Penyisipan gen fitase pada genome beberapa kultivar tebu, regenerasi, ekspresi, dan aklimatisasi
PENYISIPAN GEN FITASE PADA GENOME BEBERAPA
KULTIVAR TEBU, REGENERASI, EKSPRESI DAN
AKLIMATISASI
Oleh
SUSIYANTI
A361030111
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ‘Penyisipan gen fitase pada
genome beberapa kultivar tebu, regenerasi, ekspresi dan aklimatisasi’ belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebut dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juli 2008
Susiyanti
NIM A361030111
ABSTRACT
SUSIYANTI. Insertion of phytase gene into genome of sugarcane cultivars,
regeneration,
expression and acclimatization.
Under supervision of
G.A. WATTIMENA, DWI ANDREAS SANTOSA, MEMEN SURAHMAN,
AND AGUS PURWITO.
Sugarcane (Saccharum officinarum L.) is one of the important crops
grown in marginal land in Indonesia. Phosphorus (P) is critical to the growth and
development of plant in the marginal land. P is stored in plant as phytic acid
(myo-inositolhexakisphosphate). Phytic acid is hydrolyzed by the activity of
phytases to yield inositol and free phosphate. Genus Sacharum has low phytase
activity, so it needs phytase gene insertion from other source. Genetic
transformation of sugarcane holds promise to provide enough P during period of
rapid cell division and growth of plant. The efficient insertion of phytase gene
from other source requires plant transformation process through Agrobacterium
tumefaciens. Plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens, has
become the most used method for the introduction foreign genes into plant cells
and the sub sequens regeneration of transgenic plant. Successfulness of
transformation process depends on regeneration, transformation, gene expression,
and methode of acclimatization.
In vitro culture technique is needed to multiply clones of transgenic
sugarcane. As the first step in many tissue culture experiment, it is necesssary to
induce callus formation from the primary explant before regenerating to be
plantlets. In general sugarcane transformed lines show chlorophyll content and
leaf colour such as albino, discloration, lack of chlorophyll in the particular spot
of leaves. The abnormal leaves showed low chloprophyll content. To increase
the chlorophyll content of sugarcane transgenic line can be treated with
putrescine. At the moment there is no data about the expression of phytase gene
in form of phytase activity and its effect to phosphate and chloprophyll content in
sugarcane. The transformed sugarcane plantlets should be able to acclimatize to
field condition.
The appropriate callus induction from 3 clones of sugarcane was observed
on medium containing 3 mg l-1 2.4 D. Shoot of sugarcane has able to induce by
using modified MS medium + kinetin (0.1 mg l-1) + BAP (0.5; 1.0 ; 1.5; 2.0
mg l-1). Shoot started with the appeareance of green dot on callus within a week
on regeneration medium. The best shootlet medium of three clones of sugarcane
was MS + kinetin (0.1 mg l-1) + BAP (1.5 mg l-1). The best rooting medium of
three clones of sugarcane was MS + kinetin (0.1 mg l-1) + IBA (1.0 mg l-1).
The research showed that callus of putative transgenic line can survive
under 150 mgl-1 kanamycin medium. The efficiency regeneration of putative
transgenic line cv. Triton, cv. PSJT 94-41, and cv. PA 175 were succesively
30 %; 25 %; and 30 %. Efficiency transformation of putative transgenic line
were: cv. Triton = 21 %; cv. PSJT 94-41= 15 %; and cv. PA 175= 24 %. The
analyzed of integrated phytase gene was proven by the appearance of 900 bp of
PCR band.
Concentration of 3.64 x 10 –4 M putrescine yielded a optimum chlorophyll
content of three lines tested, where the total chlorophyll content increased at
above 28 % compare to the controll lines.
The result indicated that the increasing of phytate concentration in culture
media would increase phytase activity and P total in plantlet. Expression of
phytase activity in sugarcane, signifincantly improved phosphorus absorption and
chlorophyll content. Phytase activities in plant of the transgenic sugarcane were
increased 67.04-75.40 %. Data showed that several transgenic varieties can
increase P content in plant (2-29 %) and total chlorophyll.
From three transformed lines tested, two lines (cv. PSJT 94-41 and cv. PA
175) with green leaves grew well in the field condition, in contrary, the yellow
leaves (cv. Triton) did not show similar result. The transformed line grew slowly
in the first seven day after planting, however it grew normally in the next growing
period. Total chlorophyll, chlorophyll a and chlorophyll b were (cv. PS 851)
increased as the phytase activity increase.
Key words: Sugarcane, Agrobacterium tumefaciens, expression, phytase gene
and, acclimatization.
RINGKASAN
SUSIYANTI. Penyisipan gen fitase pada genome beberapa kultivar tebu,
regenerasi,
ekspresi
dan
aklimatisasinya.
Dibimbing
oleh
G.A. WATTIMENA, DWI ANDREAS SANTOSA, MEMEN SURAHMAN,
DAN AGUS PURWITO.
Tebu (Saccharum officinarum L.) merupakan komoditas utama yang
banyak ditanaman dilahan marginal di Indonesia. Phosphor (P) merupakan unsur
yang menjadi faktor pembatas dalam pertumbuhan tanaman di lahan marginal. P
disimpan tanaman dalam bentuk asam fitat (myo-inositolhexakisphosphate).
Asam fitat dihidrolisis oleh fitase menjadi inositol dan P yang dapat digunakan
tanaman. Genus Sacharum memiliki aktivitas fitase yang rendah, sehingga perlu
penyisipan gen fitase dari sumber lain. Guna mendapatkan tanaman yang
memiliki kecukupan P selama proses pembelahan sel dan pertumbuhannya dapat
dilakukan melalui transformasi genetik. Transformasi melalui Agrobacterium
tumefaciens, merupakan metode yang paling sering digunakan untuk
mengintroduksi gen asing ke dalam tanaman dan diregenerasikan sehingga
menghasilkan tanaman transgenik. Proses transformasi yang berhasil harus
melalui tahap regenerasi, transfrormasi, ekspresi gen, dan aklimatisasinya.
Salah satu metode yang banyak digunakan untuk perbanyakan klonal tebu
transgenik adalah melalui kultur jaringan. Langkah pertama dalam kultur jaringan
adalah menginduksi pembentukan kalus dari eksplan, sebelum diregenerasikan
menjadi plantlet. Pada umumnya tebu hasil transformasi menunjukkan variasi
kandungan klorofil berupa warna daun albino, kuning, hijau muda, hijau belang
putih, dan hijau.
Pembentukkan daun yang abnormal mengindikasikan
kandungan klorofil yang rendah. Guna meningkatkan klorofil tanaman tebu hasil
transformasi dapat dilkukan dengan penambahan putresina. Saat ini belum ada
informasi secara lengkap mengenai ekspresi gen fitase berupa aktivitas fitase dan
pengaruhnya terhadap kadar P dan klorofil tebu. Selanjutnya, tanaman tebu hasil
transformasi perlu diaklimatisasi pada kondisi di lapangan.
Pembentukan kalus yang sesuai terdapat pada media yang mengandung 3
mg l-1 2.4 D. Pembentukan tunas tebu dengan menggunakan media MS + kinetin
(0.1 mg l-1) + BAP (0.5; 1.0 ; 1.5; 2.0 mg l-1). Tunas mulai terbentuk dengan
munculnya noktah hijau pada kalus setelah seminggu dalam media regenerasi.
Media perakaran yang terbaik untuk 3 kultivar tebu terdapat pada media MS +
kinetin (0,1 mg l-1) + BAP (1.5 mg l-1). Media perakaran yang terbaik untuk 3
kultivar tebu adalah MS + kinetin (0,1 mg l-1) + IBA (1.0 mg l-1). Hasil penelitian
menunjukkan kalus transgenik putatif dapat bertahan hidup pada media 150 mgl-1
kanamisin. Efisiensi regenerasi transgenik putatif: cv. Triton = 30 %; cv. PSJT
94-41= 25 %; dan cv. PA 175= 30 %. Efisiensi transformasi transgenik putatif
cv. Triton = 21 %; cv. PSJT 94-41= 15 %; dan cv. PA 175= 24 %. Analisa
integrasi gen fitase ditunjukkan dengan pemunculan pita PCR 900 bp.
Putresina 3.64 x 10 –4 M merupakan konsentrasi optimum untuk
peningkatan kadar klorofil 3 kultivar tebu yang diuji. Peningkatan total klorofil
berkisar 28 % bila dibandingkan dengan tebu kontrol. Peningkatan konsentrasi
fitat dalam media akan meningkatkan P total dalam plantlet. Ekspresi berupa
aktivitas fitase tebu secara signifikan meningkatkan absorbsi fosfor dan kadar
klorofil tanaman. Aktivitas fitase tanaman tebu hasil transformasi meningkat
67.04-75.40 %. Data juga menunjukkan beberapa kultivar yang ditransformasi
memiliki peningkatan kadar P tanaman (2-29 %) dan total klorofil.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dua dari tiga kultivar (hasil
transformasi) yang diuji (cv. PSJT 94-41 and cv. PA 175) dengan daun hijau
dapat tumbuh di lapangan, tetapi tidak pada tebu dengan daun kuning (cv. Triton).
Tebu hasil transformasi mulanya tumbuh lambat pada 7 hari pertama, kemudian
tumbuh normal pada periode berikutnya. Total klorofil a dan klorofil b pada tebu
cv. PS 851 ditemukan meningkat sejalan dengan peningkatan aktivitas fitase.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2008
Hak cipta dilindungi
1 Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber:
a Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penyusunan laporan, penulisan
kritik atau tujuan suatu masalah
b Pengutipan tidak merugikan kepentingan wajar Institut Pertanian
Bogor
2 Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
PENYISIPAN GEN FITASE PADA GENOME BEBERAPA
KULTIVAR TEBU, REGENERASI, EKSPRESI DAN
AKLIMATISASI
Oleh
SUSIYANTI
A361030111
DISERTASI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
Penguji pada Ujian Tertutup : Dr Ir Darda Efeni, MSc
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr Ir Gatot Irianto, MS
Dr Ir Desta Wirnas, MSi
Judul Disertasi
: Penyisipan gen fitase pada genome beberapa kultivar tebu,
regenerasi, ekspresi dan aklimatisasi
Nama
:
Susiyanti
NIM
:
A361030111
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir G.A. Wattimena, MSc
Ketua
Dr Ir Dwi Andreas Santosa, MSc
Anggota
Dr Ir Memen Surahman, MSc
Anggota
Dr Ir Agus Purwito, MSc
Anggota
Mengetahui,
Ketua Program Studi
Agronomi
Dr Ir Munif Ghulamahdi, MS
Tanggal ujian: 25 Agustus 2008
Dekan Sekolah Pasca Sarjana
Prof Dr Ir Khairil Anwar Notodiputro, MS
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis merupakan anak kedua dari lima bersaudara yang lahir
pada
tanggal 11 Maret 1971 di Manggopoh (Kabupaten Agam, Sumatera Barat)
dari pasangan: Ayahanda dr. Martibas Mara dan Ibunda Arnellys Arlina.
Pendidikan Sekolah Dasar Negeri I (Teladan) diselesaikan di Kotabumi
(Lampung Utara) pada tahun 1984, Sekolah Menengah Pertama Negeri 2 pada
tahun 1987 dan Sekolah Menengah Atas Negeri 2
Tanjungkarang.
pada tahun 1990 di
Tahun 1996 penulis mendapatkan gelar Sarjana Pertanian dari
Universitas Lampung pada Jurusan Budidaya Pertanian dengan Program Studi
Agronomi. Tahun 2000 penulis mendapatkan gelas Magister Pertanian pada
program Pascasarjana Universitas Andalas (Program Studi Agronomi dengan
Pemusatan: Pemulian Tanaman). Pada tahun 2000 penulis bekerja sebagai dosen
Yayasan Universitas Tamansiswa, Padang.
Pada tahun 2003 penulis tercatat
sebagai mahasiswa S3 Sekolah Pascasarjana IPB pada program Studi Agronomi
(Pemusatan: Pemulian Tanaman dan Bioteknologi) dengan dana BPPS. Pada
tahun 2005 penulis diterima menjadi dosen PNS pada Universitas Sultan Ageng
Tirtayasa (Untirta), Serang, Banten.
