Konstruksi Peta Genetik Parsial dan Karakterisasi Sintasan Epifitik Muatan Non - Patogenik dari Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines YR32
p4-J.
4%
KONSTRUKSI PETA GENETIK PARSIAL
DAN KARAKTERISASI SINTASAN EPlFlTlK MUTAN
NON-PATOGENIK DARl Xanthomonas axonopodis
(campestris) pv. glycines Y R32
Oleh :
YAYA RUKAYADI
PROGRAM PASCASARJANA
INSTlTUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
ABSTRACT
CONSTRUCTION OF PARTIAL GENETIC MAP AND EPlPHlTlC
SURVIVAL OF NON-PATHOGENIC MUTANT OF Xanthomonas
axonopodis (campestris) pv. glycines YR32
YAYA RUKAYADI
Supe~ised
by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of Advisor), BUD1
TJAHJONO. MAGGY T. SUHARTONO, RNIANY WIDJAJAKUSUMA, and
ED1 GUHARDJA (Coadvlsors)
-
Pathogenesis of Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag)
on soybean has not been completely understood. The objective of this work is to
construct partial-genetic mapping of Xag genome which will facilitate our
understanding on the pathogenicity mechanism. and to construct non-pathogenic
isogenic strain as a paradigm for biocontrol agent for the disease.
From this work, we were able to construct a 8.2 kb recombinant plasmid
(pYR103) carrying Pacl and Pmel sites and TpRfor transposon mutagenesis and
gene localization in Xag. The transposable element (2.8 kb) also contains Asel site
which will serve as landmark to locate transposon insertion in genomic DNA
fragments generated by Asel-schizotyping. We employed transposon to generate
non-xanthomonadin mutants (pig), non-pathogenic mutants (pat), protease
negative mutants (ptf). auxotroph mutants (aus), and exopolysaccharide negative
mutants (xan-). Southern hybridization analysis was performed following complete
digestion of mutants using Asel. From the analysis using 2.8 kb-EcoRl fragment as
probe, it was revealed that pig, pat, prt, aux, and xan- genes are located within
240-. 185-. 185. 148. and 97-kb Asel fragments respectively. We were also able to
localize several unknown function genes marked by transposon insertions.
Using inaZ (pJL1703) as a reporter gene, we were able to demonstrate that
the non-pathogenic mutant (M715) could reduce colonization of Xag YR32 wild type
on soybean leaf surface. Based on competitive test using de Wit analysis, it was
revealed that M715 mutant was non-pathogenic isogenic strain of YR32 which could
compete within the same niche ecology with its wild type. Epiphytic fitness analysis
performed in the greenhouse indicated that population dynamics of YR32,
YR321ce+, and M715 were very similar. M715 mutant was able to survive until 16
days with population density of approximately 10' to 105 cells g*' of leaf wet weight.
Our study indicated the M715 mutant strain could be developed for biocontrol
directed against bacterial pustule disease on soybean plant.
Key words : partial genetic map, epiphytic survival,
Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines.
SUMMARY
YAYA RUKAYADI. Construction of partial genetic map and epiphytic survival
of non-pathogenic mutant of Xanthomonas axonopodis (campestris) pv.
glycines YR32. Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of
Advisor),
BUD1 TJAHJONO.
MAGGY T.
SUHARTONO,
REVIANY
WIDJAJAKUSUMA, and ED1 GUHARDJA (Coadvisors).
Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) is the
causal agent of bacterial pustule disease on soybean plant. The disease
could reduce total soybean production and the problem had not been solved
completely up to the present. To overcome the disease, there were two
approaches to be taken: (1) understanding the pathogenicity mechanism of
the disease, and (2) application of natural biocontrol based on ecological
principles, including interaction between the pathogen and the competitive
bacteria.
Pathogenicity mechanism on Xanthomonas was complicated and
poorly understood among enormous investigation to reveal the causes of the
disease. In this study, we showed that isogenic but non-pathogenic organism
could become a potential competitor for its parental pathogenic strain in a.
limited nutrient and space availability in the same habitats on soybean leaf
surface. One possible hypothesis that we brought into work was that the
perfect competitor for pathogenic organism could be constructed from the
pathogen itself such that it would be no longer pathogenic but still retains its
survival and fitness on soybean leaves. Therefore, we conducted work on
Xag pathogenicity mechanism and construction of non-pathogenic isogenic
strain to overcome bacterial pustule disease on soybean. The objectives of
this study are as follows : (i) To construct partial genetic map of Xag YR32
genome as one approach to understand Xag pathogenicity, and (ii) To
construct an isogenic but non-pathogenic strain derived from Xag YR32.
To achieve those objectives, series of experiment were conducted,
which includes :
(1) Screening of transposon suitable for transposon mutagenesis on Xag
YR32. This work was performed by either di- or triparental mating using
plasmid donor as follows : pUTmini-Tn5KmR, pUTmini-Tn5SpR/SmR,
pEP4351(Tn4351TcR),and pUCD623 (Tn4431TcR).
(2) Construction of plasmid carrying particular transposon carrying restriction
sites for two restriction endonucleases: Pacl and Pmel. This recombinant
plasmid will be used as donor in transposon mutagenesis on Xag YR32.
(3) Prototrophic and phenotypic of a number of mutants generated from
transposon mutagenesis. Minimal medium A (MinA) and M9 was used in
prototrophic analysis. Phenotypic characters that were evaluated include :
exopolysaccharide production (mucoid appearance of the colonies).
xanthomonadin production, catalase activity,
protease production,
pathogenicity analysis using cotyledon bioassay, and auxotrophic mutants
analysis.
(4) Gene localization and partial genetic mApping of Xag YR32 genome. In
this work, a combination of schizotyping and Southern hybridization was
performed. Genomic DNA preparation and restriction enzyme digestion
were done within agarose matrix and Pulsed-Field Gel Electrophoresis
(PFGE) was employed to separate large size DNA fragments. Southern
hybridization analysis was performed by transferring of DNA from agarose
gel onto nylon membrane (Photogene) using VacuGeneXL (Pharmacia
Biotech). Non-radioactive probe was prepared from recovered 2.8 kbEcoRl DNA fragment (pYRIO3). Probe labelling and hybridization
detection were done directly using ECLTM(direct nucleic acid labelling and
detection system) (Amersham LIFE SCIENCE).
(5) lnaZ gene introduction into Xag YR32.
In this work, triparental mating
was conducted using pJL1703 (inaZ) as donor and pRK2013 as helper
plasmid. inaZ gene was used as reporter gene for further analysis. Ice
nucleation activity in Xag YR321ce+ was performed using droplet-freezing
assay.
(6) Competition analysis between Xag M715 and Xag YR32 was conducted
in planta on two weeks old soybean plant inside a green house.
Competition capability was examined based on the number of frozen
tubes divide by total number of tubes. For de Wit serial replacement
analysis, proportion of the mixture between M715 and YR321ce+ were
formufated as follows :0:10, 1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,
10:O.
M715 and YR321ce+ were used at concentration around 5 x 10' cell ml-'.
Total concentration of the bacterial mixture was around
lo7 cell
mr'.
Fitness test of M715 and YR321ce+ was conducted for 16 days after
inoculation on 20 weeks old soybean plant. The experiment was
conducted with two different treatments : individual inoculation was 4.5 x
lo5 cell ml-' for each strain, or 1:l
for co-inoculation. Total bacterial cell
for each strain were counted using plate count method orestimated using
ice nucleation assay.
Our study indicated that transposon mutagenesis using pUTminiTn5KmR in Xag YR32 yielded higher frequency of transconjugants than
transposon mutagenesis using either pUTmini-Tn5SpRiSmR, pUCD623Tn4431TcR, or pEP4351-Tn4351TcR. Therefore pUTmini-Tn5KmRwas used
for further work.
We have constructed a 8.2 kb pYR103 derived from of Tn5 pUTminiTn5KmRwith the addition of TpR marker and Pacl and Pmel restriction sites.
Frequency of
conjugation of pYRIO3 in Xag YR32 was 8,3 x 10" per
recipient which was consistently higher than that of other transposons that
have been used previously.
The recombinant plasmid (pYRIO3) would
cloning, physical as well as genetic mapping in Xag and related species or
pathovars.
A total of 2187 mutant generated from transposon mutagenesis were
collected and 1019 of randomly selected mutants had been phenotypically
analyzed (47 %) from which a total 523 (23 %) mutants had been analysed
by DNA profiling
employing Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Among
mutants which had been analysed for their genomic DNA profile, as much as
3 % were mutants with observable alteration in their phenotypic appearance
while the rest of the mutants (97 %)were cryptic mutants which did not show
any observable phenotypic alteration relative to that of the wild type.
Phenotypic
mutants generated from
xanthomonadin- (M216) mutant,
this
mutagenesis were:
exopolysaccharide- (M180)
mutant,
protease-minus (M415) mutant, auxotroph (MI87 or M33) mutant, and nonpathogenic (M715) mutant. M715 did not show any phenotypic changes, but
cotyledon bioassay showed that M715 did not cause yellow chlorotic spot on
soybean cotyledon as its wild type.
From 523 mutants that have been
analyzed, none were catalase- (car). One possible explanation was that
catalase might be encoded by more than one gene.
Minimal medium A
contains no amino acids, therefore the media could be used for auxotroph
analysis in this study.
Southern hybridization works using 2.8 kb-EcoRI fragment from
pYR103 revealed that 88 mutants out of 93 were shown to have different
location of transposon. It was shown by the presence of two hybridization
signals in the Asel-schizotyping of Xag YR32. The data also showed that
almost all of the mutants (95 %) generated from mutagenesis were
transconjugants (mutants generated from transposition of Tn5KmR). Genes
encoding xanthomonadin (pig), pathogenicity (pat), protease (prf), auxotroph
(aux), and exopolysaccharide (xan) were located within 240-, 185, 185-,
148- and 97-kb of Asel fragments respectively. Other cryptic genes had also
been located in Asel-schizotypes which will be useful for construction of Xag
YR32 genomic library.
Xag YR32 (pJL1703) carrying inaZ (Xag YR321ce+) constructed in this
work was able to express ice nucleation protein with activity of 1-3 ice nuclei
for every 10' bacterial cells at -45°C. Xag YR32, YR321ce+, and M715
growth curves indicated that those three strains possess the same growth
patterns.
Competition analysis between M715 and YR321ce+ in frozen tube
assay demonstrated that M715 population could suppress YR32 population.
In line with this result, de Wit analysis indicated that the population of either
YR321ce+ or M715 fell around isogenic line while the total population of the
competing bacteria was relatively stable. Therefore the mutation in M715 did
not reduce its capability to compete with its wild type in planta. The
competition apparently was due to the ability of strains to occupy the same
ecological niche.
The result of individual inoculation of YR3lce+ or M715 isolates
showed similar profile of growth curve, although YR321ce+ always maintained
higher population density at any time in comparison to that of M715. This
result suggested that the pat gene on M715 influenced the fitness of the
mutant bacterium in planta. On the contrary, the result of coinoculation
experiments showed almost identical growth curve and population dynamics
pattern at all of the time after inoculation. The difference between population
growth of YR321ce+ and M715 in the individual inoculation is higher than that
of the coinoculation result. Furthermore, on day 2. 3, and 5 the population of
M715 is slightly higher than that of YR321ce+. Although overall population of
M715 is slightly lower than that of YR321ce+, it still could compete with
YR321ce+ as shown from the ability of M715 to keep the ~ ~ 3 2 1 c e +
population at a relatively constant until day 16. M715 survival on soybean
phyllosphere might be due to the existence of cross-feeding mechanism on
certain growth factor produced by wild type (YR321ce+) to M715.
RINGKASAN
YAYA RUKAYADI. Konstruksi peta genetik parsial dan karakterisasi sintasan
epifitik mutan non-patogenik dari Xanthomonas axonopodis (campesfris) pv.
glycines YR32. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO (Ketua Komisi
Pembimbing), BUD1 TJAHJONO, MAGGY T. SUHARTONO, REVIANY
WIDJAJAKUSUMA, dan ED1 GUHARDJA (Anggota Komisi Pembimbing).
Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) merupakan
penyebab penyakit bisul bakteri pada kedelai. Penyakit bisul bakteri dapat
menurunkan produksi kedelai dan sampai sekarang masih belum tertangani.
Untuk mengatasi penyakit dapat dilakukan dengan dua pendekatan yaitu
dengan : (1) memahami mekanisme patogenisitas penyakit,
dan (2)
penggunaan musuh-musuh alami berdasarkan prinsip-prinsip ekologis
termasuk faktor kompetisi antara organisme penyebab penyakit dengan
pengendali.
Mekanisme patogenisitas pada Xag sangat kompleks dan belum
banyak diteliti sehingga belum banyak dimengeiti dan pengetahuan
mengenai bakteri patogen ini di taraf molekuler masih relatif sedikit.
Sementara itu beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa bakteri-bakteri
non-patogenik yang isogenik dengan bakteri patogennya memiliki potensi
untuk saling menyingkirkan pada habitat yang sama, dengan tingkat
persaingan yang tinggi. Maka dari itu perlu dilakukan penelitian tentang
mekanisme patogenisitas Xag dan konstruksi galur non-patogenik yang
isogenik untuk mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai. Penelitian ini
bertujuan untuk: (i) Mengkonstruksi peta genetik secara parsial genom Xag
YR32 sebagai salah satu cara untuk memahami rnekanisme patogenisitas
Xag, dan (ii) Mengkonstruksi galur non-patogenik yang isogenik dari Xag
Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilakukan serangkaian
percobaan yang meliputi :
1. Penapisan transposon untuk transposon mutagenesis pada Xag YR32.
Tahap ini dilakukan dengan konjugasi dua atau tiga tetua menggunakan
pUTmini-Tn5KmR, pUTmini-Tn5SpR/SmR, pEP4351 (Tn4351TcR), dan
pUCD623 (Tn4431TcR)sebagai plasmid donor dengan plasrnid penolong
pRK2013.
