Analisis Sekuen DNA yang Terlibat dalam Patogenesitas dan Perancangan Primer PCR Spesifik untuk Xanthomonas axonopodis pv. glycines

ANALISIS SEKUEN DNA YAMG TERLIBAT DAIAM
PATUGENISITAS DAN PERANCANGAN PRIMER PCR
SPESlF lK UNTUK Xanthomonas axonopodis pv. glycines

SEKOUH PASCASARJANA
I NSTlTUTFPERTANIAN BOGQR
20M

E m PRATIWI. Analisis sekuen DNA yang terfibat dalam patugenisitas dan
perancangan primer PCR spesif ik untuk Xanthomonas axonapodjs pv. glycines,
Dibimbing oleh ANTQNlUS SUWANTQ (Ketua Kornisi Wrnbimbing), BUD1
TJAHJONO, MAGGY 7". SUHARTONO, APIJA MERYARIDINI, dan

M. MACHMUD

(Anggofa Komisi Psrnbimbing).

Xanfhomonas axunopodis pv . glycines (Xag) manyeba bkan penyakit pustul

bakteri pada kultivar-kuftivar kedelai yang rentan. Pemahaman terhadap rnakanisme
patugenisitas dan interaksi antara tanaman kedetai dengan Xag sangat penting

untuk rnengembangkan strategi pengendatian penyakit. Panefitian ini bertujuan
untuk: (i) rnanganalisis gen yang terlibat dalam patogenisitas Xag sebagai suatu

pendekatan dalam memahami mekanisrne patogenisitas pada Xag, dan (ii)
rnerancang primer-primer PCR spesifik terhadap Xag.

Mu&# non-patogenik Xag M715 telafi dikanstnrksi dari Xag YR32 tipe liar
rnalalui mutagenesis transposan rnenggunakan transpason turunan 375. Dari hasil
analisis sekuen DNA diketahui bahwzl gen yang diinaktivasi alah transpuson pada
mutan M715 rnenyandikan TunB-dependent m p f o r yang befperan dalam
pengambilan kornpleks ~a*-sidetofor ka &lam sel.

lntroduksi plasmid yang

mengandung fragmen DNA dad gen patagenisitas Xag YR32 pada M715
rnsrnulihkan patogenisitas M715 secara parsial.
Pada penelitian ini telah berbasil diklon fragmen DNA berukuran 1.8 kbPstl

dari genom Xag YR32, juga telah behasil dirancang dua primer PCR yang spesik

terhadap Xag yaitu: primer EttyOl (5'-TTgCggCgATTg-3') dan primer EttyO2 (5'-

CgCATgCCATFg-3'). Arnplifikasi

DNA genorn Xag menggunakan kedua primer ini

menghasilkan satu arnplikan barukuran 436 bp.

Analisis hibridisasi Southern

terhadap lima patovar Xanfhamonas dan lima isolat Xag tipe liar asal Indonesia dan
Taiwan menunjukkan bahwa gen patoganisitas ini sangat spesifik ierhadap Xag.

ABSTRACT

ETTY PRATIWI. Analysis of DNA sequence involved in pathogenicity and design of
specific PCR primer for

Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Supervised by

ANTQNIUS SUWANTU (Chairman of advisor), BUD1 TJAHJQNQ, M G G Y 1".

SUHARTONO, ANJA MERYANDINI, and M. MACHMUD (Coadvisors).

Xanfhomonas axompodis pv, glycines (Xag) causes bacterial pustules an
susceptible soybean cultivars.

Therefore, understanding on the? mechanism of

-

pathogenicity and soybean Xag interaction are paramount impartant to develop
strategy far disease control and as a model system fur a similar phenomenon. The

objectives of this work are: (i) to identify pathogenicity gene(s) of Xag as an

approach to understand the mechanism underlying specific pathogsnicrty in this
group of bacteria, and (ii) to design specific PCR primers for Xag. A non-pathogenic

Xag mutant derived from the wild type strain Xag YR32, designated M715, was

constructed employing a mini-Tn5 transpusan. We have cloned a 1.8 kb-Pstl DNA

fragment from Xag YR32.

DNA sequence analysis indicated that the gene

inactivated by the transposon in M"7 5 encoded a TonB-dependent receptor which is
invofved in uptake of ferric-siderophore into the cell. Introduction of a broad-host
range plasmid harboring a corresponding DNA fragment from the Xag YR32 into
MY15 restored, albeit partially, pathogenicity of the mutant. We have designed two

specific PCR primers for Xag, i.e., EttyOl (5'-TTgCggCgATTg-3') and EttyQ2 (5'CgCATgCCATTg-3'). Arnpfificatian af Xag genornic DNA employing these specific

primers generated a 436-bp amplimn.

Southern hybridization analysis of five

pathavars of Xanfhomonas and five wild types of Xag from Indonesia and Taiwan
indicated that the pathogenicity gene was unique to Xag.

Saya mahasiswa Pascasarjana fnstitut Pertanian B q a r yang bsrtanda

tangan di bawah ini:
Mama

: Etty Pratiwi

NRP

: 99.5127

Program Studi

: Biofogi

Sub Program Studi

: Mikrabialogi

rnenysrtakan bahwa disertasi saya yang berjudul:

"Analisis Sekuen DNA yang Tertibat dalam Patogenisitas dan Perancangan
Primer PCR Spesifik untuk Xanfhomnes axonopodis pv, glycims"

adalah benar-benar hasil penelitian dan tulisan saya, seda disertasi ini M u m pernah
dipublikasikan.
Dernikian swat pernyataan in! dibuat dengan sebenar-benamya, tanpa ada

paksaan dari pihak mana pun juga.

Bogor, April 2004
Yang mernberi gemyataan,

ANALlStS SEKUEN DNA YANG TERLIBAT DAMM
PATOGENISITAS DAN PERANCANGAN PRIMER PCR
SPESlFlK UNTUK Xanthomonas axonopodis pv. glycines

Disertasi sebagai salah setu syarat untuk mernperoleh gelar

Doktor

dalarn bidang Biologi (Mikrobiologi)
pada
Sekalah Pascasarjana, tnstitut Pertanian Bugor

SEKOMH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2004 .

: Analisis Sekuen DNA yang Tsrlibat dalarn Patugenisitas
dan Perancangan Primer PCR Spesifik untuk
Xantfromonas axunopodjs pv. gkcines

Nama Mahasiswa : ETTY PRATlWi

n

Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M-Sc.

Dr. Anja Mervandini, MS.
Anggota

Ketua

Dr. Muhammad Machmud. M.Sc..APU.
Anggota

RIWAYAT HtDUP
Penufls dilahirkan di Puntianak pada tanggal 19 April 1963 sebagai anak
sutung dad tiga bersaudara dari pasangan Amien Ractrman dan Vonny Amin.

Penulis rnenyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar hingga Sekolah Menengah Atas
di Jakarta.

Pada tahun 1982 penulis diterima sebagai rnahasiswa lnstitut Pertanian
Bogor (fPB) melalui jalur Proyek PeFintis I!.

Pada tahun 1986 penuiis iulus sebagai

Sajana Pertanian. Pada ttlhun 1996 penulis ditetima di Program Skrdi Biafogi pada
Program Pascasajana IPB dan menamatkannya pada tahun 1999. Kesernpatan

untuk melanjutkan ke program doktor pada program studi dan perguruan tinggi yang

sama diperaleh pada tahun 1999. Baasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh
dari PAATP, &dan Litbang Departemen Pertanian Republik Indonesia.
Penulis bekarja sebagai Panetiti di Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknolagidan Surnberdaya Genetik Partanian (BRBiugen) sejak

tahun 199Q.

Bidang peneliian yang rnenjadi tanggufigjawab peneliti adalah

mikrobiolagi.