Karya ilmiah dengan judul: ’Transformasi gen fitase pada beberapa klon
tebu melalui Agrobacterium tumefaciens GV 2260 dengan plasmid pBin dan
pMA’, telah disajikan pada Seminar Nasional Bioteknologi dan Pemuliaan
Tanaman tanggal 1-2 Agustus 2006. Sebuah artikel dengan judul: ’Transformasi
tanaman tebu (cv. PSJT 94-41) dengan gen fitase menggunakan Agrobacterium
tumefaciens GV 2260 (pBinPI-IIEC)’, diterbitkan pada Jurnal Buletin Agronomi,
Vol. XXXV, No. Desember 2007. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari
S3 penulis.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis persembahkan kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan karunia-Nya sehingga penulis dapat menulis disertasi ini. Disertasi
ini adalah sebagai salah satu syarat untuk untuk memperoleh gelar Doktor pada
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian dilakukan pada bulan September 2004 sampai dengan
Desember 2007 di Laboratorium Bioteknologi-Kultur Jaringan-Departemen
Agronomi dan Hortikultura, IPB; Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi
PPLH, IPB; Laboratorium Saraswanti Indo-Genetech (SIG), Bogor; serta
Laboratorium Indonesia Center for Biodiversity and Biotecnology (ICBB),
Situgede-Bogor.
Penulis ingin mengungkapkan terimakasih yang setulus-tulusnya kepada:
Bapak Prof Ir G.A. Wattimena, MSc sebagai Ketua Komisi Pembimbing, Bapak
Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, MSc selaku
pembimbing dan telah memberi
kesempatan berpartisipasi dalam penelitian yang didanai RAPID; Bapak Dr Ir
Memen Surahman, MSc dan
Dr Ir Agus Purwito, MSc selaku anggota komisi
pembimbing yang telah memberikan bantuan dan pengarahan. Juga penulis tak
lupa mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Ir Nurul Khumaida, MSc selaku
penguji di luar komisi pada ujian prakualifikasi program Doktor.
Ucapan
terimakasih juga diucapkan untuk Dr Ir Darda Efendi, MSc selaku penguji di luar
komisi pada ujian tertutup, juga untuk Dr Ir Gatot Irianto, MS dan Dr Ir Desta
Wirnas, MSi selaku penguji di luar komisi pembimbing pada Ujian Terbuka.
Ucapan terimakasih dihaturkan juga Dr Ir Munif Ghulamahdi, MS selaku Ketua
Program Studi Agronomi, serta Bapak dan Ibu Dosen yang telah memberikan
ilmu dan bimbingan selama menuntut ilmu yang tidak bisa penulis sebutkan satu
persatu. Terimakasih untuk bapak Adhi yang telah membantu dalam pengolahan
statistik.
Terima kasih juga dihaturkan kepada pihak Dikti yang telah
memberikan beasiswa BPPS serta Rektor Unitas dan Untirta beserta staf dan
karyawannya. Ucapan terima kasih juga untuk Reni, Ade, Uli, Neni, Nana, Dian,
teteh Tati, Salma, Mbak Lastri, Mbak Ayi, Mas Iwan, Mas Putra dan Adek-adek
kost untuk bantuan dan persahabatannya selama ini, serta Gandi Kungkung, Bang
Andi atas persaudaraannya yang telah memberikan dukungan. Mama dan Papa
atas kasih sayang beliau yang tak akan terbalas, serta Uni Meri, Evi, Nela, Rini,
Slamet, dan Kintan, Ega, Alika, Aza, Ica, Kevin dan Uda Al (Alm.) atas segala
bentuk perhatian dan kasih sayang yang diberikan.
Semoga ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan dan menjadi
amal saleh bagi semua pihak yang terkait dengannya. Amin.
Bogor, Agustus 2008
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ....................................................................................................
i
DAFTAR TABEL ............................................................................................
iii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
iv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................
vi
I PENDAHULUAN ........................................................................................
1
Latar Belakang ....................................................................................
Tujuan Penelitian ................................................................................
Manfaat Penelitian ..............................................................................
1
6
7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA.....................................................................
8
Tanaman tebu ......................................................................................
Kultur jaringan tebu dan poliamin ......................................................
Peranan phosphor pada pertumbuhan Tanaman .................................
Fitat dan fitase .....................................................................................
Plasmid dan gene cassette ..................................................................
Transformasi gen.................................................................................
Analisis PCR .......................................................................................
8
10
15
16
20
22
24
BAB III REGENERASI TEBU SECARA IN VITRO ....................................
27
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
27
29
31
34
52
BAB IV PENYISIPAN GEN FITASE PADA TANAMAN TEBU
MELALUI Agrobacterium tumefaciens GV 2260............................
.
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
53
53
55
57
61
77
Halaman
BAB V PENINGKATAN KLOROFIL PLANTLET
TEBU HASIL TRANSFORMASI DENGAN
PEMBERIAN PUTRESINA...............................................................
78
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
77
79
81
82
90
BAB VI .EKSPRESI GEN FITASE PADA BEBERAPA KULTIVAR
TEBU HASIL TRANSFORMASI ...................................................
89
Abstrak ................................................................................................. 90
Pendahuluan ........................................................................................ 93
Bahan dan Metode ............................................................................... 94
Hasil dan Pembahasan ......................................................................... 97
Simpulan .............................................................................................. 113
BAB VII AKLIMATISASI PLANTLET TEBU HASIL
TRANSFORMASI ........................................................................... 115
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
115
116
118
119
129
BAB VIII PEMBAHASAN UMUM .............................................................. 130
BAB IX SIMPULAN DAN SARAN.............................................................. 135
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 138
LAMPIRAN ..................................................................................................... 145
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap pdiameter kalus beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah tanam. .................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap persentase membentuk
kalus ..beberapa kultivar ...tebu secara in vitro usia 6 minggu
setelah tanam. .......................................................................................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap struktur dan warna kalus..
beberapa kultivar ...tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah
tanam ....................................................................................................
37
Rata-rata pengaruh pemberian BAP terhadap jumlah tunas .
kultivar .tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam. ................
40
Pengaruh pemberian BAP terhadap tinggi tunas .kultivar tebu
secara in . vitro usia 4 minggu setelah tanam ......................................
43
Pengaruh pemberian BAP terhadap persentase pembentukan
tunas ..beberapa....kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu
setelah tanam . ......................................................................................
44
Pengaruh pemberian IBA terhadap jumlah akar..beberapa kultivar
tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam ...............................
47
Pengaruh pemberian IBA terhadap panjang akar ..beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam . ................
48
34
35
9
Pengaruh pemberian IBA terhadap persentase membentuk
akar beberapa..kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu
setelah tanam ........................................................................................
10 Data rata-rata lamanya kalus bertahan hidup dalam media
kanamisin (mg ml-1). ..........................................................................
63
11 Data rata-rata persentase kalus hidup, lamanya kalus bertahan
hidup serta struktur dan bentuk kalus dalam media kanamisin............
65
12 Struktur dan warna kalus dalam media seleksi kanamisin
usia 4 minggu setelah tanam. ...............................................................
67
13 Jumlah dan persentase kalus resisten, jumlah kalus bergenerasi,
Efisiensi regenerasi, efisiensi transformasi, pada tanaman tebu. .........
69
14 Aktivitas fitase dan PCR plantlet non transgenik dan transgenik
putatif. ..................................................................................................
74
15 Rata-rata pengaruh putresina terhadap pembentukan klorofil
plantlet tebu transgenik usia 4 minggu setelah tanam. .........................
83
50
Halaman
16 Rata-rata pengaruh putresina terhadap klorofil b plantlet
tebu .transgenik usia 4 minggu setelah tanam. .....................................
84
17 Rata-rata pengaruh putresina terhadap total klorofil
plantlet tebu transgenik usia 4 minggu setelah tanam. ........................
85
18 Data pengaruh pemberian fitat terhadap aktivitas fitase,
P total plantlet tebu. .............................................................................
97
19 Rata-rata pengaruh pemberian fitat terhadap P total plantlet
tebu. ......................................................................................................
99
20 Peningkatan P total dan aktivitas fitase tebu transgenik ....................
dibanding non transgenik yang dikulturkan selama 1 minggu....................
pada media yang diberi fitat .................................................................
108
21 Data pengaruh pemberian fitat terhadap kadar klorofil plantlet ...................
tebu yang dikulturkan dalam media fitat . ...........................................
110
22 Data pengamatan pada tebu transgenik yang diaklimatisasi
selama .28 hari .....................................................................................
120
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Halaman
Skema alur penelitian ’transformasi regenerasi, ekspresi
aklimatisasi beberapa kultivar tebu yang disisipi gen fitase bakteri ....
7
Biosintesis poliamina, metabolisme, fungsi dan
interaksi dengan etilen .......................................................................
13
Struktur fitat .........................................................................................
17
Lintasan biosintesis fitat.......................................................................
17
Skema sintesis dan penyimpanan fitin .................................................
18
Sekuen reaksi fitase dengan substrat
myo-inositol heksakisphosphate ...........................................................
18
Konstruksi gene cassette pBinPI-IIEC. ...............................................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap diameter kalus
beberapa kultivar tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah tanam. ..
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap persentase membentuk kalus
beberapa kultivar ...tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah
tanam. ..................................................................................................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap pertumbuhan kalus beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah tanam .................
Struktur dan bentuk kalus tebu.............................................................
Rata-rata pengaruh konsentrasi BAP terhadap jumlah
tunas kultivar .tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam........
Perkembangan eksplan tebu menjadi tunas..........................................
Pengaruh pemberian BAP terhadap tinggi tunas .kultivar tebu
secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam tanam. .............................
Pengaruh pemberian BAP terhadap persentase pembentukan
tunas beberapa....kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu
setelah. ..................................................................................................
Pengaruh pemberian BAP terhadap pertumbuhan tunas beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam ..................
Pengaruh pemberian IBA terhadap pertumbuhan akar beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam ..................
Pengaruh pemberian IBA terhadap panjang akar ..beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam. ................
Pengaruh pemberian IBA terhadap pertumbuhan akar beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam. .................
20 Kalus beberapa kultivar tebu yang dikulturkan dalam media
Kanamisin usia 4 minggu .....................................................................
21 Rata-rata lamanya kalus bertahan hidup pada media kanamisin
(mg ml-1) ..............................................................................................
22 Rata-rata persentase kalus hidup dalam media kanamisin. .................
22
35
36
38
39
41
42
43
45
46
48
49
51
62
64
66
23 Kalus hasil transformasi (usia 4 minggu) yang dikulturkan
dalam media kanamisin 150 mgl-1 .......................................................
68
Halaman
24 Penampilan tunas tebu transgenik putatif . ..........................................
25 Hasil elektroforesis PCR tebu (cv. PSJT 944-41)
dengan primer spesifik EC1 dan EC3 . ................................................
26 Grafik pengaruh putresina terhadap klorofil a plantlet
tebu.transgenik usia 4 minggu setelah tanam. ...................................
27 Penampilan plantlet tebu transgenik dalam media MS yang diberi
.konsentrasi putresina berbeda usia 4 minggu setelah tanam...............
28 Hubungan antara total klorofil dengan klorofil a pada ....tebu
transgenik yang ditanam pada media yang diberi putresina usia
4 minggu ..setelah tanam....................................................................
29 Hubungan antara total klorofil dengan klorofil b pada ..tebu
transgenik .yang ditanam pada media yang diberi putresina usia
4 minggu setelah tanam........................................................................
30 Grafik pengaruh pemberian fitat terhadap aktivitas fitase ...
plantlet tebu ..........................................................................................
31 Grafik hubungan antara pengaruh pemberian fitat terhadap P......
total plantlet tebu.transgenik dan nn transgenik .................................
32 Pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap pertumbuhan
plantlet tebu ..........................................................................................
33 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap
aktivitas fitase plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan
transgenik .............................................................................................
