi sitoplasmik aktivitasnya tinggi. Secara
fenotipe koloni mutan Xoo yang dihasilkan pada penelitian ini sama dengan tipe
liarnya kecuali M99 yang koloninya berwarna putih. Mutan M99 diduga
mengalami mutasi pada gen penyandi xanthomonadin sehingga tidak berwarna
kuning seperti tipe liarnya (Tabel 2).
Tabel 2 Karakteristik mutan Xoo hasil mutagenesis dengan transposon
Isolat mutan
STG 21 (Wt)
M93
M99
M107
M112
M120
Keterangan:

Warna koloni
kuning
kuning
putih
kuning
kuning
kuning

Kecepatan
pertumbuhan
++
+
++
+
++
+

Reaksi
hipersensitivitas
+
-

pertumbuhan ++ : koloni bakteri teramati setelah inkubasi 24 jam
pertumbuhan + : koloni bakteri teramati setelah inkubasi >24 jam

Konjugasi untuk konstruksi mutan umumnya dilakukan dengan
perbandingan 1:1 antara donor dan resipien. Sedangkan pada penelitian ini
konjugasi dilakukan dengan tiga perbandingan untuk mengetahui perbandingan
yang optimum. Konjugasi dengan perbandingan donor dan resipien 1:1
menghasilkan jumlah koloni mutan rata-rata 442 dengan nilai frekuensi konjugasi
rata-rata sebesar 2. 6× 10-6. Perbandingan 1:10 menghasilkan jumlah koloni mutan
rata-rata 134 dengan nilai frekuensi konjugasi sebesar 1.1×10-6. Perbandingan
10:1 menghasilkan jumlah koloni mutan rata-rata 175 dengan nilai frekuensi ratarata 2. 4×10-6 (Tabel 3). Hal ini menunjukkan bahwa konjugasi yang dilakukan
pada perbandingan antara sel donor dan resipien yang sama menghasilkan jumlah

6
koloni lebih banyak dan frekuensi konjugasi yang lebih tinggi dibandingkan
dengan perbandingan lainnya. Sel bakteri donor dan resipien masing-masing
berjumlah kurang lebih 108 sel mL-1.
Seleksi mutan melalui uji hipersensitif pada daun tembakau dilakukan
terhadap 300 mutan yang ditentukan secara acak. Kontrol positif yang digunakan
adalah Xoo STG 21 yang merupakan tipe liar, sedangkan kontrol negatifnya
adalah akuades steril dan E.coli DH5α. Gejala yang ditimbulkan oleh kontrol
positif muncul dalam waktu 24 jam setelah inokulasi. Reaksi hipersensitif
merupakan kematian sel yang cepat dan terlokalisir. Reaksi ini muncul akibat
tanaman terinfeksi dan sel mati untuk menghambat pertumbuhan patogen. Induksi
reaksi hipersensitif dan patogenisitas dipengaruhi oleh gen hrp yang umum
ditemukan pada bakteri fitopatogen Gram negatif .
Hasil reaksi hipersensitivitas yang dilakukan pada daun tembakau
menghasilkan lima mutan yang kehilangan kemampuannya untuk menimbulkan
reaksi hipersensitivitas (Tabel 4). Sebanyak 295 mutan tetap menimbulkan respon
hipersensitif yang ditandai dengan adanya bercak berwarna kuning kecoklatan
(Gambar 3). Hilangnya kemampuan untuk menimbulkan reaksi hipersensitif juga
pernah dilaporkan pada Xanthomonas axonopodis pv. glycines M715 (mutan
isogenik dari Xag YR32) oleh Rukayadi et al. (2000). Selain itu, mutan Xag
tersebut juga tidak menyebabkan klorosis pada kotiledon kedelai dan tidak
menimbulkan gejala pustul pada tanaman kedelai. Pengamatan secara visual
terhadap pertumbuhan koloni kelima mutan tersebut pada media agar cawan
menunjukkan pertumbuhan yang sama dengan tipe liarnyanya (Gambar 4). Oleh
karena itu, hilangnya kemampuan untuk menimbulkan reaksi hipersensitivitas
(RH) pada daun tembakau oleh kelima mutan tersebut bukan disebabkan oleh
terhambatnya pertumbuhan mutan.
Tabel 3 Frekuensi konjugasi pada mutagenesis dengan transposon pada berbagai
perbandingan konsentrasi sel donor dan resipien
Perbandingan
konsentrasi
(donor:resipien)
1:1

