Hidrolisis Eucheuma Cottonii Dengan Enzim K Karagenase Dalam Menghasilkan Gula Reduksi Untuk Produksi Bioetanol

HIDROLISIS Eucheuma cottonii DENGAN ENZIM kKARAGENASE DALAM MENGHASILKAN GULA REDUKSI
UNTUK PRODUKSI BIOETANOL

MUSTIKA ZELVI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Hidrolisis Eucheuma
cottonii dengan Enzim k-Karagenase dalam Menghasilkan Gula Reduksi untuk
Produksi Bioetanol adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
Mustika Zelvi
NIM F351130431

2

3

RINGKASAN
MUSTIKA ZELVI. Hidrolisis Eucheuma cottonii dengan Enzim k-Karagenase dalam
Menghasilkan Gula Reduksi untuk Produksi Bioetanol. Dibimbing oleh ANI SURYANI
dan DWI SETYANINGSIH.
Bioetanol merupakan salah satu sumber bahan bakar terbarukan yang diperoleh
dari proses fermentasi gula dari bahan berkarbohidrat dengan bantuan mikroorganisme.
Bioetanol dapat dibuat dari bahan baku tanaman yang kaya akan pati, serat dan gula. Salah
satu bahan yang potensial sebagai bahan baku bioetanol adalah rumput laut. Proses
pembuatan etanol dengan bahan berselulosa memerlukan beberapa tahapan sebelum
menghasilkan etanol, salah satu tahapannya adalah hidrolisis. Hidrolisis adalah tahapan
untuk mendapatkan gula sederhana sehingga dapat mempermudah kerja dalam proses

fermentasi. Proses hidrolisis yang dilakukan pada penelitian ini adalah hidolisis secara
enzimatis.
Enzim merupakan katalisator sejati yang meningkatkan kecepatan reaksi kimia
spesifik dengan nyata, tanpa enzim, suatu reaksi kimia akan berlangsung amat lambat.
Enzim yang digunakan pada penelitian adalah Enzim karagenase yang mana diperoleh dari
hasil isolasi mikroba laut pada habitat Eucheuma cottonii dan menghasilkan Isolat dengan
potensi aktivitas karagenase yang tinggi. Isolat tersebut adalah isolat IH22. Isolat IH22
merupakan isolat mikroba laut yang berhasil diisolasi oleh laboratorium SBRC, LPPM IPB,
dan merupakan isolat yang terbaik dalam menghasilkan etanol tertingggi yaitu sebesar
0.89% (v/v).
Penelitian ini memiliki tiga tujuan utama diantaranya untuk menentukan waktu
hidrolisis dalam menghasilkan gula reduksi tertinggi oleh enzim karagenase, menentukan
konsentrasi asam H2SO4 3% pada perlakuan awal substrat E.cottonii, dan menganalisa
konsentrasi substrat dan enzim karagenase terbaik dalam menghasilkan gula reduksi dan
etanol tertinggi.
Tahapan penelitian dimulai dari peremajaan isolat mikroba IH22, produksi enzim
karagenase ekstrak kasar dan kemudian dipekatkan dengan pengendapan aseton 80%,
selanjutnya penentuan waktu hidrolisis dan aktivitas enzim karagenase, serta perlakuan
asam. Tahapan dilanjutkan dengan hidrolisis substrat E.cottonii dengan total padatan 6%,
9% dan 12% (b/v) oleh enzim karagenase pada konsentrasi 0%, 2,5%, dan 5% (v/v) yang

kemudian difermentasi selama 6 hari dengan bantuan khamir S.cereviseae.
Berdasarkan penentuan waktu hidrolisis karagenase diperoleh bahwa Aktivitas
enzim karagenase tertinggi diperoleh pada waktu inkubasi 30 - 60 menit, sedangkan gula
reduksi tertinggi diperoleh setelah inkubasi selama 120 menit. Selanjutnya konsentrasi
asam yang tepat untuk substrat 6, 9 dan 12% berturut-turut adalah 0.15, 0.25 dan 0.4%. Hal
ini dikarenakan semakin besarnya konsentrasi substrat mengakibatkan kontak antara asam
dengan substrat semakin kecil, sehingga dibutuhkan asam yang lebih banyak dalam
menguraikan polisakarida galaktosa pada hidrolisat.
Konsentrasi substrat 12% merupakan subsrat yang menghasilkan kadar gula
reduksi dan total gula tertinggi selama proses hidrolisis setelah perlakuan awal asam dan
enzim, dimana semakin tinggi konsentrasi substrat maka semakin besar kadar gula yang
dihasilkan. Sedangkan selama proses fermentasi substrat 9% dengan perlakuan enzim 5%
yang mengandung gula reduksi 1.49% dan total gula 2.75%, merupakan substrat yang
terbaik dalam menghasilkan etanol yaitu sebesar 1.23% (v/v) dan 0.82% (b/v) dengan
efisiensi penggunaan substrat sebesar 55.78% dan efisiensi fermentasi 70.44%.
Kata Kunci : bioetanol, Eucheuma cottonii, k-karagenase, perlakuan awal asam,
S.cereviseae

4

SUMMARY
MUSTIKA ZELVI. Hidrolysis of Eucheuma cottonii by k-carrageenase in The Produce
Reducing Sugar to Production of Bioethanol. Supervised by Ani Suryani dan Dwi
Setyaningsih.
Bioethanol is a renewable fuel source derived from sugar fermentation process of
carbohydrate substance by microorganism’s aid. Bioethanol can be made from plant raw
materials which are rich in starch, fiber and sugar. One of potential material as raw material
for bioethanol is seaweed. The process of ethanol production from cellulose materials
requires several stages before producig ethanol, one of the stages is hydrolysis. Hydrolysis
is the stage to obtain a simple sugar that can simplify the work in the fermentation process.
The hydrolysis process carried out in this research is hydrolysis enzymatically.
Enzymes are the true catalyst increasing the rate of spesific chemical, without
enzyme, a chemical reaction will take place very slowly. The enzyme used in the study was
k-carrageenase which enzyme obtained from the isolation of marine microbial habitat
Eucheuma cottonii and produce Isolates with high potential k-carrageenase activity. These
isolates was isolate IH22. Isolate IH22 is a marine microbial isolate that were isolated by
the laboratory of SBRC LPPM-IPB, and is the best isolate in ethanol producing with
highest yield amount of 0.89 % (v/v).
This study has three main objectives such as to determine the time of hydrolysis to
produce the highest reducting sugar by k-carrageenase, to determine the concentration of

the sulfuric acid (H2SO4 3%) on E.cottonii substrate pretreatment, and to analyze the best
concentration of substrate and k-carrageenase best that produce the highest reducing sugar
and ethanol.
Steps of the research were started from microbial rejuvenation of isolates IH22,
enzyme production of rough extraction of enzyme and precipitation by acetone 80%,
determination of the hydrolysis time and activity of k-carrageenase and the acid treatment.
The next process is hydrolysis substrate with consentration of 6, 9 and 12% (b/v) with
enzymes concentration of 0, 2.5 and 5% (v/v) then it’s fermented for six days with the help
of S.cereviseae.
Based on the determination of k-carrageenase hydrolysis time, the highest kcarrageenase activity was obtained at the time of incubation of 30-60 minutes, while the
highest reducing sugar was obtained after incubation of 120 minutes. Furthermore, the
exact acid concentration for the substrate of 6, 9 and 12% respectively were 0.15, 0.25 and
0.4%. This is caused that the more concentration of the substrate results the contact between
acid with the substrate is getting smaller, so it takes a lot more acid in outlining the
galactose polysaccharides in the hydrolyzate.
Then the substrate concentration of 12% is subsrate producing reducing sugar and
the highest total sugar during the hydrolysis process after the initial treatment of acid and
enzyme which was higher the concentration of the substrate so was greater sugar levels
resulted. Meanwhile, during the fermentation process of 9% substrate and 5% of enzyme
treatment containing 1.49% reducing sugar and 2.75% total sugar was the best substrate to

produce ethanol with the yield of 1.23% (v / v) and 0.82 % (w / v) with 55.78% substrate
utilization efficiency and 70.44% fermentation efficiency.
Keywords : bioethanol, Eucheuma cottonii, k-carrageenasse, pretreatment acid,
S.cereviseae