Selama rnengikuti Program 53 penulis berkesernpatan mendahmi teknik
bialogi rnofekukr untuk Xsnthumnas di National Chung-Hsing University, Tatchung,

Taiwan pada April - Agustus 2000. Karya itmiah bejudul "A unique DNA sequense
involved in pathogenesis of Xantfiomorras axonopodis pv. gfpims" tetah disajikan
pada 8f" fntemational Congtess of Plant Pathology di Christchurch,

New Zealand

pada Februari 2003. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari disertasi penulis.

Syukur Alhamdulillsh atas segala rahmat dan hidayah A%ahS W , penulis

dapat rnanyelesaikan disertasi yang berjudul: "Analisis Sakuen DNA yang Terfibat
dalam Patogenisitas dan Perancangan Primer PCR Spesifik unkrk Xanthomonas
axonopadis pu. glycines".
Selama pslaksanaan penelitian dan penulisan faparan penulis banyak
mendapat bantuan dari bebagai pihak, baik bsfupa dana penelitian, saran

perbaikan, semangat rnaupun dm. Untuk itu penulis msnggunakan bagian in! untuk
mengungkapkan rasa teFirna kasih kepada semua pihak yang telah memberi
bantuan tersebut.

Dengan segala kerendahan hati dan rasa tulus, penuiis menghaturkan terima
kasih yang tak temingga kepada Prof. flr. Ir, Antonius Swanto, M.Sc. atas segala

bimbingan yang sangat intensif dan luar biasa sejak penyusunan usulan penelitian,

pefaksanaan penelitian dan penulisan disertasi. Penulis merasa sangat beruntung
dibimbing oleh beliau, karena sefain karena swat ilrnu, beliau juga rnerupakan figur
ilmuwan yatlg patut diteladani.

Psnulis mendapat banyak pengalaman berharga.

Atas rekumendasi beliau, genulis mendapat kesempertan untuk memperfuas
wawasan, serta mendatami teknik biotagi rnatekuler di fnstifufe of Mole3cuIarBidogy

-

National Chung-Hsing University, Taiwan dan Scottish Agricultural College (SAC),
Edinburgh, Scotland.

%lama menjsdi bimbingan beliau, penulis berkesernpatan

menjadi asisten mata kuiiah Genetika Mikraba, Bialagi Keragarnan Bakteri, serta

dilibatkan sebagai pangajar dalam kegiatan "4'h/ntamaf/unafTminiw C o m e on
Advances in Mu!ecuIar Bidogy Techniques to Assess Microbial Biadim~iw.

2

Untuk itu penulis berdoa semoga Altat S W mencatat dan mernbalas segata

Pada kesernpatan ini perkenankan pula penufis menyampaikan umpan

terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada:
I.Dr. Ir. Bud#Tjahjono, M.Agr., selaku anggota kamisi pembirnbing dan Ketua
RUT VII atas segala birnbingan dan biaya peneiitian yang telah bliau berikan.
Tidak henti-hentinya kliau memberi .dorangan kepada pnulis untuk

rnenyetasaikan psnulisan disertasi.

2, Prof. Dr, Ir, Mtrggy T. Suhartono, selaku anggota kornisi pembimbing dan
Kapala Lab. Mikrabiolugi dan Biakimia PAW Bioteknotagi IPB tempat pnulis
malakukan awal penelitian. Sebagai searang ilmuwan dengan sikap keibuannya

yang rnenyentuh, beliau banyak memberi masukan dan dorongan dalam rnanulis
disertasi.
3. Dr. Anja Meryandini, M.S., selaku anggata kurnisi pembimbing atas saran
birnbingan dan diskusi yang rnenarik selarna penulis metakukan penalitian.
4. Dr. Fn, Machmud, M,Sc,, APU,, selaku angggata kamisi pembimbing atas segala

saran, koreksi yang sangat teliti dan kessmpurnaan penulisan disertasi ini.
5. Prof. Yi-Hsiung Tseng, atas segala dana, fasilitas, dan birnbingan selarna

penul is mernperdalarn teknik bialogi molekuter Xanthomonas di Institute of
Molecular Biology - National Chung-Hsing University, Taiwan.
6. Dr, Rob Hading, afas segala fasilitas dan bantuail selarna penulis rnelakukan

skrining plasmid tekombinan pernbawa gen patogenisitas Xag di Scottish
Agricultural Cuttege (SAC), Edinburgh, Scatland.

3

Tanpa ingin mengabailran beberapa nama, ucapan terima kasih juga penulis
sarnpaikan kepada:

1. Sekretafis 8adan LitbanglKetua Komisi Pembinaan Tenaga Kerja Departernen
Perhnian yang telah rnemberikan kesernpatan kepsda psnutis untuk
menyelesaiktan Program Doicfor di Sekolah Pascasarjana lnstitut Pertanian

Bogor,

2. Pimpinan Proyek PAATP Badan Li@ang Pertanian, Departernen Pertanian atas

segala bantuan dana pendidikan yang diberikan selama penulis menyelesaikan
studi.
3. Kapala Balai Bsar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan

Surnberclaya Genetik Pertmian (BE-Biagen) yaw telah rnencalonkan dan
rnemberikan kesernpatan kepada penulis untuk menernpuh pendidikan di

Sekolah Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor.
4. Direktur dan staF Southeast Asian Regional Centm for Tmpjcal Biology

(SWMEO-BIUTRQP) atas sarana maupun fasilitas laboratoriurn,ternpat penulis
melakukan konstruksi plasmid rekornbinan, pangujian-pengujian mutan, dan
bioesei kotiledon.

5. Sernua rskan-rekan mahasiswa satu bimbingan: lrawan Tan, Diana Waturangi,

Dinamelh Wahyuningnrrn, Ni Nyoman Tri Puspaningsih, Widanami, Yogiara,
Esti Puspitasari, Andi Khaeruni, Pieter Riupasa, Selly Salma, Numasanah,
Annitaqwa, Yuliasari tsrnail, Cecilia Seumahu, Any Fitriani; adik-adik rnahasiswa

S-7, serta Bapak Husen Sarnhari. Panulis mengucapkan terirna kasih atas
bantuan dan persahabatan yang baik sslama peiaksanaan penelitian di

Laboratorium Biologi Malekular SEAMEO-BIOTROP.

4

Ungkapan terirna kasih yang tulus dan setinggi-tingginya pgnulis sampaikan

kepada suamiku tercinta Ir. Nanang Hadadi, M.Sc, serta anak-anakku tersayang
Lukman Adi Prananto dan Vinnyssa Anindh dan kedua orang-tuaku atas segala

dua, kasih sayang, dukungan, waktu, pengertian dan pengarbanannya yang sangat
luar biasa.

Kepada semua pihak yang telslh rnembantu dan tembutkan namanya,
penulis uapkan terirna kasih atas segata banhannya.

Semaga bantuan ini

senantiam mendapat:imbalan yang setimpal dari Allah SWT. Amin.

Sugar, April ZOU4
Etty Pmtiwi

1.8. Uji Komplementasi ...................................................
1.9. Kanjugasi Tiga Tetuua ................................................
1.10. Efektroporasi ..........................................................
1.1 1. Bioesei Patogenisitas pada Kotitedan Kedelai ...............
2. Perancangan Primer-primer Spesifik Terhadap Xag ...............
2.1. Uji Spesifisitas PCR ..................................................
IV. HASlL DAN PEMBAHASAN ......................................................

A . Anatisis Gen yang Terfibat datarn Patogenisitas Xag ..................
1. Hibridisasi terhadap Bebrapa Patovar Xanthomonas ...........
2 . Posisi Gen pat XAG pada Xag Y R32 .................................
3 . Kloning Gen pat XAG .....................................................
4 . Pemetaan Plasmid pEPHl1 ............................................
5 . Sekuen DNA dan Analisis Gen pat XAG ............................
6. Analisis Gen Knack Out (Double Cmssover Recombination)...
7 . Uji Komplernentasi M7?5 ...............................................
8 . Bioesei Kotitedon Hasil Uji Komplementasi Xag M735 ..........