2. Konstruksi plasmid khusus yang membawa transposon terpilih dengan
tambahan penanda antibiotika trimetoprim dan dua situs enzirn restriksi
(Pacl dan Pmel). Plasmid rekombinan ini digunakan sebagai donor dalam
transposon rnutagenesis pada Xag YR32.
3. Analisis prototrofi dan fenotipik terhadap sejumlah mutan hasil transposon
mutagenesis. Medium minimal yang digunakan untuk uji prototrofi adalah
medium minimal MinA dan M9. Analisis fenotipik mutan meliputi:
penampilan eksopolisakarida (mukoiditas pada koloni), produksi pigmen
xanthomonadin,
aktivitas
katalase,
produksi
protease,
analisis
patogenisitas dengan bioasai kotiledon, dan analisis auksotrofi.
4. Lokalisasi gen dan pemetaan genetik genom Xag YR32 secara parsial,
Tahap ini dilakukan dengan kombinasi antara schizotyping dan hibridisasi
Southern. Penyiapan dan pemotongan DNA genom utuh dengan enzim
restriksi dilakukan dalam matriks agarosa. Elektroforesis dengan PulsedField Gel Electrophoresis (PFGE). Analisis hibridisasi Southern diawali
dengan transfer DNA hasil pernisahan dengan PFGE ke membran nilon
(Photogene nylon membrane) menggunakan VacuGeneXL (Pharrnacia
Biotech). Pelacak non-radioaktif dipersiapkan dari fragmen DNA potongan
2.8 kb-EcoRI (pYR103). Pelabelan pelacak dan deteksi hibridisasi
dilakukan secara langsung menggunakan ECLTM(direct nucleic acid
labelling and detection system) (Amersham LIFE SCIENCE).
5. lntroduksi inaZ ke Xag YR32. Pada tahap ini dilakukan konjugasi tiga
tetua dengan pJL1703 (inaZ) sebagai donor dan pRK2013 sebagai
penolong. Gen inaZ ini digunakan sebagai gen patapor pada analisis
selanjutnya. Aktivitas nukleasi es pada YR321ce+ dilakukan dengan asai
tetes beku.
6. Analisis kompetisi antara Xag M715 dengan YR321ce+ dilakukan secara
in planta pada tanaman kedelai umur dua minggu di rumah kaca.
Kemampuan kompetisi diamati berdasarkan persentase jumlah tabung
beku dari seluruh jumlah tabung asai. Untuk analisis pergantian serial de
Wit, proporsi campuran antara M715 dan YR321ce+ adalah sebagai
berikut: 0:1, 1.9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3,8:2, 9:1, dan 10:O. Konsentrasi
suspensi bakteri M715 dan YR321ce+ yang digunakan pada analisis
pergantian serial de Wit masing-masing lebih kurang 5 x 10' sellmi,
sehingga total campuran bakteri adalah lo7 sellml. Analisis kebugaran
M715 dan YR321ce+ dilakukan selama 16 hari setelah inokulasi pada
tanaman kedelai berumur dua minggu, dengan dua perlakuan yaitu:
inokulasi secara terpisah dan ko-inokulasi. Konsentrasi suspensi set yang
diinokulasi untuk inokulasi terpisah masing-masing adalah 4.5 x
lo5
sellml, pada ko-inokulasi perbandingan antara M715 dengan YR321ce+
adalah
1:l.
Populasi
masing-masing
bakteri
dihitung
dengan
penghitungan cawan sebar dan asai nukleasi es.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa transposon mutagenesis dengan
pUTmini-Tn5KmR memberikan frekuensi
konjugasi
rata-rata
tertinggi
dibandingkan dengan menggunakan pUTmini-Tn5SpR/SmR, pUCD623Tn4431TcR,
dan
pEP4351-Tn4351TcR.
Sehingga
pUTmini-Tn5KmR
digunakan untuk penelitian selanjutnya.
Pada penelitian ini telah berhasil dikonstruksi plasmid rekombinan
pYR103 berukuran 8.2 kb, plasmid ini merupakan turunan Tn5 yang
dikonstruksi dari pUTmini-Tn5KmR dengan tambahan penanda antibiotika
trirnetoprirn yang mempunyai satu situs pengenal Pacl dan Pmel.
Frekuensi konjugasi pYR103 pada Xag YR32 adalah 8.3 x
lo4
per
resipien, frekuensi ini secara konsisten lebih tinggi dibandingkan dengan
menggunakan transposon lain pada percobaan yang sarna. Plasmid
rekornbinan ini
(pYRl03) dapat
digunakan sebagai fasilitas
untuk
mengkonstruksi mutan-mutan khusus untuk keperluan lokalisasi gen, kloning
molekuler, konstruksi peta fisik dan genetik pada Xag dan spesies-spesies
atau patovar-patovar lain yang berhubungan.
Sebanyak 1019 (47 %) mutan dari total 2187 mutan hasil transposon
mutagenesis telah berhasil dianalisis fenotipiknya, dan sebanyak 523 (23 %)
telah berhasil dianalisis DNA genornnya, yang terdiri dari : mutan-mutan
dengan perubahan fenotipik yang diamati dalam penelitian ini (3 %) dan
mutan-mutan kriptik yang tidak diketahui perubahan fenotipiknya (97 %).
Mutan fenotipik
yang
diperoleh antara
lain
: tidak
rnernproduksi
xantomonadin (M216), tidak mernproduksi eksopolisakarida (M180). tidak
memproduksi protease (M415), auksotrof (MI87 atau M33) dan nonpatogenik dengan bioasai kotiledon (M715).
Meskipun M715 tidak
menampilkan kelainan fenotipik, tetapi dengan bioasai kotiledon mutan ini
kehilangan sifat patogennya. Hal tersebut terlihat dari tidak terbentuknya
bercak kuning klorotik pada kotiledon kedelai, sedangkan rnutan pada gengen pig, prt, aux, dan xan tetap bersifat patogen dengan bioasai kotiledon.
Dari 523 rnutan yang dianalisis, tidak satupun didapatkan mutan yang tidak
mernproduksi katalase (car). Hal ini kernungkinan karena katalase pada Xag
disandikan oleh lebih dari satu gen. Medium minimal MinA merupakan
medium minimal bagi pertumbuhan Xag sehingga medium ini dapat
digunakan untuk analisis auksotrofi.
Hasil hibridisasi Southern rnenggunakan pelacak potongan 2.8 kbEcoRl dari pYR103 rnenunjukkan bahwa 88 dari 93 mutan yang diarnati
memperoleh sisipan transposon pada lokasi yang berbeda. Hal tersebut
ditunjukkan oleh adanya dua sinyal yang terletak pada posisi yang berbeda
pada skizotipe-Asel krornosom Xag YR32. Data tersebut juga menunjukkan
bahwa transkonjugan yang diperoleh pada penelitian ini hampir seluruhnya
merupakan mutan hasil transposisi (95%). Gen-gen penyandi xanthomonadin (pig), patogenisitas (pat), protease (prt), auksotrof (aux) dan
eksopolisakarida (xan) masing-masing terletak pada potongan 240-, 185,
185, 148-, dan 97-kb-Asel pada krornosom Xag. Selain itu juga telah
berhasil ditentukan lokasi sejumlah gen lain yang belum diketahui
ekspresinya (kriptik), gen-gen ini sangat berguna untuk menyusun pustaka
genom Xag.
XagYR32 (pJL1703) yang membawa inaZ (YR321ce+) temyata
mampu mengekspresikan inti es dengan nilai aktivitas sebesar 1-3 inti es
untuk setiap 10' sei bakteri pada suhu sekitar -4.5'C. Kuwa pertumbuhan
YR32, YR321ce+ dan M715 memperlihatkan bahwa pertumbuhan ketiga
isolat tersebut memiliki pola perturnbuhan yang sarna.
Analisis kemampuan kompetisi antara M715 dengan YR321ce+
dengan asai tabung beku memperlihatkan bahwa populasi M715 dapat
menekan populasi YR32. Berdasarkan analisis pergantian serial de Wit,
terlihat bahwa populasi kedua bakteri YR321ce+ dan M715 untuk setiap
proporsi selalu terdapat disekitar garis isogenik dan jumlah total bakterinya
relatif tetap. Ini rnenunjukkan bahwa mutasi pada M715 tidak menurunkan
kemampuannya dalam berkompetisi atau kemungkinan penernpatannya
pada relung ekologi yang sama.
Hasil inokulasi terpisah untuk rnelihat kebugaran isolat YR321ce+ dan
M715 memperlihatkan pola dinamika yang sama, akan tetapi populasi
YR321ce+ selalu lebih besar dari populasi M715. Hasil ini menunjukkan
bahwa gen pat pada M715 rnernpengaruhi kebugaran hidup bakteri tersebut
in planta. Sedangkan, hasil percobaan ko-inokulasi memperlihatkan pota
dinamika yang sama dengan inokulasi terpisah, akan tetapi populasi
YR321ce+ secara keseluruhan menjadi berkurang. Hasil ini menunjukkan
bahwa M715 dapat menekan pertambahan populasi YR321ce+. Hal ini
diperjelas dengan melihat perbedaan (rasio) populasi antara YR321ce+
dengan M715. Perbedaan populasi hasil inokulasi terpisah lebih besar
dibandingkan dengan perbedaan populasi hasil ko-inokulasi, bahkan pada
hari ke-2, 3 dan 5 populasi M715 lebih besar dibandingkan populasi
YR321ce+. Meskipun secara keseluruhan populasi M715 lebih rendah
dibandingkan populasi YR321ce+, akan tetapi M715 mampu berkompetisi
dengan YR321ce+. Kemungkinan isolat M715 dapat mempertahankan hidup
karena isolat tersebut mempunyai sintasan yang relatif sama dengan tipe
liarnya di lingkungan filosfer. Kemungkinan lain karena adanya cross-feeding
mechanisms pada suatu faktor tumbuh tertentu antara M715 dengan tipe
liarnya YR321ce+.
KONSTRUKSI PETA GENETIK PARSIAL
DAN KARAKTERISASI SINTASAN EPlFlTlK MUTAN
NON-PATOGENIK DARl Xanthomonas axonopodis
(campestris) pv. glycines Y R32
Oleh :
YAYA RUKAYADI
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
dalam bidang Biologi (Mikrobiologi)
pada
Program Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
Judul
Konstruksi Peta
Genetik
Parsial dan
Karakterisasi Sintasan Epifitik Mutan NonPatogenik dari Xanthomonas axonopodis
(campestris) pv. glycines YR32
Nama Mahasiswa
:
Nomor Pokok
:
Yaya Rukayadi
95.576lBIOLOGI-MIKROBlOLOGl
Menyetujui
1. Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc.
(Ketua)
iakusuma.MSc.
(Anggota)
Prof.Dr.lr. Edi Guhardia.MSc.
(Anggota)
~ r o f . ~ r . & v i a n vWidiaiakusuma.M
Tanggal Lulus
: Senin, 21 Desember 1998
ida Manuwoto,M.Sc.
RIWAYAT HlDUP
Penulis dilahirkan di Bumi Parahyangan Surnedang pada tanggal 17
Agustus 1964 dari pasangan Bapak Enco Suarma serta Ibu Enoh Menoh
sebagai anak bungsu dari delapan bersaudara.
Sekolah Dasar, Sekolah Menengah Pertarna, dan Sekolah Menengah
Atas diselesaikan pada tahun 1983 di Situraja, Surnedang, Jawa Barat. Pada
tahun 1983 penulis diterirna di Proyek Perintis I Departemen Farmasi lnstitut
Teknologi Bandung dan pada tahun berikutnya penulis rnelalui Sipenmaru di
terima di Jurusan Pendidikan Biologi FPMlPA IKlP Bandung. Tahun 1990
penulis lulus sebagai Sarjana Pendidikan Biologi.
Pada tahun 1991 penulis diterima sebagai staf pengajar Jurusan
Pendidikan Biologi FPMlPA IKlP Negeri Medan. Setahun kemudian penulis
melanjutkan Program Magister Sains pada Program Studi Biologi
Sub
Program Studi Mikrobiologi Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor
dan lulus pada tahun 1995. Pada tahun itu juga atas dorongan dan saran
dari Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., penulis mendapat kesernpatan untuk
rnelanjutkan pendidikan Program Doktor pada Program Studi dan Sub
Program yang sarna.
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdullilah hirobbil a'lamin atas rahmat dan karunia-Nya penulis
dapat menyeiesaikan laporan penelitian ini dalam bentuk disertasi yang
berjudul "Konstruksi Peta Genetik Parsial dan Karakterisasi Sintasan
Epifitik
Mutan
Non-Patogenik
dari
Xanthomonas
axonopodis
(campestris) pv. glycines YR32".
Penelitian ini terselesaikan atas bimbingan luar biasa dari Dr. Ir.
