Alat-alat yang digunakan Bahan-bahan yang digunakan Pembuatan Ekstrak Pembuatan ekstrak dilakukan secara sokletasi mengunakan pelarut etanol

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

Metode penelitian adalah metode eksperimental yang meliputi identifikasi tumbuhan, pengumpulan bahan tumbuhan, pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, analisis kromatografi kertas,uji kemurnian dan identifikasi senyawa hasil isolasi secara spektrofotometri ultraviolet menggunakan pereaksi geser shift reagent.

3.1 Alat-alat yang digunakan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah: alat-alat gelas laboratorium, blender national, lampu sinar ultraviolet Nimura, neraca kasar Ohaus, neraca listrik Sartorius, penangas air Yenaco, rotary evaporator Buchi 461, seperangkat alat kromatografi kertas dan spektrofotometer ultraviolet Shimadzu UV-1240, mikroskop, kaca objek, kaca penutup.

3.2 Bahan-bahan yang digunakan

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar ekor naga Rhaphidophora pinnata Schott. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analisis E.Merck yaitu: aluminium III klorida, ammonium hidroksida, asam asetat glasial, asam borat, asam klorida pekat, besi III klorida, etil asetat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, n-butanol, n-heksana, petroleum eter, etil asetat, serbuk magnesium, serbuk seng, etanol, air suling, alpa Universitas Sumatera Utara 43 naftol, timbal asetat, dragendorff, mayer, bouchardat, kertas Whatman No.1 dan No. 3, kloralhidrat, floroglusinol. 3.3 Pembuatan Larutan pereaksi 3.3.1 Pereaksi Dragendorff Sebanyak 8,0 g bismut III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat dan dilarutkan 27,2 g, kalium iodida dalam 50 ml air suling. Campur kedua larutan dan diamkan sampai memisah sempurna. Diambil larutan jernih dan diencerkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.

3.3.2 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g iodium sedikit demi sedikit dan dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 ml Depkes RI,1979.

3.3.3 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,36 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain, 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989. Universitas Sumatera Utara 44

3.3.4 Pereaksi Besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hinnga 100 ml Depkes RI, 1989.

3.3.5 Pereaksi Asam klorida 6 N

Sebanyak 50 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1979.

3.3.6 Pereaksi Asam klorida 2N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1979.

3.3.7 Pereaksi Aluminium klorida 5

Sebanyak 5 g aluminium klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml Harborne, 1989.

3.3.8 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1979.

3.3.9 Pereaksi Asam Sulfat 2 N

Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1995 Universitas Sumatera Utara 45

3.3.10 Pereaksi Molish

Seban yak 3 g α- naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh 100 ml larutan Depkes RI, 1989.

3.3.11 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g Timbal II Asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1989.

3.3.12 Pereaksi Kloralhidrat jenuh

Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan didalam 20 ml air suling Depkes RI, 1989.

3.3.13 Pereaksi Floroglusinol HCl

1 g floroglusinol ditambah beberapa tetes HCl pekat sampai memerahkan lignin Depkes RI, 1989.

3.3.14 Air suling bebas karbondioksida

Sebanyak 500 ml sulingan dididihkan selama tidak kurang dari 10 menit, sambil mencegah sesempurna mungkin dengan udara, dinginkan, dimasukkan kedalam wadah bertutup kedap Depkes RI, 1979. 3.4 Penyiapan Sampel 3.4.1 Pengambilan sampel Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan adalah daun Universitas Sumatera Utara 46 tanaman ekor naga Rhaphidophorae pinnatae Folium segar yang diperoleh dari Komplek Bea Cukai No. 22 Kecamatan Padang Selatan, Kota Madya Padang, Provinsi Sumatera Barat.

3.4.2 Determinasi Tumbuhan

Determinasi tanaman dilakukan oleh lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian Biologi, Bogor Frans, 2007. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 28.

3.4.3 Pengolahan Sampel

Sebanyak 6 kg daun tanaman ekor naga Rhaphidophorae pinnatae Folium yang segar dibersihkan dari pengotoran, dicuci bersih, ditiriskan. Selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan diudara terbuka terhindar dari sinar matahari langsung, setelah kering diserbukkan dengan blender dan serbuk disimpan dalam wadah plastik.

3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

Karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Depkes, 1989; WHO, 1992. Universitas Sumatera Utara 47

3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik Simplisia

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk,ukuran, warna, rasa dan bau dari simplisia daun tanaman ekor naga Rhaphidophorae pinnatae Folium.