8. Perancangan Primer-primer PCR yang Spesifik terhadap Xag .....
1. Posisi Penyisipan f ransposan pada Mutan Xag M715 ..........
2. Amplifikasi DNA Pengapit Tfansposan dengan hverse PCR ...
3 . Hibridisasi terhadap Beberapa Patovar Xanthomonas ...........
4 . Perancangan Primer PCR ................................................
5 . Spesifitas Primer PCR ...................................................
V . KESIMPUUN DAN SARAN

......................................................
A . Kesirnpulan ......................................................................
8. Saran ...............................................................................

VI . DAFTAR PUSTAKA .................................................................

DAFTAR TABEL

1.

Gafurgalur bairteri dan plasmid yang digunakan dalarn penelitian........

2.

Hasit pngujian patogenisitas dengan bioesei kotiledon ...... ................

18

58

DAFTAR GAM8AR

t.

lokasi dan susunan protein-protein transrnernbtan Tans-ExbBExbD pada rnembran sitoplasma E. coli (Braun f 995) ..................

12

2.

Hasil esei patagenisitas dengan bioesei kotiledon. Xag tipe liar
rnenimbulkan gejala kuning klaratik, sedangkan Xag An715 nonpatogenik tidak rnenimbulkan gejala kuning klaratik, Umur
kotifedon 7 hari, umur biakan 24 jam pada media Y DC padat,
inkubasi 28-30% selama 5 hari (Rukayadi 1998) ........................

14

4.

Analisis patugenisitaslkaraMerisasigen patugenisitas Xag ...........

22

5.

Elektrofaresis DNA genorn beberapa patovar Xanfhomonas y ang
didigesti dengan Psff (A). Hasil hibridisasi Southern untuk
rnengetahui posisi gen yang terlibat dalam patagenisitas bekrapa
patavar Xanfhomunas menggunakan fragrnen 0,7 kb (pAAO1EmRl) sebagai gefacak (0) ...................................................

36

Elektroforesis DNA genorn Xag yang didigesti sempurna dengan
berbagai enzirn restriksi (A). Hasil hibridisasi Southern untuk
rnengetahui pasisi gen yang terlibat patagenisitas pada Xag YR32
menggunakan pAAOl-EmRI sebagai pelacak (B) .....................

37

ElektrufaresisDNA genorn beberapa isalat:X, axonopodis pv.
glycines dari Indonesia dan Taiwan yang didigesti dengan Psfl (A).
Hasil hibridisasi Southern menggunakan fragrnen DNA pengapit
transpuson 0.7kb (pAAOt- EcoRl) sebagai pelacak ...................

39

Strategi konstruksi plasmid pembawa gen yang terlibat dalam
patogenisitas Xag YR32 ........................................................

40

Elektraforesis hasil arnplifikasi PCR beberapa plasmid rekarnbinan
pEPH1 I dengan primer EQO1 dan Ern02 menggunakan DNA
pofymerase terrnostabil prodrrksl Qiagen GmbH (Germany) pada
suhu pelekatan primer 5U°C ....................................................

41

6.

7.

8.
9.

24.

Perbedaan gejala kuning klarotik mutan M715 komplernentasi pada
hari ke-5 dan hari ke-la setelah inakulasi ...................................

25.

Elektroforesis DNA genom Xag M7 15 yang didigesti dengan
beberapa enzirn restriksi (A). Hasii hibridisasi Southern untuk
mengetahui posisi peny isipan transgoson pada mutan Xag M715
rnenggunakan pUC4K sebagai pelacak (8).................................

26.

Situs PsA pada DNA pengapit transpason mutan Xag M715 ...........

27.

Arnplifikasi DNA pengapit transpusan pada rnutan Xag M175-Pstl
dengan teknik fnvorse PCR, rnenggunakan primer Km-Tn903 dan
M I 3-F.., .............................................................................

28.

Sekuen salah satu fragrnen DNA pengapit transpuson ..................

29.

Hasil keluaran atau output perancangan primer PCR EttyOl dan
EWU2 menggunakan prugram Primer3 (hhttp:ilwww.iustbiu.com) .....

30.

Elektroforesis hasil arnplifikasi PCR DNA genom beberapa patovar
Xanthomonas dengan primer EttyOj-€tyO2, rnenggunakan DNA
polymerase termustabit dari Qiagen GmbH (Germany) pada suhu
pelekatan primer 45OC ............................................................

31.

Elektrufuresishasil arnplifikasi PCR DNA genorn beberapa patovar
Xanthomonas dangan primer Et€yO1-Etty 02, rnenggunakan DNA
plymerase termostabil dari Finnzyrnes OY (Finland) pada suhu
peiekatan primer 45% .........................
... ............................

32.

Peirjajaran atau alignment protein sistem sekresi tipe II dari Xac (X.
a. pv. citH str. 306)dan Xag (X. a. pv. glyci~esY R32)....................

33.

Elektruforesis hasil arnplifikasi PCR DNA genom beberapa patovar
Xanthomanas dengan primer EttyU t -Etty02, rnenggunakan DNA
polymerase termostabil produksi Qiagen GmbH (Germany) dan
Finnzyrnes OY (Finland) pada suttu pelekatan primer 5U0C ............

xvii

DAFTAR UMPXRAN

1.
2.
3.

4.

Hasil analisis wkuen gen yang tedibat patogenisitas X. axonopadis
pv. glycines (1793 nt) rnenggunakan program BWSTN 2.0 ............

82

Hasil analisis sekuen gen yang terlibat patogenisitas X. axonopodis
pv. glycines (nt 1100-1 6QO)menggunakan program BUSTN 2.0...

85

Open Reading Fmme (ORE) gen iroM penyandi TunB-depncjent
receptor pada GenSank AEO ii700 ..........................................

84

Open Reading Fmme (ORF) gen xcsN psnyandi type fl secretion
sysf8mpmt~inNpadaG~nBankAEQ11699
.................................. 88

I. FENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kedelai (Glycine max (L) Memil) rnentpakan salah satu jenis tanarnan pangan

yang sangat dibutuhkan oteh penduduk Indonesia.

Wataupun Indonesia

dikategorikan sebagai sala h satu negara penghnsil kedefai di dunia, tetapi
produksinya rnasih sangat rendah, yakni hanya sebesar 1,7 juta ton pacla tahun
2001 @ira Pusat Statistik 2001).

ProduMivitas kedelal di lndonesis ini jauh di

bawah rata-rata produittkritas nagara penghasil kedelai lainnya, seperti Amerika
Serikat yang mencapai 2,8 tunha maupun Brazil dan Argentina yang mampu

menghasilkan lebih dari 2,Utonha (Adisarwanto dan Wudianto 1999).
Dari ssgi luas areal tanaman kedelsri, Indonesia yang memifiiri 1,4 juta ha

areal tanaman kedelai menduduki peringkat ketiga setetah China (8juta ha) dan
fndia (4,s juta ha), tefapi dnri sisi produksinya Indonesia tranya rnenduduki peringkat

keenam setelah AS, Brazil, Argentina, China, dan India.

Rendahnya produlrtivitss

pertanaman kedelai dapat disebabkan obh bberapa faktor, antaw lain kerusakan
aleh hama dan penyakit yang belum tertangani dengan baik. Salama tahun 1998
serangan penyakit kedelai yang mengakibatkan kentgian atau kehlangan hasil

panen kedelai di Indonesia mencapai 447.500 tan atau setara dengan US$32,5 juta
(Wrather et a/. 2001).