34 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap
aktivitas fitase transgenik dan non transgenik .....................................
71
73
83
86
87
88
98
100
101
103
103
35 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media
terhadap.aktivitas fitase plantlet tebu cv. PA 175 transgenik
dan non transgenik ...............................................................................
104
36 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan .....
dan non transgenik ...............................................................................
105
37 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan .....
plantlet tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan non transgenik .........
105
38 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan .....
plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan non transgenik. ..................
106
39 P yang diserap oleh plantlet tebu putatif transgenik dan non .........
trangenik usia 1 minggu setelah tanaman pada media fitat. ................
107
.......
40 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam
jaringan plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan..transgenik ............
yang ditanam pada media fitat .............................................................
111
41 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam ...........
jaringan ..plantlet tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan. ...........
transgenik ..putatif ..yang ditanam pada media fitat. ..........................
111
42 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam..........
jaringan plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan..transgenik. ..........
yang ditanam pada media fitat. ..........................................................
112
43 Aklimatisasi tebu transgenik cv. PSJT 94-41 ......................................
122
Halaman
44 Aklimatisasi tebu transgenik cv. PA 175 .............................................
45 Aklimatisasi tebu transgenik cv. PS 851 ..............................................
46 Korelasi antara aktivitas fitase dan klorofil a tebu transgenik ................
(cv. PS ....851) di lapangan ................................................................
47 Korelasi antara aktivitas fitase dan klorofil b tebu transgenik
(cv. PS 851) di lapangan ......................................................................
48 Korelasi antara aktivitas fitase dan total klorofil tebu transgenik...........
(cv. PS 851) di lapangan. ....................................................................
123
125
126
126
127
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi bahan kimia dan media yang digunakan
dalam penelitian .................................................................................. 145
2 Pembuatan media kultur...................................................................... 147
3 Analisis kandungan klorofil ................................................................ 148
4 Deskripsi dan morfologi kultivar tebu ................................................ 149
5 Analisis sidik ragam ............................................................................ 152
6 Glossary (istilah umum yang digunakan dalam disertasi) .................. 164
I PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman tebu Saccharum officinarum L. merupakan tanaman industri
yang memiliki peran penting, karena 65% produksi gula dunia berasal dari tebu.
Tebu banyak digunakan sebagai bahan industri farmasi, sumber bahan bakar dan
produksi beberapa bahan kimia seperti furfural, dekstran, pakan ternak, industri
selulosa dan alkohol. Banyaknya produk yang memerlukan tebu sebagai bahan
baku, mengakibatkan permintaan akan komoditas tebu juga terus meningkat.
Gambaran kebutuhan gula nasional adalah sebesar 3 juta ton pada tahun 2002, dan
yang dapat dipenuhi hanya 1.7 juta ton gula dari produksi dalam negeri, sehingga
sisanya harus diimpor (Pakpahan dan Supriono, 2005).
Luas areal penanaman tebu pada tahun 1930 adalah 196.529 ha dengan
hablur 14.80 ton ha-1, yang bisa menghasilkan total gula 2.907.078 ton. Tahun
2002 dengan luas areal tanam 360.767.9 ha dan hablur
4.8 ton ha-1 hanya
menghasilkan 1.735.131.02 ton gula (Pakpahan dan Supriono 2005). Tahun 1999
dengan luas lahan tebu: 342.211 ha, produksi tebu Indonesia hanya 62.5 ton ha-1,
dengan hablur 4.36 ton ha-1 dan rendemen 6.97 % (Basuki, 2000).
Tebu
sebenarnya memiliki potensi untuk ditingkatkan rendemennya menjadi 8-10%.
Rendahnya rendemen tebu tersebut disebabkan penggunaan kultivar tebu yang
telah mengalami degenerasi klonal atau peluruhan
genetik. Kultivar Triton
(yang digunakan dalam penelitian ini) merupakan kultivar yang diintroduksi dari
Australia
(Subarkat et al. 1988).
Penanaman tebu cv. Triton di Indonesia
mencapai 1438 ha, dengan produksi tebu 39.8 ton ha-1, dengan rendemen 6.31
serta hablur 2.51 ton ha-1 (Tjokrodirjo 2000). Tebu cv. PSJT 94-41 merupakan
klon tebu harapan koleksi P3GI dan belum dilepaskan (Hermono, komunikasi
pribadi 3 Desember 2007). Demikian pula halnya dengan tebu cv. PA 175 yang
merupakan klon koleksi Puslitagro PT Rajawali II, Cirebon.
Konversi lahan tebu dari lahan basah ke lahan kering turut memberikan
andil dalam rendahnya produksi tebu di Indonesia. Pada lahan kering umumnya
ketersediaan P rendah (P terikat).
Penggunaan lahan kering ini membawa
konsekuensi membutuhkan pupuk P yang lebih banyak. Kebutuhan P untuk
2
tanaman tebu tergantung jenis tanah dan kultivar yang digunakan. Berdasarkan
hasil penelitian Glaz et al. (1997) dan Chen et al. (2002) rata-rata kultivar tebu
dapat menyerap rata-rata 8.5 kg P ha-1 di tanah pertanian di Florida dan sekitar 3085 % P tebu diambil dari tanah dalam bentuk P organik. Bentuk P organik dalam
tanah (Buckman dan Brady 1982; Anas et al. 1992) maupun dalam tanaman
terfiksasi dalam bentuk fitat yang sukar digunakan oleh tanaman (Greiner 2005a).
Defisiensi P pada tanaman tebu akan menurunkan produksi tebu dan gula,
hal ini sejalan dengan penelitian Pawirosemadi (1980) yang membuktikan adanya
korelasi yang positif antara kandungan hara P2O5 dalam daun terhadap hasil dan
hablur gula tebu. Fungsi P adalah sebagai komponen penyusun struktur molekul
asam nukleat (DNA, RNA), gula fosfat (metabolisme intermediet tanaman),
nukleotida (ATP, CTP, UTP, GTP,TTP), koenzim, fosfolipid (membran sel).
Umumnya, Pi dalam banyak reaksi merupakan substrat dan atau produk yang
dihasilkan. Pi mengontrol beberapa reaksi enzim, serta penting dalam lintasan
metabolik di sitoplasma dan kloroplas (Marschner 1995).
Fitat (inositolhexakisphosphate, IP6) merupakan sumber fosfat dalam
tanaman yang mencapai lebih dari 80 % dari total fosfor pada tanaman sereal dan
legum (Keruvuo et al. 2000). Fitat diduga terkait dengan penyimpanan energi dan
inisiasi dormansi pada benih. Sintesis fitat berlangsung saat pengisian biji dan
berhenti saat fase awal perkecambahan, namun peranannya pada jaringan tanaman
non reproduksi belum jelas.
P yang terdapat dalam fitat sukar untuk digunakan tanaman (Greiner
2005a) dan baru dapat dilepaskan bila ada aktivitas enzim fitase. Namun tidak
semua tanaman dapat menghasilkan fitase.
Beberapa jenis tanaman yang
diketahui dapat menghasilkan fitase adalah kacang hijau, kedelai, gandum, dan
padi (Kyriakidis et al. 1998). Aktivitas fitase pada tanaman tebu (cv. PSJT 9433, cv. PA 183, dan cv. Triton) secara alami sangat rendah yaitu kurang lebih
0.01 U/ml (Wulandari 2005). Guna menghasilkan tebu dengan aktivitas fitase
yang tinggi, maka perlu dilakukan rekayasa secara genetika melalui donor lain
selain genus dan spesies dari Saccharum. Transfer gen dari donor yang tidak satu
spesies telah umum dilakukan secara non konvensional seperti fusi protoplas, fusi
mikroprotoplas, transformasi dengan menggunakan vektor (virus, Agrobacterium)
3
dan tanpa vektor (misalnya: elektroforasi, biolistik, serat silikon, makro dan mikro
injeksi, dan sonifikasi).
Upaya perbaikan genetik pada tanaman tebu secara konvensional sulit
dilakukan karena tingginya tingkat poliploid tanaman tebu (Gilbert et al. 2005).
Dengan pertimbangan tersebut, maka lebih menjanjikan bila upaya perbaikan
genetik dilakukan melalui rekayasa genetika,
misalnya dengan transformasi.
Proses transformasi dengan mediasi Agrobacterium tumefaciens paling sering
digunakan untuk memasukan gen asing ke dalam sel tanaman dengan tingkat
keberhasilan dan kestabilan gen yang tinggi (Riva et al. 1999). Teknik
transformasi Agrobacterium memiliki keunggulan, antara lain (1) efisiensi
transformasi dengan salinan gen tunggal lebih tinggi dan (2) dapat dilakukan
dengan peralatan laboratorium yang sederhana. Gen dengan salinan tunggal lebih
mudah dianalisa dan biasanya bersegregasi mengikuti pola pewarisan Mendel
(Rahmawati 2006).
Keberhasilan transformasi Agrobacterium masih terbatas
pada genotipe tanaman tertentu. Saat ini transformasi pada tanaman monokotil
(seperti tebu) sangat mungkin untuk dilakukan. Keberhasilan transformasi pada
jaringan meristem tebu terkait dengan laju kemampuan bertahan hidup dari sel
target (Riva et al 1999). Santosa et al. (2004a), telah berhasil mengembangkan
suatu metode yang tepat untuk transformasi gen fitase pada tanaman tebu dengan
menggunakan Agrobacterium tumefaciens GV 2260.
Beberapa peneliti dari IPB telah berhasil menyisipkan gen fitase asal bakteri
dengan
menggunakan
metode
Santosa
(2004a)
melalui
Agrobacterium
tumefaciens GV 2260 (pBin1-ECS) pada kultivar tebu cv.PSJT 9443, cv. PA 183
cv. Triton (Wulandari 2005), cv. CB 6979, dan cv. PA 183 (Hayatyzul 2007).
Penyisipan gen fitase melalui Agrobacterium
tumefaciens GV2260 dengan
konstruksi gene cassette berbeda yaitu pBinPI-IIEC juga telah dilakukan pada
tebu cv. PSJT 94-33, cv. BR 194 (Ananda 2004), cv. PSJT 94-33, cv.PSJT 94-41,
cv. PA117 (Pesik 2005), dan cv. PS 851 (Nurhasanah 2007).
Penyisipan gen fitase ini diharapkan mampu menghasilkan enzim yang
dapat mengubah fitat dalam jaringan maupun di sekitar perakaran menjadi fosfat
yang dapat digunakan tumbuhan. Coello et al. (2001) telah berhasil
mengintroduksikan gen fitase dari E. coli ke dalam genom Arabidopsis sehingga
4
kadar fitat dalam tanaman menjadi rendah. P tersedia yang meningkat dalam
tanaman diharapkan dapat
meningkatkan laju fotosintesis, serta berpengaruh
positif dalam proses pembentukan klorofil.
Keberhasilan penyisipan gen fitase ini dapat dideteksi secara dini dengan
menggunakan PCR. Ananda (2004) dan Nurhasanah (2007) telah melaporkan
pada tebu cv. PSJT 94-33, cv. BR 194; dan cv. PS 851 yang ditransformasi
Agrobacterium
tumefaciens GV2260 dengan konstruksi gene cassette pBinPI-
IIEC dapat dideteksi dengan PCR yang menghasilkan pita ukuran 900 bp dengan
primer EC1 dan EC3.
Tanaman tebu yang berhasil disisipi gen fitase diharapkan dapat
mengekpresikan aktivitas fitase yang tinggi. Penelitian mengenai ekspresi gen
fitase pada tanaman tebu yang telah disisipi gen fitase belum banyak diketahui.
Ini merupakan pijakan penting untuk mengetahui ekspresi gen fitase pada
beberapa kultivar tanaman tebu hasil transformasi.
Ekspresi berupa aktivitas
enzim fitase akan memberikan pengaruh langsung terhadap kadar P total dalam
jaringan tanaman plantlet tebu dan juga berpengaruh terhadap pembentukan
klorofil.