Antonius Suwanto, MSc. Untuk itu, dengan rasa rendah hati penulis
haturkan terima kasih dan penghargaan yang tak terhingga. Beliau telah
membimbing dengan luar biasa dari mulai penulis mengikuti Program
Magister Sains sampai terselesaikannya Program Doktor ini. Rasa hormat
dan kagurn penulis rasakan selarna beliau membimbing di dalam
laboratorium rnaupun di luar, beliau telah memberikan suri tauladan seorang
ilmuwan dan sejumlah kesempatan yang tak terhingga baik berupa diskusi
yang menarik, mengikuti dan memimpin suatu kursus dalam bidang biologi
molekuler,
peminjaman
buku-buku dan
referensi
yang
diperlukan,
kesempatan rnenjadi asisten pada berbagai mata ajaran (Biologi Molekuler,
Genetika Mikroba, Rekayasa Genetika, dan Biologi Molekuler Keragaman
Bakteri) serta dana SPP pada waktu tahun pertarna penulis mengikuti
program doktor. Semoga Tuhan membalasnya yang setimpal. Amin.
Pada kesempatan ini juga perkenankan penulis menyampaikan
ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada :
1. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, selaku anggota komisi pembimbing
yang sekaligus sebagai Kepala Lab. Mikrobiologi dan Biokimia PAU
Bioteknologi IPB tempat penulis melakukan penelitian atas bimbingan dan
kepercaan yang diberikan kepada penulis menjadi asisten pada mata ajaran
Biokimia Mikroba sejak tahun 1993. Beliau dengan sikap ilmuwan dan kasih
sayang yang tinggi telah berhasil menciptakan suasana ilmiah dan
kekeluargaan di laboratorium sehingga penulis merasa nyaman dan betah
untuk menyelesaikan penelitian.
2. Dr. Ir. Budi Tjahjono, M.Agr., selaku anggota komisi pembimbing
dan Ketua Proyek Hibah Tim II atas segala birnbingan dan biaya penelitian
yang telah beliau berikan. Serta atas kesempatan mengikuti kegiatan
Overseas Visiting ke UC. Berkeley. USA.
3. Prof. Dr. drh. Reviany Widjajakusuma, M.Sc.,
selaku anggota
komisi dan ketua program studi Biologi, atas bimbingan dan arahan selama
penulis rnenyelesaikan studi baik pada waktu S2 maupun S3. Selain itu
beliau telah memberikan contoh serta filosofi seorang ilmuwan yang baik.
4. Prof. Dr. Ir. Edi Guhardja, M.Sc., selaku anggota komisi atas
segala bimbingan dan arahan yang sebesar-besarnya, terutama untuk
perbaikan yang sangat teliti akan penulisan disertasi ini.
5. Dr. Ir. Meity S. Sinaga, M.Sc dan Dr. M. Machmud, M.Sc., selaku
dosen penguji di luar komisi atas saran untuk kesempurnaan penulisan
disertasi ini dan atas diskusi yang menarik selama penulis melakukan
penetitian.
6. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, atas dana Beasiswa
Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan Project University Research for
Graduate Education (URGE)/ Proyek Hibah Tim II, yang diberikan selama
penulis menyelesaikan studi.
7. Dr. Ir. Muhammad Yusuf dan Dr. Ir. A. Aziz Darwis, selaku
mantan dan Direktur PAU Bioteknologi IPB atas izin dan penggunaan fasilitas
selama penulis melaksanakan penelitian.
8. Prof. Steve E. Lindow, Ph.D.,
atas penggunaan gen inaZ
(pJL1703), fasilitas, bimbingan, arahan, dan segala bantuan lainnya selama
penulis melakukan Overseas Visiting di Depattment of Plant and Microbial
Biology University of California, Berkeley., USA.
9. Maria Brandl, Ph.D.,
atas segala bantuan selama penulis
melakukan Overseas Visiting, tetutama atas arahan eksperimen mengenai
analisis kebugaran.
10. Jean-Michel Monier, Mavis Hansond Chong, Ph.D., dan LaiMun Gong, atas bantuan selama penulis melakukan Overseas Visiting,
diskusi melalui e-mail,
kiriman journal atau paper aktual dan sejumlah
referensi lain yang sangat membantu penulis menyelesaikan penulisan
disertasi ini.
11. Ir. Budiasih Wahyuntari, M.Sc., atas pengambilan gambar untuk
dokumentasi dan slide, selain itu atas persahabatan dan motivasi yang
diberikan.
12.
Moch. Firly Nurochman, SSi. dan Yogiara,
SSi. (atas
bantuannya pada waktu penyemprotan, sampling, dan penimbangan daun
kedelai). Rudy Widjaya, STp. (atas bantuannya pada waktu pembuatan
slide), Ir. Benny Tanudjaja (atas bantuannya pada waktu penggunaan
program komputer SAS version 6.12), Ir. B. Junaidi Lee, Ir. Ricky Widjaja,
M.Si, segenap rekan dan sejumlah teknisi di Lab. Mikrobiologi dan
Biokimia khususnya dan PAU Bioteknologi IPB umumnya, atas motivasi,
bantuan tenaga dan pikiran, persaudaraan, persahabatan, dan kebersarnaan
serta diskusi ilrniah yang menarik selama penulis melakukan penelitian.
13. Dr. Ir. Alex Hartana,M.Sc.,
atas izin pernakaian Rumah Kaca
untuk pengujian in planta dan atas penggunaan alat blotting dan fiksasi
membran.
14. Dr. Ir. Soni Suharsono, atas kelonggaran penggunaan E C L ~ ~
(direct nucleic acid labelling and detection system).
15. Dr. Dra. Anya Meryandini, M.Si., atas persahabatan dan motivasi
yang diberikan.
16. Kedua orang tua penuiis (Bapak Enco dan Ma Enoh), Kakak-
Kakak (Kang Enas, Kang Dede, Ceu Eruk, Ceu Wiwi, Ceu Cucu, Ceu
Yoyoh, serta Yuyu), segenap kakak ipar dan keponakan. Atas do'a,
dorongan mental dan spiritual , kasih sayang yang telah, sedang dan akan
diberikan pada penulis selamanya.
Bogor, Desember 1908
Yaya Rukayadi
KATA PENGANTAR
Salah satu sumber protein nabati yang paling banyak dikonsumsi
masyarakat Indonesia adalah kedelai (Glycine max (L.) Merr), akan tetapi
produksi kedelai nasional masih belum mencukupi kebutuhan. Hal ini
disebabkan salah satunya karena adanya penyakit bisul bakteri pada kedelai
yang disebabkan oleh Xanthornonas axonopodis (campestris) pv. glycines
atau Xag. Akhir-akhir ini untuk mengatasi penyakit tanaman banyak
dilakukan dengan dua macam pendekatan yaitu : (i) memahami mekanisme
patogenisitas Xag, dan (ii) penggunaan agens biokontrol.
Tulisan ini berisi serangkaian hasil penelitian dengan penggunaan
pendekatan teknik-teknik molekuler, yang terdiri dari: (i) lokalisasi gen dan
pemetaan parsial gen-gen yang mungkin terlibat dalam mekanisme
patogenisitas Xag, dan (ii) konstruksi dan karakterisasi galur non-patogenik
yang isogenik dari Xag untuk agens biokontrol penyakit bisul bakteri pada
kedelai. Hasil yang menarik dari penelitian ini yaitu telah berhasilnya
dikonstruksi satu galur non-patogenik yang isogenik (M715) dengan tipe
liamya (Xag YR32). sehingga sudah hampir pasti dapat menempati relung
ekologi dan mampu berkompetisi pada sumber nutrisi yang sama. Galur
M715 non-patogenik yang isogenik ini mempunyai potensi sebagai agens
biokontrol untuk mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat mernberikan informasi dan suatu
model pendekatan dalam mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai
khususnya dan penyakit tanaman pada urnumnya. Amin.
Bogor, Desember 1998
Yaya Rukayadi
xxiii
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANTAR...........................................................................
xxii
DAFTAR IS1......................................................................................
xxiv
DAFTAR TABEL..............................................................................
xxvii
DAFTAR GAMBAR.........................................................................
xxviii
PENDAHULUAN ..................................................................
Latar Belakang............................................................
1
1
Tujuan Penelitian.........................................................
6
TINJAUAN PUSTAKA.............................................................
Biologi Molekuler Xanthomonas axonopodis (campestris)
pv. glycines..................................................................
7
Studi Patogenisitas Molekuler Xanthomonas axonopodis
(campestris)....................................................................
7
9
Mutagenesis Transposon................................................
Tn5.................................................................................
Tn4431..........................................................................
Tn4351..........................................................................
12
Pemetaan Fisik dan Genetik DNA Genom...........................
16
Biokontrol Penyakit Tanaman............................................
19
Konstruksi Galur Non-Patogenik yang Isogenik....................
Mutagenesis terarah .............................................
Mutagenesis transposon .......................................
21
21
22
Gen inaZ Sebagai Gen Pelapor........................................
24
BAHAN DAN METODE.............................................................
26
13
15
15
Media dan Kondisi Perturnbuhan.......................................
Bahan dan Alat ................................................................
Teknik Molekuler dan Mutagenesis Transposon .....................
Penyiapan Kotiledon dan Tanaman Kedelai...........................
Metodologi......................................................................
Penapisan Transposon untuk Mutagenesis Transposon............
Konstruksi Plasmid untuk Transposon Mutagenesis pada
X. axonopodis (campestris) pv. glycines YR32 ........................
Mutagenesis Transposon Xag YR32 dengan pUTminiTn5KmR-TpR(pYR103).........................................................
Uji Prototrofi dan Analisis Fenotipik Mutan..............................
Lokalisasi Gen dan Pemetaan Genetika Parsial..........................
A . Schizotyping.........................................................
Penyiapan suspensi bakteri...............................
Penyiapan DNA genom utuh..............................
Pernotongan DNA genom utuh
dengan enzim restriksi.............................................
Elektroforesis dengan PFGE..............................
Visualisasi DNA..............................................
B. Analisis hibridisasi Southern....................................
Proses blotting................................................
Petabelan pelacak dan deteksi hibridisasi.............
lnstroduksi Gen Penyandi Nukleasi Es (inaZ)
ke dalam Xag YR32 ....................................................................
Analisis Ekspresi Nukleasi es pada Xag YR32 (pJL1703).........
Analisis Kompetisi.............................................................
Karakterisasi galur bakteri yang berkompetisi (Xag YR32.
YR321ce+. dan M715).................................................
Asai tabung beku...................................................
Analisis pergantian serial de Wit .......................................
xxv
Analisis Kebugaran ..........................................................
45
Analisis Data....................................................................
46
HASlL DAN PEMBAHASAN.......................................................
Penapisan Transposon untuk Konstruksi Plasmid.....................
Konstruksi Plasmid untuk Mutagenesis Transposon pada
X. axonopodis (campestris) pv. glycines YR32 ........................
Mutagenesis Transposon X axonopodis (campestris)
pv. glycines YR32 dengan pYR103........................................
Uji Prototrofi dan Analisis Mutan.............................................
Lokalisasi Gen dan Pemetaan genetik Secara Parsial Genom
X. axonopodis (campestris) pv.glycines YR32 .............................
Karakterisasi Galur Non-patogenik yang isogenik dari Xag YR32 .
lntrodulsi inaZ pada Xag YR32 ...................................
Karakterisasi galur bakteri yang berkompetisi: Xag YR32
YR321ce+. dan M715................................................
Analisis kompetisi...................................................
Analisis pergantian serial de Wit ................................
.
Analisis Kebugaran M715...................................................
KESIMPULAN DAN SARAN........................................................
Kesimpulan....................................................................
Saran............................................................................
DAFTAR PUSTAKA.................................................................
DAFTAR TABEL
Nomor Tabel
Teks
Halaman
1.
Galur bakteri, plasmid dan transposon.....................................
2.
Frekuensi konjugasi hasil mutagenesis transposon
pada Xag YR32 dengan transposon mini-Tn5KmR,
Tn4431TcR,dan Tn4351TcR........... ...... ......... 47
mini-Tn5SpR/SmR,
3.
Frekuensi konjugasi pYR103 pada X. axonopodis (campestris) pv.
glycines YR32.. ....................... ............ .... ........................
58
4.
Penarnpilan fenotipik mutan-mutan Xag YR32 hasil rnutagenesis
transposon .....................................................................
61
5.
Hasil pengujian patogenesitas dengan bioasai kotiledon............
68
6.
Hasil analisis aktivitas nukleasi es pada Xag YR321ce+
dengan asai tetes beku..... ..................................................
78
Hasil analisis kompetisi bakteri M715 dan YR321ce+ dengan
asai tabung beku pada suhu 4.5"C ......................................
83
7.
xxvii
26
DAFTAR GAMBAR
3r Garnbar
Teks
Halarnan
Bagan alur penelitian.......................................................... 31
lnokulasi bakteri pada permukaan daun dengan
penyemprotan (A), dan tanaman kedelai setelah inokulasi (B) .....
43
Konstruksi plasmid pYR103 (pUTrnini-Tn5KrnR-TpR).
.................. 49
Hasil verifikasi plasmid (pNEB193-TpR): A. Plasmid pNEB193
dipotong dengan Smal (I), 1 kb DNA Ladder (2), dan dipotong
dengan Asp7181 + Notl (3) B. Plasrnid pYR101 (pNEB193-Tp)
intact (utuh) (1) dipotong dengan Kpnl + Pmel (3), 1 kb Ladder (4).
51
dan dipotong dengan Kpnl + Hindlll (5) ...............................