5

©Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutupan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

6

7

HIDROLISIS Eucheuma cottonii DENGAN ENZIM kKARAGENASE DALAM MENGHASILKAN GULA REDUKSI
UNTUK PRODUKSI BIOETANOL

MUSTIKA ZELVI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Teknologi Industri Pertanian

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

8

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Liesbetini Haditjaroko, MS

10

11

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan
tesis ini dengan judul Hidrolisis Eucheuma cottonii dengan Enzim k-Karagenase dalam
Menghasilkan Gula Reduksi untuk Produksi Bioetanol. Penyusunan tesis ini merupakan
salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Magister Sains pada Program Studi
Teknologi Industri Pertanian, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengikuti pendidikan di Sekolah Pascasarjana IPB ini tidak lepas
dari dukungan berbagai pihak. Penulis menyampaikan banyak terima kasih dan
penghargaan yang tinggi kepada
1. Prof Dr Ir Ani Suryani DEA dan Dr Dwi Setyaningsih STP MSi selaku komisi
pembimbing atas kesediaan waktu untuk membimbing, memberikan arahan
dan masukan selama penyusunan tesis ini.
2. Prof Dr Ir Machfud MS selaku ketua Program Studi TIP dan moderator yang
telah memberi masukan selama ujian tesis.
3. Ayahanda dan Ibunda tercinta, uda dan adik-adik tersayang beserta seluruh
keluarga atas doa, motivasi, finansial dan semangat yang diberikan selama

penulis menempuh studi.
4. Bapak dan Ibu staf pengajar, staf administrasi Program Studi Teknologi
Industri Pertanian yang telah banyak membantu dan atas kerjasamanya yang
baik selama penulis menempuh studi.
5. Staf di Laboratorium Surfactant and Bioenergy Research Center (SBRC), yang
telah membantu selama kegiatan penelitian.
6. DIKTI atas Beasiswa unggulan BPPDN 2013 yang diberikan,
7. Rekan-rekan di Mahasiswa Magister Teknologi Industri Pertanian angkatan
2013, serta The Agroindustrialist yang telah banyak berbagi dalam suka dan
duka serta segala motivasi, persahabatan, dan diskusi selama penulis
menempuh studi.
Penulis menyadari bahwa penulisan tesis ini masih jauh dari kesempurnaan,
oleh karenanya kritik dan saran sangat penulis harapkan guna menyempurnakan
penulisan tesis ini. Akhir kata penulis mengucapkan banyak terima kasih dan
semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016
Mustika Zelvi

12

13

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

i

DAFTAR LAMPIRAN

i

1. PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

2

Ruang Lingkup

2

Manfaat Penelitian

2

2. TINJAUAN PUSTAKA

3

Karagenan

3

Enzim Karagenase

5

Hidrolisis Enzimatik

7

Saccharomyces cereviseae

8

3. METODOLOGI

9

Bahan dan Alat

9

Waktu dan Tempat Penelitian

9

Tahapan Penelitian

9

Pengolahan Data

11

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

13

Stabilitas Akt. Enzim k-Karagenase pada Berbagai Waktu Inkubasi

13

Perbandingan Akt. EEK dan Enzim Hasil Pengendapan Aseton

13

Kadar Gula Reduksi selama Hidrolisis oleh k-Karagenase

14

Penentuan Konsentrasi Asam pada Perlakuan Awal Hidrolisis

15

Hidrolisis E.cottonii dengan Asam dan Enzim k-Karagenase

16

Fermentasi

20

5. SIMPULAN DAN SARAN

25

Simpulan

25

Saran

25

DAFTAR PUSTAKA

26

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

48

14

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5

Komposisi Kimia Rumput Laut Eucheuma cottonii
4
Oligosakarida yang Dihasilkan oleh k-Karagenase
6
Perbandingan Aktivitas EEK dan Enzim Hasil Pengendapan Aseton 80%
13
Konsentrasi Asam H2SO4 3% Pada Masing-masing Substrat
15
Perbandingan Nilai Efisiensi Fermentasi dan Yp/s pada Hidrolisat E.cottonii 24

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Struktur Molekul Karagenan
Model Gambar kappa-karagenan pada Sisi Aktif k-Karagenase
Diagram Skematik dua Pengulangan Unit Disakarida dari Karagenan
Contoh Degradasi Spesifik pada kappa-karagenan oleh k-Karagenase
Stabilitas Aktivitas Enzim k-Karagenase Pada Berbagai Waktu Inkubasi
Kadar Gula Reduksi selama Hidrolisis oleh Enzim k-Karagenase
Histogram Konsentrasi Gula Reduksi dan Total Gula setelah Perlakuan
Awal Asam
Derajat Polimerisasi setelah Perlakuan Awal Asam
Histogram Konsentrasi Gula Reduksi dan Total Gula setelah Hidrolisis
Enzimatik
Derajat Polimerisasi setelah Hidrolisis Enzimatik
Histogram Konsentrasi Gula Reduksi dan Total Gula setelah Fermentasi
Histogram Konsumsi Gula Reduksi dan Total Gula selama Fermentasi
Histogram Efisiensi Penggunaan Substrat
Histogram Kadar Etanol Pada Hidrolisat

3
5
5
6
13
14
17
17
18
19
20
21
22
23

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8

Tahapan penelitian
Proses Hidrolisis E.cottonii dengan asam dan enzim karagenase
Produksi enzim ekstrak kasar dan pemekatan enzim dengan
pengendapan aseton 80%
Komposisi berbagai media dan larutan yang digunakan pada penelitian
Analisa yang dilakukan pada penelitian
Perhitungan produksi bioetanol, efisiensi fermentasi, efisiensi penggunaan
substrat, kadar gula pereduksi dan total gula
Kurva standar DNS, Phenol dan BSA
Tabel sidik ragam dan hasil uji lanjut Duncan