Salah satu penyakit utarna tanarnan kedatai yang

mengakibatkan kerugian cukup serius di Indonesia adalah penyaki bisul bakteri

yang disebabkan oleh Xanthomonas axonopudis pv. glyctnes (Xag). Sernuta nama
patogen penyebab penyakit bisul bakteri ini adatah X.

camwstn's pv. glycines, tetapi

berdasarkan ciri-ciri DNA yang dianalisis rnenggunakan teknik hibridlsasi DNA-DNA,

baMeri ini dimasukkan ke dalam spesiss X, axonoporlis pv. gtycines betsarna-sama

2

dengan 34 patovar lainnya (Vauterin ef a/. f 995). Penurunan produksi kedelai yang

disebabkttn oleh penyakit bisul bakteri ini dapat mencapai 53% (Shukla 1994).
Penyakit bisui baked banyak terdapat di wilayah beriklim hangat dan lernbab
(Kennedy dan Sincfair 1989), termasuk areal pertanaman kedelai di Indonesia

(Machrnud et a/. ? 999). Gejala awal penyakit ini ditandai aleh bercak kecil, berwarna
Rijau muda dengan bagiatt tengahnya agak rnenonjol ke pemukaan daun. Bercak

mernbesar dan di bagian tengatrnya terdapat tonjolan seperti bisul berwarna coltlat
muda. Serangan penyakit yang parah dapat mengakibatkan gugurnya daun sebelum

waktunya, sehingga pengisian pafang tidair sempurna (Anonim 1990). Walaupun
penyakit bisul bakieri ini tersebar di seluruh pertanaman kedelai di Indonesia,

penelitian tentang penyakit ini k l u m banyak dilakukan.

Penelitian yang telah

dilakufian rnasih seputar pengarnatan gejala dan ketahanan penyakit yang seringkali
tidak dipublikasikan.

Penyebaran penyakit bisul bakteri dapat terjadi melalui biji dan sisa-sisa

tanaman di lapangan (Sincfair dan Buckman 1989). Pengendatian penyakit ini di

fapangan pertu ditangani dengan baik, karena Xag rnerripakan salah satu patogen
yang bersifat seed borne atau terbawa benih, dan dapat berada secara internal

rnaupun eksternal pada benih kedelai (Neergaard 1979, Mortensen 1989).
ldentifikasi dan deteksi bakteri Xag secara visual sulit dilakukan karena benih yang
terinfeksi Xag tidak rnenunjukkan g ~ j a l ayang khas. Untuk mendukung keberhasilan
program sertifikasi k n i h guna menjamin benih kedelai yang bebas patagen
diperlukan suatu tsknik deteksi yang cepat dan sensitif (Verdier 1998).

Mekanisme patogenisitas pada genus Xanfhomonas bglum banyak
dipsthami. Hasil penelitian yang dilakukan Daniel (1988) rnenunjukkan terdapat 20
sampai 100 gen yang terlibat dalarn rnekanisme patogenisitas baMsfi ini. Penelitian

3

mengenai patogenisitas penyakit bisul baktsri pada level molekuter pernah dilakukan

aleh Hwang et a/. (1992) yang mempelajari gen-gen yang terfibat dalam
patogenisitas dengan mra mengkanstnrksimutan Xag non-patogenik rnenggunakan
mutagen kirniawi N-methfly,N-nifmIV'-nitmsogtianidine.
Hanya saja gen yang

terfibat patogenisitas pada Xag ini tidak. unik, karena bersifat conserved pada
patovar-patovar Xanfhomonas, bahbn pada baicteri patogen sewra urnum,
Sedangkan di indonasia, penelitian mangenai mekanisme patogenisitas

penyakit bisul bairteri pada taraf rnolekuler blah dimulai sejak tahun 1992 di
laboratoriurn kami (Mesak et sf. 1994). Pada tahun 1 998 Rukayadi mendapatkan

mutan Xag M715 nan-pattogenik. Mutan isogenik ini dikanstruksi dad Xag YR32 tipe

liar melalui mutagenesis rtransposon rnenggunakan pYR I 03 yang rnenrpakan

tunrnan dan' Tn5 (pUTmini-TnfKrn) dengan tarnbatran antibiotika timethoprim atau
gen Tp' (gen Tp' diisolasi dari pAS396 menggunakan enzim Asp71 8 dan Notf).
Meskipun mutan Xag M715 tidak menampilkan fenotipik yang b e h d a dengan tipe

liarnya, tetapi dsngan bioesei kotiledon diketahui bahwa mutan ini kehilangan sifat

patogennya. Selain kehilangan patoganisitas yang ditunjukkan dengan tidak
tarnpaknya gejala kuning klorotik pada kotiledon yang diinokulasi pada biaesei
patogenisitas katiledan, mu&n Xag M715 juga tidait rnarnpu menginduksi respon

hipersensitif pada daun tarnat. Hal ini rnenarik untuk diteliti lebih fanjut guna

rnenelaah mekanisme patogenisitas Xag pada taraf mofekufer. Itu sebabnya perfu
dilakukan kloning dan analisis gen yang menyebabkan hilangnya patogenisitas Xag

YR32 tipe liar.
Hasil hibridisasi Southern menggunakan pelacak pYR?03 berukuran 2,8 kb-

EcoRl menunjokkan bahwa transpusan menyisip pada potongan t 85 kb skixotipeAsel kromosom mutan Xag An715 (Rukayadi .t 998). Selanjutnya Akhdiya (2000)

4

blah mengarnplifikasi fragmen DNA pengapit transposon berukuran 0,7kb dengan

tekn ik Inverse PCR menggunakan primer Urn- Tn903 (5;SAATATggCTCATAACAC-

3') dan Mt 3-F (5'-TgTAAAACgACggCCAgT-3'). Fragrnen DNA pengapit fransposon

tersebut telah disisipkan pada plasmid rekornbinan pAAU?.
Pemahaman rnengenai mekanisme patogenisitas secara

malekuler

rnerupzlkan dasar utarna untuk rnengembangkan aplikatif lain, diantaranya

perancangan primer PCR untuk mendeteksi patogen secara akurat dan spesifik

yang dapat dipakai untuk mempstajari epitlemiolagi penyakit bisul bakteri pada k n i h
atau pertanaman kedelai dan lembaga sertifikasi benih untuk mendetebi Xag pada

benih-benih kedalai.

Panelitian ini hrtujuan untuk: (i) rnenganaliais gen yang terlibat dalarn
patogenisitasdalam upaya mempetajari mekanisrns patogenisitas pada Xag dan (ii)

rnemncang primer-primer PCR spesifik terhadap Xag.
Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilakukan serangkaian prcubaan

untuk: (2) mengidentifikasi pasisi penyisipan transpason pada mutan Xag M7f 5, (2)

memncang primer PCR yang spesifik terhadap Xag menggunakan program Primer3
(http:l/www.iustbio.com), (3) menguji optimasi kondisi PCR pada suhu pelekatan

primer 45% dan 5Q°Crnenggunakan DNA polymerase tarmostabil produksi Qiagen
GmbH dan Finnxymes OY, (4) menguji spesifisitas primer PCR dengan
membandingkan hasil amplifikasi PCR terhadap bebrapa patovar Xsnthomonas
lain, yaitu X. axonopodis pv. begonia@,X.

axonopodis pv. citri, X. axonopodis pv.

glycines, X. campest#s pv. campestis, X. axompodis pv.

phaseofi, d m

5

X.axonopodis pv. vesicato#a, (5) rnelokalisasi gen yang terfibat dalam patogenisitas
pada Xag YR32, clan mengklon gen tersebut pada pOK12 sebagai cloning vector,

(6)mensekuen dan rnenganalisis gen yang teeitsat dalam patogenisitas XagYR32
untuk mengetahui posisi promoter pufatif, RBS (ribosome binding sits) putatif, serta
situs penyisipan transposan pada gen yang terfibat patugenisitas XagYR32, (7)

melakukan double cmsmver recombination untuit mengetahui apaka h gen yang
mengalami rnutasi bemifat pteiotrofik atau bukan, (8) mslakukan uji komplementasi
untuk mengetahui apakah gen yang airan dikfon memang b n a r terlibat dalarn

patogenisitas Xag, (9) rnelakukan biaewi katiledon terhadap ekskunjugan hasit

double cms-owr recombination dan ekskunjugan hasil komplementasi melalui
pengamatan gejala kuning klorotik yang terbentuk.

