11 hingga homogen kemudian ditambahkan dengan akuades hingga volume mencapai
50 ml. Tunggu selama 10 menit kemudian diukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 600 nm. Absorbansi kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi
linier kurva standar fosfat Lampiran 5 sehingga akan didapatkan jumlah fosfat anorganik terlarut, pH medium diukur pada awal dan akhir masa inkubasi. Untuk
mengetahui populasi total bakteri pelarut fosfat dilakukan TPC pada medium Pikovskaya Agar dan diinkubasi selama 3-7 hari. Hitung jumlah koloni yang
menghasilkan zona jernih di sekitar koloni.
3.3.6 Uji Kemampuan Produksi Hormon Tumbuh IAA Isolat Azospirillum
spp. asal rizosfer lahan pasir besi Modifikasi Patten dan Glick, 2002 Sebanyak 0,5 ml inokulum cair kultur Azospirillum spp. dengan kepadatan sel 10
8
CFU’sml diinokulasikan pada 25 ml medium Nutrient Broth Half-Strength yang telah ditambahkan substrat L-Triptofan dengan konsentrasi 100 mgL dalam labu
Erlenmeyer 50 ml yang telah ditutupi plastik hitam. Kultur diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang. Pengukuran IAA dilakukan
pada jam ke-0, 24, 48, dan 72. Sebanyak 4 ml kultur diambil secara aseptis dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf kemudian dipisahkan filtrat dengan
supernatannya menggunakan microcentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan dengan
1 ml reagen Salkowski Lampiran 3.A kemudian diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit, dilakukan sebanyak dua kali pengulangan. Setelah diinkubasi,
supernatan diukur nilai absorbansinya menggunakan UV-Vis Spektofotometer dengan panjang gelombang 530 nm. Hasil absorbansi dimasukkan ke dalam
persamaan kurva standar IAA Lampiran 4.A
3.3.7. Analisa Kandungan IAA menggunakan HPLC High Performance Liquid
Chromatography Sebanyak 3 ml supernatan kultur dari percobaan 3.3.6 diatur derajat keasamannya
hingga menjadi 2,8. Supernatan kemudian diekstrak sebanyak 3 kali menggunakan etil asetat dengan volume yang sama dengan jumlah sampel vv. Pelarut kemudian
diuapkan menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kering. Ekstrak dibilas dengan ethanol absolute hingga didapatkan volume sebanyak 1 ml.
Sampel kemudian disaring menggunakan milipore PTFE 0,2 µm lalu ditempatkan
bio.unsoed.ac.id
12 pda vial HPLC. Sampel diinjeksikan pada HPLC Shimadzu dengan kolom C18
Supelco. Fase gerak menggunakan 70 akuabides : asam asetat; 99:1 dan 30 methanol : asam asetat; 99:1 vv dengan flow rate 1mlmin pada panjang
gelombang 280 nm. Tunggu hingga terbentuk peak chromatogram pada layar. Luas area peak chromatogram dibandingkan dengan persamaan regresi linier kurva
standar IAA sintetik Lampiran 4.B. 3.3.8 Uji Kualitatif Kemampuan Produksi Siderofor Isolat
Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi Schwyn dan Neilands, 1987; Louden et al., 2011
Sebanyak satu ose kultur padat isolat Azospirillum spp. diinokulasikan secara
aseptis dengan cara digoreskan pada cawan Petri berisi medium Chrome Azurol Sulfate Lampiran 2.F. Kultur diinkubasi pada suhu ruang dan diamati tiap hari.
Isolat yang mampu menghasilkan siderofor ditandai dengan terbentuknya warna orange di sekitar koloni yang tumbuh.
3.3.9 Pengukuran Estimasi Siderofor Unit Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer
lahan pasir besi Modifikasi Schwyn dan Neilands, 1987 Sebanyak satu ose kultur diinokulasikan pada 5 ml medium Succinate Iron Free
Lampiran 2.G kemudian diinkubasi pada shaker waterbath incubator selama 48 jam pada kecepatan 125 rpm. Setelah inkubasi inokulasikan sebanyak 1 volume
kultur ke dalam 30 ml medium Succinate Iron Free dan inkubasi pada shaker orbital dengan kecepatan 125 rpm dan diinkubasi selama 48 jam. Sebanyak 2 ml
kultur disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit kemudian 0,5 ml supernatan ditambahkan dengan 0,5 ml Blue Dye CAS Lampiran 2.F divortex
kemudian ukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm. Untuk blanko digunakan medium Sucinnate Iron Free tanpa penambahan isolat. Jumlah siderofor
unit dihitung dengan rumus sebagai berikut :
bio.unsoed.ac.id
13
3.3.10 Uji Kualitatif Kemampuan Produksi ACC Deaminase Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer lahan pasir besi Modifikasi Penrose dan Glick,
2003; Husen at al., 2009 Sebanyak satu ose kultur padat isolat Azospirillum spp. digoreskan pada medium
DF Salt Dworkin-Foster Salt yang telah ditambahkan dengan 3 mM ACC 1- aminocylopropane-1-carboxylic acid sebagai sumber nitrogen. Sebelumnya dibuat
larutan induk ACC sebanyak 0,5 M dengan cara melarutkan 0,1 g ACC ke dalam 1,987 ml akuades steril kemudian disterilisasi dengan menggunakan milipore
berukuran 0,22 µm dan disimpan pada kulkas bersuhu -20
o
C. Medium yang telah diinokulasi oleh isolat diamati tiap hari dan dibandingkan dengan perlakuan kontrol
negatif medium DF Salt tanpa N dan perlakuan kontrol positif medium DF dengan Ammonium Sulfate. Suatu isolat mampu menghasilkan enzim ACC
Deaminase apabila isolat tersebut mampu tumbuh pada medium dengan ACC dan
Ammonium Sulfate namun tidak mampu tumbuh pada medium DF tanpa N.
3.3.11 Uji Kemampuan Antagonisme Isolat Azospirillum spp. asal rizosfer