30
31
32
33
35
38
39
40

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu sumber bahan bakar terbarukan dan ramah lingkungan yang sangat
prospektif saat ini adalah bioetanol. Penggunaan bioetanol sangat dibutuhkan untuk
10 tahun kedepan, yaitu berdasarkan peraturan Kementrian Energi dan Sumber Daya
Mineral No 32 tahun 2008, pada tahun 2008 hingga 2010 etanol harus mensubstitusi
premium sebanyak 3% untuk transportasi, akan meningkat menjadi 10% pada tahun
2010 dan 15% di tahun 2025 mendatang (Sutarto 2009). Bioetanol merupakan
senyawa alkohol (etanol) yang diperoleh dari proses fermentasi gula bahan-bahan
berkarbohidrat menggunakan bantuan mikroorganisme. Etanol atau lebih dikenal
dengan etil alkohol ini memiliki dua atom karbon dengan sifat-sifat tertentu
diantaranya cairan yang tidak stabil, mudah terbakar, mudah menguap dan tidak
berwarna.
Bioetanol dapat dibuat dari bahan baku tanaman yang kaya akan pati, serat dan
gula. Salah satu bahan baku yang berpotensi sebagai bioetanol adalah rumput laut.
Keuntungan dari rumput laut dibandingkan dengan komoditas lainnya adalah
ketersediaan lahan budidaya yang sangat luas, sehingga tidak bersaing dengan lahan
pemukiman, industri ataupun pertanian, waktu panen yang relatif lebih singkat, dapat
menghasilkan bioetanol dan produk samping yang bernilai sebagai pupuk organik,
tingginya kandungan polisakarida sehingga banyak menghasilkan gula (Meinita et
al. 2012).
Jenis rumput laut yang paling banyak digunakan adalah Eucheuma cottonii
karena jenis rumput laut ini banyak tumbuh di perairan Indonesia dengan kepadatan
populasi yang tinggi. Didalam rumput laut terdapat karbohidrat karagenan yang
dapat digunakan sebagai bahan baku etanol (Banati et al. 2007). Kappaphycus sp.
atau lebih dikenal dengan Eucheuma cottonii adalah salah satu rumput laut yang
menghasilkan ekstrak karagenan yang tinggi, dimana menurut Istini et al. (1986),
kandungan karagenan pada rumput laut E.cottonii sebesar 65.75%. Karagenan
merupakan polisakarida rumput laut yang mengandung natrium, magnesium, dan
kalsium yang dapat terikat pada gugus ester sulfat dari galaktosa dan kopolimer 3.6anhidro-galaktosa (Bawa et al. 2007).
Proses pembuatan etanol dengan bahan berselulosa memerlukan beberapa
tahapan sebelum menghasilkan etanol, salah satu tahapnya adalah hidrolisis. Proses
hidrolisis dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan gula sederhana dan
mempermudah kerja dalam proses fermentasi. Proses hidrolisis karagenan yang
terdapat dalam Eucheuma cottonii dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara
kimiawi dan enzimatik. Menurut (Riyanti 2008) efisiensi proses hidrolisis dengan
menggunakan asam masih rendah karena proses yang dilakukan masih panjang dan
penanganan limbah asam yang tidak mudah. Kelemahan lainnya menghasilkan
senyawa toksik yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada proses
fermentasi, terjadinya korosi pada peralatan produksi, penggunaan energi yang
cukup tinggi untuk proses daur ulang asam dan terbentuk produk samping yang tidak
diharapkan (Tahezadeh dan Karimin 2007). Sehingga banyak peneliti yang beralih
menggunakan hidrolisis secara enzimatik dimana selain produk yang dihasilkan
aman, senyawa penghambat pertumbuhan mikroba tidak terbentuk.
Menurut Rahmadini (2012) enzim memiliki aktivitas spesifik terhadap zat
tertentu yang akan dihidrolisis sehingga produk monosakarida yang akan dihasilkan

2

lebih tinggi. Enzim adalah protein dengan struktur tiga dimensi yang kompleks yang
aktif di bawah kondisi khusus dan hanya dengan substrat spesifik (Poedjiadi 2006).
Enzim k-Karagenase merupakan enzim yang memiliki aktivitas tinggi dalam
menghidrolisis k-karagenan. Enzim yang digunakan adalah enzim yang diproduksi
dari hasil isolasi mikroba laut pada habitat Eucheuma cottonii segar dan
menghasilkan isolat dengan potensi aktivitas karagenase tertinggi. Salah satunya
yaitu isolat IH22. Isolat IH22 adalah isolat mikroba laut yang berhasil diisolasi oleh
laboratorium SBRC, LPPM IPB, dan merupakan isolat terbaik dengan nilai aktivitas
tertinggi sebesar 0.061 IU/ml dengan kadar gula reduksi 0.117 mg/ml dan kadar
etanol yang dihasilkan sebesar 0.89% (v/v) dengan waktu inkubasi 10 jam pada suhu
40°C. Enzim yang dihasilkan telah dievaluasi aktivitasnya dengan cara pemekatan
enzim melalui pengendapan aseton 80% (Meliawati 2015).
Khamir yang digunakan untuk fermentasi etanol pada penelitian ini adalah
khamir S.cerevisiae yang telah diadaptasi dalam media galaktosa yaitu IPBCC AL
IX, dimana kebanyakan S.cerevisiae yang digunakan memiliki kemampuan
memetabolisme jenis gula tertentu salah satunya glukosa, sehingga perlu dilakukan
adaptasi khamir pada media yang sesuai.
Penggunaan dan pemanfaatan k-karagenase hasil isolasi dari lingkungan hidup
rumput laut pada hidrolisis enzim k-karagenase merupakan penelitian yang perlu
dikembangkan lagi. Hal inilah yang melatarbelakangi penelitian hidrolisis rumput
laut E.cottonii dengan enzim k-karagenase untuk memproduksi bioetanol oleh
S.cerevisiae dilakukan.

1.
2.
3.

1.
2.
3.

Tujuan penelitian
Tujuan penelitian ini diantaranya :
Menentukan waktu optimum dalam hidrolisis enzim k-karagenase dengan
menghasilkan aktivitas enzim dan gula reduksi yang tertinggi.
Menentukan konsentrasi asam H2SO4 3% pada perlakuan awal substrat
E.cottoniii.
Menganalisis konsentrasi substrat E.cottonii dan enzim k-karagenase yang
terbaik dalam menghasilkan gula reduksi selama proses hidrolisis dengan kadar
etanol yang tertinggi pada proses fermentasi oleh S.cereviseae.
Ruang Lingkup
Ruang lingkup penelitian ini diantaranya :
Produksi enzim k-karagenase ekstrak kasar dan pengendapan aseton 80%.
Penentuan waktu hidrolisis enzim k-karagenase terhadap aktivitas enzim dan
gula reduksi karagenan.
Penentuan konsentrasi substrat dan enzim k-karagenase dari proses hidrolisis
dalam menghasilkan gula reduksi untuk produksi etanol.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat untuk memberikan pengetahuan tentang
perkembangan dan ilmu teknologi terhadap penggunaan enzim k-karagenase dan
prosesnya yang diaplikasikan pada substrat E.cottonii untuk mengetahui kemampuan
enzim dari bakteri isolat IH22 sebagai penghidrolisis dalam memproduksi bioetanol
yang lebih ramah lingkungan.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Karagenan
Karagenan adalah hasil ekstraksi dari rumput laut dari kelas Rhodophyceae
yaitu jenis Condrus, Gigartina dan Eucheuma dengan menggunakan air atau larutan
alkali dengan konsentrasi tertentu pada suhu kamar tanpa pemasakan selama 2-4 jam,
kemudian rumput laut direndam menggunakan alkali NaOH atau KOH. Setelah itu,
rumput laut dikeringkan dengan sinar matahari selama 2-3 hari. Proses produksi
karagenan semirefine ini lebih banyak diaplikasikan pada rumput laut jenis
Eucheuma cottonii dan produk SRC ada yang berbentuk chips ataupun tepung
(flour). Karagenan merupakan polisakarida yang linier atau lurus dan merupakan
molekul galaktan dengan unit-unit utamanya adalah galaktosa. Karagenan memiliki
molekul besar yang terdiri dari lebih 1.000 residu galaktosa (Diharmi 2011).
Di alam ini, terdapat tiga jenis karagenan yang dapat ditemukan secara luas
di berbagai perairan di dunia. Ketiganya dibedakan berdasarkan struktur molekul
yang mengakibatkan perbedaan sifat fisik dan karakteristik penggunaannya dalam
industri pangan. Ketiga jenis karagenan ini adalah kappa, iota dan lambda. Perbedaan
ketiganya terletak pada perbedaan posisi gugus ester-sulfate dan jumlah residu 3,6
anhydro-D-galaktosa. Kedua gugus tersebut dihubungkan oleh ikatan glikosidik α1,3 dan β-1,4 secara bergantian (Campo et al. 2009). Jenis karagenan yang berbeda
ini diperoleh dari spesies Rhodophyta yang berbeda (Van De Velde et al. 2002).
Ciri-ciri karagenan secara umum adalah berbentuk tepung berwarna kuningkekuningan, mudah larut dalam air, akan tetapi tidak larut dalam pelarut organik dan
membentuk larutan kental atau gel. Karagenan memiliki sifat khas yaitu kelarutan,
stabilitas pH, pembentuk gel dan viskositas.
Molekul k-karagenan secara umum dideskripsikan sebagai pengulangan dari
disakarida β-D-galactopyranosil-4-sulfat dan (1,4)-3,6-anhydro-α-D-galaktosa yang
dihasilkan dari rumput laut jenis Eucheuma cottonii (Campo et al. 2009). Iotakaragenan ditandai dengan adanya 4-sulfat ester pada setiap residu D-glukosa dan
gugusan 2-sulfat ester pada setiap gugusan 3,6-anhidro-D-galaktosa. Lambda
karagenan berbeda dengan kappa-dan iota-karagenan, karena memiliki residu
disulfat [1-4]-D-galaktosa, sedangkan kappa- dan iota-karagenan memiliki gugus 4fosfat ester. Perbedaan stuktur karagenan dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

