Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L)

IMMUNOMODULATOR EKSTRAK

DAUN KUMIS KUCING (

Orthosiphon stamineus

Benth)

DAN BUNGA KNOP (

Gomphrena globosa

L.)

TRI HARI AQUARINI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2006

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2006 Tri Hari Aquarini NIM P09500014

ABSTRAK

TRI HARI AQUARINI. Kajian Keamanan dan Aktivitas

Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (

Orthosiphon

stamineus

Benth) Dan Bunga Knop (

Gomphrena globosa

L.)

.

Di

bawah bimbingan FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA dan

MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO

Daun kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan bunga knop (Gomphrena globosa L.) telah lama digunakan secara tradisional untuk mencegah atau mengobati berbagai macam penyakit. Daun kumis biasa digunakan untuk mencegah infeksi kandung kemih, kencing batu, infeksi saluran kemih dan mengobati diabetes melitus, rematik, dan asam urat. Bunga knop biasa digunakan untuk mengobati sesak napas karena asma, batuk rejan, radang saluran napas, disentri dan sakit panas. Walaupun demikian, belum ada informasi ilmiah mengenai keamanan kedua produk ini untuk dikonsumsi. Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan metode pengeringan terbaik untuk membuat bubuk daun kumis kucing dan bunga knop dan untuk menguji pengaruh ekstrak kedua produk ini terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Metode pengeringan terbaik untuk kumis kucing adalah pengeringan dengan sinar matahari, ditunjukkan oleh nilai rataan konsentrasi total fenol sebesar 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering yang lebih tinggi dari pada nilai rataan total fenol pada pengeringan dengan oven sebesar 16.918 + 0.174 mg fenolik/g berat kering dan oleh nilai rataan aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering dan 470.441 + 61.670 mM/g berat kering. Metode pengeringan terbaik untuk bunga knop adalah pengeringan dengan oven ditunjukkan oleh nilai rataan konsentrasi total fenolnya 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering yang lebih tinggi dari pada nilai rataan total fenol pada pengeringan dengan sinar matahari sebesar 2.239+0.055 mg fenolik/g berat kering dan oleh nilai rataan aktivitas antioksidannya berturut-turut sebesar nilai TEAC 108.346+14.166 mM/g berat kering dan 56.070 + 7.085 mM/g berat kering. Pengujian keamanan ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dilakukan menggunakan sel limfosit manusia yang dikultur dengan menambahkan ekstrak keduanya dan atau mitogen. Untuk ekstrak daun kumis kucing peningkatan konsentrasi dari 1.203 mg/ml menjadi 2.406 mg/ml kemudian menjadi 4.812 mg/ml meningkatkan rataan indeks stimulasi (IS) berturut-turut sebesar 1.518 + 0.124 menjadi 1.819+0.031 kemudian menjadi 2.389+0.148. Untuk bunga knop peningkatan konsentrasi dari 0.4115 mg/ml menjadi 0.823 mg/ml juga meningkatkan rataan IS berturut-turut sebesar 1.011+0.082 dan 1.071 + 0.122. Sebaliknya, peningkatan konsentrasi menjadi 1.646 mg/ml kemudian menjadi 3.292 mg/ml menghambat proliferasi sel limfosit sebesar 0.938 + 0.041 dan 0.780 + 0.142. Tampaknya bubuk daun kumis kucing tidak bersifat racun terhadap sel limfosit, sebaliknya mempunyai aktivitas imunomodulator. Bubuk bunga knop pada konsentrasi yang lebih tinggi tampaknya bersifat racun.

Kata kunci: daun kumis kucing, bunga knop, total fenol, aktivitas antioksidan, proliferasi sel limfosit.

© Hak cipta milik Tri Hari Aquarini, tahun 2006 Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam

bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm dan sebagainya

KAJIAN KEAMANAN DAN AKTIVITAS

IMMUNOMODULATOR EKSTRAK

DAUN KUMIS KUCING (

Orthosiphon stamineus

Benth)

DAN BUNGA KNOP (

Gomphrena globosa

L.)

TRI HARI AQUARINI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2006

Judul Tesis : Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.)

Nama : Tri Hari Aquarini NIM : P09500014

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.

PRAKATA

Alhamdulillah segala puji bagi Allah yang dengan seizinnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini, yang berjudul Kajian keamanan dan aktivitas immunomodulator ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan bunga knop (Gomphrena globosa L.).

Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada :

1. Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria selaku ketua komisi pembimbing yang selalu memberi semangat, motivasi dan bimbingan pada penulis dalam melaksanakan penelitian dan penulisan tesis ini.

2. Prof. Dr. Maggy T. Suhartono, selaku anggota komisi pembimbing yang juga selalu memberi semangat dan bimbingan selama penelitian dan penulisan tesis ini.

3. Ir. Didah Nur Faridah, MSi., atas segala bantuan dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan tesis ini.

4. Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS, selaku ketua Program Studi Ilmu Pangan.

5. Program Hibah B Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian IPB yang telah mensponsori penelitian ini.

6. Ibu Prof. Dr. Aisjah Girindra yang terus memberi semangat agar penulis dapat menyelesaikan studinya.

7. Teman-teman di LPPOM-MUI atas segala dukungan dan doanya.

8. Laboran dan pegawai di Lab. PAU BIOTEK, Mbak Ika, Mbak Eni dan Novi yang selalu memberi semangat dan bantuan bila ada kesulitan selama penulis bekerja di laboratorium.

9. Teman-teman di Lab. Mikrobiologi PAU BIOTEK, Mbak Eko, Mbak Yuyun, Emma, Dina, Siti, Agnes, Rudi, Bobby, Eni dan Darta yang selalu berbagi ilmu dan saling mendukung.

10.Adik-adik satu penelitian Nora dan Inggrid yang selalu saling menyemangati dan bekerja sama.

11.Teman-teman pada Program Studi Ilmu Pangan yang selalu bersedia membantu dan memberi semangat kepada penulis untuk menyelesaikan penelitian.

12. Papa dan Mama juga Bapak (Soedibjo N.H) dan Ibu (Sumarti) atas segala dukungan dan bantuannya.

13. Suamiku tercinta Mas Upi dan anak-anakku tersayang Mbak Ima, Mbak Ifa, Mas Fawzan dan Adek Ira atas segala pengorbanan dan pengertiannya selama Ibu kuliah.

14. Kakak-kakakku Mas Eko, Bu Nien, Mbak Yanti dan Aa Bagus serta adik-adikku De Ida dan Joko, De Ika dan Gandjar, De Dewi, dan De Rudi dan Fika atas segala doa dan dukungannya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan tesis ini, oleh karena itu penulis mohon kritik dan saran untuk kesempurnaan tesis ini. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua. Amin.

Bogor, Januari 2006

Tri Hari Aquarini

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor, pada tanggal 18 Februari 1969 sebagai anak terakhir dari tiga bersaudara putra Bapak Prof. Dr. Harimurti Martojo dan Ibu Rastini Rasjid, MSc. Penulis menempuh pendidikan SD sampai SMA di Bogor. Tahun 1987 diterima di Institut Pertanian Bogor dan tahun 1988 diterima di Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fateta IPB. Penulis menyelesaikan studi Sarjananya pada tahun 1992.

Sejak 1993 sampai sekarang penulis bekerja paruh waktu di Lembaga Pengkajian Pangan dan Obat-obatan-MUI (LPPOM-MUI). Penulis telah menikah dengan dr. Supriyadi Bektiwibowo SpA dan dikaruniai empat orang anak, Fathimah Hanun Syifaul Jannah, Hanifah Sakinatun Khalidah, Muhammad Khalid Fawzan ’Adziima dan Khadijah Zhafirah Nurul Ramadhani.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... 11

DAFTAR GAMBAR ... 12

DAFTAR LAMPIRAN ... 13

PENDAHULUAN ... 14

Latar Belakang ... 14

Tujuan ... 15

TINJAUAN PUSTAKA ... 16

Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) ... 16

Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) ... 18

Pengeringan ... 21

Senyawa Fenolik ... 23

Keamanan Pangan ... 25

Limfosit dan Proliferasi Sel Limfosit ... 26

Immunomodulator ... 29

Kultur Sel ... 30

BAHAN DAN METODE ... 32

Bahan dan Alat ... 32

Metode Penelitian ... 33

Pembuatan Bubuk Daun Kumis Kucing dan Bubuk Bunga Knop ... 33

Metode Pengeringan Oven ... 33

Metode Pengeringan Sinar Matahari ... 33

Pembuatan Ekstrak Air Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Segar dan Bubuk ... 33

Analisa Total Fenol modifikasi metode Chandler dan Dodds (Shetty et al. 1995)... 34

Analisa Aktivitas Antioksidan (Kubo et al. 2002) ... 34

Analisa Proksimat (Apriyantono et al. 1989)... 35

Analisa Proliferasi Limfosit ... 37

Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Serta Larutan Mitogen ………... 37

Persiapan Medium Kultur Sel Limfosit (Koesitoresmi 2002), Isolasi Limfosit (Nurrahman 1999) dan Penghitungan Sel ... 38

Kultur Limfosit ... 40

HASIL DAN PEMBAHASAN... 42

Daun Kumis Kucing ... 42

Metode Pengeringan ... 42

Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan... 44

Analisa Proksimat Bubuk Daun Kumis Kucing Hasil Pengeringan Dengan Sinar Matahari ... 49

Pengujian Ekstrak Daun Kumis Kucing Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT...49

Bunga Knop... 53

Metode Pengeringan... 53

Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan... 55

Analisa Proksimat Bubuk Bunga Knop Hasil Pengeringan Dengan Oven ... 59

Pengujian Ekstrak Bunga Knop Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT... 60

SIMPULAN DAN SARAN ... 65

Simpulan ... 65

Saran ... 65

DAFTAR PUSTAKA... 66

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Mitogen-mitogen ”nonspecific” yang mengaktivasi sel limfosit manusia ... 28

2 Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel... 41

3 Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar ... 45

4 Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar ...…... 47

5 Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari ... 49

6 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing dengan mitogen (Con A, LPS dan PK) dengan yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja pada konsentrasi C2 (1.203 mg/ml) ,C4 (2.406 mg/ml) dan C8 (4.812 mg/ml) ... 50

7 Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air bunga knop segar... 54

8 Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air bunga knop segar...…… 57

9 Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven ... 59

10 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop dengan mitogen (Con A, LPS dan PK) dengan yang ditambah ekstrak bunga knop saja pada konsentrasi C1 (0.4115 mg/ml), C2 (0.8230 mg/ml), C4 (1.646 mg/ml) dan C8 (3.292 mg/ml)... 60

11 Perbandingan hasil penelitian ekstrak daun kumis kucing dengan bunga knop ... 64

12 Hasil analisa total fenol dan aktivitas antioksidan... 77

13 Hasil analisa MTT ekstrak bunga knop ... 77

14 Hasil analisa MTT ekstrak daun kumis kucing... ... 78

15 Absorbansi untuk Trolox (mM)... ... 79

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) ... 16

2 Tanaman bunga knop (Gomphrena globosa L.) ... 19

3 Pengambilan darah secara aseptis... 39

4 Bubuk daun kumis kucing ... 43

5 Ekstrak air bubuk daun kumis kucing... 43

6 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing perlakuan pada daun kumis kucing ... 46

