Analisis keragaman genetik labi-labi (Amyda cartilaginea) berdasarkan genom mitokondria
1
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK LABI-LABI
(Amyda cartilaginea) BERDASARKAN GENOM MITOKONDRIA
EVI RIZKY AMELIA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
2
ABSTRAK
EVI RIZKY AMELIA. Analisis Keragaman Genetik Labi-labi (Amyda cartilaginea)
Berdasarkan Genom Mitokondria. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan R.R. DYAH
PERWITASARI.
Amyda cartilaginea termasuk ke dalam Ordo Testudinata, Subordo Cryptodira dan Famili
Trionychidae. Amyda cartilaginea dilaporkan telah mengalami penurunan populasi yang
diakibatkan oleh pengaruh manusia dan lingkungan. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian
untuk mengetahui keragaman genetik spesies tersebut dengan menggunakan penanda DNA
melalui pendekatan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphisms (PCR-RFLP). Teknik tersebut dilakukan untuk mengetahui keragaman genetik
mtDNA dengan menggunakan sepasang primer 577 dan 578. Daerah yang diamplifikasi ialah
daerah pengontrol yang diapit oleh gen tRNA Pro dan tRNA Phe berdasarkan runutan acuan
Dogania subplana. Produk amplifikasi yang dihasilkan sebesar 500 pasang basa dan 710 pasang
basa. Produk tersebut dipotong dengan menggunakan lima macam enzim restriksi yaitu, HhaI
(GCG• C), HaeIII(GG• CC), AluI (AG• CT ), MboI (•GAT C), dan DraI (TTT• AAA). Dari 39
sampel yang dianalisis ditemukan 12 haplotipe. Haplotipe 2 menyebar pada beberapa wilayah
sedangkan haplotipe lain menyebar pada sampel dengan wilayah tertentu saja. Dari 12 haplotipe
diperoleh keragaman nukleotida total A. cartilaginea sebesar 5.4%.
ABSTRACT
EVI RIZKY AMELIA. Genetic Diversity of soft-shelled turtle (Amyda cartilaginea). Under
supervision of ACHMAD FARAJALLAH and R.R. DYAH PERWITASARI.
Amyda cartilaginea belongs to the Order Testudinata, Suborder Cryptodira and Family
Trionychidae. Recently, the population of A. cartilaginea has been decreasing because of human
exploitation and environmental destruction. Therefore, it is important to carry on the research in
genetic diversity among this spesies. The research was conducted using the mitochondrial DNA
marker by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphisms (PCR–RFLP)
technique. PCR technique was conducted to observe genetic diversity of mtDNA using a pair of
primer 577 and 578. The amplified region was control region which flanked tRNA Pro and tRNA
Phe based on reference sequence of Dogania subplana. The amplification resulted in the product
of 500 base pairs and 710 base pairs. The PCR product was then cut by restriction endonuclease,
namely HhaI (GCG• C), HaeIII(GG• CC), AluI (AG• CT ), MboI (•GAT C) and DraI (TTT• AAA).
Twelve haplotypes was found among 39 samples.. Haplotype 2 showed wide distribution
compared to other haplotypes. Nucleotide diversity among haplotypes is 5.4 %.
3
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK LABI-LABI
(Amyda cartilaginea) BERDASARKAN GENOM MITOKONDRIA
EVI RIZKY AMELIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
4
Judul Skripsi
: ANALISIS KERAGAMAN GENETIK LABI-LABI (Amyda cartilaginea)
Nama
NIM
: Evi Rizky Amelia
BERDASARKANGENOM MITOKONDRIA
: G34101008
Menyetujui,
Pembimbing 1
Pembimbing 2
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si.
NIP : 131878947
Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc.
NIP : 131916787
Mengetahui,
Dejan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP : 131473999
Tanggal Lulus : 26 September 200
5
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 20 Mei 1983. Penulis merupakan anak kedua
dari enam bersaudara dari pasangan Asep M Yusuf dan Euis Siti Saelah.
Penulis lulus dari SMU Negeri I Leuwiliang pada tahun 2001 dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis
memilih jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah
Vertebrata pada tahun ajaran 2004/2005. Penulis juga pernah mengikuti praktek lapang dengan
judul Manajemen Pemeliharaan Sapi Perah di Kawasan Usaha Peternakan Sapi Perah
Cibungbulang Bogor.