C. Manfaat Pentsfitian
Diharapkan dari penelitian dihasilkan ketuaran berupa primer-primer PCR

yang spesifik untuk rnendeteksi Xag dari tanaman atau benih.

Pemahaman

rnekanisme patogenisitas pada Xag pada level malekuler dapat digunakan untuk
mempetajari epidemiologi penyakit bisul bakten' pada benitr afau pertanaman

kedelai. Beberapa manfaat prakis yang dsrpat diperateh dad hasit penelitian ini,

adalah dapat digunakan untuk: (1) uji kesehatan benih kedetai pada lembaga
sertifikasi knih, (2) pengsndalian hayati pnyaki bisul bakteri, dan (3) (roleksi dan

konservasi Xag.

A. Penyebab Penyakit Bisul Bakteri
Penyakit bisul bakteri pada tanaman kedelai disebabkan oleh Xanthamonas

axonopodis pv. glycines. Menurut Bradbury (1986) sebelumnya bakteri ini merniliki
beberapa sinonim yaitu Pserrdornonas glycines Plakano t919, Bacf@#umphaseoIi

var. sojensis Hedges 1922,

P, phaseuli var.

sojensis (Hedges) Stapp 1928,

Phyfomonas phaseoii var, sojenw (Hedges) Stapp 1928, Bacterium glycines
(Nakano) Elliot 1930,Phflamonas glycines Na kano 1937,X, phaseofi var. sojensis

(Hedges) Stan & Burkhalder 1942, X. glycines (Nakano) Magtau dan Prevut 1948,

X. soj@nses (Burltholder) Hedges .f 964, dan X. campestn's pv. glycines (Nakana)
Dye 1978.

Bakteri X. axonopodis pv. glyciines sebelumnya lebih dikenal sebagai

X.campestris pv. glycines, tetapi krdasarkan ciri-ciri DNA-nya yang dianalisis

menggunakan teknik hibridisasi DNA-DNA, baMeri ini dirnasukkan ke dalam spesies

Xanthomonas axortopodis bersarna-sama dengan 34 patavar lainnya (Vauterin et al.
1995).

Bakteri Xag terrnasuk Gram negatPf berbentuk batang, berukuran 0.5-0.9grn

x 1.4-2.3 pm, clan rnotil yang rnernDiki satu flagelurn polar.

Pada media beef

infusion agar kolani berwarna kuning pucat (semakin lama rnenjadi kuning tua
sesuai dengan bertambahnyrt umur koloni), berukuran kecil, bulat, dan licin dengan

tepian yang rata.

maksimum 38'C,

Suhu petturnbuhan optimal berkisar antara 30-33% (suhu
dan suhu minimum lU°C).

Pada kultur turnbuh bakteri

rnenghasifkan auksin, bakteriosin, dan eksopolisakarida (Sinclair dan Buckman

1989).

7

Berdasarkan konstnrksi peta fisik kromosom yang dilakukan oleh Widjaja et

a/, (1999) diketahui Xag rnerniliki satu kramasam sirkuler berukuran sekitar 5,Q Mb.
Sebagai perbandingan, da Sifva ef al. (2002) melaporkan bsxhwa X. axonupodis pv.

citri (Xac) dan X. ciampesfn's pv, campestris (Xcc) masing-masing memiliki satu
krornosorn sirkuler berukuran 5,2 Mb dan 5,1 Mb.
Bakteri Xanthomonas dikenaf sebagai mikrob yang rnerniliki kandungan O/b
G+C tinggi. Kandungan persentase mol (G+C) Xanthomonas umurnnya berftisar
antara 63-71% (Bradbury 1986).

Penelitian yang dilakukan aleh da Sifva et al.

(2002)rnenginfomasikan babwa kandungan % G+C pada DNA genom Xacdan Xcc
masing-masing sebesar 64,7% dan 65,096,KandMgan parsentass mat (G+C) DNA

genarn sangat penting untuk prnilihan enxirn restriksi yang akan digunakan urttuk

mematang DNA genom tersebut. Widjaja et a/. (1999) berhasil rnambuat peta
makrorestriksi dari kromosom Xag YR32 dengan teknik Pulsed-Fbld Gel

EIectmphoresis (PFGE) rnenggunakan enzirn restriksi yang kaya AT, yaitu Pacl(5'dan S wal (~'-ATI"T&MT-~').
TTAATJTAA-3'), Pmel (~'-GT"!T&WC-~'),

8. Patogenisitas Bakbri Patogen Tanaman
Patagenisitas bakteri dapat diuji krdasarkan respon hipefsensitivitasnjra

pada tanaman kmbakau (Kfernent dan Goodman f 967). Pada umumnya respon
hipersensitif atau hypersensitive response (HR)diartikan sebagai reaksi partahanan

yang -pat dari tanaman menghadapi patogen yang inkornpatibel, diserbi dengan
kernatian sei yang cepat atau nekrosis jaringan di daerah yang diinjeksi dengan

suspensi bakt&.

8

Bebempa tahun terakhir ini, teknik pendekatan genetika rnolekuler banyak
digunakan untuk rnengidentifikasi dan mengisolasi gen-gen bakteri yang terlibat
dalam interaksi antara patogen dan tanaman inangnya. Menurut Karnoun dan Kado

(1990) gen-gen ini diklasifikasikan ke dalam empat kelampak, yaitu: (i) gen-gen hrp

(hypem8nsifivity response and pathogenicdy) yang diperlukan untu k patogenisitas
pada tanaman inang dan induksi HR pada tanaman non-inang, (ii) gen-gen &p

(disease-specific)yang berfungsi untuk patogenisitas tetapi tidak menginduksi HR
pada tanaman nun-inang, (iii) gen-gen svr faviwlenw)yang memtwrikan interaksi

ras-spesifik atau patovar-spesifik, dan (iv) gen-gen hsv (host-specif~vir*uenm)
yang berfungsi untuk patogenisitas pada beberapa tanaman inang tertentu.

Gen

hrp juga menentukan kernarnpuan bakteri untuk memperbanyak diri pada tanaman
rentan dan menyebabkan respon hipersensitif pada tanaman resisten. Ssdangkan

gen avr mernberikan reaksi inkarnpatibel dalarn intemksi antara patagen dengan

tanaman yang berhubungan dsngan gen untuk resistensi (Mansfield ef a!. 1994).

C. Genetlka MolekuXer Pa*genisi&s

Xantttomonas

Ksmampuan bakteri menimbulkan penyakit pada tanaman inangnya
tergantung pada aspek lingkungan dan inang. Berbagai penelitian telah ditakukan

unttrk rnengetahui patogenisitas bakteri Xanthomonas. Beberapa hasil penefitian
rnemberi infumasi bahwa sistem sekresi protein tige 11 dan tipe III krperan psnting

untuk vinrknsi Xanfhomonas (Chart dan Goodwin, 1999).
Sistern sekresi protein t i p It rnerupakan lintasan utarna untuk sekresi enxim-

emim degradatif eitstrasefubr pada bakteri Gram negatif,

Pada protein-protein

yang disskresikan malalui tintasan tipe II, seicuen signal pada amino-terminal

9

dipotong secara protealitik oleh pe:plasmtc peptdase setelah diekspor melalui

sistern general secmtuw pathway. Hasil penelitian rnekanisme patogenisitas pada

X mmpestris pv. mmpesffis {Xcc) yang dilakukan oleh Daniels ef a!. (1984) dan

Turner ef a/. (1985) rnembarikan garnbaran bahwa pada DNA berukuran I0 kb yang
telah diisolasi terdapat sejumiatr gen yang diperlukan dalam patagenisitas. Setelah
diidentiikasi ternyata gengen tersebut berperan datam proses sekiesi enzim-enzim

ekstraseluler melewati rnembran sel (Daw et a!. 1989).