): A. Plasmid
Hasil verifikasi plasrnid pYR102 (p~~18-Notl-TpR
pYR101 yang dipotong dengan Kpnl + Hindll (I), 1 kb DNA Ladder
(2). dan plasmid pUC18-Notl yang dipotong dengan Kpnl +
Hindll (3). B. Hasil pemotongan plasmid pYR102
(pUC18-Notl-TpR)dengan Pacl (I), Pmel (2). Pacl-Notl (3).
1 kb DNA ladder (4). Pmel + Notl(5), dan plasmid pYR102
utuh (6) ............................................................................
52
Hasil pernotongan pUTmini-Tn5KmRdan PYR102 dengan Notl:
A. Hasil pemotongan plasmid pUTmini-Tn5KrnRdengan Notl
(1 dan 2). 1 kb DNA Ladder (3) B. plasrnid pYR102 utuh (1) 1 kb
DNA ladder (2), dan hasil pernotongan pYR102 dengan
Notl (3) .......................................................................
53
Hasil verifikasi sejurnlah transforman pYR103: A. Plasrnid
transforman utuh (1-1 I), dan 1 kb DNA Ladder (12). B. Plasrnid
transforman yang dipotong dengan EcoRl (I), (2), (3). (5),(6), (8).
(9). (11), (12), Pacl + Pmel (4), (lo), dan 1 kb DNA Ladder (7) ...... 54
Hasil verifikasi plasrnid pYR103: A. Plasmid pYR103 yang
dipotong dengan EcoRl (I),
(2),Pacl + EcoRl (3), Pmel +
EcoRl(4), dan 1 kb DNA Ladder (5). B. 1 kb DNA Ladder (I),
plasmid pYR103 utuh (2),plasmid pYR?03yang dipotong
dengan Xhol (3). Asel (4),Spel + EcoRl (5) ............................
56
9.
Hasil pengujian pototrof Xag YR32 tipe liar : medium agaragar M9 (A), dan (b) medium agar-agar MinA (B)..................
61
10.
Hasil pengujian katalasem adanya aktivitas katalase diperlihatkan
dengan produksi gelembung (gas 0,)
pada koloni yang ditetesi 3%
H,O,: tipe liar (I), M715 (2), dan sejurnlah rnutan (yang tidak
diberi nomor) .................................................................
63
11.
Uji proteolitik, adanya aktivitas protease ditandai dengan
terbentuknya area bening disekitar koloni pada media LA
yang ditarnbah dengan 2% susu skim: tipe liar (I), mutan prt (2).
dan M715 (3) .........................................................................
64
12.
Penarnpilan koloni: tipe liar Xag YR32 (I), mutan pig atau atau
xanthomonadin (2). mutan pat (3), dan rnutan xan (3) ................. 66
13.
Hasil asai patogenisitas dengan bioasai kotiledon: galur
non-patogenik tidak menirnbulkan area kuning klorotik disekitar
luka pada kotiledon kedelai (A.l), galur patogenik rnenimbulkan
area kuning klorotik di sekitar luka pada kotiledon (A.2).
Xcc sebagai kontrol negatif (B.1). Xag YR32 sebagai kontrol
positif (8.5). rnutan aux (M33) (B.2), mutan pig- (M216) (8.3).
mutan prt- (M415) (8.4). mutan xan- (M 180) (B.6), mutan pat(M715) (B.7), dan YR321ce+ (Xag YR32 inaZ) (8.8).
Umur kotiledon 7 hari, inkubasi 28-30°C selama 7 hari,
dan umur biakan bakteri 48 jam pada media agar-agar YDC. ...... 67
14.
Skizotipe-Asel sejurnlah mutan pada kondisi : 1% agar, waktu
pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam,
tegangan 5.0 volffcrn (25-33 mA), dan ternperatur
penyangga 14OC (A). Hasil analisis hibridisasi Southern
menggunakan pelacak 2.8 kb-EcoRI pYR103........................... 71
15.
Skizotipe-Asel M715 pada kondisi : 1% agar, waktu
pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam,
tegangan 5.0 volffcrn (25-33 mA), dan temperatur penyangga
14OC (A). Hasil analisis hibridisasi Southern menggunakan
pelacak 2.8 kb-EcoRI pYR103 (B). ..........................................
16.
A. Skizotipe-Asel mutan: aux (I), prt- (2). xan- (3). pig- (4). dan
dan pat- (5) pada kondisi : 1% agar, waktu pulsa ramping
5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam. tegangan 5.0 volffcm
(25-33 mA) dan temperatur penyangga 14OC;
73
B. Hasil analisis hibridisasi Southern menggunakan pelacak
2.8 kb-EcoRI pYR103 ................................................................
74
Lokalisasi gen pada skizotipe-Asel Xag YR32 ..........................
75
Peta genetik parsial skizotipe-Asel Xag YR32 ..........................
76
Analisis aktivitas nukleasi es dengan asai tetes beku, tetesan
yang membeku menunjukkan adanya aktivitas nukleasi es..........
77
Penampilan koloni: YR32 (1). YR321ce+ (2). dan M715 (3). .......
79
A. Skizotipe-Asel YR32 (2). YR321ce+ (3). dan M715 (4);
B. Skizotipe-Spel YR32 (2), YR321ce+ (3). dan M715 (4) pada
kondisi : 1%agar, waktu pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE,
waktu running 22 jam, tegangan 5.0 voltlcm (25-33 mA),
dan temperatur penyangga 14'C. Penanda ukuran molekul DNA:
kromosom Rhodobactersphaeroides 2.4.1 yang dipotong
dengan Asel (A.1, B.l ).. ..................................................
79
Kuwa pertumbuhan Xag YR32, YR321ce+, dan M715 pada
media LB dengan suhu inkubasi 2830% pada goyangan 200 rpm
dan diukur pada OD ..................................................... 80
,
Asai nukleasi es dengan asai tabung beku: YR32lce+(kontrol+)
yang memiliki aktivitas nukleasi es (isi tabung yang membeku
dan berwarna putih) dibandingkan dengan YR32 tipe liar (kontrol -)
(A), dan hasil asai dengan dua puluh tabung reaksi masingmasing berisi daun kedelai di dalam 10 ml penyangga fosfat
(10 mM; pH 7.0) (B).................................................................. 82
Analisis pergantian serial de Wit antara X. axonopodis (campestris)
pv. glycines YR321ce+ dan M715, garis diagonal (.....) merupakan
garis isogenik. ........................................................................... 85
Dinamika populasi YR321ce+ dan M715 pada daun kedelai dengan
inokulasi secara terpisah (individu), konsentrasi sel bakteri yang
diinokulasikan masing-masing 4.5 x lo5sellml............................ 86
Dinamika populasi YR321ce+ dan M715 pada daun kedelai secara
KO-inokulasidengan perbandingan antara YR321ce+ dengan M715
adalah 1: 1. Konsentrasi total populasi bakteri yang diinokulasikan
9 x 1O5 sellml. ............................................................................
87
27 .
28 .
29 .
Dinamika perbedaan populasi (rasio populasi) antara YR321ce+
dan M715 yang diinokulasikan secara terpisah dan ko-inokulasi
dengan perbandingan 1 : 1...................................................
88
Dinamika populasi YR32 : dengan inokulasi terpisah (a) dan
dengan ko-inokulasi (b)..................................................
89
Dinamika populasi M715 : dengan inokulasi terpisah (a) dan
dengan koinokulasi (b).....................................................
91
xxxi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai (Glycine max (L.) Merr) merupakan salah satu sumber protein
nabati yang paling banyak dikonsumsi masyarakat Indonesia. Produksi
kedelai nasional sampai saat ini masih belum mencukupi kebutuhan. Data
Direktorat Bina Program Tanaman Pangan dan Hortikultura (TPH),
memperlihatkan bahwa produksi kedelai pada tahun 1998 diperkirakan
1.875.558 ton, sernentara kebutuhan pada tahun yang sama mencapai
2.361.497 ton. Sehingga terdapat kesenjangan antara produksi dan
kebutuhan sekitar 500.000 ton (Adnyana, 1998). Kesenjangan itu dapat
ditutupi dengan mengirnpor kedelai dari luar negeri, tetapi sekarang harga
kedelai impor sangat tinggi akibat depresiasi rupiah terhadap dolar. Harga
kedelai impor yang lebih tinggi dibandingkan harga kedelai lokal, ha1 ini
merupakan peluang bagi petani untuk meningkatkan produksi dan kualitas
kedelai lokal. Tetapi dalam usaha meningkatkan produksi dan kualitas
kedelai lokal seringkali serangan harna dan penyakit menjadi kendala.
Salah satu penyakit kedelai di lndonesia yang belum tertangani adalah
penyakit bisul bakteri (bacterial pustule) yang disebabkan oleh Xanthomonas
campestris pv. glycines (Moffet dan Croft, 1983). Penyakit bisul bakteri ini
merupakan penyakit bakterial penting di lndonesia (Semangun, 1991), yang
tersebar di Pulau Jawa, Larnpung, Sulawesi Selatan (Machmud. 1987). dan
di Kalimantan Selatan (Aini, 1993). Berdasarkan analisis hibridisasi DNADNA bakteri ini lebih dekat hubungannya dengan X. axonopodis sehingga
Vauterin et a/. (1995) mengusulkan narnanya menjadi X. axonopodis pv.
glycines.
Akhir-akhir ini, untuk rnengatasi suatu penyakit dapat dilakukan
dengan dua pendekatan yaitu dengan memahami mekanisme patogenisitas
penyakit itu, dan penggunaan musuh-musuh alami (agens biokontrol)
berdasarkan prinsip-prinsip ekologis terrnasuk faktor kompetisi antara
organisme penyebab penyakit dengan pengendali. Maka dari itu, untuk
mengatasi penyakit bisul bakteri diperlukan suatu telaah untuk memahami
faktor-faktor yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas dan penggunaan
agens biokontrol.
Studi fisiologis yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi faktorfaktor yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas X.
axonopodis
(campestris) pv. glycines (Xag) banyak memberikan hasil yang meragukan
atau menemui jalan buntu. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme
patogenisitas sangat kompleks sehingga muncul pertanyaan-pertanyaan,
antara lain : Apakah enzim ekstraseluler patogen m e ~ p a k a nha1 yang
terpenting dalam proses patogenisitas? Berapa banyaknya gen yang terlibat
dalam proses patogenisitas? Serta bagaimana hubungan antara faktor-faktor
tersebut dengan tanaman inang hingga dapat rnenyebabkan penyakit?
lsolasi dan karakterisasi gen-gen yang terlibat dalam proses
patogenisitas merupakan tahap
awal
guna
memahami
mekanisme
patogenisitas bakteri tersebut. Meskipun demikian tahap ini dalam waktu
relatif singkat sudah cukup banyak memberikan informasi yang dapat
menunjang untuk memahami mekanisme patogenisitas suatu penyakit
(Gerhold dan Stacey, 1990). Oleh karena itu data yang rinci mengenai
genetika molekuler Xag, termasuk organisasi genom, peta fisik dan genetik
genomnya merupakan ha1 yang sangat penting untuk mengungkapkan
mekanisme biologis dalam ha1 ini mekanisme patogenisitas penyakit.
Sampai saat ini belum tersedia informasi mengenai struktur genom
maupun peta fisik dan genetik dari Xag yang memadai, bahkan sejauh
pengetahuan penulis peta fisik dan genetik bakteri tersebut belum ada selain
peta fisik dan genetik yang dikonstruksi oleh Widjaja (1996). Padahal,
informasi mengenai struktur genom merupakan suatu kerangka kerja yang
berguna untuk penelitian patogenisitas. Seiring dengan penelitian yang
sedang dilakukan untuk mengidentifikasi faktor-faktor yang berperan dalam
mekanisme patogenisitas, struktur genom dapat menyediakan informasi
mengenai peta fisik kromosom, peta fisik plasmid, serta lokasi relatif dari
masing-masing gen yang diperkirakan berperan pada proses patogenisitas
Xag pada tanaman inangnya.
Untuk menunjang pemetaan fisik yang beresolusi tinggi, perlu
dilakukan pemetaan dengan menggunakan enzim-enzim restriksi yang
memotong total genom bakteri itu lebih sering, seperti Asel dan Spel (Rosana
et a/., 1995; Rukayadi, 1995; Wahidin, 1996; Widjaja, 1996). Fragmenfragmen yang dihasilkan oleh pernotongan enzim yang memotong lebih
sering
berukuran
relatif lebih
kecil
sehingga
memudahkan dalam
penanganan maupun untuk pekerjaan sub-kloning fragmen restriksi tersebut.
Selain itu. peta fisik juga memerlukan lebih banyak penanda-penanda
genetik yang spesifik untuk rnelengkapi peta genetiknya. Hal ini dapat
dilakukan antara lain dengan menghasilkan mutan-mutan auksotrof, mutan
yang kehilangan sifat proteolitiknya (protease negatif), xantornonadin negatif,
katalase negatif, dan lain-lain dengan cara rnutagenesis transposon dan
kemudian menentukan lokasinya pada peta fisik dengan analisis hibridisasi
Southern menggunakan transposon yang bersangkutan sebagai pelacaknya
(probe).
Di lain pihak, penelitian agens biokontrol untuk mengatasi penyakit
bisul bakteri pada kedelai belum banyak dilakukan. Penelitian yang selama
ini telah dilakukan menunjukkan bahwa Pseudomonas fluorescen 829
merupakan agens biokontrol yang potensial untuk mengatasi penyakit bisul
bakteri pada kedelai (Mariani. 1995; Suwanto et a/., 1996; Manuella et a/.
.