Selama ini regenerasi kalus tebu transforman yang disisipi gen fitase
umumnya menghasilkan plantlet yang memiliki kandungan klorofil sedikit bahkan
albino. Hasil regenerasi yang menghasilkan plantlet yang berwarna hijau hanya
sedikit. Dewi (2003) menyatakan pemberian poliamina (seperti: putresina) ke
dalam media kultur dapat meningkatkan regenerasi kalus menjadi tanaman hijau
pada kultur antera tanaman padi. Hal tersebut menjadi pertimbangan dan
diharapkan terjadi peningkatan tanaman hijau pada tebu hasil transformasi dengan
penambahan poliamina.
Plantlet tansgenik yang diperoleh pada akhirnya dilakukan aklimatisasi pada
lingkungan yang sesuai. Banyak faktor yang mempengaruhi keberhasilan dalam
aklimatisasi ini, seperti kadar klorofil plantlet, vigor plantlet, kelembaban, suhu,
dan lain-lain. Setiap individu memiliki kemampuan adaptasi terhadap lingkungan
baru yang berbeda. Diharapkan dengan metode aklimatisasi yang tepat, maka
tebu-tebu transgenik tersebut dapat tumbuh dan berkembang di lapangan.
5
Dengan mempertimbangkan latar belakang di atas, maka diperlukan suatu
penelitian yang lebih mendalam bagi pengembangan sistem regenerasi tanaman
tebu secara in vitro yang merupakan target transformasi, metode dan teknik yang
tepat dalam melakukan transformasi, serta aklimatisasi yang tepat bagi tebu
transgenik di lapangan.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian secara umum adalah untuk memperoleh tanaman tebu
yang memiliki aktivitas fitase yang tinggi dari gen fitase yang disisipkan melalui
proses transformasi. Tujuan penelitian secara khusus adalah: (1) mengembangkan
dan mempelajari regenerasi tanaman tebu secara in vitro yang meliputi induksi
dan multiplikasi kalus, inisiasi dan multiplikasi tunas, induksi perakaran dengan
pemberian ZPT yang tepat; (2) mempelajari dan mengkaji proses transformasi
beberapa kultivar tebu yang disisipi gen fitase bakteri melalui Agrobacterium
tumefacens GV 2260 (pBinPI-IIEC), serta mendeteksi keberadaan gen yang
disisipkan dengan PCR; (3) mengkaji dan mempelajari pengaruh putresina
terhadap kadar klorofil plantlet tebu hasil transformasi; (4) mengkaji aktivitas
fitase serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan kadar klorofil plantlet tebu
hasil transformasi; serta (5) mengembangkan dan mempelajari teknik aklimatisasi
plantlet tebu hasil transformasi serta ekspresinya di lapangan.
Manfaat Penelitian
Secara umum manfaat penelitian ini adalah memperoleh tanaman tebu
transgenik yang memiliki aktivitas fitase yang tinggi. Manfaat penelitian secara
khusus adalah: (1) memberikan informasi berupa respon 3 kultivar tebu terhadap
pemberian ZPT yang tepat untuk menginduksi pembentukan kalus, tunas, dan
akar tebu,
serta interaksi antara kultivar dan konsentrasi yang diberikan;
(2) memberikan kontribusi dalam bentuk sumber plasma nutfah yang berharga
bagi pemuliaan tanaman bila berhasil mendapatkan tanaman tebu yang
mengekspresikan aktivitas fitase tinggi; (3) mengetahui perbedaan variasi antara
tebu transgenik dan non transgenik; dan (4) diharapkan tanaman tebu hasil
transformasi tersebut dapat menjadi klon unggul.
6
Alur pemikiran
Hal yang menjadi alur pemikiran penelitian ini adalah:
(1) Salah satu masalah utama dalam perpindahan penanaman tebu dari lahan
basah ke lahan kering adalah keterikatan P. Keterikatan P bukan saja
terdapat pada tanah tetapi juga pada jaringan tanaman.
(2) Enzim fitase dapat melepaskan keterkaitan P baik pada lingkungan rizosfer
maupun pada jaringan tanaman
(3) Tanaman tebu dari genu Saccharum mempunyai aktivitas fitase yang
rendah sehingga perlu peningkatan enzim fitase melalui penyisipan gen
fitase yang berasl dari sumber lain
(4) Penyisipan gen fitase yang efisien dari sumber lain memerlukan proses
transformasi tanaman melalui Agrobacterium tumefaciens
(5) Proses transformasi yang berhasil harus melalui tahap regenerasi,
transformasi, ekspresi gen, dan aklimatisasi
(6) Kegagalan aklimatisasi tanaman tebu transgenik disebabkan oleh
albinisme atau kekurangan klorofil.
Strategi Penelitian
Berdasarkan alur penelitian tersebut, maka disusun strategi penelitian
sebagai berikut:
(1) Regenerasi tebu secara in vitro.
(2) Penyisipan gen fitase pada tanaman tebu melalui Agrobacterium
tumefaciens GV 2260.
(3) Peningkatan klorofil plantlet tebu hasil transformasi dengan menggunakan
putresina.
(4) Ekspresi gen fitase pada beberapa kultivar tebu hasil transformasi
(5) Aklimatisasi plantlet tebu hasil transformasi.
Adapun strategi yang dilakukan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.
I.
Regenerasi
tebu secara in
vitro
Tujuan:
Mengkaji
konsentrasi ZPT
1 mengkaji
konsentrasi
2.4 D yang
terbaik untuk
pembentukan
kalus
2 mengkaji
konsentrasi
BAP
yang
terbaik untuk
pembentukan
tunas
3 mengkaji
konsentrasi
IBA
yang
terbaik untuk
pembentukan
akar
Output: kalus dan
plantlet
tebu
untuk
materi
penelitian
dan
informasi
ZPT
yang tepat untuk
regenerasi tebu
transgenik
dan
non transgenik
7
II. Transformasi tanaman tebu dengan gen fitase bakteri
melalui Agrobacterium tumefaciens GV 2260 (pBINPIIIEC)
Tujuan:
1 menguji konsentrasi kanamisin sebagai penanda tebu
transforman
2 mempelajari dan mengkaji proses transformasi
3 mendeteksi integrasi gen fitase dalam genom tebu.
Output: kalus transgenik putatif
Plantlet transgenik putatif
III.
Peningkatan klorofil plantlet
transformasi dengan pemberian putresina
tebu hasil
Tujuan:
meningkatkan klorofil tanaman
transformasi dengan menggunakan putresina.
tebu
hasil
Output :
Plantlet tebu transgenik putatif dengan klorofil yang baik
IV. Ekspresi gen fitase bakteri pada beberapa kultivar
tebu hasil transformasi.
Tujuan: mengkaji aktivitas fitase plantlet tebu hasil
transformasi serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan
kadar klorofil
Output: Informasi ekspresi gen fitase tebu transgenik putatif
V. Aklimatisasi plantlet tebu hasil transformasi.
Tujuan:
1 mengkaji dan mempelajari aklimatisasi tebu hasil
transformasi gen fitase bakteri
2 mengevaluasi ekspresi gen dan kadar klorofil tebu
transgenik putatif di lapangan
Output:
Tanaman tebu transgenik putatif dan informasi
ekspresi gen fitase bakteri di lapangan
Tujuan:
1 Mengembangkan dan mempelajari regenerasi tanaman tebu secara in vitro (induksi
dan multiplikasi kalus, inisiasi dan multiplikasi tunas, induksi perakaran ) dengan
pemberian ZPT yang tepat
2 Mempelajari dan mengkaji proses transformasi beberapa kultivar tebu yang disisipi
gen fitase bakteri melalui Agrobacterium tumefacens GV 2260 (pBinPI-IIEC), serta
mendeteksi keberadaan gen yang disisipkan;
3 Mengkaji dan mempelajari pengaruh putresina terhadap kadar klorofil plantlet tebu
hasil transformasi
4 Mengkaji aktivitas fitase serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan kadar
klorofil plantlet tebu hasil transformasi
5 Mengembangkan dan mempelajari teknik aklimatisasi plantlet tebu hasil
transformasi serta ekspresinya di lapangan.
Gambar 1 .Skema strategi penelitian ’Penyisipan gen fitase pada genome beberapa
kultivar tebu, regenerasi, ekspresi dan aklimatisasinya’.
8
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Tebu
Tanaman tebu (Saccharum officinarum) dibudidayakan sebagai tanaman
komersial pada hampir 60 negara di dunia. Negara penghasil tebu utama adalah
Brazil, Cuba, Fiji, India, Indonesia, Mauritius dan Amerika. Tanaman tebu
diklasifikasikan
ke dalam famili Graminae; kelompok Andropogone; genus:
Saccharum. Hanya 3 genus dari 5 genus Saccharum yang dibudidayakan yaitu:
(1) S. officinarum (yang merupakan penghasil gula utama); (2) S. sinensis, (3) S.
barberi, dan wild type terdapat 2 genus yaitu: (4) S. spontaneum, dan (5) S.
robustum. Tebu dari genus S. sinensis, S. barberi, dan S. spontaneum memiliki
kadar gula sedang hingga rendah (Naik 2001).
Pusat asal dan perkembangan tebu dunia diduga berada di New Guinea
dan pulau-pulau di sekitar Indonesia untuk S. officinarum dan S. robustum; di
India sampai ke perbatasan Utara-Timur China dan Myanmar untuk S.
spontaneum dan kerabat rerumputan lainnya seperti Erianthus sp., Sclerostachya
sp., Narenga sp. dan sebagainya (Sugiyarta 1993). Naik (2001) mengemukakan
bahwa India adalah asal dari tebu-tebu yang dibudidayakan di Indonesia. Kata
‘sakara’ yang berarti gula berasal dari Bahasa Sansekerta telah ada dalam catatan
Budha pada 500 tahun SM.
Guna memperoleh genotipe baru dalam program pemuliaan tanaman tebu
sangat tergantung pada rekombinasi dan segregasi progeni dari individu
heterosigot. Tanaman tebu merupakan allopoliploid dengan n = 5,6,7,8,9
(Hetharie 2003). Berdasarkan penelitian para ahli, di India ditemukan tanaman
tebu oktoploid (2n = 80) dengan jumlah dasar x = 10 kromosom yang merupakan
hasil persilangan tipe liar Sclerostahya fusca dengan Saccharum officinarum.
Kultivar tebu modern adalah aneuploids dan memiliki jumlah kromosom 100125 dimana 5-10% merupakan hasil persilangan kerabat liar S. spontaneum dan
S. officinarum (Alexander 1973).
Awalnya, kultivar-kultivar dari spesies S. officinarum merupakan kultivar
yang banyak digunakan
untuk memproduksi sebagian besar gula di dunia.
9
Stevenson pada tahun 1965 menyatakan bahwa sel somatik akar tebu S.
officinarum ditemukan sekitar 80 kromosom.
Kromosom pada S. robustum
terdiri dari 2 tipe yaitu berkromosom 60 dan 80. Sementara tebu-tebu komersial
umumnya memiliki jumlah kromosom 80 – 120. Diduga kromosom dasar genus
Saccharum adalah 10 (Alexander 1973).
Total produktivitas gula Indonesia yang berasal dari tebu pada tahun 2002
yaitu 5.01 gula ton ha-1 (Pakpahan dan Supriono 2005), dan menurut BPS (2004)
produktivitas tebu di Indonesia rata-rata 5.5 gula ton ha-1. Produktivitas tersebut
masih memiliki potensi untuk dapat ditingkatkan menjadi 14.1 ton ha-1 (Pakpahan
dan Supriono 2005).
Penelitian dan pemanfaatan plasma nutfah tebu di Indonesia mulai
dilakukan sejak tahun 1888 ketika ledakan serangan penyakit sereh. Kultivar
Kasoer yang merupakan hasil persilangan alami S. officinarum dan S. spontaneum
yang memiliki keunggulan toleran terhadap penyakit sereh tersebut. Nobilasi
tebu-tebu komersial berasal dari S. officinarum dengan S. spontaneum dan atau S.
robustum. Sejak tahun 1888 sampai tahun 1960, Indonesia sangat t
KULTIVAR TEBU, REGENERASI, EKSPRESI DAN
AKLIMATISASI
Oleh
SUSIYANTI
A361030111
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ‘Penyisipan gen fitase pada
genome beberapa kultivar tebu, regenerasi, ekspresi dan aklimatisasi’ belum
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebut dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juli 2008
Susiyanti
NIM A361030111
ABSTRACT
SUSIYANTI. Insertion of phytase gene into genome of sugarcane cultivars,
regeneration,
expression and acclimatization.