6
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke Hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
hidayahNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini
adalah
Analisis Keragaman Genetik Labi-labi Amyda cartilaginea Berdasarkan Genom
Mitokondria.
Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan penghargaan dan terima kasih kepada
Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan Ibu Dr. Ir. RR. Dyah Perwitasari, M.Sc, selaku
pembimbing yang telah memberikan fasilitas, pengarahan, kritik, dan saran selama pelaksanaan
penelitian dan penulisan laporan. Terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Nisa Rachmania
Mubarik sebagai penguji yang telah banyak memberikan kritik dan masukan kepada penulis. Di
samping itu, ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada Bapak Bambang Suryobroto, Ibu
Taruni Sri Prawasti, Bapak Tri Heru, Bapak Tri Atmowidi, Ibu Rika Raffiudin, Bapak Adi.
Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak, Mama, Kakek, Nenek, Teh
Rini, Mas Gundul Ignas, Iyank, Leli, dan Adit serta yang terkasih ‘Aa Jembar’ yang telah
memberikan dukungan serta doa dan kasih sayangnya kepada penulis. Tak lupa kepada temanteman Zoologi Anne Susanti, Cynthia, Ae, Hijrah, Yudith, Ati, Duti, Fitri, Anne Nelistia dan
teman-teman Biologi 38 terima kasih atas persahabatannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2005
Evi Rizky Amelia
7
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................................
Tujuan ...................................................................................................................
Waktu dan Tempat ................................................................................................
1
1
1
BAHAN DAN METODE
Bahan. .....................................................................................................................
Metode ..................................................................................................................
Ekstraksi dan Isolasi DNA..........................................................................
Amplifikasi Ruas DNA Target dengan PCR ..............................................
Pemotongan Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi ............................
Analisis Keragaman ....................................................................................
2
2
2
2
2
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil........................................................................................................................
Amplifikasi Ruas DNA Target dengan PCR..............................................
3
3
Pemotongan Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi...........................
3
Analisis Keragaman...................................................................................
Pembahasan............................................................................................................
4
4
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan............................................................................................................
5
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................
5
LAMPIRAN .................................................................................................................
7
8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pola pemotongan enzim restriksi masing-masing haplotipe.....................................
3
2 Keragaman nukleotida antar haplotipe mtDNA A. cartilaginea (di atas diagonal),
situs restriksi yang terdapat pada kedua haplotipe (di bawah diagonal)
dan jumlah situs restriksi setiap haplotipe (diagona)l...................................................
5
DAFTAR GAMBAR
1 Labi-labi Amyda cartilaginea ...................................................................................
2 Posisi primer 577 dan 578 berdasarkan peta genom labi-labi Dogania subplana
(Farajallah 2002) ......................................................................................................
Halaman
1
2
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
Peta situs restriksi dari 12 haplotipe mtDNA A. cartilaginea.....................................
Peta penyebaran sampel A. cartilaginea yang dianalisis...........................................
Pola pemotongan Enzim restriksi DraI, MboI, HhaI, AluI dan HaeIII.......................
Komposisi larutan gel poliakrilamid 5% larutan pewarnaan perak ............................
8
9
9
10
9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Amyda cartilaginea merupakan kura-kura air tawar bercangkang lunak yang termasuk ke
dalam Ordo Testudinata, Subordo Cryptodira, FamiliTrionychidae (Iverson 1992). Famili
Trionychidae secara umum disebut dengan labi-labi. Anggota famili ini mempunyai karapas
(perisai dorsal) dan plastron (perisai ventral) yang sebagian besar terdiri atas tulang rawan (softshelled turtle). Amyda cartilaginea (Gambar 1) mempunyai ciri-ciri kepala berwarna hitam atau
abu-abu, kepala hewan muda pada umumnya dijumpai bintik-bintik berwarna kuning; leher relatif
panjang, kepala hampir dapat mencapai bagian belakang badan; mata berukuran relatif kecil;
lubang hidung terletak di ujung belalai; mulut mempunyai bibir yang tebal; perisai relatif bulat;
kaki mempunyai selaput penuh dan jari-jarinya mempunyai cakar yang relatif kuat dan berujung
lancip (Iskandar 2000).
Gambar 1 Labi-labi Amyda cartilaginea.