1:10

10:1

Ulangan
I
II
II
Rata-rata
I
II
III
Rata-rata
I
II
III
Rata-rata

Frekuensi
konjugasi
5. 3×10-6
2. 2×10-6
3. 8× 10-7
2. 7× 10-6
2. 4×10-6
0. 9×10-6
3. 1×10-8
1. 9×10-6
6. 7×10-7
2. 1×10-6
4. 4×10-6
2. 4×10-6

Jumlah koloni
930
261
137
442
244
147
11
134
7
359
160
175

7

A

B

C

D

E
Gambar 3 Respon pada daun tembakau yang dinokulasikan dengan isolat E.coli
DH5α (A), akuades steril (B), STG 21(C), mutan hasil transposon
hipersensitif positif (D) dan mutan hipersensitif negatif (E) .
Bagianyang disuntik ditunjukan dengan anak panah

Tabel 4 Hasil reaksi hipersensitivitas yang dilakukan pada daun tembakau dari
mutan hasil mutagenesis dengan transposon
Hasil uji

Isolat
Ulangan 1
+

Ulangan 2
+

E.coli DH5α **)

-

-

-

M93

-

-

-

M899

-

-

-

M107

-

-

-

M112

-

-

-

M120

-

-

-

STG 21*)

Keterangan:

*)

Kontrol positif
Kontrol negatif

**)

Ulangan 3
+

+ menimbulkan RH
- tidak menimbulkan RH

Ketiadaan reaksi hipersentif pada daun tembakau setelah diinfeksi mutan
M93, M99, M107, M112, dan M120 diduga akibat mutasi yang terjadi
menyebabkannya tidak dikenali sebagai fitopatogen oleh tanaman tembakau.
Gen-gen hrp adalah gen-gen yang berperan penting dalam interaksi antara bakteri
fitopatogen dengan tumbuhan inang. Gen-gen ini terlibat dalam mekanisme
timbulnya reaksi hipersensitivitas dan patogenisitas sehingga mutasi pada gen

8
tersebut dapat menyebabkan hilangnya kedua kemampuan itu (Chan dan Goodwin
1999).

0, 45 mm

1 mm

Gambar 4 Koloni isolat M93 dan M99 pada media LA+Kan Rif (50 µg mL-1) setelah
diinkubasi 48 jam pada suhu ruang

Infeksi Xoo menyebabkan terbentuknya lesio warna kuning kecoklatan
(gejala HDB) pada daun padi yang diinokulasi. Lesio tersebut memanjang pada
tepian daun atau seluruh helai daun. Panjang lesio bertambah seiring dengan
bertambahnya waktu. Uji patogenisitas pada daun padi menunjukkan bahwa
mutan M93, M99 dan M107, M112 dan M120 masih dapat menimbulkan gejala
HDB walaupun gejalanya jauh lebih ringan dibandingkan dengan gejala yang
ditimbulkan oleh Xoo STG21 (Tabel 5). Panjang lesio yang ditimbulkan mutan
berkurang hingga 96% dibandingkan dengan lesio yang ditimbulkan oleh tipe
liarnya (Gambar 5), yang menunjukkan bahwa mutan-mutan tersebut belum
sepenuhnya kehilangan sifat virulensinya. Sejalan dengan penelitian Hu et al.
(2007) dari uji virulensi pada IR24 didapatkan panjang rata-rata lesio 2.5-4.0 cm
(Wt=23.1 cm), artinya presentase reduksinya sekitar 79.4%. Penelitian Sun et al.
(2005), tipe liar Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99 menyebabkan panjang
lesio sampai 20 cm setelah 10-12 hari inokulasi pada padi IR24, sedangkan lebih
dari 200 mutan dapat mereduksi virulensi pada padi IR24 dengan panjang lesio
kurang dari 2 cm. Persentasi reduksi pada penelitian tersebut sekitar 82%.
Defisiensi virulensi pada mutan menunjukkan telah terinsersinya transposon pada
tempat yang berbeda pada ORF yang sama.
Tabel 5 Perbandingan panjang gejala HDB tipe liar terhadap mutan
Isolat
STG 21(Wt)
M93
M99
M107
M112
M120