7 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada daun kumis kucing ... 47

8 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja dengan yang ditambah mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak daun kumis kucing ditambah mitogen ... 52

9 Bubuk bunga knop ... 54

10 Ekstrak air bubuk bunga knop... ... 54

11 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing perlakuan pada bunga knop ... 57

12 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada Bungaknop... 58

13 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop saja dengan yang ditambah mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak bunga knop ditambah mitogen ... 61

14 Kurva standar Trolox ... 79

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Dosis dasar jumlah penggunaan daun segar dan bubuk daun kumis

kucing untuk membuat ekstrak air …..………. 72

2 Dosis dasar jumlah penggunaan bunga segar dan bubuk bunga knop untuk membuat ekstrak air ...……… 73

3 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Daun Kumis Kucing ... 74

4 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop ... 75

5 Penentuan konsentrasi larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) ... 76

6 Master tabel data penelitian ... 77

7 Tabel absorbansi dan kurva standar trolox ... 79

8 Tabel absorbansi dan kurva standar asam tanat... 80

9 Daftar singkatan ... 81

10 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air daun kumis Kucing ...….... . 82

11 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air daun kumis Kucing ... 84

12 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak daun kumis kucing ....86

13 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air bunga knop ...….90

14 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air bunga knop.... 92

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Seiring dengan semboyan kembali ke alam, akhir-akhir ini minat masyarakat untuk menggunakan bahan-bahan alami semakin meningkat. Hal ini terbukti dengan semakin banyaknya industri-industri baik industri kecil maupun besar yang menggunakan tumbuh-tumbuhan yang banyak terdapat di Indonesia. Kenyataan ini mendorong dilakukannya penelitian-penelitian tentang tumbuhan-tumbuhan yang secara tradisional sering digunakan untuk mencegah atau mengobati berbagai penyakit.

Di hutan tropik Indonesia terdapat sekitar 30.000 spesies tumbuhan berbunga. Dari jumlah tersebut, diperkirakan tidak kurang dari 9.606 spesies diketahui berkhasiat obat (Mahendra dan Fauzi 2005), diantaranya kumis kucing dan bunga knop (Dalimartha 2000). Dalam kehidupan sehari-hari, masyarakat biasa mengkonsumsi kumis kucing dan bunga knop dalam bentuk air rebusan. Kumis kucing secara tradisional biasa digunakan untuk mencegah infeksi kandung kemih, kencing batu, infeksi saluran kemih dan mengobati diabetes melitus, rematik, batu kemih, batu ginjal dan asam urat (Mahendra dan Fauzi 2005). Bunga knop secara tradisional biasa digunakan untuk mengobati sesak napas karena asma, batuk rejan (pertusis), radang saluran napas, radang mata, sakit kepala, disentri dan sakit panas (Dalimartha 2000).

Daun kumis kucing dan bunga knop segar mempunyai kandungan air yang tinggi, sehingga tidak dapat disimpan dalam waktu yang relatif lama. Berdasarkan kenyataan tersebut, perlu dilakukan pengawetan terhadap kedua komoditas ini yaitu dalam bentuk bubuk. Penelitian perlu dilakukan untuk membuat bubuk dengan metode terbaik, sehingga komponen-komponen penting yang terkandung di dalam daun kumis kucing dan bunga knop tidak banyak yang hilang.

Produk dalam bentuk bubuk ini dapat dikembangkan sebagai suatu produk minuman seduhan, sehingga dapat memberi nilai tambah terhadap daun kumis kucing dan bunga knop. Mengingat berbagai fungsinya secara tradisional,

minuman seduhan kedua komoditas tersebut dapat dijadikan sebagai minuman fungsional.

Sebelum dapat dikonsumsi secara aman, minuman seduhan daun kumis kucing dan bunga knop terlebih dahulu harus diuji keamanannya ddan fungsi biologis lainnya. Untuk itu perlu diketahui dosis yang aman untuk dikonsumsi sehari-hari dengan cara pengujian secara in vitro terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Penggunaan sel limfosit manusia adalah karena limfosit merupakan sel yang sangat rentan terhadap bahan kimia, sehingga pengujian dengan limfosit ini dapat memberikan hasil yang akurat dan sensitif. Di samping itu, penggunaan sel limfosit dapat menggambarkan adanya aktifitas immunomodulator, yaitu memacu atau menekan respon imun (Pranoto 2003 ; Wahyuni 2004 ; Lin et al. 2005). Penelitian-penelitian yang menggunakan sel limfosit untuk pengujian keamanan pangan antara lain cincau hijau (Zakaria dan Prangdimurti 2001 ; Koesitoresmi 2002), jahe (Tejasari et al. 2000 ; Nurrahman 1998) dan makanan jajanan (Zakaria et al. 1997).

Tujuan

Tujuan penelitian ini adalah 1) memilih metode pengeringan terbaik untuk membuat bubuk seduhan daun kumis kucing dan bunga knop 2) menentukan dosis yang aman dari kedua komoditas tersebut dengan pengujian secara in vitro terhadap proliferasi sel limfosit manusia 3) Menunjukkan adanya aktivitas immunomodulator dari kedua komoditas tersebut.

TINJAUAN PUSTAKA

Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth)

Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) diduga berasal dari daerah Afrika tropik, kemudian menyebar ke wilayah Georgia (Kaukasus), Kuba, Asia dan Australia Tropik. Penyebarannya di Indonesia, yaitu di Jawa sejak 1928, India, Malaysia, Vietnam dan Thailand (de Padua et al. 1999).

Gambar 1 Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth)

Menurut Dalimartha (2000) kumis kucing tersebar di Sumatera dengan nama daerah kumis kucing (bahasa Melayu), di Jawa dengan nama daerah kumis kucing (bahasa Sunda) atau remujung (bahasa Jawa) dan soengoet koceng (bahasa Madura). Sentra produksi kumis kucing yaitu Jawa Tengah (Ambarawa, Kopeng dan Blora), Jawa Barat (Sukabumi dan Bogor), Jawa Timur, Sumatera Barat, Sumatera Utara, Aceh dan Sulawesi Utara (Mahendra dan Fauzi 2005).

Berdasarkan ilmu taksonomi (Mahendra dan Fauzi 2005) tata nama kumis kucing adalah sebagai berikut.

Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Subkelas : Sympetalae

Ordo : Tubiflorae

Famili : Labitae (Laminaceae) Genus : Orthosiphon

Spesies : Orthosiphon stamineus Benth Tanaman kumis kucing berakar tunggang, termasuk tanaman tahunan, tumbuh tegak dengan tinggi mencapai 100-150 cm. Batang berbentuk persegi empat agak beralur, bercabang-cabang, berambut pendek atau gundul, berwarna hijau atau keunguan dan berdiameter sekitar 1.5 cm. Daun berbentuk bulat telur, lonjong, lanset atau belah ketupat dengan permukaan berbintik-bintik dan licin karena adanya kelenjar dalam jumlah banyak dan berwarna hijau keunguan. Panjang daun sekitar 10 cm dan lebar 3-5 cm (Mahendra dan Fauzi 2000). Bunga majemuk dalam tandan yang keluar di ujung percabangan, berwarna ungu pucat atau putih, benang sari lebih panjang dari tabung bunga. Buah berupa buah kotak, bulat telur, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwarna coklat. Biji kecil, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwana hitam Kumis kucing biasa tumbuh liar di sepanjang anak sungai dan selokan atau ditanam di pekarangan sebagai tumbuhan obat. Tumbuhan ini dapat ditemukan di daerah dataran rendah sampai ketinggian 700 m diatas permukaan laut (Dalimartha 2000).

Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) serta Dalimartha (2000), kumis kucing mengandung banyak komponen bioaktif seperti orthosiphon glikosida, tanin, minyak atsiri, minyak lemak, saponin, sapofonin, garam kalium (0.6-3.5%) , myoinositol dan sinensetin. Berdasarkan hasil penelitian Olah et al. (2003), kumis kucing mengandung polifenol yaitu polymethoxylated flavonoid dan turunan caffeic acid. Identifikasi lebih lanjut menunjukkan adanya kandungan caffeic acid, cichoric acid, rosmarinic acid, sinensetin dan eupatorine. Loon et al. (2005) melakukan penentuan tiga jenis flavonoid dari kumis kucing di dalam plasma mencit dengan metode HPLC dan deteksi dengan sinar ultraviolet. Ketiga jenis flavonoid tersebut adalah sinensetin, eupatorin dan 3’-hydroxy-5,6,7,4’tetramethoxyflavone. Kumis kucing rasanya manis sedikit pahit dan sifatnya sejuk. Penelitian yang dilakukan terhadap efek yang ditimbulkan setelah seorang responden yang sehat meminum teh kumis kucing adalah dapat mencegah

asam urat dan terbentuknya batu yang mengandung asam urat dalam kandung kemih. Hal ini disebabkan oleh meningkatnya alkalinitas urin (Nirdnoy dan Muangman 1991). Hasil penelitian Isparyanto (1999) menunjukkan bahwa pemberian infus daun kumis kucing berdosis 12.85 g/kg bobot badan selama 7 hari dapat menurunkan asam urat darah tikus dengan efek yang sama dengan pemberian obat kimia Alopurinol 42.85 mg/kg bobot badan.

Efek diuretik dari ekstrak air kumis kucing pada mencit menunjukkan adanya peningkatan pengeluaran urin (Casadebaig-Lafon et al. 1989; Beaux et al. 1999) . Kandungan Natrium dalam urin mencit juga meningkat dengan pemberian ekstrak air kumis kucing (Beaux et al. 1999). Berdasarkan penelitian Sari (1985) efek maksimal terhadap sifat diuretikum dari rata-rata 1 ml infus dengan kandungan 5%, 10% dan 20% daun kumis kucing berturut-turut adalah 275.22%, 376.64% dan 646.12%. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa kumis kucing mengandung Kalium yang berfungsi sebagai pelarut batu ginjal dan batu saluran kemih. Dibandingkan dengan batangnya potensi diuretikum daun kumis kucing lebih baik. Volume urin rata-rata kelinci yang diberi infus daun kumis kucing sebesar 27.0 ml sedangkan volume urin rata-rata kelinci yang diberi infus batang sebesar 22.4 ml (Garnadi 1998).

Daun kumis kucing juga dapat berfungsi sebagai anti bakteri. Hasil penelitian Sofiani (2003) menunjukkan adanya sifat anti bakteri dari ektrak daun kumis kucing terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Eschericia coli dengan daya penghambatan yang berbeda. Sinensetin yang terkandung di dalam daun kumis kucing juga menghambat relatif besar terhadap Staphylococcus epidermidis. Tanaman ini yang biasa digunakan adalah daun atau seluruh bagian tanamannya, baik segar maupun sudah dikeringkan (Anonim 2005).

Bunga Knop (Gomphrena globosa L.)