Amyda cartilaginea dapat dijumpai di daerah perairan yang tenang, berarus lambat, kadangkadang membenam di dalam lumpur atau pasir dan dasar perairan. Daerah penyebaran A.
cartilaginea meliputi Myanmar bagian timur dan selatan, Thailand, Kamboja, Laos,Vietnam,
Malaysia, Singapura (Lim & Das 1999), sedangkan di Indonesia terdapat di Sumatera, Jawa,
Kalimantan (Iskandar 2000). Lim dan Das (1999)
melaporkan populasi A. cartilaginea
dan spesies kura-kura air tawar lainnya mengalami penurunan karena eksploitasi besar-besaran,
khususnya penggunaan spesies ini sebagai makanan eksotis, obat tradisional Cina, dan lemaknya
digunakan dalam industri kosmetik. Turtle jelly yang berasal dari perisainya dapat digunakan
dalam pengobatan kanker dan juga sebagai obat kuat. Labi-labi kecil umumnya lebih disukai
dibanding yang berukuran besar, karena mempunyai proporsi tulang rawan dan gelatinous skin
yang tinggi (Behler 1997)..
Genom mitokondria (mtDNA) sering digunakan sebagai penanda genetik dalam mempelajari
keragaman genetik hewan dan hubungan sistematik dalam beberapa tingkat hierarki (Lamb et al.
1994). Molekul mtDNA berbentuk sirkular, bersifat haploid karena diturunkan secara maternal,
berukuran kecil (15-20 kb), lebih sederhana dibanding DNA inti dan dapat melakukan replikasi
sendiri. Genom mitokondria pada sebagian besar hewan terdiri atas 22 gen yang menyandikan
tRNA, 2 gen yang menyandikan rRNA (12S dan 16S), 13 gen yang menyandikan protein dan satu
ruas DNA berukuran besar yang tidak menyandikan yang disebut sebagai daerah pengontrol atau
DLoop (Avise 1994). Daerah pengontrol telah dibuktikan merupakan bagian yang paling
bervariasi pada genom mitokondria dan tempat dimulainya replikasi (Avise 1994).
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk memperbanyak DNA secara
in vitro dengan menggunakan sepasang primer. Variasi antar individu dari produk hasil PCR dapat
dikarakterisasi
menggunakan berbagai teknik, antara lain Restriction Fragment Length
Polymorphisms (RFLP). Dengan teknik ini, setiap enzim restriksi memotong molekul DNA pada
runutan nukleotida secara spesifik yang disebut dengan situs restriksi atau situs pemotongan
sehingga menghasilkan sejumlah fragmen DNA. Teknik tersebut telah banyak digunakan dalam
mempelajari keragaman dalam populasi, filogeografi intraspesifik (Walker et al. 1995), sejarah
biogeografi, hibridisasi, pola dan tingkat evolusi dan konservasi (Lawton & Lkiens 2000). Analisis
dengan menggunakan teknik RFLP adalah cara yang cepat, relatif murah sehingga dapat
digunakan dalam jumlah sampel yang besar.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari keragaman genetik labi-labi A. cartilaginea
berdasarkan analisis DNA mitokondria menggunakan teknik PCR- RFLP.
10
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Juli 2005 di Laboratorium
Zoologi Departemen Biologi, FMIPA IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel DNA total labi-labi A. cartilaginea yang merupakan koleksi Laboratorium Zoologi
Departemen Biologi FMIPA IPB, digunakan dalam penelitian ini. Sampel tersebut berasal dari
Pangkalan Bun (sembilan ekor), Senggau (tiga ekor), Banjar Baru (11 ekor), dan Bengkulu (15
ekor). Sampel dalam bentuk DNA total sebanyak 38, sedangkan satu sampel dari Senggau dalam
bentuk darah segar (Lampiran 2).