Hu %t a!. (1992) dan Chen

ef al. (1996) juga berhasil mangisolasi dan rnsngkarakterisasi gerr xpsD yang tarlibat

dalarn proses sekresi endm ekstmseluler melewati mmbran luar WI mutan Xcc
nanpatogenik.

Sistem sekresi protein tipe III beperan dalam translokasi protein-protein
patagenisitas rnelintasi membran bakteri menuju situplasma sel inang. Sekresi

protein diregulasi oleh kantak dengan pemukaan sel target. Kalonisasi bebra pa

bakteri patagen Gram negatif pada jaringan inang tergantung pada suatu moiecular
syn'nge, yaitu sistern sekresi protein tipe Itl.

Pada sistsm ini diperlukan interaksi

patogen dengan tanarnan inangnya. Bebetapa bakteri patogen tanaman rnerniliki
dua kumpulan gen yang dapat mernodulasi interaksinya dengan tanaman, yaitu gen

avr (avirulence) dan hrp (hypersensitive response and pathogenicify) (La haye dan

Banas 2001).
Kebanyakan rnutasi yang menyebabkan cacat pada patagenisitas
Xanfhomonas melibatkan gengen hrp (Mansfieid ei a/. 1994). Genus utarna

prokariot patogen tanaman, yakni Erwinia, Pseudomonas, dan Xanfhomonas,
merniliki gen-gen hrp dengan susunan yang sangat mirip. Mutasi pada beberapa

gen hrp menyebabkan cacat terhadag: (i) patogenisitas pada tanarnan rentan; (ii)

10

respan hipersensitif pada tanarnan resisten; dan (iii) respon hipersensitif pada
tanaman nun-inang.

Wiggerich dan PQhler (2000) rnempelajari mekanisme patogenisitas
Xanthomonas melalui mutan non-patogenik Xcc,

Mutan ini setain kefiilangan

patugenisitas pada tanaman inangnya (Brassica spp.) juga tidak dapat menginduksi
respan hipersensitif pada tanaman non-inang fcabai).

Setelah diteliti ternyata

mutan Xcc mengalami mutasi pada gengen penyandi kompleks protein Ton0
("Ton8, ExbB, dan ExbD),

Rumknya protein-protein ini secara tidak langsung

rnernpengaruhi aMivitas protein Tun8-&ppendenf ~ c e p t a ryang berpefan dalam
pengambifan besi feri atau ~ e ' ~ ,

Produksi feri-siderofor dipetkirakan berfungsi sebagai suatu elisitor terhadap

feairsi pertahanan tanarnan, Chrysobactin, sicferofor yang dihasifkan ofeh Erwinia
chrysanthtsmi, blah diidentifikasi dan mewpaitan faMor virutensi pada penyakit
tanarnan (Expert et a!. 1996). Tetaapi pada penelitian y ang dilakukan Wiggerich dan
Pijhler (1997) diketahui bahwa Xcc yang mengalami mutasi pada gen-gen yang
tertibat patogenisitas tetap mernproduksi siderofor, dengan dernikian praduksi

siderofor pada Xcc bukan rnenrpakan elisitor terfradap reaksi pertahanan tanaman.

0. Ton8-dependent receptor

Pada awatnya istilah TanB digunakan untuk rnenjelaskan fenatipik mutan
Ecofi yang resisten terhadap fage T1 atau T-une = 'Tan' (Braun 4995). Protein
Ton0 diperlukan untuk transpcr yang bergantung pada energi fenergydependent
tmnspoIf) dari suatu kompleks besi-sidetofor melintasi rnernbran Iuar Xanthamotlas
(Wiggerich dan PUhkr 2000).

11

Besi berperan penting dalarn inEeraksi tanaman-fitopatagen, karena
merupakan salah satu fairtor yang berpengaruh tertradap pertumbuhan dan
muftipfikasi baMeri

in pfanta. Selain itu bakeri patagen rnemerlukan besi untuk

vintlensi (Neidhart et a!. tl. 990).

Dalarn proses biologi, besi brfungsi diantaranya

sebagai komponen dalam rantai transpor elektrun, sebagai kofaktor pada sistem
anzim dalarn proses metabolisme mspirasi. Walaupun ketersediannya di bumi

melimpah, dalarn kondisi aerob besi berada dalarn bentuk mineral yang tidak larut.
Pada pH fisialagi kelamtan ion ~ e sangat
* ~ rendah, dengan kernungkinan
kelanrtannya tidak pernah labih k s a r daripada 1 0 " ' ~(Neilands 1995, Wiggerich et

al. t 997). Untuk memenuhi kebutuhan b s i , bakteri mengembangkan stfategi untuk
rnengarnbil k s i dari lingkungannya dengan mensintesis siderafar untuk mengkelat

besi fed atau fa'3. Ion ~

akan dikelat oleh siderofor, kernudian ditransportasikan

0 ' ~

ke sel melalui suatu proses penggandengan energi yang diperantarai olsh sistem
TonB (Wiggerich dan Pljhler 2000).

Transpar besi rnelewati membran luar baktefi memedukan energi, padahai
mernbran luar ticlak memiliki mekanisme prnbangkit energi. Untuk mangatasi ha1

ini bakteri (khususnya bakteri Gram negatif) rnanggunakan sistem TanB sebagai

penghubung antara rnernbran fuardan rnernbran dalarn untuk mengaktifkan transpor
besi-siderafur mglatui reseptor rnernbran luar. Sistem Ton8 y ang tefah dipelajari
dengan baik adalah sistem Ton8 pada Eschekhia coli. Pada kompkks TonB di E.

coli (Gambar 11, ada dua protein tarnbahan, yakni protein ExbB dan ExbD, yang
rnembentuk suatu kompleks TonB-ExbB-ExbD (Braun 1995). Wilayah yang kay a

pralina (X-Pro) rnernbentuk struktur kaku serupa balok yang membantu
rnenjembatani tuang periplasma (PP) dsngan rnembran sitoptasma dan membran

12

luar (OM). Protein reseptor FhuA untuk fransportasi kornpleks baskiderafor akan
dibuka setelah diinduksi aleh kornpleks Ton8-ExbB-ExbD.

Gambar 3 . Lokasi dan susunan protein-protein hnsmembran TanB-ExbB-ExbD
pada rnernbran situplasma E. coli (Braun 5 995)
OM = rnernbmn luar; PP = ruang periplasma; CM = rnernbran
sitoplasrna; FhuA = reseptor untuk kamgfeks besi-siderofar

E. Meknisrne fatogenisitas X. axanopodis p v. giycines
Hasil analisis genetika rnolekuter rnembuktikan bahwa gen-gen yang

bertanggung jawab dsrlam proses patogenisitas Xanthomonas kebanyakan terletak
di krornosom (Sharrna ef al. 19941, tetapi pada patuvar tertentu seperti X,ax~nopodis

pv. rnanihatis gen patagenisitasnya terletak di DNA ptasrnid (Verdier 1998).
Beberapa spesies Xanthomonas diketahui memiliki DNA plasrnid indigenous.
Keberadaan plasmid-plasmid indigenous pada Xag dibuktikan pertama kali oleh

Suwanto (1994).

Pada saat itu diketahui bahwa Xag YR32 merniliki plasrnid

indigenous berukuran lebib dari 10,s kb yang terdeteksi melalui hasil running PFEE
terhadap DNA genam Xag utuh. Beberapa tahun kernudian peneliti asaf Brazil, yakni

13

Baldini ef a/. (1999) juga mernpubiikasikan bahwa strain Xag lain, yakni Xag 333,
memiliki dua plasmid indjgenous rnuttikopi yang masing-masing benrkursxn sekitar 25

kts dan I,7 kb. X. axonopodis pv. c&ri juga mmiliki dua plasmid masing-masing
bntkuran 33,7 kb dan 64,9 kb (da Silva e
E a!, 2002).Tetapi kelompok Xanfhomonas

tainnya, misalnya X. campestfi'spv. campesfn'sATCC339 4 3, tidak rnemiliki pfasmid.