1997; Nawa
4%
KONSTRUKSI PETA GENETIK PARSIAL
DAN KARAKTERISASI SINTASAN EPlFlTlK MUTAN
NON-PATOGENIK DARl Xanthomonas axonopodis
(campestris) pv. glycines Y R32
Oleh :
YAYA RUKAYADI
PROGRAM PASCASARJANA
INSTlTUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
ABSTRACT
CONSTRUCTION OF PARTIAL GENETIC MAP AND EPlPHlTlC
SURVIVAL OF NON-PATHOGENIC MUTANT OF Xanthomonas
axonopodis (campestris) pv. glycines YR32
YAYA RUKAYADI
Supe~ised
by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of Advisor), BUD1
TJAHJONO. MAGGY T. SUHARTONO, RNIANY WIDJAJAKUSUMA, and
ED1 GUHARDJA (Coadvlsors)
-
Pathogenesis of Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag)
on soybean has not been completely understood. The objective of this work is to
construct partial-genetic mapping of Xag genome which will facilitate our
understanding on the pathogenicity mechanism. and to construct non-pathogenic
isogenic strain as a paradigm for biocontrol agent for the disease.
From this work, we were able to construct a 8.2 kb recombinant plasmid
(pYR103) carrying Pacl and Pmel sites and TpRfor transposon mutagenesis and
gene localization in Xag. The transposable element (2.8 kb) also contains Asel site
which will serve as landmark to locate transposon insertion in genomic DNA
fragments generated by Asel-schizotyping. We employed transposon to generate
non-xanthomonadin mutants (pig), non-pathogenic mutants (pat), protease
negative mutants (ptf). auxotroph mutants (aus), and exopolysaccharide negative
mutants (xan-). Southern hybridization analysis was performed following complete
digestion of mutants using Asel. From the analysis using 2.8 kb-EcoRl fragment as
probe, it was revealed that pig, pat, prt, aux, and xan- genes are located within
240-. 185-. 185. 148. and 97-kb Asel fragments respectively. We were also able to
localize several unknown function genes marked by transposon insertions.
Using inaZ (pJL1703) as a reporter gene, we were able to demonstrate that
the non-pathogenic mutant (M715) could reduce colonization of Xag YR32 wild type
on soybean leaf surface. Based on competitive test using de Wit analysis, it was
revealed that M715 mutant was non-pathogenic isogenic strain of YR32 which could
compete within the same niche ecology with its wild type. Epiphytic fitness analysis
performed in the greenhouse indicated that population dynamics of YR32,
YR321ce+, and M715 were very similar. M715 mutant was able to survive until 16
days with population density of approximately 10' to 105 cells g*' of leaf wet weight.
Our study indicated the M715 mutant strain could be developed for biocontrol
directed against bacterial pustule disease on soybean plant.
Key words : partial genetic map, epiphytic survival,
Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines.
SUMMARY
YAYA RUKAYADI. Construction of partial genetic map and epiphytic survival
of non-pathogenic mutant of Xanthomonas axonopodis (campestris) pv.
glycines YR32. Supervised by ANTONIUS SUWANTO (Chairman of
Advisor),
BUD1 TJAHJONO.
MAGGY T.
SUHARTONO,
REVIANY
WIDJAJAKUSUMA, and ED1 GUHARDJA (Coadvisors).
Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) is the
causal agent of bacterial pustule disease on soybean plant. The disease
could reduce total soybean production and the problem had not been solved
completely up to the present. To overcome the disease, there were two
approaches to be taken: (1) understanding the pathogenicity mechanism of
the disease, and (2) application of natural biocontrol based on ecological
principles, including interaction between the pathogen and the competitive
bacteria.
Pathogenicity mechanism on Xanthomonas was complicated and
poorly understood among enormous investigation to reveal the causes of the
disease. In this study, we showed that isogenic but non-pathogenic organism
could become a potential competitor for its parental pathogenic strain in a.
limited nutrient and space availability in the same habitats on soybean leaf
surface. One possible hypothesis that we brought into work was that the
perfect competitor for pathogenic organism could be constructed from the
pathogen itself such that it would be no longer pathogenic but still retains its
survival and fitness on soybean leaves. Therefore, we conducted work on
Xag pathogenicity mechanism and construction of non-pathogenic isogenic
strain to overcome bacterial pustule disease on soybean. The objectives of
this study are as follows : (i) To construct partial genetic map of Xag YR32
genome as one approach to understand Xag pathogenicity, and (ii) To
construct an isogenic but non-pathogenic strain derived from Xag YR32.
To achieve those objectives, series of experiment were conducted,
which includes :
(1) Screening of transposon suitable for transposon mutagenesis on Xag
YR32. This work was performed by either di- or triparental mating using
plasmid donor as follows : pUTmini-Tn5KmR, pUTmini-Tn5SpR/SmR,
pEP4351(Tn4351TcR),and pUCD623 (Tn4431TcR).
(2) Construction of plasmid carrying particular transposon carrying restriction
sites for two restriction endonucleases: Pacl and Pmel. This recombinant
plasmid will be used as donor in transposon mutagenesis on Xag YR32.
(3) Prototrophic and phenotypic of a number of mutants generated from
transposon mutagenesis. Minimal medium A (MinA) and M9 was used in
prototrophic analysis. Phenotypic characters that were evaluated include :
exopolysaccharide production (mucoid appearance of the colonies).
xanthomonadin production, catalase activity,
protease production,
pathogenicity analysis using cotyledon bioassay, and auxotrophic mutants
analysis.
(4) Gene localization and partial genetic mApping of Xag YR32 genome. In
this work, a combination of schizotyping and Southern hybridization was
performed. Genomic DNA preparation and restriction enzyme digestion
were done within agarose matrix and Pulsed-Field Gel Electrophoresis
(PFGE) was employed to separate large size DNA fragments. Southern
hybridization analysis was performed by transferring of DNA from agarose
gel onto nylon membrane (Photogene) using VacuGeneXL (Pharmacia
Biotech). Non-radioactive probe was prepared from recovered 2.8 kbEcoRl DNA fragment (pYRIO3). Probe labelling and hybridization
detection were done directly using ECLTM(direct nucleic acid labelling and
detection system) (Amersham LIFE SCIENCE).
(5) lnaZ gene introduction into Xag YR32.
In this work, triparental mating
was conducted using pJL1703 (inaZ) as donor and pRK2013 as helper
plasmid. inaZ gene was used as reporter gene for further analysis. Ice
nucleation activity in Xag YR321ce+ was performed using droplet-freezing
assay.
(6) Competition analysis between Xag M715 and Xag YR32 was conducted
in planta on two weeks old soybean plant inside a green house.
Competition capability was examined based on the number of frozen
tubes divide by total number of tubes. For de Wit serial replacement
analysis, proportion of the mixture between M715 and YR321ce+ were
formufated as follows :0:10, 1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,
10:O.
M715 and YR321ce+ were used at concentration around 5 x 10' cell ml-'.
Total concentration of the bacterial mixture was around
lo7 cell
mr'.
Fitness test of M715 and YR321ce+ was conducted for 16 days after
inoculation on 20 weeks old soybean plant. The experiment was
conducted with two different treatments : individual inoculation was 4.5 x
lo5 cell ml-' for each strain, or 1:l
for co-inoculation. Total bacterial cell
for each strain were counted using plate count method orestimated using
ice nucleation assay.
Our study indicated that transposon mutagenesis using pUTminiTn5KmR in Xag YR32 yielded higher frequency of transconjugants than
transposon mutagenesis using either pUTmini-Tn5SpRiSmR, pUCD623Tn4431TcR, or pEP4351-Tn4351TcR. Therefore pUTmini-Tn5KmRwas used
for further work.
We have constructed a 8.2 kb pYR103 derived from of Tn5 pUTminiTn5KmRwith the addition of TpR marker and Pacl and Pmel restriction sites.
Frequency of
conjugation of pYRIO3 in Xag YR32 was 8,3 x 10" per
recipient which was consistently higher than that of other transposons that
have been used previously.
The recombinant plasmid (pYRIO3) would
cloning, physical as well as genetic mapping in Xag and related species or
pathovars.
A total of 2187 mutant generated from transposon mutagenesis were
collected and 1019 of randomly selected mutants had been phenotypically
analyzed (47 %) from which a total 523 (23 %) mutants had been analysed
by DNA profiling
employing Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Among
mutants which had been analysed for their genomic DNA profile, as much as
3 % were mutants with observable alteration in their phenotypic appearance
while the rest of the mutants (97 %)were cryptic mutants which did not show
any observable phenotypic alteration relative to that of the wild type.
Phenotypic
mutants generated from
xanthomonadin- (M216) mutant,
this
mutagenesis were:
exopolysaccharide- (M180)
mutant,
protease-minus (M415) mutant, auxotroph (MI87 or M33) mutant, and nonpathogenic (M715) mutant. M715 did not show any phenotypic changes, but
cotyledon bioassay showed that M715 did not cause yellow chlorotic spot on
soybean cotyledon as its wild type.
From 523 mutants that have been
analyzed, none were catalase- (car). One possible explanation was that
catalase might be encoded by more than one gene.
Minimal medium A
contains no amino acids, therefore the media could be used for auxotroph
analysis in this study.
Southern hybridization works using 2.8 kb-EcoRI fragment from
pYR103 revealed that 88 mutants out of 93 were shown to have different
location of transposon. It was shown by the presence of two hybridization
signals in the Asel-schizotyping of Xag YR32. The data also showed that
almost all of the mutants (95 %) generated from mutagenesis were
transconjugants (mutants generated from transposition of Tn5KmR). Genes
encoding xanthomonadin (pig), pathogenicity (pat), protease (prf), auxotroph
(aux), and exopolysaccharide (xan) were located within 240-, 185, 185-,
148- and 97-kb of Asel fragments respectively. Other cryptic genes had also
been located in Asel-schizotypes which will be useful for construction of Xag
YR32 genomic library.
Xag YR32 (pJL1703) carrying inaZ (Xag YR321ce+) constructed in this
work was able to express ice nucleation protein with activity of 1-3 ice nuclei
for every 10' bacterial cells at -45°C. Xag YR32, YR321ce+, and M715
growth curves indicated that those three strains possess the same growth
patterns.
Competition analysis between M715 and YR321ce+ in frozen tube
assay demonstrated that M715 population could suppress YR32 population.
In line with this result, de Wit analysis indicated that the population of either
YR321ce+ or M715 fell around isogenic line while the total population of the
competing bacteria was relatively stable. Therefore the mutation in M715 did
not reduce its capability to compete with its wild type in planta. The
competition apparently was due to the ability of strains to occupy the same
ecological niche.
The result of individual inoculation of YR3lce+ or M715 isolates
showed similar profile of growth curve, although YR321ce+ always maintained
higher population density at any time in comparison to that of M715. This
result suggested that the pat gene on M715 influenced the fitness of the
mutant bacterium in planta. On the contrary, the result of coinoculation
experiments showed almost identical growth curve and population dynamics
pattern at all of the time after inoculation. The difference between population
growth of YR321ce+ and M715 in the individual inoculation is higher than that
of the coinoculation result. Furthermore, on day 2. 3, and 5 the population of
M715 is slightly higher than that of YR321ce+. Although overall population of
M715 is slightly lower than that of YR321ce+, it still could compete with
YR321ce+ as shown from the ability of M715 to keep the ~ ~ 3 2 1 c e +
population at a relatively constant until day 16. M715 survival on soybean
phyllosphere might be due to the existence of cross-feeding mechanism on
certain growth factor produced by wild type (YR321ce+) to M715.
RINGKASAN
YAYA RUKAYADI. Konstruksi peta genetik parsial dan karakterisasi sintasan
epifitik mutan non-patogenik dari Xanthomonas axonopodis (campesfris) pv.
glycines YR32. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO (Ketua Komisi
Pembimbing), BUD1 TJAHJONO, MAGGY T. SUHARTONO, REVIANY
WIDJAJAKUSUMA, dan ED1 GUHARDJA (Anggota Komisi Pembimbing).
Xanthomonas axonopodis (campestris) pv. glycines (Xag) merupakan
penyebab penyakit bisul bakteri pada kedelai. Penyakit bisul bakteri dapat
menurunkan produksi kedelai dan sampai sekarang masih belum tertangani.
Untuk mengatasi penyakit dapat dilakukan dengan dua pendekatan yaitu
dengan : (1) memahami mekanisme patogenisitas penyakit,
dan (2)
penggunaan musuh-musuh alami berdasarkan prinsip-prinsip ekologis
termasuk faktor kompetisi antara organisme penyebab penyakit dengan
pengendali.
Mekanisme patogenisitas pada Xag sangat kompleks dan belum
banyak diteliti sehingga belum banyak dimengeiti dan pengetahuan
mengenai bakteri patogen ini di taraf molekuler masih relatif sedikit.
Sementara itu beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa bakteri-bakteri
non-patogenik yang isogenik dengan bakteri patogennya memiliki potensi
untuk saling menyingkirkan pada habitat yang sama, dengan tingkat
persaingan yang tinggi. Maka dari itu perlu dilakukan penelitian tentang
mekanisme patogenisitas Xag dan konstruksi galur non-patogenik yang
isogenik untuk mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai. Penelitian ini
bertujuan untuk: (i) Mengkonstruksi peta genetik secara parsial genom Xag
YR32 sebagai salah satu cara untuk memahami rnekanisme patogenisitas
Xag, dan (ii) Mengkonstruksi galur non-patogenik yang isogenik dari Xag
Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilakukan serangkaian
percobaan yang meliputi :
1. Penapisan transposon untuk transposon mutagenesis pada Xag YR32.
Tahap ini dilakukan dengan konjugasi dua atau tiga tetua menggunakan
pUTmini-Tn5KmR, pUTmini-Tn5SpR/SmR, pEP4351 (Tn4351TcR), dan
pUCD623 (Tn4431TcR)sebagai plasmid donor dengan plasrnid penolong
pRK2013.