Metode
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Sampel darah segar labi-labi asal Senggau diambil dari jantung menggunakan siring
berheparin dalam kondisi labi-labi deep anaesthetized. Sel-sel darah dipisahkan dari plasma, dilisis
menggunakan NaCl 0.2% yang mengandung 1 mM EDTA (Etilen Diamin Tetraacetic Acid)
sebanyak 1x volume, kemudian diendapkan pada kecepatan 5000 g selama 10 menit. Hal ini
dimaksudkan untuk membuang sebanyak mungkin molekul hemoglobin. Endapan sel-sel darah
sebanyak 200 ì l disuspensikan dalam bufer 1x STE (NaCl 10 mM, Tris HCl 20 mM, EDTA
0.1mM, pH 8.00) 2 ml dan ditambahkan SDS (Sodium Dodesil Sulfat) 10% 200 ì l dan ProteinaseK 50 mg/ml 30 ì l. Campuran ini diinkubasi 550 C selama 2 jam sambil dikocok pelan. Ekstraksi
dilanjutkan dengan menambahkan NaCl 5 M 200 ì l, larutan fenol 2 ml dan kloroform : isoamil
alkohol (24:1) 2 ml dikocok pelan selama 2 jam dalam suhu ruang pada kecepatan 3500 rpm
selama 10 menit. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol kemudian dipindahkan ke dalam kantung
dialisis DNA dan dilanjutkan dengan dialisis dalam bufer TE (Tris HCl 2 mM dan EDTA 2 mM)
dan diinkubasi dalam refrigerator selama tiga malam. Setiap hari bufer TE diganti dengan yang
baru. Molekul DNA murni dari kantung dialisis dipindahkan ke tabung penyimpan dan tabung
aliquot. Sampel DNA dalam tabung aliquot kemudian yang digunakan dalam penelitian ini.
Amplifikasi Ruas DNA Target dengan PCR
Ruas daerah pengontrol mtDNA diamplifikasi secara in vitro menggunakan PCR ialah daerah
pengontrol yang diapit oleh gen tRNA Pro dan tRNA Phe berdasarkan runutan acuan (Gambar 2).
Penggandaan DNA ini meng-gunakan pasangan primer 577 (5’-TTC ACG AGA GAT AAG CAA
CC-3’) dan primer 578 (5’-CTC GGA TTT TGG GGT TTG AC-3’). Proses PCR menggunakan
mesin TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4 dengan tahap denaturasi pada suhu 940 C selama 60
detik, penempelan primer pada suhu 520 C selama 2 menit dan sintesis DNA pada suhu 720C
selama 2 menit, dan dilakukan sebanyak 30 siklus. Sebelum penggandaan, dilakukan denaturasi
awal pada suhu 940 C selama 5 menit. Di akhir penggandaan dilakukan proses sintesis akhir pada
suhu 720 C selama 7 menit dan penyimpanan pada suhu 100 C sampai mesin dimatikan.
Gambar 2 Posisi primer 577 dan 578 berdasarkan peta genom labi-labi Dogania subplana
(Farajallah 2002)
Komposisi pereaksi PCR sebanyak 50 ì l terdiri atas sampel DNA 2 ì l (10-100 ng), 10x bufer
Polimerase 5 ì l, MgCl 2 2 mM 4 ì l, dNT P 2.5 mM 6 ì l, Taq Gold Polymerase 1 ì l, primer 577
dan 578 1 pmol 2 ì l, BSA 10 ng/ml 2 ì l dan air steril 28 ì l. Produk PCR dimigrasikan dengan
11
teknik elektroforesis gel poliakrilamid 5% dan dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Tegelstrom
1986 yang dimodifikasi) (Lampiran 4).
Pemotongan Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi
Untuk mengetahui keragaman daerah pe-ngontrol, produk PCR dipotong mengguna-kan lima
macam enzim restriksi, yaitu HhaI (GCG• C), HaeIII(GG•CC), AluI (AG•CT ), MboI (•GAT C)
dan DraI (TTT•AAA). Komposisi pereaksi terdiri atas produk PCR seba-nyak 4 ì l, enzim
restriksi sebanyak 2 unit, bufer enzim (sesuai petunjuk produsen) dan air steril sampai volume
reaksi 5 ì l. Campuran diinkubasi pada suhu 370 C yang diinapkan semalam. Hasil pemotongan
dimigrasikan pada gel poliakrilamid 5 % dengan menggunakan bufer 1x TBE (Tris 0.5 M, Asam
Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M) 165 mV selama 100 menit. Dalam setiap gel ikut juga dimigrasikan
DNA ladder 100 pb (Promega). Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid dilakukan dengan
pewarnaan perak (Tegelstrom 1986 yang dimodifikasi).
ð : keragaman nukleotida
S : peluang jika setiap haplotipe
Analisis Keragaman
Fragmen-fragmen
mtDNA
hasil
pemotongan oleh enzim restriksi kemudian
diterjemahkan ke dalam haplotipe. Ukuran
fragmen dapat bervariasi diantara individu
berdasarkan ada atau tidaknya situs restriksi
(Lawton dan Lkiens 2000). Analisis
keragaman dihitung dengan metode Nei dan
Kumar (2000) berdasarkan ada atau tidaknya
situs restriksi.