Penelitian rnengenai gen-gen yang terfibat dalarn patagenisitas pada
Xaxonupodis pv. giycines di luar negeri dilakukan oteh para peneliti dari Korea
Sslatan, yakni tiwang

et al. (1992) dan

Kim ~t al. (2003).

Hwang et a]. (1992)

mengkonstnrksi mutan Xag non-patogenik rnenggunakan mutagen kirniawi

(N-

methyf-N-nitro-Wnifmquanidine) untuk meng karairterisasi gen-gen patogenisitas
bakteri, Satah satu mutan yang dipefoleh, NPI, tidak rnernperbanyak, diri pada
katiledon kedelai. Mereka mengidentifikasi tiga wilayah yang mampu msmulihkan
patagenisitas, yakni: (i) Fragrnan 2.7kb-CIA; (ii) ORF1; dan fiii) ORFZ. Tetapi belurn
jelas apakah fragmen-fargrnen DNA ini msnrpakan faMor penentu utarna
patogenisitasxag.

Kim ef a!. (2003) telah mensekuen wilayah pada Xaq yang

disebut sebagai PathogonfcQ Island (PA!) yang berukuran kira-kira 29 kb dan

membentang di kromosom.

PA/ terditi atas 9 gen hrp, 9 gsn hrc (hw and

conserved), dan 8 gen hpa (hrp-associat&) yang menyandiiran protein H t p

tyw /I1

secretion system, Walaupun mutan-mutan Xag yang rnemiliki gen-ggen hrp dan hn:
tersebut gaga#mengelisitasi HR pada tanaman cabai, tetapi mutan-mutan tersebut

mampu menginduksi HR pada tanaman tomat.

Penelitian patugenisitasXag pada tingkat rnokkuler di Indonesia difintis oleh
Labaratorium Biologi Molekubr Jurusan Biologi, FMIPA IPB wjak tahun 1992

(Mesak ef a!, 1994).

Pada tahun 1998, Rukayadi behasif mengisolasi mutan Xag

nun-patogenik, Xag M715.

Mutan ini dikonstruksi dari

Xag YR32 tipe liar

14

rnelalui rnutagenesis transposon menggunakan pYR103 yang rnerupakan turunan
dari Tn5 (pUTrnini-Tnmrn) dengan tarnbahan gen penyandi resistensi antibiotika
trirnethoprirn atau gen ~p~ (Rukayadi 1998). Selain kehilangan patogenisitas yang
ditunjukkan dengan tidak tampaknya gejala bercak kuning klorotik pada kotiledon
yang diinokulasi pada bioesei patogenisitas kotiledon (Gambar 2), rnutan Xag M715
juga tidak marnpu rnenginduksi respon hipersensitif pada daun tornat. Dari hasil
hibridisasi Southern rnenggunakan pelacak pYR103 berukuran 2,8 kb-EcoRI dapat
diketahui bahwa transposon rnenyisip pada potongan 185 kb skiiotipe-Asel (Widjaja
et a/. 1999 ) dari krornosorn mutan Xag M715.

Xag YR32 tipe liar

Xag mutan M715

Garnbar 2. Hasil esei patogenisitas dengan bioesei kotiledon. Xag tipe liar
rnenirnbulkan gejala kuning klorotik, sedangkan Xag M715 nonpatogenik tidak rnenimbulkan gejala kuning klorotik. Umur kotiledon 7
hari, urnur biakan 24 jam pada media YDC padat, inkubasi 28-30°C
selarna 5 hari (Rukayadi 1998).

F. Metode Deteksi Bakteri Patogen Tanaman
Bakteri X. axonopodis pv. glycines rnerupakan salah satu patogen yang
dilaporkan bersifat seed borne atau terbawa benih yang dapat berada di dalarn atau
pun di luar biji kedelai. ldentifikasi dan deteksi bakteri Xag secara visual ~#J,it.
dilakukan, karena benih yang terinfeksi Xag tidak rnenunjukkan gejala yang khas

'

,

15

(Mortensen 1989). Salah satu upaya untuk mengendalikan penyakit bisul bakteri di

lapangan adafah dengan rnenggunakan k n i h kedelai yang bebas Xag (Hidayat et

a/. 20003. Sertifikasi benih kedelai bebas hama dan patogen telah rnendorong
dikembangkannya teknik-teknik deteksi, baik yang tradisianal maupun yang modern.

Metode deteksi tradisional =perti plating dan uji patogenisitas memeflukan

waMu yang fama ( V e n a dan Vuurde 20023. Metode deteksi yang tersedia saat ini
(teknik serologi, analisis poiipeptida, profil asam lemak, serta anaiisis behasis DNA
genom bakteri) kbih sensitif dan cepat (Sigee 1993). Teknik serologi mewpatcan

cam rnendeteksi bsMeri fitopatogen rnenggunakan reaksi antigen dan antibodi.
Teknik ini banyak digunakan untuk mendeteksi bakteti fitopatagen pada tanaman
atau benih, katena reaksinya sangat sensitif dan spesifik. Keberhasilan teknik ini
sangat ditentukan oleh spesifisitas dan deteksi interaksi antrgen-antibodi. Analisis

berbasis DNA genom fsakteri rnemiliki kelebihan lain, ya#u umumnya krsifat stabil.
Bebefapa teknik molekubr yang didasarkan pada analisis DNA genorn antara ta'm

DNA-DNA hybridization,

restriction endonuckase patterns, Random Ampiifled

Pdyrnorphic DNA (RAPD), Macromsfn'ctbn Fmgmenf Length Po/ymorphisrn

menggunakan teknik Puked Fiefd Gei Efectrophoresis (PFG E) dan Pofyrnemse
Chain Reaction atau PCR (Gillis et a!. 1990).
PCR rnerupakan teknik untuk mengarnplifikasi DNA secara in vitro yang
terletak di antara dua wilayab yang telah dikenal sekuennya. Oalam teknik ini
digunskan dua aligonukleotida sebagai primer dari suatu rangkaian reaksi sintesis
yang dikatalisis aleh suatu DNA polymerase temstabil. Sekuen kedua
aligonukleotida tersebut berbeda dan masing-masing komptemen dengan sekuen

pengapit utas DNA yang airan diarnplifikasi pacta utas yang berlawanan (Gtick dan
Pasternak t994), Proses PCR pertarna kali ditemukan oleh Kary Mullis pada bulan

16

April 1983, Setelah publikasinya yang pertarna tentang prosedur PCR ditehitkan

pada tahun 1985, Mullis mendapatkan penghargaan Hadiah Nobel di bidang kirnia
pada tahun 1993 (Burke 1996).

Untuk mengarnplifikasi DNA, saat itu digunakan

enzim Taq Polymeram yang diisalasi dari bakteri Themus aquaficus YTt yang
hidup di mata air panas Yellawstone National Park, USA. Reaksi PCU memeflukan

tiga tahap, yaitu: (i) denaturasi

DNA,(ii) pelekatan primer atau annealing, dan (iii)

pemanjangan primer atau elongasi oleh DNA polymerase termostabil.

Penggunaan teknik PCR untuk rnendeteksi penyakit tanaman semakin

populer, karma hasitnya akurat, sensitif, hbih cepat dan dapat digunakan tanpa
harus rnengisalasi baMeri patogen terlebih dahulu dari tanarnan. f eknik PCR untuk
mendeteksi patogen mernerlukan primer yang spesifik (Donald dan Wong 20013.