Bunga knop (Gomphrena globosa L.) berasal dari Amerika (Dalimartha 2000 ; Anonim 2005) dan Asia (Anonim 2005). Tanaman ini tumbuh liar di ladang yang cukup mendapat sinar matahari dan dapat ditemukan pada ketinggian 1- 1.300 m di atas permukaan laut (Dalimartha 2000).

Gambar 2 Tanaman bunga knop (Gomphrena globosa L.)

Di Indonesia, bunga knop tersebar di Sumatera dengan nama daerah bunga knop, kembang puter dan ratnapakaja. Nama daerahnya di Jawa adalah adas-adasan, kembang gundul dan bunga kancing Selain itu dikenal pula di Bali dengan nama daerah ratna serta di Gorontalo dengan nama daerah taimantulu (Dalimartha 2000).

Berdasarkan ilmu taksonomi (Anonim 2000), tata nama bunga knop adalah sebagai berikut :

Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Caryophyllales Suku : Amaranthaceae Marga : Gomphrena

Jenis : Gomphrena globosa L.

Tanaman ini berupa perdu dengan batang hijau kemerahan, berambut dan bercabang-cabang serta tinggi mencapai 60 cm (Anonim 2005). Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang. Helaian daun bentuknya bulat

telur sungsang sampai memanjang, ujung meruncing, tepi rata, berwarna hijau, berambut kasar berwarna putih di permukaan atas dan berambut halus di permukaan bawah. (Dalimartha 2000). Bunga bentuk bonggol seperti bola, berwarna merah tua keunguan, putih (Anonim 2005) atau merah muda (Dalimartha 2000). Bijinya banyak dengan ukuran kecil-kecil panjang (Anonim 2005), sedang buahnya buah kotak berbentuk segi tiga terbungkus oleh lapisan tipis berwarna putih, berbiji satu (Dalimartha 2000).

Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) serta Dalimartha (2000), bunga knop mengandung gomphrenin I, II, III, V dan VI, amaranthin, minyak atsiri, saponin dan flavon. Menurut Cai et al (2001), bunga knop banyak mengandung komponen pigmen alami yaitu dari kelompok betasianin sebesar 1.3 mg/g sampel segar. Betasianin ini terdiri dari komponen gomphrenin I (betanidin 6-0-â -glukosida) sebesar 16.9%, isogomphrenin I (isobetanidin 6-0-â-glukosida) sebesar 8.8%, gomphrenin II (betanidin 6-0-(6’-0-E-4-coumarooyl)-â-glukosida) sebesar 11.1%, isogomphrenin II (isobetanidin 6-0-(6’-0-E-4-coumarooyl)-â -glukosida) sebesar 3.5%, gomphrenin III (betanidin 6-0-(6’-0-E-4-feruroyl)-â -glukosida) sebesar 40.8% dan isogomphrenin III (isobetanidin 6-0-(6’-0-E-4-feruroyl)-â-glukosida). Menurut Cai et al (2001), betasianin merah yang terdiri dari betanin dan amaranthin bersifat tahan terhadap panas dalam sistem buffer, tetapi bersifat tidak stabil pada suhu di atas 40oC dan bersifat lebih stabil pada suhu 40oC tanpa adanya udara dan sinar.

Penelitian yang dilakukan terhadap Amaranthus spinosus L., yaitu tanaman yang biasa digunakan sebagai obat di Afrika menunjukkan adanya kandungan betalain utama yang diidentifikasi sebagai amaranthin dan isoamaranthin. Selain itu tanaman ini juga mengandung hidroksisinamat, quersetin dan kaempferol glikosida yang semuanya merupakan senyawa fenolik (Stintzing et al. 2004). Warna bunga dan buah tanaman dari famili Caryophyllales berasal dari betalain yang berwarna merah-ungu untuk betasianin dan kuning untuk betaxanthin, keduanya menggantikan anthosianin. Betalain biasa digunakan sebagai pewarna makanan dan mempunyai sifat antioksidan yang dapat mencegah stress oksidatif (Strack et al. 2003). Pengujian terhadap kandungan polifenol Amaranthus sp. menunjukkan bahwa penambahan ekstrak Amaranthus sp. dengan konsentrasi

polifenol sampai dengan 0.2 µg/ml dapat meningkatkan perlindungan terhadap stress oksidatif oleh H2O2 yang menginduksi kerusakan DNA dari limfosit (Kapiszewska et al. 2005).

Aurone I (E) 3’ –O ß D glucopyranosy l4,5, 6,4’ tetrahydroxy 7,2’ -dimethoxyaurone dan dua senyawa lain yaitu aurantiamide acetate dan tiliroside diisolasi dari ekstrak etanol Gomphrena agretis. Evaluasi terhadap aktivitas biologis ekstrak etanol Gomphrena agretis dan ketiga senyawa di atas menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa (Ferreira et al. 2004). Ekstrak petroleum eter dari Gomphrena martiana dan Gompohrena boliviana yang kemudian difraksinasi menghasilkan lima jenis 5,6,7-trisubstituted flavon. Pengujian secara terpisah terhadap hasil fraksinasi ini menunjukkan aktivitas antimikrobial yang tinggi terhadap M. Phlei dengan minimum inhibitory concentration (MIC) 15, 20 dan 75 µ/ml, mendekati hasil yang didapat dengan bakterisida komersial (Pomilio et al. 1992).

Kultur sel dari sel endotel tali pusat manusia (HUVEC) yang diberi ekstrak Amaranthus sp. menunjukkan tidak dihasilkannya IL-1 sebagai proinflamatory sitokin yang menginduksi aktivasi AP-1. Mekanisme aktivitas penghambatan ini belum jelas, tetapi kemungkinan kandungan polifenol dari tanaman merupakan salah satu mediatornya (Stalinska et al. 2005).

Bunga knop rasanya manis, sifatnya netral dan biasa digunakan sebagai obat batuk, obat sesak, obat astma, obat bronkhitis kronis, peluruh dahak, panas pada anak, disentri dan penambah nafsu makan. Tanaman ini yang biasa digunakan adalah bunga atau seluruh bagian tanamannya baik segar maupun sudah dikeringkan (Anonim 2005).

Pengeringan

Pengeringan bahan-bahan pertanian seperti sayuran dan buah-buahan adalah suatu cara untuk mengawetkan bahan-bahan pertanian (Imre 1995). Produk pertanian yang sudah dikeringkan berkurang kadar air dan kelembabannya, sehingga tidak memberi kesempatan pada mikroorganisme seperti bakteri dan

kapang untuk hidup (Sokhansanj dan Jayas 1999; Jayaraman dan Das Gupta 1995).

Menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995), faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan metode pengeringan adalah bentuk dari bahan mentah dan sifat-sifatnya, karakteristik dan bentuk fisik yang diinginkan untuk produk akhirnya dan biaya operasional. Tiga cara yang biasa digunakan untuk mengeringkan buah-buahan dan sayur-sayuran adalah pengeringan dengan sinar matahari, pengeringan atmosfirik baik secara batch (tower atau cabinet dryers) atau kontinyu (tunnel, belt, Spray atau pemanasan dengan microwave) serta dehidrasi subatmosfir (vacuum shelf belt dan freeze dryer).

Perubahan warna, aroma dan penampakan terjadi pada produk yang dikeringkan. Pengeringan dapat pula meningkatkan kualitas dan nilai nutrisi suatu produk pangan dan pakan, seperti rasa yang lebih enak dan daya cerna serta perubahan metabolik yang meningkat (Sokhansanj dan Jayas 1995). Selama pengeringan terjadi degradasi senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun seperti klorofil yang memberi warna hijau pada daun. Degradasi klorofil tergantung pada ph, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya (Jayaraman dan Das Gupta 1995).

Pengeringan dengan sinar matahari adalah suatu metode pengeringan tradisional yang telah berabad-abad dilakukan. Pengeringan ini dilakukan pada waktu matahari bersinar dengan suhu produk sewaktu dikeringkan berkisar antara 5-15oC di atas suhu ambient (Sokhansanj dan Jayas 1999). Masalah yang mungkin timbul pada pengeringan dengan sinar matahari antara lain adalah terjadinya hujan atau mendung, kontaminasi oleh debu, serangga, burung dan binatang lainnya, kurangnya pengawasan sehinga terjadi pengeringan melewati batas dan kemungkinan terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Selain itu dapat terjadi penurunan mutu selama penyimpanan karena terjadi ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) pengeringan daun kumis kucing dengan sinar matahari dilakukan selama 2-3 hari (bila matahari bersinar penuh) dan dapat pula dilakukan dengan menggunakan oven yang dapat diatur suhunya sebesar 60oC selama 3 – 6 jam.

Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik dalam bahan pangan meliputi asam-asam fenolik, polimer fenolik yang dikenal sebagai tanin dan flavonoid. Asam-asam fenolik terdiri dari kelompok asam hidroksibenzoat dan asam hidroksisinamat. Senyawa polimer fenolik adalah senyawa dengan berat molekul tinggi seperti tanin. Flavonoid adalah kelompok fenolik terbanyak yang terkandung dalam tanaman dan biasanya ditemukan dalam bentuk glikosida.

Fenol adalah antioksidan terbanyak dalam tumbuhan yang berperan sebagai antioksidan pemutus rantai. Hal ini disebabkan oleh adanya gugus –OH yang menghalangi senyawa radikal yang reaktif seperti radikal peroksil (RO2’)

-OH + RO2’ R-O’ + ROOH

Hasil reaksi di atas menghasilkan radikal fenoksil yaitu R-O’ yang cenderung mempunyai sifat kurang reaktif karena terjadi delokalisasi elektron ke cincin aromatik. Hal ini menyebabkan radikal reaktif RO2’ berkurang kereaktifannya. Fenol kadangkala mempunyai mekanisme reaksi antioksidan tambahan seperti reaksi mengkelat ion logam transisi (Halliwell 2002). Penelitian yang dilakukan Cai et al. (2004) terhadap 112 tanaman yang biasa digunakan dalam pengobatan kanker secara tradisional di Cina menunjukkan adanya hubungan yang positif dan berbanding lurus antara aktivitas antioksidan dengan kandungan total fenolik dalam tanaman-tanaman tersebut. Nilai TEAC tanaman-tanaman tersebut berkisar antara 46.7 sampai 17,323 µM dan GAE sebesar 0.22 sampai 50.3 g GAE/100g berat kering. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa- senyawa fenolik merupakan senyawa antioksidan yang dominan dalam tanaman-tanaman tersebut. Senyawa-senyawa fenolik utama yang terkandung di dalam tanaman-tanaman tersebut yang telah diidentifikasi dan dianalisa adalah asam-asam fenolik, flavonoid, tanin, coumarin, lignan, quinon, stilbene dan curcuminoid. Tanaman-tanaman tersebut dengan demikian kemungkinan merupakan sumber potensial antioksidan alami dan kemopreventif untuk mencegah kanker.

