10 larutan NaCl fisiologis 0,9 berisi kultur bakteri dilarutkan dalam 9 ml akuades
steril dan dilakukan seri pengenceran bertingkat hingga mencapai pengenceran 10
-8
kemudian dua pengenceran terakhir ditanam pada medium Nutrient Agar dengan metode agar tuang PP lalu diinkubasi pada suhu ruang. Koloni yang tumbuh
kemudian dihitung untuk mendapatkan jumlah total bakteri. Angka absorbansi kultur yang jumlah koloni bakteri mencapai 10
8
dijadikan patokan dalam membuat inokulum selanjutnya.
Tahap II : Karakterisasi Kemampuan Fisiologis PGPR Isolat Azospirillum
spp. asal lahan pasir besi 3.3.4 Uji Kemampuan Pelarutan Fosfat Isolat
Azospirillum spp. asal lahan pasir besi pada medium
Pikovskaya Agar
Sebanyak satu ose kultur padat isolat Azospirillum spp. diinokulasikan secara aseptis dengan metode spot inoculation pada cawan Petri berisi medium Pikovskaya
Agar Lampiran 2.C. Inokulasi dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan pada tiap cawan. Cawan yang telah diinokulasi kultur, diinkubasi pada suhu ruang selama 7
hari. Zona jernih yang muncul di sekitar koloni yang tumbuh diamati. Kemampuan pelarutan fosfat IP diukur berdasarkan rumus Oedjijono et al., 2014 :
3.3.5 Estimasi Fosfat Anorganik Terlarut Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer
lahan pasir besi Modifikasi Ahmad et al., 2008
Sebanyak 4 inokulum dengan kepadatan seragam OD
600
=0,600-0,650 isolat Azospirillum spp. diinokulasikan pada 50 ml medium Pikovskaya Broth dalam
Erlenmeyer 100 ml. Inkubasi pada shaker orbital pada kecepatan 150 rpm selama 7 hari. Untuk perlakuan kontrol diinokulasikan dengan NaCl fisiologis 0,9 steril.
Setelah 7 hari inkubasi, kultur diambil, untuk pengukuran fosfat anorganik terlarut, sebanyak 10 ml kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no.41
untuk memisahkan sisa Ca
3
PO
4 2
yang masih terbawa. Hasil saringan kemudian disentrifus pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit. Sebanyak 1 ml supernatan
dimasukkan dalam labu takar 50 ml kemudian ditambahkan dengan 10 ml reagen Chloromolybdic acid Lampiran 3.B dikocok hingga homogen kemudian
ditambahkan dengan 100 µl reagen Chlorostannous Lampiran 3.C lalu dikocok
bio.unsoed.ac.id
11 hingga homogen kemudian ditambahkan dengan akuades hingga volume mencapai
50 ml. Tunggu selama 10 menit kemudian diukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 600 nm. Absorbansi kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi
linier kurva standar fosfat Lampiran 5 sehingga akan didapatkan jumlah fosfat anorganik terlarut, pH medium diukur pada awal dan akhir masa inkubasi. Untuk
mengetahui populasi total bakteri pelarut fosfat dilakukan TPC pada medium Pikovskaya Agar dan diinkubasi selama 3-7 hari. Hitung jumlah koloni yang
menghasilkan zona jernih di sekitar koloni.
3.3.6 Uji Kemampuan Produksi Hormon Tumbuh IAA Isolat Azospirillum
spp. asal rizosfer lahan pasir besi Modifikasi Patten dan Glick, 2002 Sebanyak 0,5 ml inokulum cair kultur Azospirillum spp. dengan kepadatan sel 10
8
CFU’sml diinokulasikan pada 25 ml medium Nutrient Broth Half-Strength yang telah ditambahkan substrat L-Triptofan dengan konsentrasi 100 mgL dalam labu
Erlenmeyer 50 ml yang telah ditutupi plastik hitam. Kultur diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang. Pengukuran IAA dilakukan
pada jam ke-0, 24, 48, dan 72. Sebanyak 4 ml kultur diambil secara aseptis dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf kemudian dipisahkan filtrat dengan
supernatannya menggunakan microcentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan dengan
1 ml reagen Salkowski Lampiran 3.A kemudian diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit, dilakukan sebanyak dua kali pengulangan. Setelah diinkubasi,
supernatan diukur nilai absorbansinya menggunakan UV-Vis Spektofotometer dengan panjang gelombang 530 nm. Hasil absorbansi dimasukkan ke dalam
persamaan kurva standar IAA Lampiran 4.A
3.3.7. Analisa Kandungan IAA menggunakan HPLC High Performance Liquid