2. Konstruksi plasmid khusus yang membawa transposon terpilih dengan
tambahan penanda antibiotika trimetoprim dan dua situs enzirn restriksi
(Pacl dan Pmel). Plasmid rekombinan ini digunakan sebagai donor dalam
transposon rnutagenesis pada Xag YR32.
3. Analisis prototrofi dan fenotipik terhadap sejumlah mutan hasil transposon
mutagenesis. Medium minimal yang digunakan untuk uji prototrofi adalah
medium minimal MinA dan M9. Analisis fenotipik mutan meliputi:
penampilan eksopolisakarida (mukoiditas pada koloni), produksi pigmen
xanthomonadin,
aktivitas
katalase,
produksi
protease,
analisis
patogenisitas dengan bioasai kotiledon, dan analisis auksotrofi.
4. Lokalisasi gen dan pemetaan genetik genom Xag YR32 secara parsial,
Tahap ini dilakukan dengan kombinasi antara schizotyping dan hibridisasi
Southern. Penyiapan dan pemotongan DNA genom utuh dengan enzim
restriksi dilakukan dalam matriks agarosa. Elektroforesis dengan PulsedField Gel Electrophoresis (PFGE). Analisis hibridisasi Southern diawali
dengan transfer DNA hasil pernisahan dengan PFGE ke membran nilon
(Photogene nylon membrane) menggunakan VacuGeneXL (Pharrnacia
Biotech). Pelacak non-radioaktif dipersiapkan dari fragmen DNA potongan
2.8 kb-EcoRI (pYR103). Pelabelan pelacak dan deteksi hibridisasi
dilakukan secara langsung menggunakan ECLTM(direct nucleic acid
labelling and detection system) (Amersham LIFE SCIENCE).
5. lntroduksi inaZ ke Xag YR32. Pada tahap ini dilakukan konjugasi tiga
tetua dengan pJL1703 (inaZ) sebagai donor dan pRK2013 sebagai
penolong. Gen inaZ ini digunakan sebagai gen patapor pada analisis
selanjutnya. Aktivitas nukleasi es pada YR321ce+ dilakukan dengan asai
tetes beku.
6. Analisis kompetisi antara Xag M715 dengan YR321ce+ dilakukan secara
in planta pada tanaman kedelai umur dua minggu di rumah kaca.
Kemampuan kompetisi diamati berdasarkan persentase jumlah tabung
beku dari seluruh jumlah tabung asai. Untuk analisis pergantian serial de
Wit, proporsi campuran antara M715 dan YR321ce+ adalah sebagai
berikut: 0:1, 1.9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3,8:2, 9:1, dan 10:O. Konsentrasi
suspensi bakteri M715 dan YR321ce+ yang digunakan pada analisis
pergantian serial de Wit masing-masing lebih kurang 5 x 10' sellmi,
sehingga total campuran bakteri adalah lo7 sellml. Analisis kebugaran
M715 dan YR321ce+ dilakukan selama 16 hari setelah inokulasi pada
tanaman kedelai berumur dua minggu, dengan dua perlakuan yaitu:
inokulasi secara terpisah dan ko-inokulasi. Konsentrasi suspensi set yang
diinokulasi untuk inokulasi terpisah masing-masing adalah 4.5 x
lo5
sellml, pada ko-inokulasi perbandingan antara M715 dengan YR321ce+
adalah
1:l.
Populasi
masing-masing
bakteri
dihitung
dengan
penghitungan cawan sebar dan asai nukleasi es.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa transposon mutagenesis dengan
pUTmini-Tn5KmR memberikan frekuensi
konjugasi
rata-rata
tertinggi
dibandingkan dengan menggunakan pUTmini-Tn5SpR/SmR, pUCD623Tn4431TcR,
dan
pEP4351-Tn4351TcR.
Sehingga
pUTmini-Tn5KmR
digunakan untuk penelitian selanjutnya.
Pada penelitian ini telah berhasil dikonstruksi plasmid rekombinan
pYR103 berukuran 8.2 kb, plasmid ini merupakan turunan Tn5 yang
dikonstruksi dari pUTmini-Tn5KmR dengan tambahan penanda antibiotika
trirnetoprirn yang mempunyai satu situs pengenal Pacl dan Pmel.
Frekuensi konjugasi pYR103 pada Xag YR32 adalah 8.3 x
lo4
per
resipien, frekuensi ini secara konsisten lebih tinggi dibandingkan dengan
menggunakan transposon lain pada percobaan yang sarna. Plasmid
rekornbinan ini
(pYRl03) dapat
digunakan sebagai fasilitas
untuk
mengkonstruksi mutan-mutan khusus untuk keperluan lokalisasi gen, kloning
molekuler, konstruksi peta fisik dan genetik pada Xag dan spesies-spesies
atau patovar-patovar lain yang berhubungan.
Sebanyak 1019 (47 %) mutan dari total 2187 mutan hasil transposon
mutagenesis telah berhasil dianalisis fenotipiknya, dan sebanyak 523 (23 %)
telah berhasil dianalisis DNA genornnya, yang terdiri dari : mutan-mutan
dengan perubahan fenotipik yang diamati dalam penelitian ini (3 %) dan
mutan-mutan kriptik yang tidak diketahui perubahan fenotipiknya (97 %).
Mutan fenotipik
yang
diperoleh antara
lain
: tidak
rnernproduksi
xantomonadin (M216), tidak mernproduksi eksopolisakarida (M180). tidak
memproduksi protease (M415), auksotrof (MI87 atau M33) dan nonpatogenik dengan bioasai kotiledon (M715).
Meskipun M715 tidak
menampilkan kelainan fenotipik, tetapi dengan bioasai kotiledon mutan ini
kehilangan sifat patogennya. Hal tersebut terlihat dari tidak terbentuknya
bercak kuning klorotik pada kotiledon kedelai, sedangkan rnutan pada gengen pig, prt, aux, dan xan tetap bersifat patogen dengan bioasai kotiledon.
Dari 523 rnutan yang dianalisis, tidak satupun didapatkan mutan yang tidak
mernproduksi katalase (car). Hal ini kernungkinan karena katalase pada Xag
disandikan oleh lebih dari satu gen. Medium minimal MinA merupakan
medium minimal bagi pertumbuhan Xag sehingga medium ini dapat
digunakan untuk analisis auksotrofi.
Hasil hibridisasi Southern rnenggunakan pelacak potongan 2.8 kbEcoRl dari pYR103 rnenunjukkan bahwa 88 dari 93 mutan yang diarnati
memperoleh sisipan transposon pada lokasi yang berbeda. Hal tersebut
ditunjukkan oleh adanya dua sinyal yang terletak pada posisi yang berbeda
pada skizotipe-Asel krornosom Xag YR32. Data tersebut juga menunjukkan
bahwa transkonjugan yang diperoleh pada penelitian ini hampir seluruhnya
merupakan mutan hasil transposisi (95%). Gen-gen penyandi xanthomonadin (pig), patogenisitas (pat), protease (prt), auksotrof (aux) dan
eksopolisakarida (xan) masing-masing terletak pada potongan 240-, 185,
185, 148-, dan 97-kb-Asel pada krornosom Xag. Selain itu juga telah
berhasil ditentukan lokasi sejumlah gen lain yang belum diketahui
ekspresinya (kriptik), gen-gen ini sangat berguna untuk menyusun pustaka
genom Xag.
XagYR32 (pJL1703) yang membawa inaZ (YR321ce+) temyata
mampu mengekspresikan inti es dengan nilai aktivitas sebesar 1-3 inti es
untuk setiap 10' sei bakteri pada suhu sekitar -4.5'C. Kuwa pertumbuhan
YR32, YR321ce+ dan M715 memperlihatkan bahwa pertumbuhan ketiga
isolat tersebut memiliki pola perturnbuhan yang sarna.
Analisis kemampuan kompetisi antara M715 dengan YR321ce+
dengan asai tabung beku memperlihatkan bahwa populasi M715 dapat
menekan populasi YR32. Berdasarkan analisis pergantian serial de Wit,
terlihat bahwa populasi kedua bakteri YR321ce+ dan M715 untuk setiap
proporsi selalu terdapat disekitar garis isogenik dan jumlah total bakterinya
relatif tetap. Ini rnenunjukkan bahwa mutasi pada M715 tidak menurunkan
kemampuannya dalam berkompetisi atau kemungkinan penernpatannya
pada relung ekologi yang sama.
Hasil inokulasi terpisah untuk rnelihat kebugaran isolat YR321ce+ dan
M715 memperlihatkan pola dinamika yang sama, akan tetapi populasi
YR321ce+ selalu lebih besar dari populasi M715. Hasil ini menunjukkan
bahwa gen pat pada M715 rnernpengaruhi kebugaran hidup bakteri tersebut
in planta. Sedangkan, hasil percobaan ko-inokulasi memperlihatkan pota
dinamika yang sama dengan inokulasi terpisah, akan tetapi populasi
YR321ce+ secara keseluruhan menjadi berkurang. Hasil ini menunjukkan
bahwa M715 dapat menekan pertambahan populasi YR321ce+. Hal ini
diperjelas dengan melihat perbedaan (rasio) populasi antara YR321ce+
dengan M715. Perbedaan populasi hasil inokulasi terpisah lebih besar
dibandingkan dengan perbedaan populasi hasil ko-inokulasi, bahkan pada
hari ke-2, 3 dan 5 populasi M715 lebih besar dibandingkan populasi
YR321ce+. Meskipun secara keseluruhan populasi M715 lebih rendah
dibandingkan populasi YR321ce+, akan tetapi M715 mampu berkompetisi
dengan YR321ce+. Kemungkinan isolat M715 dapat mempertahankan hidup
karena isolat tersebut mempunyai sintasan yang relatif sama dengan tipe
liarnya di lingkungan filosfer. Kemungkinan lain karena adanya cross-feeding
mechanisms pada suatu faktor tumbuh tertentu antara M715 dengan tipe
liarnya YR321ce+.
KONSTRUKSI PETA GENETIK PARSIAL
DAN KARAKTERISASI SINTASAN EPlFlTlK MUTAN
NON-PATOGENIK DARl Xanthomonas axonopodis
(campestris) pv. glycines Y R32
Oleh :
YAYA RUKAYADI
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
dalam bidang Biologi (Mikrobiologi)
pada
Program Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
1998
Judul
Konstruksi Peta
Genetik
Parsial dan
Karakterisasi Sintasan Epifitik Mutan NonPatogenik dari Xanthomonas axonopodis
(campestris) pv. glycines YR32
Nama Mahasiswa
:
Nomor Pokok
:
Yaya Rukayadi
95.576lBIOLOGI-MIKROBlOLOGl
Menyetujui
1. Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc.
(Ketua)
iakusuma.MSc.
(Anggota)
Prof.Dr.lr. Edi Guhardia.MSc.
(Anggota)
~ r o f . ~ r . & v i a n vWidiaiakusuma.M
Tanggal Lulus
: Senin, 21 Desember 1998
ida Manuwoto,M.Sc.
RIWAYAT HlDUP
Penulis dilahirkan di Bumi Parahyangan Surnedang pada tanggal 17
Agustus 1964 dari pasangan Bapak Enco Suarma serta Ibu Enoh Menoh
sebagai anak bungsu dari delapan bersaudara.
Sekolah Dasar, Sekolah Menengah Pertarna, dan Sekolah Menengah
Atas diselesaikan pada tahun 1983 di Situraja, Surnedang, Jawa Barat. Pada
tahun 1983 penulis diterirna di Proyek Perintis I Departemen Farmasi lnstitut
Teknologi Bandung dan pada tahun berikutnya penulis rnelalui Sipenmaru di
terima di Jurusan Pendidikan Biologi FPMlPA IKlP Bandung. Tahun 1990
penulis lulus sebagai Sarjana Pendidikan Biologi.
Pada tahun 1991 penulis diterima sebagai staf pengajar Jurusan
Pendidikan Biologi FPMlPA IKlP Negeri Medan. Setahun kemudian penulis
melanjutkan Program Magister Sains pada Program Studi Biologi
Sub
Program Studi Mikrobiologi Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor
dan lulus pada tahun 1995. Pada tahun itu juga atas dorongan dan saran
dari Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., penulis mendapat kesernpatan untuk
rnelanjutkan pendidikan Program Doktor pada Program Studi dan Sub
Program yang sarna.
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdullilah hirobbil a'lamin atas rahmat dan karunia-Nya penulis
dapat menyeiesaikan laporan penelitian ini dalam bentuk disertasi yang
berjudul "Konstruksi Peta Genetik Parsial dan Karakterisasi Sintasan
Epifitik
Mutan
Non-Patogenik
dari
Xanthomonas
axonopodis
(campestris) pv. glycines YR32".
Penelitian ini terselesaikan atas bimbingan luar biasa dari Dr. Ir.