Panjang gejala
(cm)
8. 97
4. 5
3. 1
3. 07
0. 4
0.33

Persentase reduksi (%)
96
94
94
91
91

9

3.0 cm

[

2.5 cm

[

] 1.5 cm

]3.0 cm

M112

] 0. 33 cm

11 cm

M120

K-

K+

Gambar 5 Penampilan daun padi yang diinfeksi mutan M93, M99 dan M107,
M112, M120, akuades steril (K-) dan STG 21 (K+)

Beberapa faktor yang mempengaruhi virulensi pada Xanthomonas spp.
adalah eksopolisakarida (EPS), lipopolisakarida (LPS), dan setidaknya enam
sistem sekresi protein (I-VI). EPS menghambat aliran air dalam pembuluh xilem
pada tanaman inang (Chan dan Goodwin 1999). LPS berperan dalam interaksi
dengan tanaman inang. Sedangkan pada Xoo faktor virulensi yang berhasil
diidentifikasi adalah sistem Xps-T2S (lipase/esterase, selobiosidase, selulase,
endoglukanase EglXoB) (Hu et al. 2007; Jha et al. 2007 ; Rajeshwari et al. 2005;
Ray et al. 2000; Sun et al. 2005; Wang et al. 2007) T3S system (efektor AvrXa7,
AvrXa10, PthXo6, PthXo7) (Sugio et al. 2007; Yang et al. 2004; Yang et al.
2000) sistem T5S (adhesin XadA, XadB, YapH).
Kluster gen hrp pada Xoo telah diidentifikasi termasuk 26 gen inklusif dari
hpa2 dan hrpF yang berperan besar pada sifat virulensi dan patogenisitas (Lee et
al. 2005). Mutasi pada gen hrpF dapat mengurangi virulensi, sedangkan mutasi
pada hpa3, hpa4, dan hpaF tidak mempengaruhi virulensi (Sugio et al. 2005).
Oleh karena itu, mutan Xoo yang diperoleh dari penelitian ini tidak sepenuhnya
kehilangan patogenisitasnya diduga karena penyisipan transposon melalui proses
konjugasi ini tidak menyebabkan gen hrpF bermutasi.

10

SIMPULAN
Mutagenesis transposon pada Xanthomonas oryzae pv oryzae STG 21
dengan perbandingan donor dan resipien 1:1, 1:10, dan 10:1, frekuensi
konjugasinya secara berturut-turut, yaitu 2. 7× 10-6 ; 1. 1×10-6 ; dan 2. 4×10-6.
Konjugasi donor dan resipien dengan perbandingan 1:1 lebih banyak koloni yang
dihasilkan dan frekuensi konjugasi yang lebih tinggi dibandingkan perbandingan
lainnya. Dari 300 isolat yang diujikan pada daun tembakau didapatkan lima mutan
Xoo yang tidak menginduksi reaksi hipersensitif, yaitu M93, M99, M107, M112,
dan M120. Mutan-mutan tersebut dapat mereduksi patogenisitas hingga 96%
dibandingkan dengan tipe liar Xoo (STG 21).