kappa-karagenan

iota-karagenan

lamda-karagenan
Gambar 1 Struktur Molekul Karagenan

4

Eucheuma cottonii merupakan salah satu Carragaenaphyces, yaitu rumput
laut penghasil karagenan yang terbentuk dari polisakarida linear yang biasa.
Karagenan merupakan polisakarida yang diekstraksi dari beberapa spesies rumput
laut atau alga merah (Rhodophyceae). Karagenan juga merupakan galaktan
tersulfatasi linear hidrofilik. Polimer ini merupakan pengulangan unit disakarida.
Galaktan tersulfatasi ini diklasifikasi menurut adanya unit 3.6-anhydro galaktosa
(DA) dan posisi gugus sulfat (Campo et al. 2009).
Saat ini jenis karagenan kappa didominasi diperoleh dari rumput laut tropis
Kappaphycus alvarezii, yang di dunia perdagangan dikenal sebagai Eucheuma
cottonii. Euchema denticulatum adalah spesies utama untuk menghasilkan jenis
karagenan iota. Karagenan lambda diproduksi dari spesies Gigartina dan Condrus
(Van de Velde et al. 2002). Menurut Doty (1987) Eucheuma cottonii sp. Merupakan
salah satu jenis rumput laut merah (Rhodophyceae) dan dikenal dalam dunia
perdagangan nasional maupun internasional sesuai dengan nama daerahnya yaitu
cottonii padahal nama ilmiah sebenarnya adalah Kappaphycus alvarezii karena
karagenan yang dihasilkan termasuk fraksi kappa-karagenan.
Ciri-ciri Eucheuma cottonii adalah thallus dan cabang-cabangnya berbentuk
silindris atau pipih, percabangannya tidak teratur dan kasar (yang menyerupai
lingkaran) karena ditumbuhi oleh nodulla atau spine untuk melindungi gametan.
Ujungnya runcing atau tumpul berwarna cokelat ungu atau hijau kuning. Permukaan
licin, cartilaginous, warna hijau, hijau kuning, abu-abu atau merah (Ditjenkan
Budidaya 2004).
Rumput laut Eucheuma cottonii mengandung karbohidrat, protein, sedikit
lemak dan abu. Selain itu juga merupakan sumber vitamin seperti vitamin A, B1, B2,
B6, B12 dan vitamin C, serta mengandung mineral seperti K, Ca, P, Na, fe dan
Iodium (Istini 1986). Komposisi kimia rumput laut Eucheuma cottonii dapat dilihat
pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi kimia rumput laut Eucheuma cottonii
Komposisi
Jumlah
Air
12.90%
Protein
5.12%
Lemak
0.13%
Karbohidrat
13.38%
Serat Kasar
1.39%
Abu
14.21%
Ca
52.82 ppm
Fe
0.11 ppm
Riboflavin
2.26 m/100g
Vitamin C
4.00 mg/100g
Karagenan
65.75%
Serat
39.47%
Sumber: Istini (1986)

5

Enzim Karagenase
Enzim merupakan protein sel hidup yang berperan sebagai biokatalisator
dalam proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di-luar sel. Enzim
mempunyai spesifisitas katalitik yang tinggi yang ditentukan oleh gugus fungsi pada
situs aktifnya. Enzim terdiri dari bagian protein dan bagian non protein. Bagian
protein enzim yang disebut apoenzim sangat menentukan fungsi biokatalisator dari
enzim. Bagian ini akan rusak pada suhu terlampau panas atau bersifat termolabil.
Bagian non protein dari enzim disebut kofaktor atau gugus prostetik, yang dapat
berupa senyawa organik (koenzim) atau senyawa non organik, seperti ion-ion logam.
Gugus prostetik ini berukuran kecil, tahan panas (termostabil), dan diperlukan enzim
untuk aktivitas katalitiknya. Reaksi yang dikatalisis enzim dapat berlangsung sangat
cepat.
Enzim bekerja secara spesifik, karena sisi aktifnya (permukaan tempat
melekatnya substrat) hanya cocok dengan permukaan substrat tertentu. Gambar di
bawah ini merupakan letak kappa-karagenan pada bagian dari sisi aktif enzim
karagenase.

Gambar 2 Model gambar kappa-karagenan pada sisi aktif kappa-karagenase
(Michel et al 2001)
Enzim karagenase adalah enzim yang mampu menghidrolisis rangkaian
polimer karagenan dari neocarrabiose-4-sulphate (AG4S). Hasilnya adalah
oligosakarida A-G4S dengan enzyme resistant fraction (ERF) (Knutsen dan Hans
1992). Enzim karagenase dalam proses hidrolisis berperan untuk memecah molekul
karagenan pada posisi β-1,4 sehingga menghasilkan neokarabiosa dan selanjutnya
dirubah menjadi galaktosa.