Antonius Suwanto, MSc. Untuk itu, dengan rasa rendah hati penulis
haturkan terima kasih dan penghargaan yang tak terhingga. Beliau telah
membimbing dengan luar biasa dari mulai penulis mengikuti Program
Magister Sains sampai terselesaikannya Program Doktor ini. Rasa hormat
dan kagurn penulis rasakan selarna beliau membimbing di dalam
laboratorium rnaupun di luar, beliau telah memberikan suri tauladan seorang
ilmuwan dan sejumlah kesempatan yang tak terhingga baik berupa diskusi
yang menarik, mengikuti dan memimpin suatu kursus dalam bidang biologi
molekuler,
peminjaman
buku-buku dan
referensi
yang
diperlukan,
kesempatan rnenjadi asisten pada berbagai mata ajaran (Biologi Molekuler,
Genetika Mikroba, Rekayasa Genetika, dan Biologi Molekuler Keragaman
Bakteri) serta dana SPP pada waktu tahun pertarna penulis mengikuti
program doktor. Semoga Tuhan membalasnya yang setimpal. Amin.
Pada kesempatan ini juga perkenankan penulis menyampaikan
ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada :
1. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, selaku anggota komisi pembimbing
yang sekaligus sebagai Kepala Lab. Mikrobiologi dan Biokimia PAU
Bioteknologi IPB tempat penulis melakukan penelitian atas bimbingan dan
kepercaan yang diberikan kepada penulis menjadi asisten pada mata ajaran
Biokimia Mikroba sejak tahun 1993. Beliau dengan sikap ilmuwan dan kasih
sayang yang tinggi telah berhasil menciptakan suasana ilmiah dan
kekeluargaan di laboratorium sehingga penulis merasa nyaman dan betah
untuk menyelesaikan penelitian.
2. Dr. Ir. Budi Tjahjono, M.Agr., selaku anggota komisi pembimbing
dan Ketua Proyek Hibah Tim II atas segala birnbingan dan biaya penelitian
yang telah beliau berikan. Serta atas kesempatan mengikuti kegiatan
Overseas Visiting ke UC. Berkeley. USA.
3. Prof. Dr. drh. Reviany Widjajakusuma, M.Sc.,
selaku anggota
komisi dan ketua program studi Biologi, atas bimbingan dan arahan selama
penulis rnenyelesaikan studi baik pada waktu S2 maupun S3. Selain itu
beliau telah memberikan contoh serta filosofi seorang ilmuwan yang baik.
4. Prof. Dr. Ir. Edi Guhardja, M.Sc., selaku anggota komisi atas
segala bimbingan dan arahan yang sebesar-besarnya, terutama untuk
perbaikan yang sangat teliti akan penulisan disertasi ini.
5. Dr. Ir. Meity S. Sinaga, M.Sc dan Dr. M. Machmud, M.Sc., selaku
dosen penguji di luar komisi atas saran untuk kesempurnaan penulisan
disertasi ini dan atas diskusi yang menarik selama penulis melakukan
penetitian.
6. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, atas dana Beasiswa
Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan Project University Research for
Graduate Education (URGE)/ Proyek Hibah Tim II, yang diberikan selama
penulis menyelesaikan studi.
7. Dr. Ir. Muhammad Yusuf dan Dr. Ir. A. Aziz Darwis, selaku
mantan dan Direktur PAU Bioteknologi IPB atas izin dan penggunaan fasilitas
selama penulis melaksanakan penelitian.
8. Prof. Steve E. Lindow, Ph.D.,
atas penggunaan gen inaZ
(pJL1703), fasilitas, bimbingan, arahan, dan segala bantuan lainnya selama
penulis melakukan Overseas Visiting di Depattment of Plant and Microbial
Biology University of California, Berkeley., USA.
9. Maria Brandl, Ph.D.,
atas segala bantuan selama penulis
melakukan Overseas Visiting, tetutama atas arahan eksperimen mengenai
analisis kebugaran.
10. Jean-Michel Monier, Mavis Hansond Chong, Ph.D., dan LaiMun Gong, atas bantuan selama penulis melakukan Overseas Visiting,
diskusi melalui e-mail,
kiriman journal atau paper aktual dan sejumlah
referensi lain yang sangat membantu penulis menyelesaikan penulisan
disertasi ini.
11. Ir. Budiasih Wahyuntari, M.Sc., atas pengambilan gambar untuk
dokumentasi dan slide, selain itu atas persahabatan dan motivasi yang
diberikan.
12.
Moch. Firly Nurochman, SSi. dan Yogiara,
SSi. (atas
bantuannya pada waktu penyemprotan, sampling, dan penimbangan daun
kedelai). Rudy Widjaya, STp. (atas bantuannya pada waktu pembuatan
slide), Ir. Benny Tanudjaja (atas bantuannya pada waktu penggunaan
program komputer SAS version 6.12), Ir. B. Junaidi Lee, Ir. Ricky Widjaja,
M.Si, segenap rekan dan sejumlah teknisi di Lab. Mikrobiologi dan
Biokimia khususnya dan PAU Bioteknologi IPB umumnya, atas motivasi,
bantuan tenaga dan pikiran, persaudaraan, persahabatan, dan kebersarnaan
serta diskusi ilrniah yang menarik selama penulis melakukan penelitian.
13. Dr. Ir. Alex Hartana,M.Sc.,
atas izin pernakaian Rumah Kaca
untuk pengujian in planta dan atas penggunaan alat blotting dan fiksasi
membran.
14. Dr. Ir. Soni Suharsono, atas kelonggaran penggunaan E C L ~ ~
(direct nucleic acid labelling and detection system).
15. Dr. Dra. Anya Meryandini, M.Si., atas persahabatan dan motivasi
yang diberikan.
16. Kedua orang tua penuiis (Bapak Enco dan Ma Enoh), Kakak-
Kakak (Kang Enas, Kang Dede, Ceu Eruk, Ceu Wiwi, Ceu Cucu, Ceu
Yoyoh, serta Yuyu), segenap kakak ipar dan keponakan. Atas do'a,
dorongan mental dan spiritual , kasih sayang yang telah, sedang dan akan
diberikan pada penulis selamanya.
Bogor, Desember 1908
Yaya Rukayadi
KATA PENGANTAR
Salah satu sumber protein nabati yang paling banyak dikonsumsi
masyarakat Indonesia adalah kedelai (Glycine max (L.) Merr), akan tetapi
produksi kedelai nasional masih belum mencukupi kebutuhan. Hal ini
disebabkan salah satunya karena adanya penyakit bisul bakteri pada kedelai
yang disebabkan oleh Xanthornonas axonopodis (campestris) pv. glycines
atau Xag. Akhir-akhir ini untuk mengatasi penyakit tanaman banyak
dilakukan dengan dua macam pendekatan yaitu : (i) memahami mekanisme
patogenisitas Xag, dan (ii) penggunaan agens biokontrol.
Tulisan ini berisi serangkaian hasil penelitian dengan penggunaan
pendekatan teknik-teknik molekuler, yang terdiri dari: (i) lokalisasi gen dan
pemetaan parsial gen-gen yang mungkin terlibat dalam mekanisme
patogenisitas Xag, dan (ii) konstruksi dan karakterisasi galur non-patogenik
yang isogenik dari Xag untuk agens biokontrol penyakit bisul bakteri pada
kedelai. Hasil yang menarik dari penelitian ini yaitu telah berhasilnya
dikonstruksi satu galur non-patogenik yang isogenik (M715) dengan tipe
liamya (Xag YR32). sehingga sudah hampir pasti dapat menempati relung
ekologi dan mampu berkompetisi pada sumber nutrisi yang sama. Galur
M715 non-patogenik yang isogenik ini mempunyai potensi sebagai agens
biokontrol untuk mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat mernberikan informasi dan suatu
model pendekatan dalam mengatasi penyakit bisul bakteri pada kedelai
khususnya dan penyakit tanaman pada urnumnya. Amin.
Bogor, Desember 1998
Yaya Rukayadi
xxiii
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANTAR...........................................................................
xxii
DAFTAR IS1......................................................................................
xxiv
DAFTAR TABEL..............................................................................
xxvii
DAFTAR GAMBAR.........................................................................
xxviii
PENDAHULUAN ..................................................................
Latar Belakang............................................................
1
1
Tujuan Penelitian.........................................................
6
TINJAUAN PUSTAKA.............................................................
Biologi Molekuler Xanthomonas axonopodis (campestris)
pv. glycines..................................................................
7
Studi Patogenisitas Molekuler Xanthomonas axonopodis
(campestris)....................................................................
7
9
Mutagenesis Transposon................................................
Tn5.................................................................................
Tn4431..........................................................................
Tn4351..........................................................................
12
Pemetaan Fisik dan Genetik DNA Genom...........................
16
Biokontrol Penyakit Tanaman............................................
19
Konstruksi Galur Non-Patogenik yang Isogenik....................
Mutagenesis terarah .............................................
Mutagenesis transposon .......................................
21
21
22
Gen inaZ Sebagai Gen Pelapor........................................
24
BAHAN DAN METODE.............................................................
26
13
15
15
Media dan Kondisi Perturnbuhan.......................................
Bahan dan Alat ................................................................
Teknik Molekuler dan Mutagenesis Transposon .....................
Penyiapan Kotiledon dan Tanaman Kedelai...........................
Metodologi......................................................................
Penapisan Transposon untuk Mutagenesis Transposon............
Konstruksi Plasmid untuk Transposon Mutagenesis pada
X. axonopodis (campestris) pv. glycines YR32 ........................
Mutagenesis Transposon Xag YR32 dengan pUTminiTn5KmR-TpR(pYR103).........................................................
Uji Prototrofi dan Analisis Fenotipik Mutan..............................
Lokalisasi Gen dan Pemetaan Genetika Parsial..........................
A . Schizotyping.........................................................
Penyiapan suspensi bakteri...............................
Penyiapan DNA genom utuh..............................
Pernotongan DNA genom utuh
dengan enzim restriksi.............................................
Elektroforesis dengan PFGE..............................
Visualisasi DNA..............................................
B. Analisis hibridisasi Southern....................................
Proses blotting................................................
Petabelan pelacak dan deteksi hibridisasi.............
lnstroduksi Gen Penyandi Nukleasi Es (inaZ)
ke dalam Xag YR32 ....................................................................
Analisis Ekspresi Nukleasi es pada Xag YR32 (pJL1703).........
Analisis Kompetisi.............................................................
Karakterisasi galur bakteri yang berkompetisi (Xag YR32.
YR321ce+. dan M715).................................................
Asai tabung beku...................................................
Analisis pergantian serial de Wit .......................................
xxv
Analisis Kebugaran ..........................................................
45
Analisis Data....................................................................
46
HASlL DAN PEMBAHASAN.......................................................
Penapisan Transposon untuk Konstruksi Plasmid.....................
Konstruksi Plasmid untuk Mutagenesis Transposon pada
X. axonopodis (campestris) pv. glycines YR32 ........................
Mutagenesis Transposon X axonopodis (campestris)
pv. glycines YR32 dengan pYR103........................................
Uji Prototrofi dan Analisis Mutan.............................................
Lokalisasi Gen dan Pemetaan genetik Secara Parsial Genom
X. axonopodis (campestris) pv.glycines YR32 .............................
Karakterisasi Galur Non-patogenik yang isogenik dari Xag YR32 .
lntrodulsi inaZ pada Xag YR32 ...................................
Karakterisasi galur bakteri yang berkompetisi: Xag YR32
YR321ce+. dan M715................................................
Analisis kompetisi...................................................
Analisis pergantian serial de Wit ................................
.
Analisis Kebugaran M715...................................................
KESIMPULAN DAN SARAN........................................................
Kesimpulan....................................................................
Saran............................................................................
DAFTAR PUSTAKA.................................................................
DAFTAR TABEL
Nomor Tabel
Teks
Halaman
1.
Galur bakteri, plasmid dan transposon.....................................
2.
Frekuensi konjugasi hasil mutagenesis transposon
pada Xag YR32 dengan transposon mini-Tn5KmR,
Tn4431TcR,dan Tn4351TcR........... ...... ......... 47
mini-Tn5SpR/SmR,
3.
Frekuensi konjugasi pYR103 pada X. axonopodis (campestris) pv.
glycines YR32.. ....................... ............ .... ........................
58
4.
Penarnpilan fenotipik mutan-mutan Xag YR32 hasil rnutagenesis
transposon .....................................................................
61
5.
Hasil pengujian patogenesitas dengan bioasai kotiledon............
68
6.
Hasil analisis aktivitas nukleasi es pada Xag YR321ce+
dengan asai tetes beku..... ..................................................
78
Hasil analisis kompetisi bakteri M715 dan YR321ce+ dengan
asai tabung beku pada suhu 4.5"C ......................................
83
7.
xxvii
26
DAFTAR GAMBAR
3r Garnbar
Teks
Halarnan
Bagan alur penelitian.......................................................... 31
lnokulasi bakteri pada permukaan daun dengan
penyemprotan (A), dan tanaman kedelai setelah inokulasi (B) .....
43
Konstruksi plasmid pYR103 (pUTrnini-Tn5KrnR-TpR).
.................. 49
Hasil verifikasi plasmid (pNEB193-TpR): A. Plasmid pNEB193
dipotong dengan Smal (I), 1 kb DNA Ladder (2), dan dipotong
dengan Asp7181 + Notl (3) B. Plasrnid pYR101 (pNEB193-Tp)
intact (utuh) (1) dipotong dengan Kpnl + Pmel (3), 1 kb Ladder (4).
51
dan dipotong dengan Kpnl + Hindlll (5) ...............................
): A. Plasmid
Hasil verifikasi plasrnid pYR102 (p~~18-Notl-TpR
pYR101 yang dipotong dengan Kpnl + Hindll (I), 1 kb DNA Ladder
(2). dan plasmid pUC18-Notl yang dipotong dengan Kpnl +
Hindll (3). B. Hasil pemotongan plasmid pYR102
(pUC18-Notl-TpR)dengan Pacl (I), Pmel (2). Pacl-Notl (3).