Under supervision of
G.A. WATTIMENA, DWI ANDREAS SANTOSA, MEMEN SURAHMAN,
AND AGUS PURWITO.
Sugarcane (Saccharum officinarum L.) is one of the important crops
grown in marginal land in Indonesia. Phosphorus (P) is critical to the growth and
development of plant in the marginal land. P is stored in plant as phytic acid
(myo-inositolhexakisphosphate). Phytic acid is hydrolyzed by the activity of
phytases to yield inositol and free phosphate. Genus Sacharum has low phytase
activity, so it needs phytase gene insertion from other source. Genetic
transformation of sugarcane holds promise to provide enough P during period of
rapid cell division and growth of plant. The efficient insertion of phytase gene
from other source requires plant transformation process through Agrobacterium
tumefaciens. Plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens, has
become the most used method for the introduction foreign genes into plant cells
and the sub sequens regeneration of transgenic plant. Successfulness of
transformation process depends on regeneration, transformation, gene expression,
and methode of acclimatization.
In vitro culture technique is needed to multiply clones of transgenic
sugarcane. As the first step in many tissue culture experiment, it is necesssary to
induce callus formation from the primary explant before regenerating to be
plantlets. In general sugarcane transformed lines show chlorophyll content and
leaf colour such as albino, discloration, lack of chlorophyll in the particular spot
of leaves. The abnormal leaves showed low chloprophyll content. To increase
the chlorophyll content of sugarcane transgenic line can be treated with
putrescine. At the moment there is no data about the expression of phytase gene
in form of phytase activity and its effect to phosphate and chloprophyll content in
sugarcane. The transformed sugarcane plantlets should be able to acclimatize to
field condition.
The appropriate callus induction from 3 clones of sugarcane was observed
on medium containing 3 mg l-1 2.4 D. Shoot of sugarcane has able to induce by
using modified MS medium + kinetin (0.1 mg l-1) + BAP (0.5; 1.0 ; 1.5; 2.0
mg l-1). Shoot started with the appeareance of green dot on callus within a week
on regeneration medium. The best shootlet medium of three clones of sugarcane
was MS + kinetin (0.1 mg l-1) + BAP (1.5 mg l-1). The best rooting medium of
three clones of sugarcane was MS + kinetin (0.1 mg l-1) + IBA (1.0 mg l-1).
The research showed that callus of putative transgenic line can survive
under 150 mgl-1 kanamycin medium. The efficiency regeneration of putative
transgenic line cv. Triton, cv. PSJT 94-41, and cv. PA 175 were succesively
30 %; 25 %; and 30 %. Efficiency transformation of putative transgenic line
were: cv. Triton = 21 %; cv. PSJT 94-41= 15 %; and cv. PA 175= 24 %. The
analyzed of integrated phytase gene was proven by the appearance of 900 bp of
PCR band.
Concentration of 3.64 x 10 –4 M putrescine yielded a optimum chlorophyll
content of three lines tested, where the total chlorophyll content increased at
above 28 % compare to the controll lines.
The result indicated that the increasing of phytate concentration in culture
media would increase phytase activity and P total in plantlet. Expression of
phytase activity in sugarcane, signifincantly improved phosphorus absorption and
chlorophyll content. Phytase activities in plant of the transgenic sugarcane were
increased 67.04-75.40 %. Data showed that several transgenic varieties can
increase P content in plant (2-29 %) and total chlorophyll.
From three transformed lines tested, two lines (cv. PSJT 94-41 and cv. PA
175) with green leaves grew well in the field condition, in contrary, the yellow
leaves (cv. Triton) did not show similar result. The transformed line grew slowly
in the first seven day after planting, however it grew normally in the next growing
period. Total chlorophyll, chlorophyll a and chlorophyll b were (cv. PS 851)
increased as the phytase activity increase.
Key words: Sugarcane, Agrobacterium tumefaciens, expression, phytase gene
and, acclimatization.
RINGKASAN
SUSIYANTI. Penyisipan gen fitase pada genome beberapa kultivar tebu,
regenerasi,
ekspresi
dan
aklimatisasinya.
Dibimbing
oleh
G.A. WATTIMENA, DWI ANDREAS SANTOSA, MEMEN SURAHMAN,
DAN AGUS PURWITO.
Tebu (Saccharum officinarum L.) merupakan komoditas utama yang
banyak ditanaman dilahan marginal di Indonesia. Phosphor (P) merupakan unsur
yang menjadi faktor pembatas dalam pertumbuhan tanaman di lahan marginal. P
disimpan tanaman dalam bentuk asam fitat (myo-inositolhexakisphosphate).
Asam fitat dihidrolisis oleh fitase menjadi inositol dan P yang dapat digunakan
tanaman. Genus Sacharum memiliki aktivitas fitase yang rendah, sehingga perlu
penyisipan gen fitase dari sumber lain. Guna mendapatkan tanaman yang
memiliki kecukupan P selama proses pembelahan sel dan pertumbuhannya dapat
dilakukan melalui transformasi genetik. Transformasi melalui Agrobacterium
tumefaciens, merupakan metode yang paling sering digunakan untuk
mengintroduksi gen asing ke dalam tanaman dan diregenerasikan sehingga
menghasilkan tanaman transgenik. Proses transformasi yang berhasil harus
melalui tahap regenerasi, transfrormasi, ekspresi gen, dan aklimatisasinya.
Salah satu metode yang banyak digunakan untuk perbanyakan klonal tebu
transgenik adalah melalui kultur jaringan. Langkah pertama dalam kultur jaringan
adalah menginduksi pembentukan kalus dari eksplan, sebelum diregenerasikan
menjadi plantlet. Pada umumnya tebu hasil transformasi menunjukkan variasi
kandungan klorofil berupa warna daun albino, kuning, hijau muda, hijau belang
putih, dan hijau.
Pembentukkan daun yang abnormal mengindikasikan
kandungan klorofil yang rendah. Guna meningkatkan klorofil tanaman tebu hasil
transformasi dapat dilkukan dengan penambahan putresina. Saat ini belum ada
informasi secara lengkap mengenai ekspresi gen fitase berupa aktivitas fitase dan
pengaruhnya terhadap kadar P dan klorofil tebu. Selanjutnya, tanaman tebu hasil
transformasi perlu diaklimatisasi pada kondisi di lapangan.
Pembentukan kalus yang sesuai terdapat pada media yang mengandung 3
mg l-1 2.4 D. Pembentukan tunas tebu dengan menggunakan media MS + kinetin
(0.1 mg l-1) + BAP (0.5; 1.0 ; 1.5; 2.0 mg l-1). Tunas mulai terbentuk dengan
munculnya noktah hijau pada kalus setelah seminggu dalam media regenerasi.
Media perakaran yang terbaik untuk 3 kultivar tebu terdapat pada media MS +
kinetin (0,1 mg l-1) + BAP (1.5 mg l-1). Media perakaran yang terbaik untuk 3
kultivar tebu adalah MS + kinetin (0,1 mg l-1) + IBA (1.0 mg l-1). Hasil penelitian
menunjukkan kalus transgenik putatif dapat bertahan hidup pada media 150 mgl-1
kanamisin. Efisiensi regenerasi transgenik putatif: cv. Triton = 30 %; cv. PSJT
94-41= 25 %; dan cv. PA 175= 30 %. Efisiensi transformasi transgenik putatif
cv. Triton = 21 %; cv. PSJT 94-41= 15 %; dan cv. PA 175= 24 %. Analisa
integrasi gen fitase ditunjukkan dengan pemunculan pita PCR 900 bp.
Putresina 3.64 x 10 –4 M merupakan konsentrasi optimum untuk
peningkatan kadar klorofil 3 kultivar tebu yang diuji. Peningkatan total klorofil
berkisar 28 % bila dibandingkan dengan tebu kontrol. Peningkatan konsentrasi
fitat dalam media akan meningkatkan P total dalam plantlet. Ekspresi berupa
aktivitas fitase tebu secara signifikan meningkatkan absorbsi fosfor dan kadar
klorofil tanaman. Aktivitas fitase tanaman tebu hasil transformasi meningkat
67.04-75.40 %. Data juga menunjukkan beberapa kultivar yang ditransformasi
memiliki peningkatan kadar P tanaman (2-29 %) dan total klorofil.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dua dari tiga kultivar (hasil
transformasi) yang diuji (cv. PSJT 94-41 and cv. PA 175) dengan daun hijau
dapat tumbuh di lapangan, tetapi tidak pada tebu dengan daun kuning (cv. Triton).
Tebu hasil transformasi mulanya tumbuh lambat pada 7 hari pertama, kemudian
tumbuh normal pada periode berikutnya. Total klorofil a dan klorofil b pada tebu
cv. PS 851 ditemukan meningkat sejalan dengan peningkatan aktivitas fitase.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2008
Hak cipta dilindungi
1 Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber:
a Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan
karya ilmiah, penyusunan laporan, penyusunan laporan, penulisan
kritik atau tujuan suatu masalah
b Pengutipan tidak merugikan kepentingan wajar Institut Pertanian
Bogor
2 Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
PENYISIPAN GEN FITASE PADA GENOME BEBERAPA
KULTIVAR TEBU, REGENERASI, EKSPRESI DAN
AKLIMATISASI
Oleh
SUSIYANTI
A361030111
DISERTASI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008
Penguji pada Ujian Tertutup : Dr Ir Darda Efeni, MSc
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr Ir Gatot Irianto, MS
Dr Ir Desta Wirnas, MSi
Judul Disertasi
: Penyisipan gen fitase pada genome beberapa kultivar tebu,
regenerasi, ekspresi dan aklimatisasi
Nama
:
Susiyanti
NIM
:
A361030111
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir G.A. Wattimena, MSc
Ketua
Dr Ir Dwi Andreas Santosa, MSc
Anggota
Dr Ir Memen Surahman, MSc
Anggota
Dr Ir Agus Purwito, MSc
Anggota
Mengetahui,
Ketua Program Studi
Agronomi
Dr Ir Munif Ghulamahdi, MS
Tanggal ujian: 25 Agustus 2008
Dekan Sekolah Pasca Sarjana
Prof Dr Ir Khairil Anwar Notodiputro, MS
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis merupakan anak kedua dari lima bersaudara yang lahir
pada
tanggal 11 Maret 1971 di Manggopoh (Kabupaten Agam, Sumatera Barat)
dari pasangan: Ayahanda dr. Martibas Mara dan Ibunda Arnellys Arlina.
Pendidikan Sekolah Dasar Negeri I (Teladan) diselesaikan di Kotabumi
(Lampung Utara) pada tahun 1984, Sekolah Menengah Pertama Negeri 2 pada
tahun 1987 dan Sekolah Menengah Atas Negeri 2
Tanjungkarang.
pada tahun 1990 di
Tahun 1996 penulis mendapatkan gelar Sarjana Pertanian dari
Universitas Lampung pada Jurusan Budidaya Pertanian dengan Program Studi
Agronomi. Tahun 2000 penulis mendapatkan gelas Magister Pertanian pada
program Pascasarjana Universitas Andalas (Program Studi Agronomi dengan
Pemusatan: Pemulian Tanaman). Pada tahun 2000 penulis bekerja sebagai dosen
Yayasan Universitas Tamansiswa, Padang.
Pada tahun 2003 penulis tercatat
sebagai mahasiswa S3 Sekolah Pascasarjana IPB pada program Studi Agronomi
(Pemusatan: Pemulian Tanaman dan Bioteknologi) dengan dana BPPS. Pada
tahun 2005 penulis diterima menjadi dosen PNS pada Universitas Sultan Ageng
Tirtayasa (Untirta), Serang, Banten.