DAFTAR PUSTAKA
[BB PADI] Balai Besar Penelitian Tanaman Padi (ID). 2012. Penyakit Hawar
Daun Bakteri. http://bbpadi.litbang.deptan.go.id/index.php/in/penyakit-padikarena-bakteri/204–penyakit-hawar-daun-bakteri-blb-(5 Desember 2012).
[DITJEN TP] Direktorat Jendral Tanman Pangan (ID). 2012. Evaluasi Prakiraan
Serangan OPT Utama Tanaman Padi, Jagung, Kedelai MT. 2011/2012
Terhadap Angka Kejadian Selama Bulan Oktober 2011 – Maret 2012.
http://tanamanpangan.deptan.go.id/index.php/ (5 Desember 2012)
Chan JWYF, Goodwin PH. 1999. The molecular genetics of virulence of
Xanthomonas campestris. Biotechnol Adv. 17(1):489-508.
Gnamanickam SS, V. Brindha Priyadarisini, N.N.Narayanan, Preeti Vasudevan,
dan S. Kavitha. 1999. An overview of bacterial blight disease of rice and
strategies for its management. Curr Sci. 77(1):1435-1443.
Herlina L, Silitonga TS. 2011. Seleksi lapang ketahanan beberapa varietas padi
terhadap infeksi hawar daun bakteri strain IV dan VIII. Bul Plas Nut. 17(2)
:80-87.
Hoang DD, Nghi KO, Nguyen DT, Pham VD, Le CL. 2008. Pathotype profile of
Xanthomonas oryzae pv. oryzae isolates from the rice ecosystem in Cuulong
River Delta. Omonrice. 16(1):34-40.
Herrero M, de Lorenzo V, Timmis KN. 1990. Transposon vectos containing nonantibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal
insertion of foreign genes in Gram negative bacteria. J Bacteriol.172(11)
6557-6567.
Hu J, Qian W, He C. 2007. The Xanthomonas oryzae pv. oryzae eglXoB
endoglucanase gene is required for virulence to rice. FEMS Microbiol Lett
269(1): 273–279.
Jha G, Rajeshwari R, Sonti RV.2007. Functional interplay between two
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae secretion systems in modulating virulence
on rice. Mol Plant Microbe Interac 20(1):31–40.
Lee BM et al. 2005.The genome sequence of Xanthomonas oryzae pathovar
oryzae KACC10331, the bacterial blight pathogen of rice. Nucleic Acids
Res. 33(2): 577-586.

11
Lindow SE. 1987. Competitive exclusion of epiphytic fitness. Appl Environ
Microbiol. 53(1):2520-2627.
Meliah S. 2010. Telaah awal dan mutagenesis transposon Xanthomonas oryzae
pv.oryzae penyebab hawar daun bakteri pada padi [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Muneer N, Rafi A, Akhtar MA. 2007. Isolation and characterization Xanthomonas
oryzae pv. oryzae from North West Frontier Province (NWFP) Pakistan.
Sarhad J Agric. 23(3): 743-751.
Rajeshwari R, Jha G, Sonti RV. 2005. Role of an in plantaexpressed xylanase of
Xanthomonas oryzae pv. oryzae inpromoting virulence on rice. Mol Plant
Microbe Interac. 18(8):830–837.
Ray SK, Rajeshwari R, Sonti RV. 2000. Mutants of Xanthomonas oryzae pv.
Oryzae deficient in general secretory pathway are virulence deficient and
unable to secrete xylanase. Mol Plant Microbe Interac. 13(4): 394–401.
Rukayadi Y, Suwanto A, Tjahjono, Harling R. 2000. Survival and epiphytic
fitness of a nonpathogenic mutant of Xathomonas campestris pv. glycines.
Appl Environ Microbiol. 66(3): 1183-1189.
Shaw JJ, Settles LG, Kado CI. 1988. Transposon Tn4431 mutagenesis of
Xanthomonas campestris pv. campestris: characterization of a
nonpathogenic mutant and cloning of a locus for pathogenicity. Mol Plant
Microb Interac. 1(1): 39-45.
Sugio A, Yang B, White FF. 2005. Characterization of the hrpF pathogenicity
Peninsula of Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Mol Plant Microb
Interac.18(6): 546-554
Sun QH, Hu J, Huang GX, Ge C, Fang RX, He CZ. 2005. Type-II secretion
pathway structural gene xpsE, xylanase- and 11ellulose secretion and
virulence in Xanthomonas oryzae pv.oryzae. Plant Pathol 54(1): 15–21.
Wang L, Makino S, Subedee A, Bogdanove AJ. 2007. Novel candidate virulence
factors in rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola as revealed by
mutational analysis. Appl Environ Microb 73(24): 8023–8027.
Yang B, White FF. 2004. Diverse members of the AvrBs3/PthA family of type III
effectors are major virulence determinants in bacterial blight disease of rice.
Mol Plant Microbe Interac. 17(11): 1192–2000.
Yang B, Zhu W, Johnson LB, White FF. 2000. The virulence factor AvrXa7 of
Xanthomonas oryzae pv. oryzae is a type III secretion pathway-dependent
nuclear-localized doublestranded DNA-binding protein. Proc Natl Acad Sci
97(17): 9807–9812.
Zou L et al. 2006. Elucidation ot the hrp clusters of Xanthomonas oryzae pv.
oryzicola that control the hypersensitive response in nonhost tobacco and
pathogenicity in susceptible host rice. Appl Environ Microbiol. 72(9): 62126224.