1 kb DNA ladder (4). Pmel + Notl(5), dan plasmid pYR102
utuh (6) ............................................................................
52
Hasil pernotongan pUTmini-Tn5KmRdan PYR102 dengan Notl:
A. Hasil pemotongan plasmid pUTmini-Tn5KrnRdengan Notl
(1 dan 2). 1 kb DNA Ladder (3) B. plasrnid pYR102 utuh (1) 1 kb
DNA ladder (2), dan hasil pernotongan pYR102 dengan
Notl (3) .......................................................................
53
Hasil verifikasi sejurnlah transforman pYR103: A. Plasrnid
transforman utuh (1-1 I), dan 1 kb DNA Ladder (12). B. Plasrnid
transforman yang dipotong dengan EcoRl (I), (2), (3). (5),(6), (8).
(9). (11), (12), Pacl + Pmel (4), (lo), dan 1 kb DNA Ladder (7) ...... 54
Hasil verifikasi plasrnid pYR103: A. Plasmid pYR103 yang
dipotong dengan EcoRl (I),
(2),Pacl + EcoRl (3), Pmel +
EcoRl(4), dan 1 kb DNA Ladder (5). B. 1 kb DNA Ladder (I),
plasmid pYR103 utuh (2),plasmid pYR?03yang dipotong
dengan Xhol (3). Asel (4),Spel + EcoRl (5) ............................
56
9.
Hasil pengujian pototrof Xag YR32 tipe liar : medium agaragar M9 (A), dan (b) medium agar-agar MinA (B)..................
61
10.
Hasil pengujian katalasem adanya aktivitas katalase diperlihatkan
dengan produksi gelembung (gas 0,)
pada koloni yang ditetesi 3%
H,O,: tipe liar (I), M715 (2), dan sejurnlah rnutan (yang tidak
diberi nomor) .................................................................
63
11.
Uji proteolitik, adanya aktivitas protease ditandai dengan
terbentuknya area bening disekitar koloni pada media LA
yang ditarnbah dengan 2% susu skim: tipe liar (I), mutan prt (2).
dan M715 (3) .........................................................................
64
12.
Penarnpilan koloni: tipe liar Xag YR32 (I), mutan pig atau atau
xanthomonadin (2). mutan pat (3), dan rnutan xan (3) ................. 66
13.
Hasil asai patogenisitas dengan bioasai kotiledon: galur
non-patogenik tidak menirnbulkan area kuning klorotik disekitar
luka pada kotiledon kedelai (A.l), galur patogenik rnenimbulkan
area kuning klorotik di sekitar luka pada kotiledon (A.2).
Xcc sebagai kontrol negatif (B.1). Xag YR32 sebagai kontrol
positif (8.5). rnutan aux (M33) (B.2), mutan pig- (M216) (8.3).
mutan prt- (M415) (8.4). mutan xan- (M 180) (B.6), mutan pat(M715) (B.7), dan YR321ce+ (Xag YR32 inaZ) (8.8).
Umur kotiledon 7 hari, inkubasi 28-30°C selama 7 hari,
dan umur biakan bakteri 48 jam pada media agar-agar YDC. ...... 67
14.
Skizotipe-Asel sejurnlah mutan pada kondisi : 1% agar, waktu
pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam,
tegangan 5.0 volffcrn (25-33 mA), dan ternperatur
penyangga 14OC (A). Hasil analisis hibridisasi Southern
menggunakan pelacak 2.8 kb-EcoRI pYR103........................... 71
15.
Skizotipe-Asel M715 pada kondisi : 1% agar, waktu
pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam,
tegangan 5.0 volffcrn (25-33 mA), dan temperatur penyangga
14OC (A). Hasil analisis hibridisasi Southern menggunakan
pelacak 2.8 kb-EcoRI pYR103 (B). ..........................................
16.
A. Skizotipe-Asel mutan: aux (I), prt- (2). xan- (3). pig- (4). dan
dan pat- (5) pada kondisi : 1% agar, waktu pulsa ramping
5-40 detik, 0.5 x TBE, waktu running 22 jam. tegangan 5.0 volffcm
(25-33 mA) dan temperatur penyangga 14OC;
73
B. Hasil analisis hibridisasi Southern menggunakan pelacak
2.8 kb-EcoRI pYR103 ................................................................
74
Lokalisasi gen pada skizotipe-Asel Xag YR32 ..........................
75
Peta genetik parsial skizotipe-Asel Xag YR32 ..........................
76
Analisis aktivitas nukleasi es dengan asai tetes beku, tetesan
yang membeku menunjukkan adanya aktivitas nukleasi es..........
77
Penampilan koloni: YR32 (1). YR321ce+ (2). dan M715 (3). .......
79
A. Skizotipe-Asel YR32 (2). YR321ce+ (3). dan M715 (4);
B. Skizotipe-Spel YR32 (2), YR321ce+ (3). dan M715 (4) pada
kondisi : 1%agar, waktu pulsa ramping 5-40 detik, 0.5 x TBE,
waktu running 22 jam, tegangan 5.0 voltlcm (25-33 mA),
dan temperatur penyangga 14'C. Penanda ukuran molekul DNA:
kromosom Rhodobactersphaeroides 2.4.1 yang dipotong
dengan Asel (A.1, B.l ).. ..................................................
79
Kuwa pertumbuhan Xag YR32, YR321ce+, dan M715 pada
media LB dengan suhu inkubasi 2830% pada goyangan 200 rpm
dan diukur pada OD ..................................................... 80
,
Asai nukleasi es dengan asai tabung beku: YR32lce+(kontrol+)
yang memiliki aktivitas nukleasi es (isi tabung yang membeku
dan berwarna putih) dibandingkan dengan YR32 tipe liar (kontrol -)
(A), dan hasil asai dengan dua puluh tabung reaksi masingmasing berisi daun kedelai di dalam 10 ml penyangga fosfat
(10 mM; pH 7.0) (B).................................................................. 82
Analisis pergantian serial de Wit antara X. axonopodis (campestris)
pv. glycines YR321ce+ dan M715, garis diagonal (.....) merupakan
garis isogenik. ........................................................................... 85
Dinamika populasi YR321ce+ dan M715 pada daun kedelai dengan
inokulasi secara terpisah (individu), konsentrasi sel bakteri yang
diinokulasikan masing-masing 4.5 x lo5sellml............................ 86
Dinamika populasi YR321ce+ dan M715 pada daun kedelai secara
KO-inokulasidengan perbandingan antara YR321ce+ dengan M715
adalah 1: 1. Konsentrasi total populasi bakteri yang diinokulasikan
9 x 1O5 sellml. ............................................................................
87
27 .
28 .
29 .
Dinamika perbedaan populasi (rasio populasi) antara YR321ce+
dan M715 yang diinokulasikan secara terpisah dan ko-inokulasi
dengan perbandingan 1 : 1...................................................
88
Dinamika populasi YR32 : dengan inokulasi terpisah (a) dan
dengan ko-inokulasi (b)..................................................
89
Dinamika populasi M715 : dengan inokulasi terpisah (a) dan
dengan koinokulasi (b).....................................................
91
xxxi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai (Glycine max (L.) Merr) merupakan salah satu sumber protein
nabati yang paling banyak dikonsumsi masyarakat Indonesia. Produksi
kedelai nasional sampai saat ini masih belum mencukupi kebutuhan. Data
Direktorat Bina Program Tanaman Pangan dan Hortikultura (TPH),
memperlihatkan bahwa produksi kedelai pada tahun 1998 diperkirakan
1.875.558 ton, sernentara kebutuhan pada tahun yang sama mencapai
2.361.497 ton. Sehingga terdapat kesenjangan antara produksi dan
kebutuhan sekitar 500.000 ton (Adnyana, 1998). Kesenjangan itu dapat
ditutupi dengan mengirnpor kedelai dari luar negeri, tetapi sekarang harga
kedelai impor sangat tinggi akibat depresiasi rupiah terhadap dolar. Harga
kedelai impor yang lebih tinggi dibandingkan harga kedelai lokal, ha1 ini
merupakan peluang bagi petani untuk meningkatkan produksi dan kualitas
kedelai lokal. Tetapi dalam usaha meningkatkan produksi dan kualitas
kedelai lokal seringkali serangan harna dan penyakit menjadi kendala.
Salah satu penyakit kedelai di lndonesia yang belum tertangani adalah
penyakit bisul bakteri (bacterial pustule) yang disebabkan oleh Xanthomonas
campestris pv. glycines (Moffet dan Croft, 1983). Penyakit bisul bakteri ini
merupakan penyakit bakterial penting di lndonesia (Semangun, 1991), yang
tersebar di Pulau Jawa, Larnpung, Sulawesi Selatan (Machmud. 1987). dan
di Kalimantan Selatan (Aini, 1993). Berdasarkan analisis hibridisasi DNADNA bakteri ini lebih dekat hubungannya dengan X. axonopodis sehingga
Vauterin et a/. (1995) mengusulkan narnanya menjadi X. axonopodis pv.
glycines.
Akhir-akhir ini, untuk rnengatasi suatu penyakit dapat dilakukan
dengan dua pendekatan yaitu dengan memahami mekanisme patogenisitas
penyakit itu, dan penggunaan musuh-musuh alami (agens biokontrol)
berdasarkan prinsip-prinsip ekologis terrnasuk faktor kompetisi antara
organisme penyebab penyakit dengan pengendali. Maka dari itu, untuk
mengatasi penyakit bisul bakteri diperlukan suatu telaah untuk memahami
faktor-faktor yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas dan penggunaan
agens biokontrol.
Studi fisiologis yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi faktorfaktor yang terlibat dalam mekanisme patogenisitas X.
axonopodis
(campestris) pv. glycines (Xag) banyak memberikan hasil yang meragukan
atau menemui jalan buntu. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme
patogenisitas sangat kompleks sehingga muncul pertanyaan-pertanyaan,
antara lain : Apakah enzim ekstraseluler patogen m e ~ p a k a nha1 yang
terpenting dalam proses patogenisitas? Berapa banyaknya gen yang terlibat
dalam proses patogenisitas? Serta bagaimana hubungan antara faktor-faktor
tersebut dengan tanaman inang hingga dapat rnenyebabkan penyakit?
lsolasi dan karakterisasi gen-gen yang terlibat dalam proses
patogenisitas merupakan tahap
awal
guna
memahami
mekanisme
patogenisitas bakteri tersebut. Meskipun demikian tahap ini dalam waktu
relatif singkat sudah cukup banyak memberikan informasi yang dapat
menunjang untuk memahami mekanisme patogenisitas suatu penyakit
(Gerhold dan Stacey, 1990). Oleh karena itu data yang rinci mengenai
genetika molekuler Xag, termasuk organisasi genom, peta fisik dan genetik
genomnya merupakan ha1 yang sangat penting untuk mengungkapkan
mekanisme biologis dalam ha1 ini mekanisme patogenisitas penyakit.
Sampai saat ini belum tersedia informasi mengenai struktur genom
maupun peta fisik dan genetik dari Xag yang memadai, bahkan sejauh
pengetahuan penulis peta fisik dan genetik bakteri tersebut belum ada selain
peta fisik dan genetik yang dikonstruksi oleh Widjaja (1996). Padahal,
informasi mengenai struktur genom merupakan suatu kerangka kerja yang
berguna untuk penelitian patogenisitas. Seiring dengan penelitian yang
sedang dilakukan untuk mengidentifikasi faktor-faktor yang berperan dalam
mekanisme patogenisitas, struktur genom dapat menyediakan informasi
mengenai peta fisik kromosom, peta fisik plasmid, serta lokasi relatif dari
masing-masing gen yang diperkirakan berperan pada proses patogenisitas
Xag pada tanaman inangnya.
Untuk menunjang pemetaan fisik yang beresolusi tinggi, perlu
dilakukan pemetaan dengan menggunakan enzim-enzim restriksi yang
memotong total genom bakteri itu lebih sering, seperti Asel dan Spel (Rosana
et a/., 1995; Rukayadi, 1995; Wahidin, 1996; Widjaja, 1996). Fragmenfragmen yang dihasilkan oleh pernotongan enzim yang memotong lebih
sering
berukuran
relatif lebih
kecil
sehingga
memudahkan dalam
penanganan maupun untuk pekerjaan sub-kloning fragmen restriksi tersebut.
Selain itu. peta fisik juga memerlukan lebih banyak penanda-penanda
genetik yang spesifik untuk rnelengkapi peta genetiknya. Hal ini dapat
dilakukan antara lain dengan menghasilkan mutan-mutan auksotrof, mutan
yang kehilangan sifat proteolitiknya (protease negatif), xantornonadin negatif,
katalase negatif, dan lain-lain dengan cara rnutagenesis transposon dan
kemudian menentukan lokasinya pada peta fisik dengan analisis hibridisasi
Southern menggunakan transposon yang bersangkutan sebagai pelacaknya
(probe).
Di lain pihak, penelitian agens biokontrol untuk mengatasi penyakit
bisul bakteri pada kedelai belum banyak dilakukan. Penelitian yang selama
ini telah dilakukan menunjukkan bahwa Pseudomonas fluorescen 829
merupakan agens biokontrol yang potensial untuk mengatasi penyakit bisul
bakteri pada kedelai (Mariani. 1995; Suwanto et a/., 1996; Manuella et a/.
.
1997; Nawa