Penelitian yang dilakukan terhadap aktivitas antioksidan pigmen betalain dari beberapa tanaman yang termasuk famili Amaranthaceae dengan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) yang dimodifikasi menunjukkan adanya aktivitas antioksidan yang tinggi untuk semua tanaman yang

diteliti. Betasianin tipe gomphrenin rata = 3.7 µM) dan betaxanthin (rata-rata = 4.2 µM) menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi, 3-4 kali lebih tinggi dari asam askorbat (13.9 µM) dan lebih tinggi dari rutin (6.1 ì M) dan catechin (7.2 µM). Penelitian ini juga mempelajari hubungan antara struktur kimia dengan aktivitas antioksidan betalain. Aktivitas antioksidan dari betalain biasanya meningkat dengan meningkatnya jumlah gugus hidroksil/imino dan juga tergantung dari posisi gugus hidroksil dan glikosilasi dari aglikon dalam molekulnya (Cai et al. 2003). Aktivitas radical scavenging beberapa senyawa terhadap DPPH memberikan hasil sebagai berikut aktivitas asam kafeat > asam sinapat > asam ferulat > ester asam ferulat > asam p-kumarat (Kwon et al. 2003). Aktivitas antioksidan biasanya meningkat dengan adanya peningkatan jumlah gugus hidroksil dan menurun dengan adanya glikosilasi (Fukumoto dan Mazza 2000). Penelitian yang dilakukan dengan membandingkan tiga metode yaitu metode DPPH, static headspace gas chromatography (HS-GC) dan beta-carotene bleaching test (BCBT) untuk menentukan aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa metode DPPH paling cocok digunakan uintuk menentukan aktivitas antioksidan karena dapat dilakukan dengan cepat, mudah dan tidak tergantung pada kepolaran sampel (Koleva et al. 2002).

Flavonoid bukan hanya dapat dianggap sebagai antioksidan, karena pada kondisi reaksi tertentu dapat pula menunjukkan aktivitas prooksidan. Sifat yang tidak diinginkan ini dapat dijadikan penjelasan terhadap toksisitas dari beberapa flavonoid secara in-vivo (Kessler et al. 2003). Penelitian Kang et al. (2003) terhadap ekstrak heksan, etilasetat, n-butanol dan air dari 10 herbal yang biasa digunakan sebagai obat di Korea menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak dengan pelarut yang bersifat lebih polar (n-butanol dan air) relatif lebih tinggi dari aktivitas antioksidan ekstrak dengan pelarut bersifat non-polar (heksan dan etil asetat).

Penggunaan asam tanat sebagai standar untuk memenentukan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau berdasarkan reaksi reduksi asam fosfomolibdat oleh fenol dalam larutan alkali. Metode ini menentukan total gugus fenolik bebas dengan demikian juga menentukan total fenolik terlarut. Kelemahan metode ini adalah tidak dapat membedakan antara tanin dan fenolik

lain yang bukan tanin. Senyawa seperti asam askorbat, tirosin dan mungkin juga glukosa ikut terukur (Waterman dan Mole 1994).

Keamanan Pangan

Keamanan pangan adalah suatu kebijakan yang menentukan keamanan suatu bahan pangan untuk dapat dikonsumsi. Suatu bahan pangan diminimalkan resikonya yang dapat menyebabkan sesuatu yang mambahayakan bagi kesehatan, karena tidak ada bahan pangan yang 100% bebas dari kontaminan (Finley dan Robinson 1992).

Untuk mengevaluasi resiko atau keamanan dari suatu bahan pangan atau bahan yang digunakan sebagai komposisi dalam bahan pangan yang baru, maka perlu dilakukan penentuan tipe bahaya potensial yang dapat ditimbulkan oleh bahan tersebut. Sebagai contoh, untuk suatu bahan yang merupakan komposisi dalam suatu bahan pangan harus ditentukan bahaya potensial baik yang bersifat kimiawi maupun biologis yang berhubungan dengan bahan tersebut. Bila ada bahaya yang dikandung suatu bahan, perlu ditentukan konsentrasi dimana bahan tersebut dapat bersifat toksik. Hal lain yang perlu juga diperhatikan adalah pengaruh bahan tersebut terhadap nilai nutrisi bahan pangan dan pengaruhnya terhadap penyerapan nutrien-nutrien lainnya (Finley dan Robinson 1992).

Bahan pangan yang aman tidak dapat mengesampingkan adanya toksikan alami baik yang terkandung secara alami dalam bahan maupun yang diinduksi karena adanya bahan-bahan lainnya. Makrokomponen di dalam suatu bahan pangan terutama lemak dan protein serta komponen-komponen anti kanker dan penghambat kanker yang banyak terdapat dalam bahan pangan tampaknya berinteraksi dengan komponen-komponen bahan pangan lainnya yang dapat memodulasi resiko kanker. Komponen-komponen yang secara alami terkandung dalam bahan pangan pada konsentrasi tertentu mempunyai aktivitas anti kanker, tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi menjadi bersifat toksik dan seringkali batas antara konsentrasi yang menguntungkan dan yang toksik sangat kecil (Shank dan Carson 1992).

Penentuan dosis merupakan suatu hal yang kritis untuk menguji senyawa-senyawa yang bersifat immunomodulator. Dosis tinggi yang dapat menyebabkan

toksisitas atau menurunnya berat badan harus dicegah, sebaliknya dosis terlalu rendah yang menyebabkan stress dan malnutrisi sehingga memodulasi fungsi imun tertentu juga harus dicegah (Dean et al. 1989).

Penelitian untuk mengetahui efek immunomodulator suatu komponen dapat dilakukan dengan menggunakan limfosit darah tepi manusia. Limfosit ini diisolasi kemudian diinkubasikan secara in vitro dalam kultur yang telah banyak digunakan untuk menguji fungsi immun. Komponen yang akan diuji efek immunomodulatornya kemudian ditambahkan ke dalam kultur ini (Dean et al. 1989). Hasil penelitian Duthil et al. (2003) menunjukkan bahwa beberapa polifenol dapat bersifat toksik dan mutagenik di dalam suatu sistem kultur sel tertentu.

Limfosit dan Proliferasi Sel Limfosit

Sistem yang berfungsi melindungi tubuh manusia dari unsur-unsur patogen disebut sistem imun. Sistem imun terdiri dari komponen genetik, molekuler dan seluler yang berinteraksi secara luas dalam merespon antigen endogenus dan eksogenus. Salah satu jenis sel yang berfungsi dalam merespon antigen adalah sel darah putih (Baratawidjaja 2000). Leukosit atau sel darah putih merupakan salah satu bagian dalam sistem imun yang ukurannya lebih besar dari eritrosit dan bebas bergerak (Roitt 1991). Menurut Baratawidjaja (2000) leukosit terdiri dari 75% sel granulosit dan 25% sel agranulosit yang terbentuk di dalam sumsum tulang. Granulosit terdiri dari sel limfosit dan monosit sedang agranulosit terdiri dari basofil, neutrofil dan eusinofil (Roitt 1991).

Limfosit adalah kunci pengatur sistem imun dan merupakan 20% dari semua leukosit dalam sirkulasi darah orang dewasa. Sel limfosit dibentuk dalam kelenjar timus dan sumsum tulang, merupakan sel nongranulosit berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7 – 15 µm. Sel limfosit selain dalam darah terdapat pula paada organ limfoid seperti limpa, kelenjar limfe dan timus (Baratawidjaja 2000).

Sel limfosit terdiri atas sel T dan sel B. Sel T yang dibentuk di dalam sumsum tulang, tetapi berproliferasi dan berdiferensiasi di dalam kelenjar timus berperan dalam sistem imun spesifik seluler untuk pertahanan terhadap bakteri

yang hidup intraseluler, virus, jamur parasit dan kanker (Baratawidjaja 2000). Sel T merupakan 65-80% dari jumlah sel limfosit yang ada di dalam sirkulasi darah (Kresno 1991). Sel T terdiri dari tiga populasi utama yaitu sel Thelper (Th), sel Tsupressor (Ts) dan Tcytotoxic (Tc). Masing-masing populasi sel T mengekspresikan pertanda permukaan atau Cluster Determinant (CD) berupa molekul glikoprotein yang berbeda-beda. Subset Th ditandai oleh glikoprotein CD4, sel Tc oleh glikoprotein CD8, sedangkan semua subset sel T ditandai oleh molekul CD3. Sel Th membantu sel B dalam memproduksi antibodi, sel Ts menekan pembentukan antibodi dan sel Tc berfungsi menghancurkan sasaran (Roitt 1991). Sel T berproliferasi menjadi sel T memori dan berbagai sel efektor yang mensekresi berbagai limfokin. Limfokin ini dapat mengaktivasi sel B, sel Tc, sel NK (Natural Killer) dan sel lain yang terlibat dalam respon imun (Roitt 1991).

Sel B yang berasal dari sel asal multipoten berperan dalam sistem imun spesifik humoral. Bila sel B dirangsang oleh benda asing, maka sel tesebut akan berproliferasi dan berkembang menjadi sel plasma yang dapat menghasilkan antibodi. Antibodi inilah yang mempunyai fungsi utama melawan infeksi ektraseluler virus dan bakteri serta menetralisir toksinnya (Baratawidjaja 2000). Sel B merupakan 5-15% dari limfosit dalam sirkulasi darah (Kresno 1991). Proliferasi sel limfosit dapat distimulasi oleh bahan-bahan alamiah yang disebut mitogen. Glikoprotein (lectin) asal tanaman yaitu concanavalin A (Con A) dan phytohemaglutinin (PHA) merupakan mitogen poten untuk sel T dan berguna untuk identifikasi dan mempelajari fungsi sel tersebut. Lipopolisakarida (LPS) yang diperoleh dari dinding sel bakteri gram-negatif mempunyai efek mitogen terhadap sel B sedangkan pokeweed merupakan mitogen baik untuk sel B maupun sel T (Baratawidjaja 2000). Macam-macam mitogen yang biasa digunakan untuk menentukan fungsi limfosit manusia dapat dilihat pada Tabel 1.

Sebanyak 50-60% limfosit T mampu memberikan respon terhadap stimulasi dengan mitogen misalnya Phytohemaglutinin (PHA) dan concanavalin A (Con A). Respon terhadap mitogen dianggap menyerupai respon terhadap antigen, sehingga uji transformasi limfosit dengan rangsangan mitogen banyak dipakai

untuk menguji fungsi limfosit. Stimulasi limfosit dengan antigen atau mitogen menimbulkan berbagai reaksi biokimia di dalam sel, diantaranya fosforilasi nukleoprotein, pembentukan DNA dan RNA serta peningkatan metabolisme

Tabel 1. Mitogen-mitogen ”nonspecific” yang mengaktivasi sel limfosit manusia Mitogen Singkatan Sumber biologis Spesifisitas relatif

Phytohemaglutinin PHA Phaseolus vulgaris sel T

Concanavalin A Con A Canavalia ensiformis sel T (subset yang berbeda dengan PHA)

Antilympcyte globulin ALG Heterologous antisera sel T dan sel B

Staphylococcus protein A SpA S aureus sel B sel T-independent

Pokeweed mitogen

PWM Phytolacca americana sel B sel T-independent

Stites (1991)

lemak dan lain-lain. Secara morfologik perubahan tersebut tampak menyerupai sel blast yaitu sel bersitoplasma biru dengan zone perinuklear yang terang, berinti besar dan beranak inti. Sel ini pada umumnya dapat dibedakan dengan limfosit yang tidak terangsang, namun kadang-kadang sulit membedakan sel yang terangsang dengan limfosit besar, sehingga penilaian morfologik kadang-kadang meragukan. Puncak respon limfosit normal terjadi pada hari ketiga setelah rangsangan. Limfosit B juga dapat memberi respon terhadap rangsangan mitogen, tetapi puncak respon limfosit B biasanya terjadi lebih lambat yaitu pada hari kelima atau keenam (Kresno 1991). Fungsi sel imun ditentukan oleh keseimbangan oksidan-antioksidan terutama untuk memelihara integritas dan fungsi lipida membran, protein selular dan asam-asam nukleat serta untuk pengaturan signal transduksi dan ekspresi gen di dalam sel-sel imun (Wu dan Meydani 1998).