3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik Simplisia

Sebelum dilakukan pemeriksaan mikroskopik dari serbuk simplisia maka dilakukan pemeriksaan mikroskopik pada tanaman segar. - Sayatan melintang daun tanaman ekor naga Rhaphidophorae pinnatae Folium Cara kerja: Pada kaca objek ditetesi kloralhidrat, diletakkan sayatan melintang daun tanaman ekor naga, dipanaskan diatas lampu spiritus, tidak sampai kering, dicuci dengan beberapa tetes akuades, kemudian ditetesi beberapa tetes floroglusinol HCl, didiamkan selama 10 menit, ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop. - Sayatan membujur atas dan bawah daun tanaman ekor naga Rhaphidophorae pinnatae Folium Cara kerja: Pada kaca objek ditetesi kloralhidrat, diletakkan sayatan membujur daun tanaman ekor naga, dipanaskan diatas lampu spiritus, tidak sampai kering, dicuci dengan beberapa tetes akuades, ditambah kloralhidrat, ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop. Hasil mikroskopik sayatan melintang dan membujur daun tanaman ekor naga dapat dilihat pada lampiran 5 sampai 7 halaman 32-34. Universitas Sumatera Utara 48 Simplisia Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun tanaman ekor naga. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi larutan kloral hidrat kemudian ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati pada mikroskop. Hasil mikroskopik serbuk simplisia daun tanaman ekor naga dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 35.

3.5.3 Penetapan Kadar Air a. Penjenuhan Toluen

Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian di destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml WHO, 1992.

b. Penetapan kadar air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu alas, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. selisih kedua Universitas Sumatera Utara 49 volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.

3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan diudara di maserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1989.

3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan diudara di maserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes RI, 1989. Universitas Sumatera Utara 50

3.5.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600 o C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Depkes RI, 1989; WHO, 1992.

3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

Sebanyak 25 ml asam klorida encer dimasukkan abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total, kemudian didihkan selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600 o C sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan diudara WHO, 1992.

3.6 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia dari serbuk simplesia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, steroida triterpenoida, tannin, saponin, flavonoida, glikosida dan glikosida antrakuinon, minyak atsiri.

3.6.1 Pemeriksaan Alkaloida

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: Universitas Sumatera Utara 51 a. Sebanyak 3 tetes filtrat ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, maka akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau putih kekuningan. b. Sebanyak 3 tetes filtrat ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendroff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas Depkes RI, 1989.

3.6.2 Pemeriksaaan Steroida triterpenoida

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam. Kemudian maserat yang diperoleh disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman-Bourchard. Apabila terbentuk warna biru kehijauan atau merah ungu menunjukkan adanya steroidatriterpenoida bebas Harborne, 1987.

3.6.3 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling, lalu disaring. Filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Apabila terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman, menunjukkan adanya tanin Depkes RI, 1989. Universitas Sumatera Utara 52

3.6.4 Pemeriksaan Saponin Uji Busa

Sebanyak 0,5 g serbuk simplesia dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas dan didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1989

3.6.5 Pemeriksaan Flavonoida

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol,dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1996.

3.6.6 Pemeriksaan Glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat dipartisi dengan 20 ml campuran kloroform dan isopropanol 3:2, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Lapisan air dikumpulkan, diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa kedalam tabung Universitas Sumatera Utara 53 reaksi, selanjutnya diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati secara 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya glikosida Depkes RI, 1989.

3.6.7 Pemeriksaan Glikosida Antrakuinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan ini berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakuinon Depkes RI, 1989.

3.7 Pembuatan Ekstrak Pembuatan ekstrak dilakukan secara sokletasi mengunakan pelarut etanol

Prosedur pembuatan ekstrak : Sebanyak 150 g serbuk simplisia dibungkus dengan kertas saring, diletakkan kedalam tabung soklet, kemudian pelarut dimasukkan kedalam labu sebanyak 23 bagian dari volume labu, selanjutnya alat dirangkai, dibuka kran air masuk. Mantel pemanas dihidupkan, pelarut dalam labu, mendidih dan menguap, uap pelarut terkondensasi menjadi molekul – molekul air oleh pendingin balik dan uap pelarut yang panas ini turun menyari zat aktif didalam simplisia, dan jika uap yang menyari zat aktif telah mencapai permukaan sifon tube, seluruh cairan akan turun kembali kelabu alas bulat melalui pipa kapiler sifon, sehingga terjadi sirkulasi dan Universitas Sumatera Utara 54 seterusnya. Aliran pelarut ini disebut dengan 1 satu kali sirkulasi pada alat soklet. Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan yang melewati pipa kapiler sifon tidak berwarna. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan. Bagan ekstraksi serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 56.