Karya ilmiah dengan judul: ’Transformasi gen fitase pada beberapa klon
tebu melalui Agrobacterium tumefaciens GV 2260 dengan plasmid pBin dan
pMA’, telah disajikan pada Seminar Nasional Bioteknologi dan Pemuliaan
Tanaman tanggal 1-2 Agustus 2006. Sebuah artikel dengan judul: ’Transformasi
tanaman tebu (cv. PSJT 94-41) dengan gen fitase menggunakan Agrobacterium
tumefaciens GV 2260 (pBinPI-IIEC)’, diterbitkan pada Jurnal Buletin Agronomi,
Vol. XXXV, No. Desember 2007. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari
S3 penulis.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis persembahkan kehadirat Allah SWT yang telah
melimpahkan karunia-Nya sehingga penulis dapat menulis disertasi ini. Disertasi
ini adalah sebagai salah satu syarat untuk untuk memperoleh gelar Doktor pada
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian dilakukan pada bulan September 2004 sampai dengan
Desember 2007 di Laboratorium Bioteknologi-Kultur Jaringan-Departemen
Agronomi dan Hortikultura, IPB; Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi
PPLH, IPB; Laboratorium Saraswanti Indo-Genetech (SIG), Bogor; serta
Laboratorium Indonesia Center for Biodiversity and Biotecnology (ICBB),
Situgede-Bogor.
Penulis ingin mengungkapkan terimakasih yang setulus-tulusnya kepada:
Bapak Prof Ir G.A. Wattimena, MSc sebagai Ketua Komisi Pembimbing, Bapak
Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa, MSc selaku
pembimbing dan telah memberi
kesempatan berpartisipasi dalam penelitian yang didanai RAPID; Bapak Dr Ir
Memen Surahman, MSc dan
Dr Ir Agus Purwito, MSc selaku anggota komisi
pembimbing yang telah memberikan bantuan dan pengarahan. Juga penulis tak
lupa mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Ir Nurul Khumaida, MSc selaku
penguji di luar komisi pada ujian prakualifikasi program Doktor.
Ucapan
terimakasih juga diucapkan untuk Dr Ir Darda Efendi, MSc selaku penguji di luar
komisi pada ujian tertutup, juga untuk Dr Ir Gatot Irianto, MS dan Dr Ir Desta
Wirnas, MSi selaku penguji di luar komisi pembimbing pada Ujian Terbuka.
Ucapan terimakasih dihaturkan juga Dr Ir Munif Ghulamahdi, MS selaku Ketua
Program Studi Agronomi, serta Bapak dan Ibu Dosen yang telah memberikan
ilmu dan bimbingan selama menuntut ilmu yang tidak bisa penulis sebutkan satu
persatu. Terimakasih untuk bapak Adhi yang telah membantu dalam pengolahan
statistik.
Terima kasih juga dihaturkan kepada pihak Dikti yang telah
memberikan beasiswa BPPS serta Rektor Unitas dan Untirta beserta staf dan
karyawannya. Ucapan terima kasih juga untuk Reni, Ade, Uli, Neni, Nana, Dian,
teteh Tati, Salma, Mbak Lastri, Mbak Ayi, Mas Iwan, Mas Putra dan Adek-adek
kost untuk bantuan dan persahabatannya selama ini, serta Gandi Kungkung, Bang
Andi atas persaudaraannya yang telah memberikan dukungan. Mama dan Papa
atas kasih sayang beliau yang tak akan terbalas, serta Uni Meri, Evi, Nela, Rini,
Slamet, dan Kintan, Ega, Alika, Aza, Ica, Kevin dan Uda Al (Alm.) atas segala
bentuk perhatian dan kasih sayang yang diberikan.
Semoga ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan dan menjadi
amal saleh bagi semua pihak yang terkait dengannya. Amin.
Bogor, Agustus 2008
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ....................................................................................................
i
DAFTAR TABEL ............................................................................................
iii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
iv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................
vi
I PENDAHULUAN ........................................................................................
1
Latar Belakang ....................................................................................
Tujuan Penelitian ................................................................................
Manfaat Penelitian ..............................................................................
1
6
7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA.....................................................................
8
Tanaman tebu ......................................................................................
Kultur jaringan tebu dan poliamin ......................................................
Peranan phosphor pada pertumbuhan Tanaman .................................
Fitat dan fitase .....................................................................................
Plasmid dan gene cassette ..................................................................
Transformasi gen.................................................................................
Analisis PCR .......................................................................................
8
10
15
16
20
22
24
BAB III REGENERASI TEBU SECARA IN VITRO ....................................
27
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
27
29
31
34
52
BAB IV PENYISIPAN GEN FITASE PADA TANAMAN TEBU
MELALUI Agrobacterium tumefaciens GV 2260............................
.
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
53
53
55
57
61
77
Halaman
BAB V PENINGKATAN KLOROFIL PLANTLET
TEBU HASIL TRANSFORMASI DENGAN
PEMBERIAN PUTRESINA...............................................................
78
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
77
79
81
82
90
BAB VI .EKSPRESI GEN FITASE PADA BEBERAPA KULTIVAR
TEBU HASIL TRANSFORMASI ...................................................
89
Abstrak ................................................................................................. 90
Pendahuluan ........................................................................................ 93
Bahan dan Metode ............................................................................... 94
Hasil dan Pembahasan ......................................................................... 97
Simpulan .............................................................................................. 113
BAB VII AKLIMATISASI PLANTLET TEBU HASIL
TRANSFORMASI ........................................................................... 115
Abstrak .................................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan ..............................................................................................
115
116
118
119
129
BAB VIII PEMBAHASAN UMUM .............................................................. 130
BAB IX SIMPULAN DAN SARAN.............................................................. 135
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 138
LAMPIRAN ..................................................................................................... 145
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap pdiameter kalus beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah tanam. .................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap persentase membentuk
kalus ..beberapa kultivar ...tebu secara in vitro usia 6 minggu
setelah tanam. .......................................................................................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap struktur dan warna kalus..
beberapa kultivar ...tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah
tanam ....................................................................................................
37
Rata-rata pengaruh pemberian BAP terhadap jumlah tunas .
kultivar .tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam. ................
40
Pengaruh pemberian BAP terhadap tinggi tunas .kultivar tebu
secara in . vitro usia 4 minggu setelah tanam ......................................
43
Pengaruh pemberian BAP terhadap persentase pembentukan
tunas ..beberapa....kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu
setelah tanam . ......................................................................................
44
Pengaruh pemberian IBA terhadap jumlah akar..beberapa kultivar
tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam ...............................
47
Pengaruh pemberian IBA terhadap panjang akar ..beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam . ................
48
34
35
9
Pengaruh pemberian IBA terhadap persentase membentuk
akar beberapa..kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu
setelah tanam ........................................................................................
10 Data rata-rata lamanya kalus bertahan hidup dalam media
kanamisin (mg ml-1). ..........................................................................
63
11 Data rata-rata persentase kalus hidup, lamanya kalus bertahan
hidup serta struktur dan bentuk kalus dalam media kanamisin............
65
12 Struktur dan warna kalus dalam media seleksi kanamisin
usia 4 minggu setelah tanam. ...............................................................
67
13 Jumlah dan persentase kalus resisten, jumlah kalus bergenerasi,
Efisiensi regenerasi, efisiensi transformasi, pada tanaman tebu. .........
69
14 Aktivitas fitase dan PCR plantlet non transgenik dan transgenik
putatif. ..................................................................................................
74
15 Rata-rata pengaruh putresina terhadap pembentukan klorofil
plantlet tebu transgenik usia 4 minggu setelah tanam. .........................
83
50
Halaman
16 Rata-rata pengaruh putresina terhadap klorofil b plantlet
tebu .transgenik usia 4 minggu setelah tanam. .....................................
84
17 Rata-rata pengaruh putresina terhadap total klorofil
plantlet tebu transgenik usia 4 minggu setelah tanam. ........................
85
18 Data pengaruh pemberian fitat terhadap aktivitas fitase,
P total plantlet tebu. .............................................................................
97
19 Rata-rata pengaruh pemberian fitat terhadap P total plantlet
tebu. ......................................................................................................
99
20 Peningkatan P total dan aktivitas fitase tebu transgenik ....................
dibanding non transgenik yang dikulturkan selama 1 minggu....................
pada media yang diberi fitat .................................................................
108
21 Data pengaruh pemberian fitat terhadap kadar klorofil plantlet ...................
tebu yang dikulturkan dalam media fitat . ...........................................
110
22 Data pengamatan pada tebu transgenik yang diaklimatisasi
selama .28 hari .....................................................................................
120
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Halaman
Skema alur penelitian ’transformasi regenerasi, ekspresi
aklimatisasi beberapa kultivar tebu yang disisipi gen fitase bakteri ....
7
Biosintesis poliamina, metabolisme, fungsi dan
interaksi dengan etilen .......................................................................
13
Struktur fitat .........................................................................................
17
Lintasan biosintesis fitat.......................................................................
17
Skema sintesis dan penyimpanan fitin .................................................
18
Sekuen reaksi fitase dengan substrat
myo-inositol heksakisphosphate ...........................................................
18
Konstruksi gene cassette pBinPI-IIEC. ...............................................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap diameter kalus
beberapa kultivar tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah tanam. ..
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap persentase membentuk kalus
beberapa kultivar ...tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah
tanam. ..................................................................................................
Pengaruh pemberian 2.4 D terhadap pertumbuhan kalus beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 6 minggu setelah tanam .................
Struktur dan bentuk kalus tebu.............................................................
Rata-rata pengaruh konsentrasi BAP terhadap jumlah
tunas kultivar .tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam........
Perkembangan eksplan tebu menjadi tunas..........................................
Pengaruh pemberian BAP terhadap tinggi tunas .kultivar tebu
secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam tanam. .............................
Pengaruh pemberian BAP terhadap persentase pembentukan
tunas beberapa....kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu
setelah. ..................................................................................................
Pengaruh pemberian BAP terhadap pertumbuhan tunas beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam ..................
Pengaruh pemberian IBA terhadap pertumbuhan akar beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam ..................
Pengaruh pemberian IBA terhadap panjang akar ..beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam. ................
Pengaruh pemberian IBA terhadap pertumbuhan akar beberapa
kultivar tebu secara in vitro usia 4 minggu setelah tanam. .................
20 Kalus beberapa kultivar tebu yang dikulturkan dalam media
Kanamisin usia 4 minggu .....................................................................
21 Rata-rata lamanya kalus bertahan hidup pada media kanamisin
(mg ml-1) ..............................................................................................
22 Rata-rata persentase kalus hidup dalam media kanamisin. .................
22
35
36
38
39
41
42
43
45
46
48
49
51
62
64
66
23 Kalus hasil transformasi (usia 4 minggu) yang dikulturkan
dalam media kanamisin 150 mgl-1 .......................................................
68
Halaman
24 Penampilan tunas tebu transgenik putatif . ..........................................
25 Hasil elektroforesis PCR tebu (cv. PSJT 944-41)
dengan primer spesifik EC1 dan EC3 . ................................................
26 Grafik pengaruh putresina terhadap klorofil a plantlet
tebu.transgenik usia 4 minggu setelah tanam. ...................................
27 Penampilan plantlet tebu transgenik dalam media MS yang diberi
.konsentrasi putresina berbeda usia 4 minggu setelah tanam...............
28 Hubungan antara total klorofil dengan klorofil a pada ....tebu
transgenik yang ditanam pada media yang diberi putresina usia
4 minggu ..setelah tanam....................................................................
29 Hubungan antara total klorofil dengan klorofil b pada ..tebu
transgenik .yang ditanam pada media yang diberi putresina usia
4 minggu setelah tanam........................................................................
30 Grafik pengaruh pemberian fitat terhadap aktivitas fitase ...
plantlet tebu ..........................................................................................
31 Grafik hubungan antara pengaruh pemberian fitat terhadap P......
total plantlet tebu.transgenik dan nn transgenik .................................
32 Pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap pertumbuhan
plantlet tebu ..........................................................................................