Tejasari (2000) melakukan pengujian efek komponen oleoresin jahe terhadap respon proliferatif limfosit (sel B dan T). Pada kondisi tanpa stress oksidatif penambahan senyawa oleoresin dengan konsentrasi 50 µg/ml meningkatkan proliferasi sel B tertingi sebesar 456%, sedangkan penambahan senyawa gingerol dengan konsentrasi 150 µg/ml secara nyata meningkatkan proliferasi sel T sebesar 39%.

Pengaruh aktivitas ekstrak tanaman cincau hijau terhadap proliferasi sel limfosit manusia menunjukkan adanya proliferasi sel limfosit yang ditunjukkan oleh nilai indeks stimulasi. Penambahan ekstrak air akar heksan daun kultur dengan konsentrasi 0.13655 mg/ml memberikan nilai indeks stimulasi sebesar 1.03, sedangkan penambahan ekstrak heksan akar dengan konsentrasi 0.08683 mg/ml dan sebesar 0.34732 mg/ml memberikan indeks stimulasi berturut-turut sebesar 1.31 dan 1.06 (Pandoyo 2000).

Immunomodulator

Immunonodulator adalah senyawa-senyawa yang secara langsung merubah fungsi imun spesifik atau memberikan efek baik positif maupun negatif terhadap aktivitas sistem imun (Jaffe dan Sherwin 1991). Menurut Baratawidjaja (2000) Immunomodulator bekerja menurut 3 cara, yaitu melalui immunorestorasi, immunostimulasi dan immunosupresi. Immunorestorasi dan immunostimulasi disebut immunopotensiasi atau up regulation, sedangkan immunosupresi disebut juga down regulation.

Penggunaan immunomodulator yang memberikan efek positif (stimulasi) terhadap aktivitas sistem imun diantaranya adalah untuk mengobati defisiensi imun seperti pada pengobatan penderita AIDS, sedangkan yang memberikan efek negatif (menekan) terhadap fungsi imun yang normal atau berlebihan seperti pada pengobatan penyakit autoimun (Jaffe dan Sherwin 1991).

Faktor-faktor yang mempengaruhi suatu komponen bersifat immunomodulator antara lain adalah dosis, cara dan waktu pemberian. Bentuk dan lokasi terjadinya mekanisme immunomodulasi juga berperan terhadap sifat immunomodulator suatu komponen (Tzianabos 2000).

Pengujian ekstrak air dari Amaranthus sp. terhadap sel splenosit dari mencit BALB/c menunjukkan kemampuan ekstrak ini untuk menstimulasi proliferasi sel splenosit. Sel B yang diisolasi dapat distimulasi juga oleh ekstrak ini. Pemurnian ekstrak air dari Amaranthus sp menghasilkan protein (GF1) dengan berat molekul 313kDa. GF1 mempunyai aktivitas immunomodulator 309 kali ekstrak air yang belum dimurnikan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air Amaranthus sp. mempunyai aktivitas immunomodulator dengan secara langsung

menstimulasi aktivitas proliferasi sel B dan proliferasi subset sel T secara in vitro (Lin et al. 2005). Penelitian terhadap aktivitas immunomodulator dari suatu polisakarida tertentu menunjukkan adanya pengaruh terhadap respon imun selama proses penyembuhan penyakit infeksi. Polimer-polimer ini dapat mempengaruhi imunitas spesifik dan non spesifik melalui interaksinya dengan sel T, monosit, makrofag dan limfosit polimorfonuklear (Tzianabos 2000).

Penelitian mengenai aktivitas immunomodulator dari ekstrak akar Echinacea spp. menunjukkan bahwa ekstrak Echinacea spp. dapat menstimulasi proliferasi sel mononuklear darah tepi manusia, tetapi aktivitas immunomodulator ini dapat berubah bila sebelumnya Echinacea spp. ini disimpan pada 40C selama 4 hari. (Senchina et al. 2005).

Kultur Sel

Kultur sel adalah suatu teknik untuk memelihara atau mengembangbiakkan sel di luar tubuh (in vitro). Tujuan dari pemeliharaan sel atau jaringan ini adalah untuk mempelajari sifat-sifat sel di luar tubuh. Kultur sel mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat dikontrolnya lingkungan tempat hidup sel, seperti pH, tekanan osmosis, tekanan CO2 dan O2 yang menjadikan kondisi fiologis kultur relatif konstan. Selain itu kultur sel juga mempunyai kelemahan, seperti hilanganya spesifisitas sel, karena sel di luar tubuh bekerja sendiri-sendiri sedang di dalam tubuh (in vivo) bekerja secara terintegrasi di dalam satu jaringan (Freshney, 1995).

Kondisi kultur harus disesuaikan dengan kondisi di dalam tubuh untuk menunjang pertumbuhan sel yang optimal. Kultur sebaiknya berada pada pH sekitar 7.4 dan tidak di bawah 7.0, karena pH di bawah 6.8 akan menghambat pertumbuhan sel. Sistem buffer dalam kultur biasanya menggunakan sistem CO2 -bikarbonat yang analog dengan sistem dalam darah. Sistem ini masih berada di bawah kondisi optimum fisiologis sehingga masih diperlukan tambahan CO2 5% pada bagian headspace kultur untuk menjaga stabilitas pH. Stabilitas pH juga dapat dijaga dengan menggunakan buffer yang bersifat zwitterion seperti buffer bikarbonat dan HEPES (N-2-hidroksimetil-piperazin-N-2-etan-sulphonic acid) (Freshney 1995).

Medium standar yang biasa digunakan untuk kultur sel adalah Dulbecco’s modified Eagle’s (DME) dan RPMI 1640. Medium ini diperkaya dengan 10% Fetal Bovine Serum (FBS). FBS digunakan karena mengandung molekul IgG dengan konsentrasi yang sangat rendah. Suplemen pertumbuhan lainnya tidak diperlukan kecuali bila jumlah sel yang tumbuh sangat rendah (kira-kira di bawah 103 sel/ml). Antibiotik yang biasa ditambahkan ke dalam medium adalah penisilin dan streptomisin. Penisilin efektif untuk membunuh bakteri gram positif sedang streptomisin efektif membunuh bakteri gram negatif (Harlow dan Lane 1988).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Pada penelitian ini, bahan-bahan yang digunakan adalah daun kumis kucing dari kebun di Kampus IPB Darmaga, bunga knop kebun Tanaman Obat Karyasari, Leuwiliang Bogor dan darah manusia dari responden terpilih. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah K2SO4 (Kanto Chemical, Jepang), HgO (Merck, Jerman), H2SO4 pekat (Kanto Chemical, Jepang), batu didih, H3BO3 (Kanto Chemical, Jepang), metilen merah (Kanto Chemical, Jepang) metilen biru (Kanto Chemical, Jepang), NaOH-Na2S2O3, (Merck, Jerman), HCl (Merck, Jerman), dietil eter (Merck, Jerman), air bebas ion, buffer asetat (Merck, Jerman), akuades, air bebas pirogen, standar asam tanat (Merck, Jerman), Na2CO3 (Merck, Jerman), folin-ciocalteau 50% (Sigma, USA), etanol 95% (Merck, Jerman), metanol p.a. (Merck, Jerman), DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) (Sigma, USA), trolox® (Sigma, USA), tryphan blue (Wako, Jepang), larutan Ficoll-histopaque (Sigma, USA), phosphat buffer saline (PBS) (Sigma, USA), medium RPMI-1640 (Gibco, USA), NaHCO3 (Merck, Jerman), fetal bovine serum (FBS) (Sigma, USA), penicillin-streptomycin (Sigma, USA), concanavalin A (Sigma, USA), pokeweed (Sigma,USA), lipopolisakarida S. typhosa (Sigma, USA), MTT (3(4,5-dimethylthiazol-2-5-diphenyl-tetrazolium bromide)) (Sigma, USA) dan HCl-isopropanol (Merck, Jerman).

Alat-alat yang digunakan adalah wadah seng, oven, timbangan, neraca analitik, hot plate, cawan alumunium, desikator, alat destilasi, labu kjeldahl, labu lemak, alat ekstraksi soxhlet, kondensor, cawan porselen, tanur, blender, vortek, pH-meter, alat-alat gelas, , saringan vakum, kertas saring Whatman no. 41, stop-watch, mortar, freeze drier, alumunium foil, sentrifuse, pipet mikro, tip, hemasitometer, mikroskop Zeiss Germany ID 03, spektrofotometer, vacutainer, filter 0.2 µm, pipet pasteur, micro plate, laminar flow, inkubator (5% CO2, RH 95%, suhu 37oC) dan microplate reader.

Metode Penelitian

Pembuatan Bubuk Daun Kumis Kucing dan Bubuk Bunga Knop Metode Pengeringan Oven

Daun kumis kucing segar dicuci bersih kemudian dikeringanginkan, sedangkan untuk bunga knop segar tidak perlu dicuci. Setelah itu dikeringkan dengan oven pada suhu 50oC sampai kadar airnya mencapai 7%. Produk yang telah dikeringkan kemudian diblender selama 2 menit untuk menghasilkan bubuk. Bubuk ini kemudian dianalisa proksimat.

Metode Pengeringan Sinar Matahari

Daun kumis kucing segar dicuci bersih kemudian dikeringanginkan, sedangkan untuk bunga knop segar tidak perlu dicuci. Setelah itu dikeringkan di bawah sinar matahari tetapi tidak secara langsung sampai kadar airnya mencapai 7%. Produk yang telah dikeringkan kemudian diblender selama 2 menit untuk menghasilkan bubuk. Bubuk ini kemudian di analisa proksimat.

Pembuatan Ekstrak Air Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Segar dan Bubuk

Daun kumis kucing segar dan bunga knop segar dihaluskan dengan mortar kemudian diekstraksi dengan akuades mendidih dengan perbandingan berturut-turut sebesar (1.1835 g : 220 ml) dan (3.6720 g : 80 ml) dan didiamkan selama 5 menit. Hasil ekstraksi diaduk kemudian disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41. Dasar penggunaan perbandingan antara daun kumis kucing segar dengan akuades dapat dilihat pada Lampiran 1 dan untuk bunga knop segar pada Lampiran 2. Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dianalisa total fenol dan aktivitas antioksidannya.

Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop diekstraksi dengan menggunakan akuades mendidih dengan perbandingan sebesar (1 g : 257 ml) dan (0.8667 g : 80 ml) dan didiamkan selama 5 menit. Pembuatan ekstrak air ini dilakukan dengan perbandingan yang sama, baik untuk bubuk hasil pengeringan oven maupun bubuk hasil pengeringan sinar matahari. Hasil ekstraksi diaduk kemudian disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41. Dasar penggunaan perbandingan antara bubuk daun kumis kucing

dengan akuades dapat dilihat pada Lampiran 1 dan untuk bubuk bunga knop pada Lampiran 2. Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dianalisa total fenol dan aktivitas antioksidannya.

Analisa Total Fenol modifikasi metode Chandler dan Dodds (Shetty et al. 1995)

Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop baik segar maupun bubuk sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 1 ml etanol 95%. Setelah itu 5 ml air bebas ion ditambahkan ke dalam 50%, divortek dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian 1ml Na2CO3 5% ditambahkan ke dalam tabung reaksi tersebut, divortek dan disimpan delam ruang gelap selama 60 menit. Selanjutnya sampel divortek kembali dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat standar yang dilarutkan dengan etanol 95%. Sebagian ektrak air sampel disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar untuk dianalisa lagi kandungan total fenol sampel setelah penyimpanan 24 jam.

Analisa Aktivitas Antioksidan (Kubo et al. 2002)

Buffer asetat 0.1M (pH 5.5) sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 1.87 ml etanol p.a. dan 0.15 ml senyawa radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3mM dalam metanol. Campuran ini divortek. Sebanyak 0.03 ml ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop baik segar maupun bubuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut kemudian di vortek dan disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar (25oC) selama 20 menit. Setelah 20 menit absorbansi yang dihasilkan dibaca pada 517 nm. Untuk blanko digunakan akuades sebagai pengganti sampel, sedangkan untuk kontrol DPPH diganti dengan metanol dan sampel diganti akuades. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan. Untuk pembuatan kurva standar digunakan Trolox®, dengan satuan TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Sebagian ekstrak air sampel disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar untuk dianalisa lagi aktivitas antioksidan sampel setelah penyimpanan 24 jam.

Analisa Proksimat (Apriyantono et al. 1989)

Analisa kadar air yang dilakukan dengan metode oven adalah sebagai berikut. Cawan aluminium dikeringkan dalam oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit, kemudian ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop ditimbang kurang lebih 5 gram dalam cawan. Selanjutnya cawan beserta isinya ditempatkan dalam oven selama 6 jam. Kemudian cawan dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan. Setelah dingin ditimbang kembali dan proses pengeringan dalam oven diulang sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan :

Berat sampel (g) = W1 Berat sampel setelah dikeringkan (g) = W2 Kehilangan berat (g) = W3

Kadar air (basis kering) (%) = W3 x 100% W2

Kadar air (basis basah) (%) = W3 x 100% W1

Pengukuran Kadar Protein dilakukan dengan cara menimbang sejumlah bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2 g K2SO4, 50 mg HgO, 2 ml H2SO4 pekat dan batu didih. Sampel didekstruksi selama 1-1.5 jam hingga jernih, lalu didinginkan. Secara perlahan ditambahkan 2ml air dan didinginkan kembali. Cairan hasil dekstruksi (cairan X) dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas dengan air. Erlenmeyer berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator (metilen merah : metilen biru = 2:1) diletakkan di ujung kondensor alat destilasi. Cairan X ditambah dengan 10 ml NaOH-Na2S2O3 dan didestilasi sampai larutan dalam erlenmeyer ±

5 ml. Kemudian larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan HCl 0.02 N. Perhitungan :

Volume HCl untuk titrasi sampel (ml) = Vs Volume HCl untuk titrasi blanko (ml) = Vb Konsentrasi HCl (N) = C Berat sampel (mg) = W

Kadar N (%) = (Vs-Vb)x N x 14.007 x 100% W

Kadar protein (%) = % N x 6.25

Pengukuran Kadar Lemak dilakukan dengan cara sebagai berikut. Labu lemak yang telah bebas lemak dikeringkan di dalam oven. Setelah kering labu didinginkan kemudian ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop dibungkus dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian kondensor dan labu lemak dipasang pada ujung-ujungnya. Pelarut dietil eter dimasukkan ke dalam alat lalu sampel direfluks selama 5 jam. Setelah itu pelarut didestilasi dan ditampung di dalam wadah lain. Lemak dan labu lemak dikeringkan di dalam oven pada suhu 105oC. Labu lemak kemudian dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan. Setelah dingin labu lemak ditimbang kembali dan diulang proses pengeringan dalam oven sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan :

Berat sampel (g) = W1 Berat lemak (g) = W2

Kadar lemak (%) = W2 x 100% W1

Pengukuran Kadar Abu dilakukan dengan cara sebagai berikut. Cawan porselin dibakar dalam tanur selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator. Setelah dingin cawan ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop sebanyak 5 g ditimbang di dalam cawan lalu diabukan di dalam tanur sampai didapatkan abu berwarna abu-abu dan beratnya tetap. Pengabuan dilakukan dalam 2 tahap, yaitu : tahap pertama suhu 400oC lalu dilanjutkan pada suhu 550oC. Cawan kemudian didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang. Perhitungan :

Berat sampel (g) = W1 Berat abu (g) = W2

Kadar abu (%) = W2 x 100% W1

Analisa Proliferasi Limfosit

Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Serta Larutan Mitogen

Persiapan ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop dilakukan dengan cara terlebih dahulu membuat stock ekstrak Pembuatan stock ekstrak adalah dengan cara membuat ekstrak air bubuk hasil pengeringan terbaik yang dibuat sesuai dengan perbandingan pada Lampiran 1 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 2 untuk bunga knop. Hasil ekstraksi disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41. Setelah itu hasil ektraksi dikeringbekukan dengan freeze drier. Tabung freeze drier ditimbang (X1), setelah itu hasil ekstrak air dimasukkan ke dalam tabung dan dikeringbekukan menggunakan freeze drier selama 48 jam. Selama dikeringbekukan tabung freeze drier ditutup dengan alumunium foil untuk menghindari terjadinya oksidasi. Hasil freeze dry (X2) ditimbang untuk menentukan rendemen. Rendemen didapatkan dari perhitungan :

Berat bubuk sampel awal (g) = W1

Berat hasil freeze dry (g) = X2 - X1 = W2 Rendemen sampel (basis basah) (%) = W2 x 100% W1

Rendemen yang didapat merupakan dasar untuk menghitung konsentrasi ekstrak yang akan dimasukkan ke dalam kultur sel. Perhitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 4 untuk bunga knop. Rendemen ini adalah stock ekstrak yang digunakan untuk membuat larutan stock ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop

Pembuatan Larutan Stock Ekstrak (Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop) dan Larutan Stock Mitogen (LPS, ConA dan pokeweed) dilakukan dengan cara : 1. Pembuatan larutan stock ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop)

Sebanyak 0.2 g hasil freeze dry dilarutkan dengan sedikit medium RPMI-1640 (medium pencuci), kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640 (medium pencuci) ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 40 mg/ml.

2. Pembuatan larutan stock LPS dan Con A

Sebanyak 1 mg bubuk mitogen dilarutkan dengan sedikit medium RPMI- 1640, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640 ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 µg/ml.

3. Pembuatan larutan stock Pokeweed

Sebanyak 0.005 g bubuk pokeweed dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan dilarutkan dengan medium RPMI-1640 sampai volume eppendorf 1 ml, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 5000 µg/ml.

Larutan-larutan stock ini kemudian diencerkan sesuai dengan konsentrasi larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) serta larutan mitogen yang

diinginkan.

Pembuatan larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) yang akan diuji serta larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) dari larutan Stock dilakukan dengan cara mengencerkan larutan stock dengan medium RPMI-1640 sesuai dengan konsentrasi ekstrak yang diujikan dan konsentrasi larutan mitogen yang diinginkan. Misal untuk membuat 5 ml (V2) ekstrak kumis kucing dengan konsentrasi 0.6015 mg/ml (M2), maka larutan stock dengan konsentrasi 40 mg/ml (M1) yang harus diambil (V1) adalah :

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 40 mg/ml = 5 ml x 0.6015 mg/ml V1 = 0.075 ml = 75 µl

Jadi sebanyak 75 µl larutan stock diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditambah dengan medium RPMI-1640 sampai tanda tera.

Persiapan Medium Kultur Sel Limfosit (Koesitoresmi 2002), Isolasi Limfosit (Nurrahman 1999) dan Penghitungan Sel

Medium yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit adalah 16.2 g RPMI-1640 bubuk yang telah mengandung L-glutamin dan 0.25 mM HEPES. Bubuk ini dilarutkan dengan air bebas pirogen sehingga diperoleh 1 liter larutan medium RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1%

penicillin-streptomycin. Medium yang telah diperkaya ini kemudian disterilisasi kering dengan membran filter 0.2 µm dan digunakan sebagai medium pencuci. Untuk medium kultur sel limfosit digunakan medium RPMI-1640 di atas dengan penambahan fetal bovine serum (FBS) 10% steril. Pembuatan medium dan tahap-tahap selanjutnya dalam isolasi limfosit dilakukan di dalam laminar flow yang steril dengan sistem pengaliran udara laminar. Sebelum digunakan, laminar flow ini disinari dahulu dengan sinar UV selama 15 menit.

Gambar 3 Pengambilan darah secara aseptis

Darah seorang wanita sehat berusia 22 tahun diambil secara aseptis sebanyak 50 ml dengan menggunakan needle dan vacutainer yang telah mengandung heparin. Darah dari dalam vacutainer dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril, kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Bagian tengah (lapisan buffycoat) yang berisi sel-sel limfosit diambil perlahan-lahan dengan pipet pasteur steril kemudian ditambah dengan 5 ml medium RPMI-1640.

Larutan Ficoll-histopaque dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian dimasukkan perlahan-lahan campuran lapisan buffycoat dan medium RPMI di atasnya dengan perbandingan 1: 1. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifuse didapatkan lapisan putih seperti cincin antara larutan ficoll-histopaque dan RPMI-1640.

Lapisan putih tersebut diambil dengan pipet pasteur ke dalam tabung sentrifuse dan ditambah dengan 5 ml RPMI-1640 (medium pencuci), kemudian

disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan RPMI-1640 (medium pencuci), disentrifuse pada 2000 rpm selama 10 menit. Pencucian limfosit ini dilakukan 2 kali sehingga diperoleh kemurnian suspensi sel limfosit yang tinggi.