Gambar 3 Diagram skematik dua pengulangan unit disakarida dari kappa-karagenan
(Michel et al 2001)

6

Gambar 4 Contoh degradasi spesifik pada kappa-karagenan oleh enzim kappakaragenase.
Gambar 4 adalah contoh degradasi enzim k-karagenase yang dapat
menghidrolisis ikatan β-glikosidik antara 3,6-anhidro-D-galaktosa dan Dgalaktosa,
menghasilkan pembentukan pada neocarrabiose oligosakarida dengan kode DA-G4S
dan ikatan 3-β-D-galaktopiranosa 4-sulphate sebagai residu (Riuter dan Bryan
1997). Oligosakarida yang dihasilkan dari proses hidrolisis pada karagenan terdapat
beberapa macam. Tabel di bawah ini menunjukkan oligosakarida yang dihasilkan
oleh enzim k-karagenase.
Tabel 2 Oligosakarida dari k-karagenase
Oligosakarida (A-G4S)n
Tetrasakarida (n-2)

Hexasakarida (n-3)
Octasakarida (n-4)

Dekasakarida (n-5)
Dodeasakarida (n-6)
Tetradekasarida (n-7)
Hexadekasakarida (n-8)
Octadekasakarida (n-9)

[(A-G4S)2 + C7H15NH3 +)3-H2O]+
[(A-G4S)2+ C7H15NH3+)3]+
[(A-G4S)(A-G)+ (C7H15NH3+)2-H2O]+
[(A-G4S)2+(C7H15NH3+)4+SO3]+
[(A-G4S)3+(C7H15NH3+)4]+
[(A-G4S)3+(C7H15NH3+)4-H2O]+
[(A-G4S)4+(C7H15NH3+)6-H2O]2+
[(A-G4S)4+(C7H15NH3+)5-H2O]+
[(A-G4S)4+(C7H15NH3+)5]+
[(A-G4S)3(A-G)+(C7H15NH3+)5-H2O]2+
[(A-G4S)5+(C7H15NH3+)7]2+
[(A-G4S)5+(C7H15NH3+)6]+
[(A-G4S)6+(C7H15NH3+)8-H2O]2+
[(A-G4S)6+(C7H15NH3+)8]2+
[(A-G4S)7+(C7H15NH3+)9-H2O]2+
[(A-G4S)7+(C7H15NH3+)9]2+
[(A-G4S)8+(C7H15NH3+)10-H2O]2+
[(A-G4S)8+(C7H15NH3+)10]2+
[(A-G4S)9+(C7H15NH3+)11-H2O]2+
[(A-G4S)9+(C7H15NH3 +)12]3+
(Antonopoulos 2004)

Perubahan suhu dan pH berpengaruh besar terhadap kerja enzim. Aktivitas
enzim akan bertambah dengan naiknya suhu sampai tercapainya aktivitas optimum.
Kenaikan suhu lebih lanjut akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim dan
pada akhirnya merusak enzim. Sementara itu, perubahan pH akan mempengaruhi

7

kecepatan reaksi enzim, karena berubahnya derajat ionisasi gugus asam dan basa dari
enzim. Untuk kebanyakan enzim, terdapat kisaran pH optimum dimana aktivitas
enzim berlangsung secara optimum dan mempunyai stabilitas yang tinggi. Sebagian
besar enzim mempunyai pH optimum yang mendekati netral, sebagian kecil lainnya
mempunyai pH optimum yang sangat rendah atau sangat tinggi.
Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat dipengaruhi oleh
konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat yang sangat rendah, kecepatan reaksi
yang dikatalisis enzim juga sangat rendah. Sebaliknya, kecepatan reaksi akan
meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat sampai tercapai titik tertentu,
yaitu titik batas kecepatan reaksi maksimum. Setelah titik batas, enzim menjadi jenuh
oleh substratnya, sehingga tidak dapat berfungsi lebih cepat. Pembatas kecepatan
enzimatis ini adalah kecepatan penguraian kompleks enzim terhadap substrat
menjadi produk dan enzim bebas.
Hidrolisis Enzimatik
Hidrolisis enzimatik merupakan proses penguraian suatu polimer yang
kompleks menjadi monomer penyusunnya dengan menggunakan enzim (Perez et al.
2002). Hidrolisis enzimatik memiliki beberapa keuntungan dibandingkan hidrolisis
asam, antara lain: tidak terjadi degradasi gula hasil hidrolisis, kondisi proses yang
lebih lunak (suhu rendah, pH netral), berpotensi memberikan hasil yang tinggi, dan
biaya pemeliharaan peralatan relatif rendah karena tidak ada bahan yang korosif
(Taherzadeh dan Karimin 2008), (Hamelinck et al. 2005). Beberapa kelemahan dari
hidrolisis enzimatis antara lain adalah membutuhkan waktu yang lebih lama, dan
kerja enzim dihambat oleh produk. Di sisi lain harga enzim saat ini lebih mahal
daripada asam sulfat, namun demikian pengembangan terus dilakukan untuk
menurunkan biaya dan meningkatkan efisiensi hidrolisis maupun fermentasi
(Sanchez et al. 2003).
Substrat yang digunakan untuk proses hidrolisis juga berpengaruh terhadap
aktivitas enzim. Adanya substrat tertentu di dalam medium produksi dapat
mensekresi metabolit selnya. Tingginya kandungan serat pada tanaman memerlukan
suatu proses untuk mendegradasi komponen serat yang ada pada tanaman tersebut.
Salah satu cara yang dapat digunakan yakni dengan hidrolisis. Proses hidrolisis
meliputi proses pemecahan polisakarida di dalam biomassa lignoselulosa, yakni:
selulosa dan hemiselulosa monomer gula penyusunnya. Jika hidrolisis selulosa
berlangsung sempurna akan menghasilkan glukosa sedangkan hemiselulosa akan
menghasilkan beberapa monomer gula pentose (C5) dan heksosa (C6). Hidrolisis
enzimatis polisakarida tanaman dapat dilakukan oleh enzim. Beberapa enzim yang
banyak digunakan adalah selusase dan xilanase. Selulase merupakan enzim
kompleks yang terdiri dari eksoselulase atau eksobiohidrolase, endoselulase atau
endo-β-1,4-glukanase dan β -1,4-glukosidase atau selobiase. Ekso- β-1,4 glukonase
atau selobiohidrolase bekerja dengan cara melepas unit-unit selobiosa dari ujung
rantai selulosa (Anindyawati 2009).
Secara enzimatis mekanisme hidrolisa dapat dibagi menjadi dua tahap, yaitu
tahap aktivitas oleh enzim dan dilanjutkan dengan tahap hidrolisa enzim dan
kemudian menghasilkan gula seperti glukosa (Reese et al. 1950).

8

Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces merupakan genus khamir atau ragi yang memiliki
kemampuan mengubah glukosa menjadi alkohol dan CO2. Saccharomyces
merupakan mikroorganisme bersel satu tidak berklorofil, termasuk termasuk
kelompok Eumycetes. Tumbuh baik pada suhu 30˚C dan pH 4.8. Beberapa kelebihan
Saccharomyces dalam proses fermentasi yaitu mikroorganisme ini cepat berkembang
biak, tahan terhadap kadar alkohol yang tinggi, tahan terhadap suhu yang tinggi,
mempunyai sifat stabil dan cepat mengadakan adaptasi. Suhu optimum untuk
fermentasi antara 28-30˚C. Beberapa spesies yang termasuk dalam genus ini
diantaranya yaitu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boullardii dan
Saccharomyces uvarum.
S. cerevisiae merupakan khamir yang paling banyak digunakan dalam
fermentasi, dan merupakan mikroorganisme yang sangat dikenal oleh masyarakat
luas sebagai khamir roti (baker’s yeast). Khamir ini digunakan dalam proses
fermentasi alkohol karena mampu memproduksi etanol dalam jumlah yang besar,
toleran terhadap etanol yang cukup tinggi 12-18% (v/v), toleran terhadap kadar gula
tinggi dan tetap aktif melakukan fermentasi pada suhu 4-32˚C (Harrisson dan
Graham 1970).
Bahan baku dan perlakuan yang berbeda akan mengakibatkan perbedaan
produksi etanol yang dihasilkan. Semua galur S. cerevisiae dapat tumbuh aerobik
pada glukosa, maltosa, dan trehalosa namun tidak dapat tumbuh pada laktosa dan
selobiosa. Pertumbuhannya pada gula lain dapat berubah-ubah. Dua jenis gula yang
paling baik untuk difermentasikan adalah glukosa dan fruktosa (Martini dan Martini
2001).
Secara biokimia fermentasi diartikan sebagai pembentukan energi melalui
senyawa organik, sedangkan pengertian dalam bidang industri fermentasi adalah
suatu proses untuk mengubah bahan dasar menjadi suatu produk oleh massa sel
mikroba. Monomer gula dapat diubah secara anaerobik menjadi alkohol oleh
bermacam-macam mikroorganisme. Fermentasi gula sederhana (sukrosa dan
glukosa) menjadi etanol memiliki persamaan stokiometri sebagai berikut :
C12H22O11 + H2O
4 C2H2OH + 4 CO2
C6H12O6