33 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap
aktivitas fitase plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan
transgenik .............................................................................................
34 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap
aktivitas fitase transgenik dan non transgenik .....................................
71
73
83
86
87
88
98
100
101
103
103
35 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media
terhadap.aktivitas fitase plantlet tebu cv. PA 175 transgenik
dan non transgenik ...............................................................................
104
36 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan .....
dan non transgenik ...............................................................................
105
37 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan .....
plantlet tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan non transgenik .........
105
38 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan .....
plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan non transgenik. ..................
106
39 P yang diserap oleh plantlet tebu putatif transgenik dan non .........
trangenik usia 1 minggu setelah tanaman pada media fitat. ................
107
.......
40 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam
jaringan plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan..transgenik ............
yang ditanam pada media fitat .............................................................
111
41 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam ...........
jaringan ..plantlet tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan. ...........
transgenik ..putatif ..yang ditanam pada media fitat. ..........................
111
42 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam..........
jaringan plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan..transgenik. ..........
yang ditanam pada media fitat. ..........................................................
112
43 Aklimatisasi tebu transgenik cv. PSJT 94-41 ......................................
122
Halaman
44 Aklimatisasi tebu transgenik cv. PA 175 .............................................
45 Aklimatisasi tebu transgenik cv. PS 851 ..............................................
46 Korelasi antara aktivitas fitase dan klorofil a tebu transgenik ................
(cv. PS ....851) di lapangan ................................................................
47 Korelasi antara aktivitas fitase dan klorofil b tebu transgenik
(cv. PS 851) di lapangan ......................................................................
48 Korelasi antara aktivitas fitase dan total klorofil tebu transgenik...........
(cv. PS 851) di lapangan. ....................................................................
123
125
126
126
127
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi bahan kimia dan media yang digunakan
dalam penelitian .................................................................................. 145
2 Pembuatan media kultur...................................................................... 147
3 Analisis kandungan klorofil ................................................................ 148
4 Deskripsi dan morfologi kultivar tebu ................................................ 149
5 Analisis sidik ragam ............................................................................ 152
6 Glossary (istilah umum yang digunakan dalam disertasi) .................. 164
I PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman tebu Saccharum officinarum L. merupakan tanaman industri
yang memiliki peran penting, karena 65% produksi gula dunia berasal dari tebu.
Tebu banyak digunakan sebagai bahan industri farmasi, sumber bahan bakar dan
produksi beberapa bahan kimia seperti furfural, dekstran, pakan ternak, industri
selulosa dan alkohol. Banyaknya produk yang memerlukan tebu sebagai bahan
baku, mengakibatkan permintaan akan komoditas tebu juga terus meningkat.
Gambaran kebutuhan gula nasional adalah sebesar 3 juta ton pada tahun 2002, dan
yang dapat dipenuhi hanya 1.7 juta ton gula dari produksi dalam negeri, sehingga
sisanya harus diimpor (Pakpahan dan Supriono, 2005).
Luas areal penanaman tebu pada tahun 1930 adalah 196.529 ha dengan
hablur 14.80 ton ha-1, yang bisa menghasilkan total gula 2.907.078 ton. Tahun
2002 dengan luas areal tanam 360.767.9 ha dan hablur
4.8 ton ha-1 hanya
menghasilkan 1.735.131.02 ton gula (Pakpahan dan Supriono 2005). Tahun 1999
dengan luas lahan tebu: 342.211 ha, produksi tebu Indonesia hanya 62.5 ton ha-1,
dengan hablur 4.36 ton ha-1 dan rendemen 6.97 % (Basuki, 2000).
Tebu
sebenarnya memiliki potensi untuk ditingkatkan rendemennya menjadi 8-10%.
Rendahnya rendemen tebu tersebut disebabkan penggunaan kultivar tebu yang
telah mengalami degenerasi klonal atau peluruhan
genetik. Kultivar Triton
(yang digunakan dalam penelitian ini) merupakan kultivar yang diintroduksi dari
Australia
(Subarkat et al. 1988).
Penanaman tebu cv. Triton di Indonesia
mencapai 1438 ha, dengan produksi tebu 39.8 ton ha-1, dengan rendemen 6.31
serta hablur 2.51 ton ha-1 (Tjokrodirjo 2000). Tebu cv. PSJT 94-41 merupakan
klon tebu harapan koleksi P3GI dan belum dilepaskan (Hermono, komunikasi
pribadi 3 Desember 2007). Demikian pula halnya dengan tebu cv. PA 175 yang
merupakan klon koleksi Puslitagro PT Rajawali II, Cirebon.
Konversi lahan tebu dari lahan basah ke lahan kering turut memberikan
andil dalam rendahnya produksi tebu di Indonesia. Pada lahan kering umumnya
ketersediaan P rendah (P terikat).
Penggunaan lahan kering ini membawa
konsekuensi membutuhkan pupuk P yang lebih banyak. Kebutuhan P untuk
2
tanaman tebu tergantung jenis tanah dan kultivar yang digunakan. Berdasarkan
hasil penelitian Glaz et al. (1997) dan Chen et al. (2002) rata-rata kultivar tebu
dapat menyerap rata-rata 8.5 kg P ha-1 di tanah pertanian di Florida dan sekitar 3085 % P tebu diambil dari tanah dalam bentuk P organik. Bentuk P organik dalam
tanah (Buckman dan Brady 1982; Anas et al. 1992) maupun dalam tanaman
terfiksasi dalam bentuk fitat yang sukar digunakan oleh tanaman (Greiner 2005a).
Defisiensi P pada tanaman tebu akan menurunkan produksi tebu dan gula,
hal ini sejalan dengan penelitian Pawirosemadi (1980) yang membuktikan adanya
korelasi yang positif antara kandungan hara P2O5 dalam daun terhadap hasil dan
hablur gula tebu. Fungsi P adalah sebagai komponen penyusun struktur molekul
asam nukleat (DNA, RNA), gula fosfat (metabolisme intermediet tanaman),
nukleotida (ATP, CTP, UTP, GTP,TTP), koenzim, fosfolipid (membran sel).
Umumnya, Pi dalam banyak reaksi merupakan substrat dan atau produk yang
dihasilkan. Pi mengontrol beberapa reaksi enzim, serta penting dalam lintasan
metabolik di sitoplasma dan kloroplas (Marschner 1995).
Fitat (inositolhexakisphosphate, IP6) merupakan sumber fosfat dalam
tanaman yang mencapai lebih dari 80 % dari total fosfor pada tanaman sereal dan
legum (Keruvuo et al. 2000). Fitat diduga terkait dengan penyimpanan energi dan
inisiasi dormansi pada benih. Sintesis fitat berlangsung saat pengisian biji dan
berhenti saat fase awal perkecambahan, namun peranannya pada jaringan tanaman
non reproduksi belum jelas.
P yang terdapat dalam fitat sukar untuk digunakan tanaman (Greiner
2005a) dan baru dapat dilepaskan bila ada aktivitas enzim fitase. Namun tidak
semua tanaman dapat menghasilkan fitase.
Beberapa jenis tanaman yang
diketahui dapat menghasilkan fitase adalah kacang hijau, kedelai, gandum, dan
padi (Kyriakidis et al. 1998). Aktivitas fitase pada tanaman tebu (cv. PSJT 9433, cv. PA 183, dan cv. Triton) secara alami sangat rendah yaitu kurang lebih
0.01 U/ml (Wulandari 2005). Guna menghasilkan tebu dengan aktivitas fitase
yang tinggi, maka perlu dilakukan rekayasa secara genetika melalui donor lain
selain genus dan spesies dari Saccharum. Transfer gen dari donor yang tidak satu
spesies telah umum dilakukan secara non konvensional seperti fusi protoplas, fusi
mikroprotoplas, transformasi dengan menggunakan vektor (virus, Agrobacterium)
3
dan tanpa vektor (misalnya: elektroforasi, biolistik, serat silikon, makro dan mikro
injeksi, dan sonifikasi).
Upaya perbaikan genetik pada tanaman tebu secara konvensional sulit
dilakukan karena tingginya tingkat poliploid tanaman tebu (Gilbert et al. 2005).
Dengan pertimbangan tersebut, maka lebih menjanjikan bila upaya perbaikan
genetik dilakukan melalui rekayasa genetika,
misalnya dengan transformasi.
Proses transformasi dengan mediasi Agrobacterium tumefaciens paling sering
digunakan untuk memasukan gen asing ke dalam sel tanaman dengan tingkat
keberhasilan dan kestabilan gen yang tinggi (Riva et al. 1999). Teknik
transformasi Agrobacterium memiliki keunggulan, antara lain (1) efisiensi
transformasi dengan salinan gen tunggal lebih tinggi dan (2) dapat dilakukan
dengan peralatan laboratorium yang sederhana. Gen dengan salinan tunggal lebih
mudah dianalisa dan biasanya bersegregasi mengikuti pola pewarisan Mendel
(Rahmawati 2006).
Keberhasilan transformasi Agrobacterium masih terbatas
pada genotipe tanaman tertentu. Saat ini transformasi pada tanaman monokotil
(seperti tebu) sangat mungkin untuk dilakukan. Keberhasilan transformasi pada
jaringan meristem tebu terkait dengan laju kemampuan bertahan hidup dari sel
target (Riva et al 1999). Santosa et al. (2004a), telah berhasil mengembangkan
suatu metode yang tepat untuk transformasi gen fitase pada tanaman tebu dengan
menggunakan Agrobacterium tumefaciens GV 2260.
Beberapa peneliti dari IPB telah berhasil menyisipkan gen fitase asal bakteri
dengan
menggunakan
metode
Santosa
(2004a)
melalui
Agrobacterium
tumefaciens GV 2260 (pBin1-ECS) pada kultivar tebu cv.PSJT 9443, cv. PA 183
cv. Triton (Wulandari 2005), cv. CB 6979, dan cv. PA 183 (Hayatyzul 2007).
Penyisipan gen fitase melalui Agrobacterium
tumefaciens GV2260 dengan
konstruksi gene cassette berbeda yaitu pBinPI-IIEC juga telah dilakukan pada
tebu cv. PSJT 94-33, cv. BR 194 (Ananda 2004), cv. PSJT 94-33, cv.PSJT 94-41,
cv. PA117 (Pesik 2005), dan cv. PS 851 (Nurhasanah 2007).
Penyisipan gen fitase ini diharapkan mampu menghasilkan enzim yang
dapat mengubah fitat dalam jaringan maupun di sekitar perakaran menjadi fosfat
yang dapat digunakan tumbuhan. Coello et al. (2001) telah berhasil
mengintroduksikan gen fitase dari E. coli ke dalam genom Arabidopsis sehingga
4
kadar fitat dalam tanaman menjadi rendah. P tersedia yang meningkat dalam
tanaman diharapkan dapat
meningkatkan laju fotosintesis, serta berpengaruh
positif dalam proses pembentukan klorofil.
Keberhasilan penyisipan gen fitase ini dapat dideteksi secara dini dengan
menggunakan PCR. Ananda (2004) dan Nurhasanah (2007) telah melaporkan
pada tebu cv. PSJT 94-33, cv. BR 194; dan cv. PS 851 yang ditransformasi
Agrobacterium
tumefaciens GV2260 dengan konstruksi gene cassette pBinPI-
IIEC dapat dideteksi dengan PCR yang menghasilkan pita ukuran 900 bp dengan
primer EC1 dan EC3.
Tanaman tebu yang berhasil disisipi gen fitase diharapkan dapat
mengekpresikan aktivitas fitase yang tinggi. Penelitian mengenai ekspresi gen
fitase pada tanaman tebu yang telah disisipi gen fitase belum banyak diketahui.
Ini merupakan pijakan penting untuk mengetahui ekspresi gen fitase pada
beberapa kultivar tanaman tebu hasil transformasi.
Ekspresi berupa aktivitas
enzim fitase akan memberikan pengaruh langsung terhadap kadar P total dalam
jaringan tanaman plantlet tebu dan juga berpengaruh terhadap pembentukan
klorofil.