Sebelum dilakukan kultur sel limfosit, terlebih dahulu dilakukan penghitungan sel limfosit dengan menggunakan pewarna tryphan blue. Sejumlah sel ditempatkan ke dalam sumur microplate dan ditambah dengan tryphan blue. Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop cahaya Zeiss Germany ID 03 dengan perbesaran 10 kali. Untuk dapat dikultur, jumlah sel limfosit yang dapat dihitung harus lebih besar dari 95% berupa sel limfosit hidup yang berwarna terang. Limfosit yang diperoleh akan digunakan untuk pengujian proliferasi sel B dan sel T. Penghitungan sel limfosit dengan hemasitometer dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

N = A x FP x 104 sel/ml

Keterangan : N = jumlah sel limfosit/ ml

A = jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = faktor pengenceran

104 = jumlah sel per luas bidang pandang (1.0 mm x 1.0 mm x 0.1 mm)

Kultur Limfosit

Jumlah sel limfosit dari responden ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml dengan medium RPMI-1640. Untuk microplate 96 sumur, agar volume total masing-masing sumur menjadi 100 µl, maka bahan-bahan yang dipersiapkan untuk ditanam ke dalam kultur dapat dilihat pada pada Tabel 2. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Penentuan konsentrasi mitogen dapat dilihat pada Lampiran 5. Kultur diinkubasi selama 72 jam dalam inkubator bersuhu 37oC dengan atmosfer yang mengandung 5% CO2 dan RH 95%.

Pengujian proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 10 ì l pewarna MT T 0.5% dan diinkubasi kembali pada

Tabel 2. Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel

Perlakuan RPMI (µl)

Suspensi limfosit

dalam RPMI

(µl)

Mitogen* (µl)

Ekstrak (µl)

FBS (µl)

Kontrol

limfosit 20 70 - - 10

Kontrol

mitogen* - 70 20 - 10

Kontrol

ekstrak** - 70 - 20 10

Ekstrak**+

mitogen* - 70 10 10 10

*Mitogen : Lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (conA) dan pokeweed (PK) ** Ekstrak : Ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop dengan konsentrasi Sesuai dengan Lampiran 3 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 4 untuk bunga knop

kondisi yang sama selama 6 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 80 ì l HCl-isopropanol 0.04 N, setelah itu dilakukan pembacaan sel dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm.

- Nilai indeks stimulasi (IS) untuk semua perlakuan penambahan ekstrak daun kumis kucing, bunga knop maupun mitogen :

IS = OD perlakuan OD kontrol

Pengujian ekstrak kumis kucing dan bunga knop dalam kultur sel limfosit ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK). Hasil pengujian dianalisis dengan Analisis Sidik Ragam Satu Arah (ANOVA) dengan menggunakan program SPSS versi 12.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Daun Kumis Kucing Metode Pengeringan

Daun kumis kucing setelah dikeringkan dengan dua macam metode pengeringan, maka didapatkan hasil yang terbaik. Hasil terbaik ini dinilai berdasarkan analisa total fenol dan analisa aktivitas antioksidan bubuk hasil pengeringan kedua metode. Bunga knop bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak airnya, Bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak air daun kumis kucing, hasil metode pengeringan dengan sinar matahari memberikan warna yang lebih baik dibandingkan hasil metode pengeringan dengan oven. Bubuk terlihat masih berwarna hijau, sedangkan warna ekstrak airnya coklat pekat. Pada metode pengeringan dengan sinar matahari, sebelum dikeringkan di bawah sinar matahari daun terlebih dahulu dikeringanginkan untuk memberi kesempatan daun menutup stomatanya.

Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) menutupnya stomata pada daun merupakan suatu sistem yang alami pada tumbuhan untuk mencegah penguapan zat-zat yang terkandung dalam daun. Selain itu, pada metode pengeringan dengan sinar matahari daun tidak langsung terkena matahari, sehingga lebih sedikit panas yang menyebabkan terdegradasinya klorofil. Warna hijau ini menunjukkan bahwa dengan pengeringan matahari sampai kadar air 7% zat-zat hijau daun yang terkandung dalam daun kumis kucing masih banyak (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Senyawa fenol yang terkandung di dalam daun kumis kucing adalah orthosiphon glikosida, tanin, saponin, sapofonin, myoinositol dan sinensetin (Mahendra dan Fauzi 2005; Dalimartha 2000), polifenol yaitu polymethoxylated flavonoid dan turunan caffeic acid. (Olah et al. 2003). Identifikasi lebih lanjut menunjukkan adanya kandungan caffeic acid, cichoric acid, rosmarinic acid, sinensetin dan eupatorine. Selain itu menurut Loon et al. (2005) kumis kucing juga mengandung tiga jenis flavonoid yaitu sinensetin, eupatorin dan 3’-hydroxy-5,6,7,4’tetramethoxyflavone. Warna ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang berwarna coklat pekat kemungkinan karena adanya proses oksidasi selama

Sinar matahari

(1 g bubuk : 257 ml air)

Oven

Gambar 4 Bubuk daun kumis kucing

Gambar 5 Ekstrak air bubuk daun kumis kucing

(1 g bubuk : 257 ml air)

Oven

Sinar matahari

pengeringan, seperti halnya pada teh hitam menurut Rijken et al (2002) perubahan oksidatif yang terjadi selama produksi teh hitam menyebabkan perubahan catechin monomerik yang tidak berwarna menjadi flavonoid oligomerik yang berwarna oranye kekuningan dan merah kecoklatan. Pada pengeringan dengan sinar matahari kemungkinan terjadi proses oksidasi yang lebih lama sehingga memberi warna ekstrak yang berwarna merah kecoklatan. Hasil yang didapat pada metode pengeringan dengan oven terlihat warna bubuk kecoklatan dan warna ekstrak airnya coklat terang. Warna bubuk yang kecoklatan kemungkinan karena terdegradasinya klorofil karena pengeringan dengan oven. Warna ekstrak air daun kumis kucing yang dihasilkan dengan pengeringan dengan oven warnanya coklat terang. Hal ini kemungkinan karena dengan pengeringan oven selain suhunya yang relatif stabil juga tinggi yaitu 50oC, sehingga daun kumis kucing lebih cepat mencapai kadar air 7%, sehingga proses oksidasi senyawa-senyawa fenol yang terjadi lebih sedikit dibanding dengan daun yang dikeringkan dengan sinar matahari.

Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan

Analisa total fenol dilakukan untuk mengukur kandungan fenol dalam ekstrak air daun kumis kucing. Penggunaan asam tanat sebagai standar untuk menentukan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau berdasarkan reaksi reduksi asam fosfomolibdat oleh fenol dalam larutan alkali. Metode ini menentukan total gugus fenolik bebas dengan demikian juga menentukan total fenolik terlarut (Waterman dan Mole 1994).

Berdasarkan analisa kadar total fenol dan analisa aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk daun kumis kucing, terbukti bahwa kadar rataan total fenol dan aktivitas antioksidan ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang dikeringkan dengan sinar matahari lebih tinggi yaitu 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering sampel bila dibandingkan dengan yang dikeringkan dengan oven 16.918 + 0.123 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC sebesar 470.441 + 61.699 mM/g berat kering sampel (Tabel 3 dan 4).

Lampiran 15

Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak bunga knop.

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean N Mean Std. Deviation Std. Error

Lower Bound Upper Bound

Minimum Maximum

C1 3 1.01133 .082051 .047372 .80751 1.21516 .931 1.095

C2 3 1.07067 .122460 .070702 .76646 1.37487 .958 1.201

C4 3 .93767 .040501 .023383 .83706 1.03828 .894 .974

C8 3 .78033 .141599 .081752 .42858 1.13209 .670 .940

C1ConA 3 .76600 .013077 .007550 .73352 .79848 .757 .781

C2ConA 3 .73433 .053407 .030835 .60166 .86700 .691 .794

C4ConA 3 .69467 .037541 .021674 .60141 .78792 .654 .728

C8ConA 3 .58567 .040992 .023667 .48384 .68750 .562 .633

C1LPS 3 .91133 .084678 .048889 .70098 1.12168 .815 .974

C2LPS 3 .99733 .006807 .003930 .98042 1.01424 .992 1.005

C4LPS 3 .88567 .013577 .007839 .85194 .91939 .873 .900

C8LPS 3 .80667 .043844 .025314 .69775 .91558 .760 .847

C1PK 3 .98933 .023094 .013333 .93196 1.04670 .976 1.016

C2PK 3 .89267 .045764 .026422 .77898 1.00635 .842 .931

C4PK 3 .89633 .033975 .019616 .81193 .98073 .868 .934

C8PK 3 .71567 .084109 .048560 .50673 .92461 .620 .778

Total 4

8 .85473 .142439 .020559 .81337 .89609 .562 1.201

Multiple Comparisons

95% Confidence Interval

(I) perlakuan

(J)

perlakuan Mean Difference (I-J) Std. Error Sig.