S = 2 • i
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK LABI-LABI
(Amyda cartilaginea) BERDASARKAN GENOM MITOKONDRIA
EVI RIZKY AMELIA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
2
ABSTRAK
EVI RIZKY AMELIA. Analisis Keragaman Genetik Labi-labi (Amyda cartilaginea)
Berdasarkan Genom Mitokondria. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan R.R. DYAH
PERWITASARI.
Amyda cartilaginea termasuk ke dalam Ordo Testudinata, Subordo Cryptodira dan Famili
Trionychidae. Amyda cartilaginea dilaporkan telah mengalami penurunan populasi yang
diakibatkan oleh pengaruh manusia dan lingkungan. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian
untuk mengetahui keragaman genetik spesies tersebut dengan menggunakan penanda DNA
melalui pendekatan teknik Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphisms (PCR-RFLP). Teknik tersebut dilakukan untuk mengetahui keragaman genetik
mtDNA dengan menggunakan sepasang primer 577 dan 578. Daerah yang diamplifikasi ialah
daerah pengontrol yang diapit oleh gen tRNA Pro dan tRNA Phe berdasarkan runutan acuan
Dogania subplana. Produk amplifikasi yang dihasilkan sebesar 500 pasang basa dan 710 pasang
basa. Produk tersebut dipotong dengan menggunakan lima macam enzim restriksi yaitu, HhaI
(GCG• C), HaeIII(GG• CC), AluI (AG• CT ), MboI (•GAT C), dan DraI (TTT• AAA). Dari 39
sampel yang dianalisis ditemukan 12 haplotipe. Haplotipe 2 menyebar pada beberapa wilayah
sedangkan haplotipe lain menyebar pada sampel dengan wilayah tertentu saja. Dari 12 haplotipe
diperoleh keragaman nukleotida total A. cartilaginea sebesar 5.4%.
ABSTRACT
EVI RIZKY AMELIA. Genetic Diversity of soft-shelled turtle (Amyda cartilaginea). Under
supervision of ACHMAD FARAJALLAH and R.R. DYAH PERWITASARI.
Amyda cartilaginea belongs to the Order Testudinata, Suborder Cryptodira and Family
Trionychidae. Recently, the population of A. cartilaginea has been decreasing because of human
exploitation and environmental destruction. Therefore, it is important to carry on the research in
genetic diversity among this spesies. The research was conducted using the mitochondrial DNA
marker by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphisms (PCR–RFLP)
technique. PCR technique was conducted to observe genetic diversity of mtDNA using a pair of
primer 577 and 578. The amplified region was control region which flanked tRNA Pro and tRNA
Phe based on reference sequence of Dogania subplana. The amplification resulted in the product
of 500 base pairs and 710 base pairs. The PCR product was then cut by restriction endonuclease,
namely HhaI (GCG• C), HaeIII(GG• CC), AluI (AG• CT ), MboI (•GAT C) and DraI (TTT• AAA).
Twelve haplotypes was found among 39 samples.. Haplotype 2 showed wide distribution
compared to other haplotypes. Nucleotide diversity among haplotypes is 5.4 %.
3
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK LABI-LABI
(Amyda cartilaginea) BERDASARKAN GENOM MITOKONDRIA
EVI RIZKY AMELIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
4
Judul Skripsi
: ANALISIS KERAGAMAN GENETIK LABI-LABI (Amyda cartilaginea)
Nama
NIM
: Evi Rizky Amelia
BERDASARKANGENOM MITOKONDRIA
: G34101008
Menyetujui,
Pembimbing 1
Pembimbing 2
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si.
NIP : 131878947
Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc.
NIP : 131916787
Mengetahui,
Dejan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP : 131473999
Tanggal Lulus : 26 September 200
5
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 20 Mei 1983. Penulis merupakan anak kedua
dari enam bersaudara dari pasangan Asep M Yusuf dan Euis Siti Saelah.
Penulis lulus dari SMU Negeri I Leuwiliang pada tahun 2001 dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis
memilih jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah
Vertebrata pada tahun ajaran 2004/2005. Penulis juga pernah mengikuti praktek lapang dengan
judul Manajemen Pemeliharaan Sapi Perah di Kawasan Usaha Peternakan Sapi Perah
Cibungbulang Bogor.
6
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke Hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
hidayahNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini
adalah
Analisis Keragaman Genetik Labi-labi Amyda cartilaginea Berdasarkan Genom
Mitokondria.
Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan penghargaan dan terima kasih kepada
Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan Ibu Dr. Ir. RR. Dyah Perwitasari, M.Sc, selaku
pembimbing yang telah memberikan fasilitas, pengarahan, kritik, dan saran selama pelaksanaan
penelitian dan penulisan laporan. Terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Nisa Rachmania
Mubarik sebagai penguji yang telah banyak memberikan kritik dan masukan kepada penulis. Di
samping itu, ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada Bapak Bambang Suryobroto, Ibu
Taruni Sri Prawasti, Bapak Tri Heru, Bapak Tri Atmowidi, Ibu Rika Raffiudin, Bapak Adi.
Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak, Mama, Kakek, Nenek, Teh
Rini, Mas Gundul Ignas, Iyank, Leli, dan Adit serta yang terkasih ‘Aa Jembar’ yang telah
memberikan dukungan serta doa dan kasih sayangnya kepada penulis. Tak lupa kepada temanteman Zoologi Anne Susanti, Cynthia, Ae, Hijrah, Yudith, Ati, Duti, Fitri, Anne Nelistia dan
teman-teman Biologi 38 terima kasih atas persahabatannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2005
Evi Rizky Amelia
7
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................................
Tujuan ...................................................................................................................
Waktu dan Tempat ................................................................................................
1
1
1
BAHAN DAN METODE
Bahan. .....................................................................................................................
Metode ..................................................................................................................
Ekstraksi dan Isolasi DNA..........................................................................
Amplifikasi Ruas DNA Target dengan PCR ..............................................
Pemotongan Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi ............................
Analisis Keragaman ....................................................................................
2
2
2
2
2
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil........................................................................................................................
Amplifikasi Ruas DNA Target dengan PCR..............................................
3
3
Pemotongan Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi...........................
3
Analisis Keragaman...................................................................................
Pembahasan............................................................................................................
4
4
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan............................................................................................................
5
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................
5
LAMPIRAN .................................................................................................................
7
8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pola pemotongan enzim restriksi masing-masing haplotipe.....................................
3
2 Keragaman nukleotida antar haplotipe mtDNA A. cartilaginea (di atas diagonal),
situs restriksi yang terdapat pada kedua haplotipe (di bawah diagonal)
dan jumlah situs restriksi setiap haplotipe (diagona)l...................................................
5
DAFTAR GAMBAR
1 Labi-labi Amyda cartilaginea ...................................................................................
2 Posisi primer 577 dan 578 berdasarkan peta genom labi-labi Dogania subplana
(Farajallah 2002) ......................................................................................................
Halaman
1
2
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
Peta situs restriksi dari 12 haplotipe mtDNA A. cartilaginea.....................................
Peta penyebaran sampel A. cartilaginea yang dianalisis...........................................
Pola pemotongan Enzim restriksi DraI, MboI, HhaI, AluI dan HaeIII.......................
Komposisi larutan gel poliakrilamid 5% larutan pewarnaan perak ............................
8
9
9
10
9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Amyda cartilaginea merupakan kura-kura air tawar bercangkang lunak yang termasuk ke
dalam Ordo Testudinata, Subordo Cryptodira, FamiliTrionychidae (Iverson 1992). Famili
Trionychidae secara umum disebut dengan labi-labi. Anggota famili ini mempunyai karapas
(perisai dorsal) dan plastron (perisai ventral) yang sebagian besar terdiri atas tulang rawan (softshelled turtle). Amyda cartilaginea (Gambar 1) mempunyai ciri-ciri kepala berwarna hitam atau
abu-abu, kepala hewan muda pada umumnya dijumpai bintik-bintik berwarna kuning; leher relatif
panjang, kepala hampir dapat mencapai bagian belakang badan; mata berukuran relatif kecil;
lubang hidung terletak di ujung belalai; mulut mempunyai bibir yang tebal; perisai relatif bulat;
kaki mempunyai selaput penuh dan jari-jarinya mempunyai cakar yang relatif kuat dan berujung
lancip (Iskandar 2000).
Gambar 1 Labi-labi Amyda cartilaginea.