2 C2H5OH + 2 CO2

Fermentasi pada produksi bioetanol dimaksudkan untuk mengubah glukosa
menjadi etanol (alkohol) dengan menggunakan yeast/ragi. Khamir dalam proses
fermentasi umumnya mengkonversi glukosa menjadi etanol pada kondisi anaerobik.
Meskipun demikian masih dibutuhkan sedikit oksigen untuk pertumbuhan khamir.
Oksigen yang dibutuhkan pada substrat sebesar 0.05-0.10 mmHg tekanan oksigen.
Proses fermentasi anaerobik tidak membutuhkan oksigen lebih dari itu, karena
oksigen yang lebih akan mendorong pertumbuhan khamir dengan cepat dan
mengkonsumsi glukosa. Pada beberapa kasus, konversi glukosa menjadi etanol tidak
pernah 100%, paling baik konversi maksimum sebesar 95% (Trust 2008).

9

3 METODOLOGI
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bakteri isolat
IH22 dan khamir S.cerevisiae (IPBCC AL IX), rumput laut (Eucheuma cottonii),
media karagenan, kappa-karagenan, CaCl2, KCl, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4, NaCl,
pepton, galaktosa, ekstrak khamir, asam dinitrolisilat (DNS), asetat pH-5, fospat pH6, dan aseton.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi laminar/transfer box,
cawan petri steril, labu erlenmeyer, tabung reaksi, inkubator, sentrifugasi, vorteks,
autoklaf, pipet mikro, timbangan analitik, viskometer, refraktrometer dan alat
densitometer.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilakukan pada bulan September 2015 sampai bulan April
2016 di Laboratorium Pusat Penelitian Surfaktan dan Bioenergi, LPPM Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Tahapan Penelitian
1. Peremajaan Isolat IH22
Peremajaan isolat dilakukan dengan menumbuhkan isolat IH22 pada media
padat kappa-karagenan (Lampiran 4). Isolat IH22 merupakan mikroba laut yang
dikoleksi oleh Laboratorium Pusat Studi Surfaktan dan Bioenergi, LPPM IPB yang
diperoleh dari Perairan Desa Lontar, Serang, Banten. Selanjutnya bakteri diinkubasi
selama 2 hari pada suhu 35oC.
2. Produksi Enzim k-Karagenase (Enzim Ekstrak Kasar)
Produksi enzim k-karagenase dilakukan dengan cara menginokulasi isolat
IH22 yang sudah diremajakan sebanyak satu ose ke dalam media starter cair
(Lampiran 4), selanjutnya diinkubasi selama 10 jam dengan suhu 35oC dengan
kecepatan agitasi 100 rpm. Sebanyak 50 mL kultur starter kemudian dimasukkan ke
dalam 450 mL media produksi (Lampiran 4). Media produksi enzim diinkubasi pada
waterbath dengan suhu 40°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm selama 12 jam
(merupakan waktu optimum berdasarkan hasil gula reduksi tertinggi terhadap
aktivitas enzim tertinggi pada isolat IH22) (Meliawati 2015).
Langkah selanjutnya, media produksi yang mengandung enzim disentrifugasi
pada kecepatan 2.500 rpm dengan suhu 4oC selama 15 menit untuk memisahkan
larutan enzim dengan endapan. Supernatan hasil sentrifugasi kemudian disimpan
pada suhu 10oC sebagai enzim ekstrak kasar (Modifikasi dari Khambaty et al. 2007).
Supernatan yang dihasilkan dari proses sentrifugasi enzim ekstrak kasar dilakukan
analisa kadar protein untuk memperoleh aktivitas spesifik enzim (Lampiran 5), dan
analisa aktivitas enzim dengan cara mengambil sampel sebanyak 0.33 mL supernatan
ditambah 0.67 mL substrat karagenan dalam buffer asetat pH 5 dan selanjutnya
divortex dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 50oC. Sebanyak 1 mL sampel
yang telah diinkubasi ditambah dengan 3 mL DNS (Miller 1959), dilakukan vortex
kembali dan dipanaskan pada air yang telah mendidih selama 15 menit. Selanjutnya
sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm dan dihitung kadar
gula reduksinya.

10

Aktivitas enzim merupakan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
menghasilkan 1 mikromol gula reduksi (D-galaktosa equivalent) permenit.
Pengukuran aktivitas enzim dimasukkan ke dalam rumus dibawah ini.
Aktivitas enzim (IU/ml) =
Keterangan:

M

g

×

×

BM galaktosa = 0,18 mg/µmol
Waktu inkubasi dalam menit
Vol enzim dan vol substrat dalam mL

+

×

3. Pemekatan Enzim k-Karagenase Ekstrak Kasar dengan Metode
Pengendapan Aseton 80%
Enzim ekstrak kasar yang diproduksi sebanyak 500 ml dipekatkan dengan
aseton pada konsentrasi 80% dimana sebanyak 2 ml enzim ekstrak kasar
ditambahkan dengan pelarut aseton 8 ml dalam tabung reaksi. Setelah itu campuran
diaduk dengan vortex sampai homogen dan disimpan semalaman di dalam lemari
pendingin. Kemudian dilakukan pemisahan dengan sentrifus 12000 xg selama 15
menit pada suhu 4°C. Enzim yang mengendap dipisahkan dan dilarutkan kembali
ke dalam 0,05 M buffer fosfat pH 6 sebanyak 200 µl. Sehingga dari 500 ml enzim
ekstrak kasar yang telah dipekatkan akan diperoleh konsnetrat enzim k-karagenase
sebanyak 50 ml untuk satu kali pembuatan media produksi kappa-karagenan.
Kemudian enzim yang telah dimurnikan dilakukan uji aktivitas enzim dengan
perhitungan yang sama dengan pengujian sebelumnya dan kadar proteinnya untuk
mengetahui aktivitas spesifikasi enzim (Meliawati 2015).
4. Penentuan Waktu Hidrolisis terhadap Aktivitas Enzim dan Gula Reduksi
Menggunakan Enzim k-Karagenase
Pengujian dilakukan pada enzim yang telah diendapkan dengan aseton.
Sebelumnya kappa-karagenan sebanyak 0.25% (w/v) dilarutkan dalam buffer fosfat
pH 6 dan diambil sebanyak 0.67 ml sebagai substrat kappa-karagenan kemudian
ditambahkan dengan enzim k-karagenase sebanyak 0.33 mL dan dihidrolisis pada
suhu 40°C. Waktu pengamatan dilakukan setiap setengah jam yang dimulai dari 0,
30, 60, 90, 120 dan 180 menit. Selanjutnya dilakukan analisa terhadap aktivitas
enzim dan gula reduksi pada tiap interval 30 menit untuk memperoleh waktu inkubasi
dan hidrolisis yang terbaik.
5. Penentuan Konsentrasi Asam Pada Hidrolisat E.cottonii
Tahapan ini dilakukan untuk menentukan banyaknya konsentrasi yang tepat
pada masing-masing substrat E.cottonii. Adanya penambahan asam pada subtrat
E.cottonii bertujuan agar hidrolisat tidak mudah berubah menjadi gel saat sebelum
dihidrolisis menggunakan enzim k-karagenase. Asam yang digunakan adalah asam
sulfat 3%, dimana asam yang diberikan dalam jumlah yang kecil, agar selama proses
hidrolisis dengan asam tidak menghasilkan senyawa toksik pada hidrolisat yang
dapat mengganggu proses fermentasi nantinya.
Penentuan konsentrasi asam dilakukan dengan cara menghidrolisis substrat
E.cottonii pada konsentrasi 6%, 9%, dan 12% dalam 100 ml aquades yang diautoklaf
selama 30 menit pada suhu 121°C, tekanan 1 atm. Sebelumnya masing-masing