Selama ini regenerasi kalus tebu transforman yang disisipi gen fitase
umumnya menghasilkan plantlet yang memiliki kandungan klorofil sedikit bahkan
albino. Hasil regenerasi yang menghasilkan plantlet yang berwarna hijau hanya
sedikit. Dewi (2003) menyatakan pemberian poliamina (seperti: putresina) ke
dalam media kultur dapat meningkatkan regenerasi kalus menjadi tanaman hijau
pada kultur antera tanaman padi. Hal tersebut menjadi pertimbangan dan
diharapkan terjadi peningkatan tanaman hijau pada tebu hasil transformasi dengan
penambahan poliamina.
Plantlet tansgenik yang diperoleh pada akhirnya dilakukan aklimatisasi pada
lingkungan yang sesuai. Banyak faktor yang mempengaruhi keberhasilan dalam
aklimatisasi ini, seperti kadar klorofil plantlet, vigor plantlet, kelembaban, suhu,
dan lain-lain. Setiap individu memiliki kemampuan adaptasi terhadap lingkungan
baru yang berbeda. Diharapkan dengan metode aklimatisasi yang tepat, maka
tebu-tebu transgenik tersebut dapat tumbuh dan berkembang di lapangan.
5
Dengan mempertimbangkan latar belakang di atas, maka diperlukan suatu
penelitian yang lebih mendalam bagi pengembangan sistem regenerasi tanaman
tebu secara in vitro yang merupakan target transformasi, metode dan teknik yang
tepat dalam melakukan transformasi, serta aklimatisasi yang tepat bagi tebu
transgenik di lapangan.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian secara umum adalah untuk memperoleh tanaman tebu
yang memiliki aktivitas fitase yang tinggi dari gen fitase yang disisipkan melalui
proses transformasi. Tujuan penelitian secara khusus adalah: (1) mengembangkan
dan mempelajari regenerasi tanaman tebu secara in vitro yang meliputi induksi
dan multiplikasi kalus, inisiasi dan multiplikasi tunas, induksi perakaran dengan
pemberian ZPT yang tepat; (2) mempelajari dan mengkaji proses transformasi
beberapa kultivar tebu yang disisipi gen fitase bakteri melalui Agrobacterium
tumefacens GV 2260 (pBinPI-IIEC), serta mendeteksi keberadaan gen yang
disisipkan dengan PCR; (3) mengkaji dan mempelajari pengaruh putresina
terhadap kadar klorofil plantlet tebu hasil transformasi; (4) mengkaji aktivitas
fitase serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan kadar klorofil plantlet tebu
hasil transformasi; serta (5) mengembangkan dan mempelajari teknik aklimatisasi
plantlet tebu hasil transformasi serta ekspresinya di lapangan.
Manfaat Penelitian
Secara umum manfaat penelitian ini adalah memperoleh tanaman tebu
transgenik yang memiliki aktivitas fitase yang tinggi. Manfaat penelitian secara
khusus adalah: (1) memberikan informasi berupa respon 3 kultivar tebu terhadap
pemberian ZPT yang tepat untuk menginduksi pembentukan kalus, tunas, dan
akar tebu,
serta interaksi antara kultivar dan konsentrasi yang diberikan;
(2) memberikan kontribusi dalam bentuk sumber plasma nutfah yang berharga
bagi pemuliaan tanaman bila berhasil mendapatkan tanaman tebu yang
mengekspresikan aktivitas fitase tinggi; (3) mengetahui perbedaan variasi antara
tebu transgenik dan non transgenik; dan (4) diharapkan tanaman tebu hasil
transformasi tersebut dapat menjadi klon unggul.
6
Alur pemikiran
Hal yang menjadi alur pemikiran penelitian ini adalah:
(1) Salah satu masalah utama dalam perpindahan penanaman tebu dari lahan
basah ke lahan kering adalah keterikatan P. Keterikatan P bukan saja
terdapat pada tanah tetapi juga pada jaringan tanaman.
(2) Enzim fitase dapat melepaskan keterkaitan P baik pada lingkungan rizosfer
maupun pada jaringan tanaman
(3) Tanaman tebu dari genu Saccharum mempunyai aktivitas fitase yang
rendah sehingga perlu peningkatan enzim fitase melalui penyisipan gen
fitase yang berasl dari sumber lain
(4) Penyisipan gen fitase yang efisien dari sumber lain memerlukan proses
transformasi tanaman melalui Agrobacterium tumefaciens
(5) Proses transformasi yang berhasil harus melalui tahap regenerasi,
transformasi, ekspresi gen, dan aklimatisasi
(6) Kegagalan aklimatisasi tanaman tebu transgenik disebabkan oleh
albinisme atau kekurangan klorofil.
Strategi Penelitian
Berdasarkan alur penelitian tersebut, maka disusun strategi penelitian
sebagai berikut:
(1) Regenerasi tebu secara in vitro.
(2) Penyisipan gen fitase pada tanaman tebu melalui Agrobacterium
tumefaciens GV 2260.
(3) Peningkatan klorofil plantlet tebu hasil transformasi dengan menggunakan
putresina.
(4) Ekspresi gen fitase pada beberapa kultivar tebu hasil transformasi
(5) Aklimatisasi plantlet tebu hasil transformasi.
Adapun strategi yang dilakukan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.
I.
Regenerasi
tebu secara in
vitro
Tujuan:
Mengkaji
konsentrasi ZPT
1 mengkaji
konsentrasi
2.4 D yang
terbaik untuk
pembentukan
kalus
2 mengkaji
konsentrasi
BAP
yang
terbaik untuk
pembentukan
tunas
3 mengkaji
konsentrasi
IBA
yang
terbaik untuk
pembentukan
akar
Output: kalus dan
plantlet
tebu
untuk
materi
penelitian
dan
informasi
ZPT
yang tepat untuk
regenerasi tebu
transgenik
dan
non transgenik
7
II. Transformasi tanaman tebu dengan gen fitase bakteri
melalui Agrobacterium tumefaciens GV 2260 (pBINPIIIEC)
Tujuan:
1 menguji konsentrasi kanamisin sebagai penanda tebu
transforman
2 mempelajari dan mengkaji proses transformasi
3 mendeteksi integrasi gen fitase dalam genom tebu.
Output: kalus transgenik putatif
Plantlet transgenik putatif
III.
Peningkatan klorofil plantlet
transformasi dengan pemberian putresina
tebu hasil
Tujuan:
meningkatkan klorofil tanaman
transformasi dengan menggunakan putresina.
tebu
hasil
Output :
Plantlet tebu transgenik putatif dengan klorofil yang baik
IV. Ekspresi gen fitase bakteri pada beberapa kultivar
tebu hasil transformasi.
Tujuan: mengkaji aktivitas fitase plantlet tebu hasil
transformasi serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan
kadar klorofil
Output: Informasi ekspresi gen fitase tebu transgenik putatif
V. Aklimatisasi plantlet tebu hasil transformasi.
Tujuan:
1 mengkaji dan mempelajari aklimatisasi tebu hasil
transformasi gen fitase bakteri
2 mengevaluasi ekspresi gen dan kadar klorofil tebu
transgenik putatif di lapangan
Output:
Tanaman tebu transgenik putatif dan informasi
ekspresi gen fitase bakteri di lapangan
Tujuan:
1 Mengembangkan dan mempelajari regenerasi tanaman tebu secara in vitro (induksi
dan multiplikasi kalus, inisiasi dan multiplikasi tunas, induksi perakaran ) dengan
pemberian ZPT yang tepat
2 Mempelajari dan mengkaji proses transformasi beberapa kultivar tebu yang disisipi
gen fitase bakteri melalui Agrobacterium tumefacens GV 2260 (pBinPI-IIEC), serta
mendeteksi keberadaan gen yang disisipkan;
3 Mengkaji dan mempelajari pengaruh putresina terhadap kadar klorofil plantlet tebu
hasil transformasi
4 Mengkaji aktivitas fitase serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan kadar
klorofil plantlet tebu hasil transformasi
5 Mengembangkan dan mempelajari teknik aklimatisasi plantlet tebu hasil
transformasi serta ekspresinya di lapangan.
Gambar 1 .Skema strategi penelitian ’Penyisipan gen fitase pada genome beberapa
kultivar tebu, regenerasi, ekspresi dan aklimatisasinya’.
8
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Tebu
Tanaman tebu (Saccharum officinarum) dibudidayakan sebagai tanaman
komersial pada hampir 60 negara di dunia. Negara penghasil tebu utama adalah
Brazil, Cuba, Fiji, India, Indonesia, Mauritius dan Amerika. Tanaman tebu
diklasifikasikan
ke dalam famili Graminae; kelompok Andropogone; genus:
Saccharum. Hanya 3 genus dari 5 genus Saccharum yang dibudidayakan yaitu:
(1) S. officinarum (yang merupakan penghasil gula utama); (2) S. sinensis, (3) S.
barberi, dan wild type terdapat 2 genus yaitu: (4) S. spontaneum, dan (5) S.
robustum. Tebu dari genus S. sinensis, S. barberi, dan S. spontaneum memiliki
kadar gula sedang hingga rendah (Naik 2001).
Pusat asal dan perkembangan tebu dunia diduga berada di New Guinea
dan pulau-pulau di sekitar Indonesia untuk S. officinarum dan S. robustum; di
India sampai ke perbatasan Utara-Timur China dan Myanmar untuk S.
spontaneum dan kerabat rerumputan lainnya seperti Erianthus sp., Sclerostachya
sp., Narenga sp. dan sebagainya (Sugiyarta 1993). Naik (2001) mengemukakan
bahwa India adalah asal dari tebu-tebu yang dibudidayakan di Indonesia. Kata
‘sakara’ yang berarti gula berasal dari Bahasa Sansekerta telah ada dalam catatan
Budha pada 500 tahun SM.
Guna memperoleh genotipe baru dalam program pemuliaan tanaman tebu
sangat tergantung pada rekombinasi dan segregasi progeni dari individu
heterosigot. Tanaman tebu merupakan allopoliploid dengan n = 5,6,7,8,9
(Hetharie 2003). Berdasarkan penelitian para ahli, di India ditemukan tanaman
tebu oktoploid (2n = 80) dengan jumlah dasar x = 10 kromosom yang merupakan
hasil persilangan tipe liar Sclerostahya fusca dengan Saccharum officinarum.
Kultivar tebu modern adalah aneuploids dan memiliki jumlah kromosom 100125 dimana 5-10% merupakan hasil persilangan kerabat liar S. spontaneum dan
S. officinarum (Alexander 1973).
Awalnya, kultivar-kultivar dari spesies S. officinarum merupakan kultivar
yang banyak digunakan
untuk memproduksi sebagian besar gula di dunia.
9
Stevenson pada tahun 1965 menyatakan bahwa sel somatik akar tebu S.
officinarum ditemukan sekitar 80 kromosom.
Kromosom pada S. robustum
terdiri dari 2 tipe yaitu berkromosom 60 dan 80. Sementara tebu-tebu komersial
umumnya memiliki jumlah kromosom 80 – 120. Diduga kromosom dasar genus
Saccharum adalah 10 (Alexander 1973).
Total produktivitas gula Indonesia yang berasal dari tebu pada tahun 2002
yaitu 5.01 gula ton ha-1 (Pakpahan dan Supriono 2005), dan menurut BPS (2004)
produktivitas tebu di Indonesia rata-rata 5.5 gula ton ha-1. Produktivitas tersebut
masih memiliki potensi untuk dapat ditingkatkan menjadi 14.1 ton ha-1 (Pakpahan
dan Supriono 2005).
Penelitian dan pemanfaatan plasma nutfah tebu di Indonesia mulai
dilakukan sejak tahun 1888 ketika ledakan serangan penyakit sereh. Kultivar
Kasoer yang merupakan hasil persilangan alami S. officinarum dan S. spontaneum
yang memiliki keunggulan toleran terhadap penyakit sereh tersebut. Nobilasi
tebu-tebu komersial berasal dari S. officinarum dengan S. spontaneum dan atau S.
robustum. Sejak tahun 1888 sampai tahun 1960, Indonesia sangat t