Amyda cartilaginea dapat dijumpai di daerah perairan yang tenang, berarus lambat, kadangkadang membenam di dalam lumpur atau pasir dan dasar perairan. Daerah penyebaran A.
cartilaginea meliputi Myanmar bagian timur dan selatan, Thailand, Kamboja, Laos,Vietnam,
Malaysia, Singapura (Lim & Das 1999), sedangkan di Indonesia terdapat di Sumatera, Jawa,
Kalimantan (Iskandar 2000). Lim dan Das (1999)
melaporkan populasi A. cartilaginea
dan spesies kura-kura air tawar lainnya mengalami penurunan karena eksploitasi besar-besaran,
khususnya penggunaan spesies ini sebagai makanan eksotis, obat tradisional Cina, dan lemaknya
digunakan dalam industri kosmetik. Turtle jelly yang berasal dari perisainya dapat digunakan
dalam pengobatan kanker dan juga sebagai obat kuat. Labi-labi kecil umumnya lebih disukai
dibanding yang berukuran besar, karena mempunyai proporsi tulang rawan dan gelatinous skin
yang tinggi (Behler 1997)..
Genom mitokondria (mtDNA) sering digunakan sebagai penanda genetik dalam mempelajari
keragaman genetik hewan dan hubungan sistematik dalam beberapa tingkat hierarki (Lamb et al.
1994). Molekul mtDNA berbentuk sirkular, bersifat haploid karena diturunkan secara maternal,
berukuran kecil (15-20 kb), lebih sederhana dibanding DNA inti dan dapat melakukan replikasi
sendiri. Genom mitokondria pada sebagian besar hewan terdiri atas 22 gen yang menyandikan
tRNA, 2 gen yang menyandikan rRNA (12S dan 16S), 13 gen yang menyandikan protein dan satu
ruas DNA berukuran besar yang tidak menyandikan yang disebut sebagai daerah pengontrol atau
DLoop (Avise 1994). Daerah pengontrol telah dibuktikan merupakan bagian yang paling
bervariasi pada genom mitokondria dan tempat dimulainya replikasi (Avise 1994).
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk memperbanyak DNA secara
in vitro dengan menggunakan sepasang primer. Variasi antar individu dari produk hasil PCR dapat
dikarakterisasi
menggunakan berbagai teknik, antara lain Restriction Fragment Length
Polymorphisms (RFLP). Dengan teknik ini, setiap enzim restriksi memotong molekul DNA pada
runutan nukleotida secara spesifik yang disebut dengan situs restriksi atau situs pemotongan
sehingga menghasilkan sejumlah fragmen DNA. Teknik tersebut telah banyak digunakan dalam
mempelajari keragaman dalam populasi, filogeografi intraspesifik (Walker et al. 1995), sejarah
biogeografi, hibridisasi, pola dan tingkat evolusi dan konservasi (Lawton & Lkiens 2000). Analisis
dengan menggunakan teknik RFLP adalah cara yang cepat, relatif murah sehingga dapat
digunakan dalam jumlah sampel yang besar.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari keragaman genetik labi-labi A. cartilaginea
berdasarkan analisis DNA mitokondria menggunakan teknik PCR- RFLP.
10
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Juli 2005 di Laboratorium
Zoologi Departemen Biologi, FMIPA IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel DNA total labi-labi A. cartilaginea yang merupakan koleksi Laboratorium Zoologi
Departemen Biologi FMIPA IPB, digunakan dalam penelitian ini. Sampel tersebut berasal dari
Pangkalan Bun (sembilan ekor), Senggau (tiga ekor), Banjar Baru (11 ekor), dan Bengkulu (15
ekor). Sampel dalam bentuk DNA total sebanyak 38, sedangkan satu sampel dari Senggau dalam
bentuk darah segar (Lampiran 2).