11

substrat ditambahkan asam sulfat (H2SO4 3%) yang dimulai dari konsentrasi 0.1-1%,
dimana pada tahapan ini kondisi pH pada substrat tidak terlalu asam dan masih
mendekati netral (5-5.5) dan kemudian dilakukan pengamatan terhadap penampakan
hidrolisat secara visual diantaranya warna, konsistensi kekentalan yang dihasilkan
hidrolisat yang masih kental atau tidak terlalu cair serta tidak mudah mengel pada
saat dingin. Selanjutnya dilakukan pengujian viskositas dengan viskometer. Setelah
didapatkan konsentrasi asam yang tepat pada masing-masing subtrat E.cottonii,
kemudian dilakukan analisa gula pereduksi dan total gulanya.
6. Hidrolisis E.cottonii dengan Enzim k-Karagenase
Pada tahap ini, substrat yang telah dihidrolisis menggunakan asam,
dinetralkan dengan kapur tohor hingga pH mencapai 5,5, kemudian dilanjutkan
proses hidrolisis menggunakan enzim k-karagenase. Hidrolisat asam dengan
konsentrasi 6%, 9% dan 12% yang telah dingin ditambahkan enzim k-karagenase
dengan konsentrasi 0%, 2.5% dan 5%. Hidrolisis enzimatik dilakukan dengan cara
menginkubasi substrat E.cottonii selama 2 jam (waktu hidrolisis yang terbaik untuk
gula reduksi) pada suhu 40°C, dimana banyak enzim yang ditambahkan dalam 100
ml buffer adalah 5 ml untuk konsentrasi 2.5% dan 10 ml untuk konsentrasi enzim 5%
dan kemudian sisanya ditambahkan dengan buffer fosfat pH 6 sehingga total volume
hidrolisat E.cottonii yang digunakan adalah 200 ml. Kemudian hidrolisat dipanaskan
pada suhu 90°C selama 15 menit yang bertujuan untuk menghentikan reaksi pada
hidrolisat dan masing-masing substrat diambil sampelnya untuk dianalisa gula
reduksi dan total gulanya setelah hidrolisis menggunakan enzim.
7. Fermentasi
Substrat yang telah dihidrolisis menggunakan enzim k-karagenase
selanjutnya difermentasi, yang sebelumnya dilakukan persiapan inokulum
S.cerevisiae IPBCC AL IX dan diambil sebanyak 2 ose untuk ditanam dalam 10 mL
media YMGP (Yeast Malt Galactose Pepton), dimana banyaknya media YMGP yang
ditambahkan pada hidrolisat adalah sebesar 10% dari total volume hidrolisat yaitu
sebanyak 20 ml. Selanjutnya media diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam
(Yanagisawa et al. 2011). Proses fermentasi dilakukan pada kondisi anaerobik pada
suhu ruang 30oC. Substrat yang telah dihidrolisis ditambahkan dengan pupuk urea
0.5% dan NPK 0.06% dari °Brix gula substrat sebagai sumber nutrient (Setyaningsih
et al. 2012). Proses fermentasi dilakukan selama 6 hari. Hidrolisat yang telah
difermentasi diambil sample sebanyak 2 ml untuk analisa gula reduksi dan total
gulanya setelah fermentasi. Selanjutnya hidrolisat hasil fermentasi didistilasi,
kemudian rendemen etanol yang diperoleh diukur dengan bantuan alat densitometer
(%v/v). Perhitungan kadar etanol, efisiensi fermentasi, dan efisiensi penggunaan
substrat dapat dilihat pada Lampiran 6.
Pengolahan Data
Pengolahan data dilakukan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi substrat
dan enzim terhadap proses hidrolisis dan fermentasi dilakukan uji F dengan RAL dua
faktor. Faktor pertama yang mempengaruhi adalah konsentrasi substrat E.cottonii
sebanyak 3 taraf yaitu 6% (S1), 9% (S2) dan 12% (S3). Faktor kedua konsentrasi
enzim dengan 3 taraf yaitu 0% (E1), 2,5% (E2) dan 5%(E3). Percobaan dilakukan
sebanyak 2 kali dengan masing-masing pengukuran diulang sebanyak 2 kali. Apabila

12

ada salah satu perlakuan atau interaksinya berpengaruh nyata maka analisis
dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez dan Gomez 1995). Parameter yang diuji
diantaranya gula reduksi dan total gula selama proses hidrolisis dan fermentasi, kadar
etanol, efisiensi penggunaan substrat dan efisiensi fermentasi.
Persamaan model rancangannya sebagai berikut :
Yikj = μ+ Si + Ej + (SE)ij + ε(ij)k
Keterangan :
Yijk
= Hasil pengamatan
μ
= Nilai rata-rata umum
Si
= Pengaruh faktor konsentrasi substrat E.cottonii pada taraf ke-i; i=1,2,3..n
Ej
= Pengaruh faktor konsentrasi enzim pada taraf ke-j; j=1,2,3..n
SEij = Pengaruh interaksi antara faktor konsentrasi substrat ke-i dan enzim ke-j
ε(ij)k = Galat percobaan

13

4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Aktivitas Enzim (lU/ml)

Stabilitas Aktivitas Enzim k-Karagenase pada Berbagai Waktu Inkubasi
Pengukuran aktivitas enzim k-karagenase dilakukan untuk melihat berapa lama
enzim dapat bekerja secara maksimal pada suhu optimum. Satu unit aktivitas enzim
didefinisikan sebagai 1 mikromol galaktosa (gula reduksi) yang dihasilkan per satuan
waktu pada kondisi pengukuran enzim, yang dinyatakan dalam satuan unit/ml yang
merupakan mikromol yang dilepas per menit per mililiter enzim.
0,012
0,010

0,010
Aktivitas
Enzim
(IU/ml)

0,008

0,008
0,008

0,007

0,006
0,004
0,002
0,000

0

30

60

90
120
150
Waktu Inkubasi (menit)