Lower Bound Upper Bound

Tukey HSD 11 12 -.059333 .053895 .999 -.25918 .14051

13 .073667 .053895 .989 -.12618 .27351

14 .231000(*) .053895 .012 .03115 .43085

21 .245333(*) .053895 .006 .04549 .44518

22 .277000(*) .053895 .001 .07715 .47685

23 .316667(*) .053895 .000 .11682 .51651

24 .425667(*) .053895 .000 .22582 .62551

31 .100000 .053895 .877 -.09985 .29985

32 .014000 .053895 1.000 -.18585 .21385

33 .125667 .053895 .605 -.07418 .32551

34 .204667(*) .053895 .040 .00482 .40451

41 .022000 .053895 1.000 -.17785 .22185

42 .118667 .053895 .690 -.08118 .31851

43 .115000 .053895 .732 -.08485 .31485

44 .295667(*) .053895 .000 .09582 .49551

12 11 .059333 .053895 .999 -.14051 .25918

13 .133000 .053895 .516 -.06685 .33285

14 .290333(*) .053895 .001 .09049 .49018

21 .304667(*) .053895 .000 .10482 .50451

23 .376000(*) .053895 .000 .17615 .57585

24 .485000(*) .053895 .000 .28515 .68485

31 .159333 .053895 .243 -.04051 .35918

32 .073333 .053895 .989 -.12651 .27318

33 .185000 .053895 .094 -.01485 .38485

34 .264000(*) .053895 .002 .06415 .46385

41 .081333 .053895 .973 -.11851 .28118

42 .178000 .053895 .123 -.02185 .37785

43 .174333 .053895 .142 -.02551 .37418

44 .355000(*) .053895 .000 .15515 .55485

13 11 -.073667 .053895 .989 -.27351 .12618

12 -.133000 .053895 .516 -.33285 .06685

14 .157333 .053895 .259 -.04251 .35718

21 .171667 .053895 .157 -.02818 .37151

22 .203333(*) .053895 .043 .00349 .40318

23 .243000(*) .053895 .007 .04315 .44285

24 .352000(*) .053895 .000 .15215 .55185

31 .026333 .053895 1.000 -.17351 .22618

32 -.059667 .053895 .999 -.25951 .14018

33 .052000 .053895 1.000 -.14785 .25185

34 .131000 .053895 .540 -.06885 .33085

41 -.051667 .053895 1.000 -.25151 .14818

42 .045000 .053895 1.000 -.15485 .24485

43 .041333 .053895 1.000 -.15851 .24118

44 .222000(*) .053895 .018 .02215 .42185

14 11 -.231000(*) .053895 .012 -.43085 -.03115

12 -.290333(*) .053895 .001 -.49018 -.09049

13 -.157333 .053895 .259 -.35718 .04251

21 .014333 .053895 1.000 -.18551 .21418

22 .046000 .053895 1.000 -.15385 .24585

23 .085667 .053895 .959 -.11418 .28551

24 .194667 .053895 .063 -.00518 .39451

31 -.131000 .053895 .540 -.33085 .06885

32 -.217000(*) .053895 .023 -.41685 -.01715

33 -.105333 .053895 .832 -.30518 .09451

34 -.026333 .053895 1.000 -.22618 .17351

41 -.209000(*) .053895 .033 -.40885 -.00915

42 -.112333 .053895 .761 -.31218 .08751

43 -.116000 .053895 .721 -.31585 .08385

44 .064667 .053895 .997 -.13518 .26451

21 11 -.245333(*) .053895 .006 -.44518 -.04549

12 -.304667(*) .053895 .000 -.50451 -.10482

13 -.171667 .053895 .157 -.37151 .02818

14 -.014333 .053895 1.000 -.21418 .18551

22 .031667 .053895 1.000 -.16818 .23151

23 .071333 .053895 .992 -.12851 .27118

24 .180333 .053895 .113 -.01951 .38018

31 -.145333 .053895 .375 -.34518 .05451

33 -.119667 .053895 .678 -.31951 .08018

34 -.040667 .053895 1.000 -.24051 .15918

41 -.223333(*) .053895 .017 -.42318 -.02349

42 -.126667 .053895 .593 -.32651 .07318

43 -.130333 .053895 .548 -.33018 .06951

44 .050333 .053895 1.000 -.14951 .25018

22 11 -.277000(*) .053895 .001 -.47685 -.07715

12 -.336333(*) .053895 .000 -.53618 -.13649

13 -.203333(*) .053895 .043 -.40318 -.00349

14 -.046000 .053895 1.000 -.24585 .15385

21 -.031667 .053895 1.000 -.23151 .16818

23 .039667 .053895 1.000 -.16018 .23951

24 .148667 .053895 .340 -.05118 .34851

31 -.177000 .053895 .128 -.37685 .02285

32 -.263000(*) .053895 .002 -.46285 -.06315

33 -.151333 .053895 .314 -.35118 .04851

34 -.072333 .053895 .991 -.27218 .12751

41 -.255000(*) .053895 .004 -.45485 -.05515

42 -.158333 .053895 .251 -.35818 .04151

43 -.162000 .053895 .222 -.36185 .03785

44 .018667 .053895 1.000 -.18118 .21851

23 11 -.316667(*) .053895 .000 -.51651 -.11682

12 -.376000(*) .053895 .000 -.57585 -.17615

13 -.243000(*) .053895 .007 -.44285 -.04315

14 -.085667 .053895 .959 -.28551 .11418

21 -.071333 .053895 .992 -.27118 .12851

22 -.039667 .053895 1.000 -.23951 .16018

24 .109000 .053895 .796 -.09085 .30885

31 -.216667(*) .053895 .023 -.41651 -.01682

32 -.302667(*) .053895 .000 -.50251 -.10282

33 -.191000 .053895 .073 -.39085 .00885

34 -.112000 .053895 .765 -.31185 .08785

41 -.294667(*) .053895 .000 -.49451 -.09482

42 -.198000 .053895 .054 -.39785 .00185

43 -.201667(*) .053895 .046 -.40151 -.00182

44 -.021000 .053895 1.000 -.22085 .17885

24 11 -.425667(*) .053895 .000 -.62551 -.22582

12 -.485000(*) .053895 .000 -.68485 -.28515

13 -.352000(*) .053895 .000 -.55185 -.15215

14 -.194667 .053895 .063 -.39451 .00518

21 -.180333 .053895 .113 -.38018 .01951

22 -.148667 .053895 .340 -.34851 .05118

23 -.109000 .053895 .796 -.30885 .09085

31 -.325667(*) .053895 .000 -.52551 -.12582

32 -.411667(*) .053895 .000 -.61151 -.21182

33 -.300000(*) .053895 .000 -.49985 -.10015

34 -.221000(*) .053895 .019 -.42085 -.02115

41 -.403667(*) .053895 .000 -.60351 -.20382

43 -.310667(*) .053895 .000 -.51051 -.11082

44 -.130000 .053895 .552 -.32985 .06985

31 11 -.100000 .053895 .877 -.29985 .09985

12 -.159333 .053895 .243 -.35918 .04051

13 -.026333 .053895 1.000 -.22618 .17351

14 .131000 .053895 .540 -.06885 .33085

21 .145333 .053895 .375 -.05451 .34518

22 .177000 .053895 .128 -.02285 .37685

23 .216667(*) .053895 .023 .01682 .41651

24 .325667(*) .053895 .000 .12582 .52551

32 -.086000 .053895 .958 -.28585 .11385

33 .025667 .053895 1.000 -.17418 .22551

34 .104667 .053895 .838 -.09518 .30451

41 -.078000 .053895 .981 -.27785 .12185

42 .018667 .053895 1.000 -.18118 .21851

43 .015000 .053895 1.000 -.18485 .21485

44 .195667 .053895 .060 -.00418 .39551

32 11 -.014000 .053895 1.000 -.21385 .18585

12 -.073333 .053895 .989 -.27318 .12651

13 .059667 .053895 .999 -.14018 .25951

14 .217000(*) .053895 .023 .01715 .41685

21 .231333(*) .053895 .012 .03149 .43118

22 .263000(*) .053895 .002 .06315 .46285

23 .302667(*) .053895 .000 .10282 .50251

24 .411667(*) .053895 .000 .21182 .61151

31 .086000 .053895 .958 -.11385 .28585

33 .111667 .053895 .768 -.08818 .31151

34 .190667 .053895 .074 -.00918 .39051

41 .008000 .053895 1.000 -.19185 .20785

42 .104667 .053895 .838 -.09518 .30451

43 .101000 .053895 .869 -.09885 .30085

44 .281667(*) .053895 .001 .08182 .48151

33 11 -.125667 .053895 .605 -.32551 .07418

12 -.185000 .053895 .094 -.38485 .01485

13 -.052000 .053895 1.000 -.25185 .14785

14 .105333 .053895 .832 -.09451 .30518

21 .119667 .053895 .678 -.08018 .31951

22 .151333 .053895 .314 -.04851 .35118

23 .191000 .053895 .073 -.00885 .39085

24 .300000(*) .053895 .000 .10015 .49985

31 -.025667 .053895 1.000 -.22551 .17418

32 -.111667 .053895 .768 -.31151 .08818

34 .079000 .053895 .979 -.12085 .27885

41 -.103667 .053895 .847 -.30351 .09618

42 -.007000 .053895 1.000 -.20685 .19285

43 -.010667 .053895 1.000 -.21051 .18918

44 .170000 .053895 .167 -.02985 .36985

34 11 -.204667(*) .053895 .040 -.40451 -.00482

13 -.131000 .053895 .540 -.33085 .06885

14 .026333 .053895 1.000 -.17351 .22618

21 .040667 .053895 1.000 -.15918 .24051

22 .072333 .053895 .991 -.12751 .27218

23 .112000 .053895 .765 -.08785 .31185

24 .221000(*) .053895 .019 .02115 .42085

31 -.104667 .053895 .838 -.30451 .09518

32 -.190667 .053895 .074 -.39051 .00918

33 -.079000 .053895 .979 -.27885 .12085

41 -.182667 .053895 .103 -.38251 .01718

42 -.086000 .053895 .958 -.28585 .11385

43 -.089667 .053895 .942 -.28951 .11018

44 .091000 .053895 .935 -.10885 .29085

41 11 -.022000 .053895 1.000 -.22185 .17785

12 -.081333 .053895 .973 -.28118 .11851

13 .051667 .053895 1.000 -.14818 .25151

14 .209000(*) .053895 .033 .00915 .40885

21 .223333(*) .053895 .017 .02349 .42318

22 .255000(*) .053895 .004 .05515 .45485

23 .294667(*) .053895 .000 .09482 .49451

24 .403667(*) .053895 .000 .20382 .60351

31 .078000 .053895 .981 -.12185 .27785

32 -.008000 .053895 1.000 -.20785 .19185

33 .103667 .053895 .847 -.09618 .30351

34 .182667 .053895 .103 -.01718 .38251

42 .096667 .053895 .901 -.10318 .29651

43 .093000 .053895 .924 -.10685 .29285

44 .273667(*) .053895 .001 .07382 .47351

42 11 -.118667 .053895 .690 -.31851 .08118

12 -.178000 .053895 .123 -.37785 .02185

13 -.045000 .053895 1.000 -.24485 .15485

14 .112333 .053895 .761 -.08751 .31218

21 .126667 .053895 .593 -.07318 .32651

22 .158333 .053895 .251 -.04151 .35818

23 .198000 .053895 .054 -.00185 .39785

24 .307000(*) .053895 .000 .10715 .50685

31 -.018667 .053895 1.000 -.21851 .18118

32 -.104667 .053895 .838 -.30451 .09518

33 .007000 .053895 1.000 -.19285 .20685

34 .086000 .053895 .958 -.11385 .28585

41 -.096667 .053895 .901 -.29651 .10318

43 -.003667 .053895 1.000 -.20351 .19618

44 .177000 .053895 .128 -.02285 .37685

43 11 -.115000 .053895 .732 -.31485 .08485

12 -.174333 .053895 .142 -.37418 .02551

13 -.041333 .053895 1.000 -.24118 .15851

14 .116000 .053895 .721 -.08385 .31585

21 .130333 .053895 .548 -.06951 .33018

23 .201667(*) .053895 .046 .00182 .40151

24 .310667(*) .053895 .000 .11082 .51051

31 -.015000 .053895 1.000 -.21485 .18485

32 -.101000 .053895 .869 -.30085 .09885

33 .010667 .053895 1.000 -.18918 .21051

34 .089667 .053895 .942 -.11018 .28951

41 -.093000 .053895 .924 -.29285 .10685

42 .003667 .053895 1.000 -.19618 .20351

44 .180667 .053895 .111 -.01918 .38051

44 11 -.295667(*) .053895 .000 -.49551 -.09582

12 -.355000(*) .053895 .000 -.55485 -.15515

13 -.222000(*) .053895 .018 -.42185 -.02215

14 -.064667 .053895 .997 -.26451 .13518

21 -.050333 .053895 1.000 -.25018 .14951

22 -.018667 .053895 1.000 -.21851 .18118

23 .021000 .053895 1.000 -.17885 .22085

24 .130000 .053895 .552 -.06985 .32985

31 -.195667 .053895 .060 -.39551 .00418

32 -.281667(*) .053895 .001 -.48151 -.08182

33 -.170000 .053895 .167 -.36985 .02985

34 -.091000 .053895 .935 -.29085 .10885

41 -.273667(*) .053895 .001 -.47351 -.07382

42 -.177000 .053895 .128 -.37685 .02285

43 -.180667 .053895 .111 -.38051 .01918

* The mean difference is significant at the .05 level.

Keterangan :

11 C2

12 C4

13 C8

21 C2+ConA

22 C4+ConA

23 C8+ConA

31 C2+LPS

32 C4+LPS

33 C8+LPS

41 C2+PK

42 C4+PK

43 C8+PK