12

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 9 November 1990 dari ayah Ajat
Sudrajat dan ibu Juariah. Tahun 2009 lulus dari SMAN 1 Sukaresmi (Kabupaten
Cianjur) dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian
Bogor melalui jalur USMI IPB dan diterima di Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penulis menjadi asisten praktikum
Mikrobiologi Dasar tahun ajaran 2012/2013. Penulis juga aktif mengajar mata
pelajaran Sains di lembaga belajar LP3 Diagnostiq. Penulis juga pernah aktif di
Kerohanian Islam Asrama sebagai Koordinator Wanita, LDK Al-Hurriyyah
sebagai bendahara Divisi Syiar, Serambi Ruhiyah FMIPA (SERUM-G) sebagai
bendahara umum, Forum for Scientific Studies (FORCES) sebagai sekretaris
divisi HRD dan Kepala Sekolah FORCES. Penulis pernah mengikuti magang di
LIPI Cibinong bagian Applied Microbiology pada tahun 2010, studi lapang di
Hutan Pendidikan Gunung Walat, dan praktek lapang di LIPI Kebun Raya
Cibodas pada tahun 2012.
Tahun 2012 penulis berhasil menulis buku berjudul Belajar Merawat
Indonesia: Kepemimpinan Alternatif bersama penerima manfaat Beasiswa Aktivis
Nusantara (BAKTI NUSA) lainnya. Sesuai minatnya bergelut dalam bidang tulis
menulis, pada tahun 2011 berhasil mendapatkan juara 1 Lomba Inovasi Teknologi
Lingkungan di ITS, lolos PKM-AI DIKTI dengan judul artikel “Isolasi dan
identifikasi bakteri di sekitar perakaran tanaman legum di Hutan Pendidikan
Gunung Walat” pada tahun 2012, Juara 1 LKTI Festival Tanaman IPB pada tahun
2011, Juara 3 Essay YASMINA se-Jawa Barat, Juara 3 Essay Neo-Eksmus pada
tahun 2011, delegasi PIMNAS ke-25 di UMY dan Juara 2 Lomba Karya Tulis
Ilmiah Al-Quran pada tahun 2013. Berkat beberapa capaian tersebut Republika
pernah memuat profilnya di rubrik Uswah pada tahun 2011. Prestasi lain yang
diraih penulis antara lain ialah Juara 1 Mahasiswa Berprestasi Departemen
Biologi pada tahun 2013.