0

180

Gambar 5 Aktivitas enzim k-karagenase selama waktu inkubasi
Pada Gambar 5 terlihat bahwa aktivitas enzim mengalami peningkatan di menit
30 hingga menit ke-60 yaitu sebesar 0.007 IU/ml – 0.01 IU/ml. Kemudian aktivitas
enzim menurun dimenit 90 hingga menit ke-180, dimana pada waktu ini enzim sudah
kurang aktif sehingga tidak menghasilkan kenaikan gula reduksi yang tinggi.
Berdasarkan grafik dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim yang tinggi dapat
diperoleh pada awal masa inkubasi yaitu pada kisaran 30 hingga 60 menit.
Perbandingan Aktivitas Enzim Ekstrak Kasar dan Enzim Hasil Pengendapan
Aseton
Perbandingan enzim ekstrak kasar dengan enzim hasil pengendapan aseton
dilakukan untuk membandingkan aktivitas enzim dan aktivitas spesifikasi enzim
sebelum dan setelah pengendapan aseton. Tabel 3 adalah perbandingan enzim
ekstrak kasar dan enzim hasil pengendapan aseton.
Tabel 3 Perbandingan aktivitas enzim ekstrak kasar dan enzim hasil pengendapan
Aseton 80%
Sampel

Gula
reduksi
(mg/ml)

Aktivitas
Enzim
(IU/ml)

Enzim Ekstrak Kasar
Enzim Hsl Pengendapan
Total Yield Enzim (%)

0.029
0.156

0.016
0.086

Total
Akt.
Enzim
(IU)
8
4.3
53.7

Kadar
protein
(mg/ml)
1.051
1.428

Akt.
Spesifik
Enzim
(IU/mg)
0.015
0.060

Total akt.
Spesifik.
Enzim
(IU)
7.5
3
40

Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa nilai aktivitas enzim mengalami peningkatan
pada saat sebelum dan setelah diendapkan. Aktivitas enzim diperoleh berdasarkan
nilai gula reduksi yang dihasilkan pada masing-masing enzim yaitu sebesar 0.029
mg/ml dan 0.0156 mg/ml. Secara umum, gula pereduksi berhubungan erat dengan
aktivitas enzim dimana semakin tinggi aktivitas enzim maka semakin tinggi pula gula

14

pereduksi yang dihasilkan. Nilai aktivitas enzim ekstrak kasar sebesar 0.016 IU/ml
menjadi 0.086 IU/ml dengan kelipatan hasil pengendapan aseton sebanyak 5 kali
lipat.
Sedangkan nilai aktivitas spesifikasi enzim ekstrak kasar adalah 0.015 IU/mg
dan mengalami peningkatan sebanyak 4 kali lipat menjadi 0.060 IU/mg saat setelah
diendapkan dengan aseton. Aktivitas spesifikasi enzim diperoleh bedasarkan kadar
protein pada masing-masing enzim, dimana kadar protein pada enzim ekstrak kasar
sebesar 1.051 mg/ml dan 1.428 mg/ml pada enzim hasil pengendapan. Pemekatan
enzim karagenase dengan metode pengendapan aseton merupakan metode yang
cukup baik dalam meningkatkan aktivitas enzim dengan persentase total yield yang
dihasilkan sebesar 53.7%.
Kadar Gula Reduksi selama Hidrolisis oleh Enzim k-Karagenase
Enzim k-karagenase diperoleh dengan cara mencampurkan media produksi
karagenase dengan media starter isolat IH22 dan diinkubasi selama 12 jam. Enzim
ekstrak kasar yang dihasilkan disentrifus untuk memisahkan supernatan dan
endapannya (crude) yang kemudian dipekatkan dengan metode pengendapan aseton
80% (Meliawati 2015). Perlakuan waktu hidrolisis yang diberikan dimulai dari 0
hingga 180 menit dengan rentang waktu setengah jam. Tahapan ini bertujuan untuk
mendapatkan waktu hidrolisis k-karagenan dalam menghasilkan gula reduksi yang
tertinggi oleh k-karagenase.
Gula Reduksi (mg/ml)

0,15

0,142
0,117

0,10

0,094

0,125
0,080

0,082
0,075

0,05

Rata-rata
Gula
reduksi
(mg/ml)

0,00
0

30

60
90
120
150
Waktu Hidrolisis (menit)

180

Gambar 6 Gula Reduksi selama Proses Hidrolisis oleh Enzim k-Karagenase
Gambar 6 menjelaskan bahwa gula reduksi yang dihasilkan dari menit pertama
hingga menit ke-120 mengalami peningkatan, kemudian di menit ke-150 menurun
hingga menit ke-180. Enzim karagenase menghasilkan gula reduksi yang tinggi pada
saat mencapai waktu hidrolisis 2 jam (120 menit). Selain suhu, waktu inkubasi
merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi besarnya gula reduksi yang
dihasilkan. Semakin lama waktu hidrolisis maka akan semakin tinggi kadar gula
reduksi yang dihasilkan. Namun waktu hidrolisis yang terlalu lama akan
mengakibatkan gula reduksi terdegradasi, sehingga konsentrasi gula reduksi
menurun (Idral et al. 2012). Waktu 2 jam ini selanjutnya digunakan untuk
menghidrolisis substrat E.cottonii pada proses hidrolisis enzimatik.

15

Penentuan Konsentrasi Asam H2SO4 3% pada Perlakuan Awal Hidrolisis
Proses hidrolisis yang dilakukan pada tahap ini bertujuan untuk menentukan
konsentrasi asam yang tepat agar substrat tidak mudah padat (berubah jadi gel) pada
saat didinginkan. Proses penentuan konsentrasi asam dilakukan secara tersendiri,
dimana masing-masing substrat E.cottonii diberi perlakuan konsentrasi asam
sebanyak 0.1% hingga 1%, dengan kenaikan konsentrasi setiap 0.05% dan kemudian
diautoklaf selama 30 menit pada suhu 121°C. Selanjutnya hidrolisat disaring dengan
kain kassa yang bertujuan untuk memisahkan cairan dengan ampas dan
mempermudah pengamatan terhadap penampakan hidrolisat secara visual. Hidrolisat
yang diinginkan memiliki karakteristik warna tidak terlalu coklat (kuning keruh),
konsistensi cairan kental, tidak membeku pada suhu ruang, viskositas sekitar 8 cP
dan pH yang mendekati netral yaitu 5. Tabel 4 berikut menjelaskan secara rinci
penampakan hidrolisat pada masing-masing substrat E.cottonii.
Tabel 4 Konsentrasi asam H2SO4 3% pada masing-masing substrat
Substrat
E.cottonii

6%

9%

12%

Warna

Konsistensi

Viskositas
(cP)

pH

Konsentrasi
Asam (%)

Kuning Pucat

Padat (Agar)

-

-

0.1

Kuning Keruh

Kental

8.15

5

0.15

Kuning Keruh

Agak Kental

5.86

4.5

0.2

Kuning Kecoklatan

Kental cair

4.81

4

0.25

Kuning Kecoklatan

Kental cair

2.18

3.5

0.3

Kuning Terang

Cair

1.21

3

0.4

Kuning Terang

Cair

1.1

3

0.5

Kuning Terang

Cair

1.07

3

1

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.1

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.15

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.2

Kuning Keruh

Kental

8,21

5

0.25

Kuning Keruh

Agak kental

6,86

4

0.3

Kuning Keruh

Agak kental

4,03

4

0.35

Kuning Keruh

Kental cair

2,88

4

0.4

Kekuningan

Kental cair

2,41

4

0.5

Kuning Terang

Cair

1,15

3

1

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.15

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.2

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.25

Kuning Pucat

Padat (agar)

-

-

0.3

Kuning Keruh

Setengah padat

9.79

5.5

0.35

Kuning Keruh

Kental

8.73

5

0.4

Kuning Keruh