Metode
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Sampel darah segar labi-labi asal Senggau diambil dari jantung menggunakan siring
berheparin dalam kondisi labi-labi deep anaesthetized. Sel-sel darah dipisahkan dari plasma, dilisis
menggunakan NaCl 0.2% yang mengandung 1 mM EDTA (Etilen Diamin Tetraacetic Acid)
sebanyak 1x volume, kemudian diendapkan pada kecepatan 5000 g selama 10 menit. Hal ini
dimaksudkan untuk membuang sebanyak mungkin molekul hemoglobin. Endapan sel-sel darah
sebanyak 200 ì l disuspensikan dalam bufer 1x STE (NaCl 10 mM, Tris HCl 20 mM, EDTA
0.1mM, pH 8.00) 2 ml dan ditambahkan SDS (Sodium Dodesil Sulfat) 10% 200 ì l dan ProteinaseK 50 mg/ml 30 ì l. Campuran ini diinkubasi 550 C selama 2 jam sambil dikocok pelan. Ekstraksi
dilanjutkan dengan menambahkan NaCl 5 M 200 ì l, larutan fenol 2 ml dan kloroform : isoamil
alkohol (24:1) 2 ml dikocok pelan selama 2 jam dalam suhu ruang pada kecepatan 3500 rpm
selama 10 menit. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol kemudian dipindahkan ke dalam kantung
dialisis DNA dan dilanjutkan dengan dialisis dalam bufer TE (Tris HCl 2 mM dan EDTA 2 mM)
dan diinkubasi dalam refrigerator selama tiga malam. Setiap hari bufer TE diganti dengan yang
baru. Molekul DNA murni dari kantung dialisis dipindahkan ke tabung penyimpan dan tabung
aliquot. Sampel DNA dalam tabung aliquot kemudian yang digunakan dalam penelitian ini.
Amplifikasi Ruas DNA Target dengan PCR
Ruas daerah pengontrol mtDNA diamplifikasi secara in vitro menggunakan PCR ialah daerah
pengontrol yang diapit oleh gen tRNA Pro dan tRNA Phe berdasarkan runutan acuan (Gambar 2).
Penggandaan DNA ini meng-gunakan pasangan primer 577 (5’-TTC ACG AGA GAT AAG CAA
CC-3’) dan primer 578 (5’-CTC GGA TTT TGG GGT TTG AC-3’). Proses PCR menggunakan
mesin TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4 dengan tahap denaturasi pada suhu 940 C selama 60
detik, penempelan primer pada suhu 520 C selama 2 menit dan sintesis DNA pada suhu 720C
selama 2 menit, dan dilakukan sebanyak 30 siklus. Sebelum penggandaan, dilakukan denaturasi
awal pada suhu 940 C selama 5 menit. Di akhir penggandaan dilakukan proses sintesis akhir pada
suhu 720 C selama 7 menit dan penyimpanan pada suhu 100 C sampai mesin dimatikan.
Gambar 2 Posisi primer 577 dan 578 berdasarkan peta genom labi-labi Dogania subplana
(Farajallah 2002)
Komposisi pereaksi PCR sebanyak 50 ì l terdiri atas sampel DNA 2 ì l (10-100 ng), 10x bufer
Polimerase 5 ì l, MgCl 2 2 mM 4 ì l, dNT P 2.5 mM 6 ì l, Taq Gold Polymerase 1 ì l, primer 577
dan 578 1 pmol 2 ì l, BSA 10 ng/ml 2 ì l dan air steril 28 ì l. Produk PCR dimigrasikan dengan
11
teknik elektroforesis gel poliakrilamid 5% dan dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Tegelstrom
1986 yang dimodifikasi) (Lampiran 4).
Pemotongan Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi
Untuk mengetahui keragaman daerah pe-ngontrol, produk PCR dipotong mengguna-kan lima
macam enzim restriksi, yaitu HhaI (GCG• C), HaeIII(GG•CC), AluI (AG•CT ), MboI (•GAT C)
dan DraI (TTT•AAA). Komposisi pereaksi terdiri atas produk PCR seba-nyak 4 ì l, enzim
restriksi sebanyak 2 unit, bufer enzim (sesuai petunjuk produsen) dan air steril sampai volume
reaksi 5 ì l. Campuran diinkubasi pada suhu 370 C yang diinapkan semalam. Hasil pemotongan
dimigrasikan pada gel poliakrilamid 5 % dengan menggunakan bufer 1x TBE (Tris 0.5 M, Asam
Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M) 165 mV selama 100 menit. Dalam setiap gel ikut juga dimigrasikan
DNA ladder 100 pb (Promega). Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid dilakukan dengan
pewarnaan perak (Tegelstrom 1986 yang dimodifikasi).
ð : keragaman nukleotida
S : peluang jika setiap haplotipe
Analisis Keragaman
Fragmen-fragmen
mtDNA
hasil
pemotongan oleh enzim restriksi kemudian
diterjemahkan ke dalam haplotipe. Ukuran
fragmen dapat bervariasi diantara individu
berdasarkan ada atau tidaknya situs restriksi
(Lawton dan Lkiens 2000). Analisis
keragaman dihitung dengan metode Nei dan
Kumar (2000) berdasarkan ada atau tidaknya
situs restriksi.
S = 2 • i