Supaya efeMif dan dapat dipercaya, maka primer-primer PCR ini harus rnerupakan
sekuen-sekuan yang kansemtif pada genarn spesies yang menjadi target (Sakhtivei

ef a/, 2001). Menurut tlop et a!. (1999) PCR banyak digunakan untuk mendeteksi
bakteri patogen tanarnan karantina, dan berbagai primer teiah didisain untuk
mendeteksi bakteri patogen tanarnan, antara lain Ewinia amybvora, X.

axonopodis

pv.cifn: Ciavibactermkh#anensis subsp. s6pedonicus da n Rakfonia solanacearum.

ill. BAHAN DAN METODE
A. WVaktu dan Temppat Penelitian
Penelitian diiakukan sejsk Desember 2000

- Agustus 2003 di Labaratoriurn

Bialogi Molekuler South East Asia RwIbnal Centre fbr Tropicaf Biology (SEAMEQ
BIOTROP) Bogor dan di Institute of Motecuiar Biology, National Chung-Hsing

University, Taiwan,

8. Bahan dan Alat
Enzirn yang digunakan untuk teknik mofekuler antara lain enxim T4-DM
Iigase dari Gibca-BRL. beberaps enzim restriksi endonuklease yaitu: EmRI, Sad,

Pstl, Sad, Stui, Kpnl, BamHI, Hindl, EmRV, hlotl, Xhol dan Smsal dari New England
Biolabs (NEB) fnc., USA., dan TaKaRa Shuzo Co., Ltd, Japan.

RNase dan lisazirn dari Sigma Chemical Ca., Australia.

Proteinase-K,

Pelabelan DNA pelacak

untuk hibridisasi Southern rnenggunakan N E B I Q phototupdM
~~~
Kit (New England

Biolab, Inc., Beverly, USA), sedang kan deteksi dilakukan menggunakan ~ h o t w t o p e ~ ~

Detection Kif (New England Bialab Inc., Beverly, USA).

Bahan-bahan fain yang

digunakan yaitu Taq DNA Poiyrnerase (Finnzymes QY, Finland; dan Qiagen GmbH,
Germany), Geneclean Kit (8fQ10 1, Inc. La Jalla, CA).
Alat utarna yang digunakan dafam penelitian ini adalah seperangkat piranti

elektroforesis mini gel (Bio-Rad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), karnera Polaroid

Hoefer's Photoman DS32 (Kadak), piranti elektroporasi (Bio-Rad Gene ?ulserm, CA,
USA), UV Tmnsilluminator (Hoefer Scientific tn strumants, San Fransisco, USA),

Micmentrifuge (SORVALLQ Pica, USA), A#f5#1af8d DNA Sequencer AB I PRISM

18

377 (Perkin Elmer Biasystem, USA), dan GerreAmp PCR System 2400 (Perkin
Elmer Biosystem, USA).

1. Galur-galur BakEeri dan Ptasmtd

Bakten' dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini tercantum pada
Tabeel1*

Tatpel 1. Galur-galur bakeri dan plasmid yang digunakan dalam peneliian

X. a. pv. &&%s

Referensi

Karakteristik

Galur dan Plasmid

1

Tip# liar; Rif ; asat Muara - 3ogor

(Xagj YR32

Kanr,R f , pat -

Rukayadi (1998)

fipe Liar: R~ asal muling -Pasuruan

Rubyadi (1993

Tipe liar; Ri(; asal Pasir Sarongge Cianjur

/

T i p liar: W

f nsfitute of Molecular
Biology, National
Chung-Hsing Univ.
(NCHU), Taiwan

Xag 89

T i p Iiar; Rf

Institute af Mswlar
Biology. fdCt-1U. Taiwan

X. a. pv. &mLe 59

T i p liar: Rif

Institute of MolacJar
Biology. NCHU,Taiwan

X. a. pv. cifn'60

Tipe liar; R8

lnsfttute of Molecular
Biology, NCHU, Taiwan

X campestk pv. campest& 17

Xpe liar; Rif

Institute of Molecular
Biology, MCHU,Taiwan

1

X. a gv. phased 73

1

f

Tipe liar; RiP

Institute of Molecular
Biology, NCHU, Taiwan

T i p liar; Ri?

Institute of Molecular
8ialwy, NCHU, Taiwan

I

I

Eschw.chia coIi
S17-1

pro'res-dm&, plasmid diintegrasi pada Simon et el { 1983)
RP4-Tc::Mu-)(m-Tn7

Dt.tfia

supE44 &cUf68 (& lacZdM15) h d R #7
recA1 endAI gyrA96 fhCf =&If

Sambrook dan Russell
(20011

I

20

medium rnengandung ekstrak khamir 10 g, dekstrosa 5 g, CaC0320 g, agar-agar 15
g dan air suling 1000 ml.

BaMeri Xanthamonas diinkubasi pada suhu 28-3U°C

sefarna 2448 jam, sedangiran Exhetkbia coli ditumbuhkan pada media Luria
(ekstrak kfiarnir 5 g, tryptane 10 g, dan NaCl5 g, air suling 1000 ml) pada suhu 37°C

%lama 12-16 jam atau sernalam. Antibiatika yang dicampurkan pada media adalah
rifarnpisin (Rif) 100 pglrnl, kanamisin (Km) 50 pglrnl, ampisilin (Ap) 100 rnlrnl,
tetrasiklin (Tc) 15 pglml, spktinomosin (Sp) 50 pglml, dan streptomisin (Sm) 50

Tahapan dan tangkah kerja penelitian ini disajikan dsrlarn diagram {bagan)

alur yang disajikan pada Garnbar 3 dan 4.

yang Terflbat dalam

Identifikasi posisi penyisipan

Amplifikasi DNA pensapit transposon
dengan teknik l n w r s ~
PCR

Mumsing dan

Ktoning arnplikon pada p M Q 1
(Akhdiya 2000)

analisisisitas
gen
patogen

I

Uji kom@ementasi*)

r

1

+

Selrumsing DNA ampiikd DNA
pengapit transpason

Perancangan primer PCR

Keterangan: Langkah kwja t dan fl diuraiican pada halaman 23 sarnpai 35
*) dirinci pada Gambar 4

Gambar 3. Bagan alur penslitian

OoubIe cross over
dengan Xag YR32

dengan Xsg M715

denhset SpYSm',
dan diklon pada @asmid
h p e k n t m inang
m p i t @UP203

Garnbar 4. Anafisis patoganisitaslkaraktefisasi gen patogenisitas Xag Y R32

I. Analireis Sekuen DNA yang Terlibstt daXam Patogenbitas Xag

1,1, lsolasli DNA Genam To&l
lsalasi total DNA genom yang digunakan merupakan rnadifikasi dari metode

Lazo et aal, (1987).

Sel ditumbuhlran selama sernalam di dalarn 5 ml medium LB

cair yang diinkubasi pada suhu 2B°C, dan dipanan dengan cara disentrifugasi pada
kernpatan 8000 rpm selama 10 menit.

Sentrifugasi difakukan menggunakan

Micmntrifuge (SORVALLQ Pica, USA). Pefet dicuci dengan 1 ml bufer ST€

(1QQrnMNaCf, lUmM Tris-HCI, imM EDTA pH 8,O) kemudian cfiresuspensi dan
disentrifugasi pada kecepatan yang wma. Setelah pelet diresuspensi dengan 200
p1 bufw STE

dan ditarnbahkan 40 rtf larutan 10% SDS, suspensi diinkubasi pada

suhu 65% selarna 1 jam 30 rnenit kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Pernecahan sel dilakukan dengan menarnbahkan 4 pl 10 rnglrnt Proteinase-K dan

diinkubasi pada suhu 37% setarna paling sedikit 4 jam. Setelah ditarnbah 200 - 400
$ bbufer ST€, suspensi diekstraksi menggunakan Iarutan fend dan kloroform

masing-masing sebanyak 120 PI (tahap ini dilakukan secara pertahan sampai
terbentuk ernulsi). Suspensi yang telah terernulsi ini kemudian disentrifugasi pada

kecepatan 12.000 rpm setarna 15 rnenit.
kemudian dipindahkan

ke tabung

Supernatan yang mengandung DNA

rnikfu steril dan dipresipitasi dengan

rnenarnbahkan etanol 95% dingin sebanyak 2x volume supernatan, falu diinkubasi
pada suhu -2