Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji Kestabilan Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64
DETEKSI GEN hpt DAN bar UNTUK UJI KESTABILAN
GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA
PADI MUTAN IR64
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Deteksi Gen hpt dan
bar untuk Uji Kestabilan Gen Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai
oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, S.P, M.Si. Sumber informasi
yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan
dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Clara Shinta Ayu Fitriyanti
NIM G84090064
ABSTRAK
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI. Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji
Kestabilan Gen Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64. Dibimbing oleh POPI
ASRI KURNIATIN dan BUDI SANTOSA.
Sistem transposon Ac/Ds dapat digunakan untuk memperoleh genotipe
mutan yang bervariasi pada genom padi dan untuk mengetahui fungsi gen-gen
tersebut khususnya pada padi kultivar IR64. Namun untuk memperoleh tanaman
mutan yang diinginkan, diperlukan transposon yang stabil sehingga tidak terjadi
perpindahan ke kromosom lain. Penelitian ini bertujuan mendapatkan tanaman
padi IR64 transgenik generasi T1 yang mengandung transposon Ds stabil.
Penelitian ini telah menganalisis 26 sampel DNA genom generasi pertama (T0)
dengan polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer bar dan hpt serta
analisis hibridisasi Southern. Sebanyak 26 sampel DNA genom generasi kedua
(T1) dianalisis dengan PCR. Hasil analisis PCR menunjukkan keberadaan
transposon Ac/Ds pada seluruh sampel generasi pertama. Hasil analisis hibridisasi
Southern menunjukkan 14 dari 26 sampel DNA tanaman T0 mengandung satu
salinan T-DNA transposon. Sebanyak 14 tanaman generasi T1 mengandung
transposon Ds yang stabil berdasarkan hasil analisis PCR. Penelitian ini berhasil
membuktikan gen transposon Ds bersifat stabil karena dapat diwariskan pada
generasi berikutnya.
Kata kunci: IR64, Transposon Ac/Ds, analisis kestabilan
ABSTRACT
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI. hpt dan bar Gene Detection for Stability
Test of Transposon Ac/Ds Gen in IR64 Mutant Rice. Supervised by POPI ASRI
KURNIATIN and BUDI SANTOSA.
Ac/Ds transposon system can be used to gain variety of mutant rice
genotype and for identifying the function of mutant gen especially IR64 rice.
However to obtain mutant plant that we want, stable transposon is required in
order to avoid transposon movement to other chromosoms. This research has
analyzed 26 samples of genom DNA of first generation (T0) plants with
polymerase chain reaction (PCR) using bar and hpt primer also Southern
hybridization analyzing. There is 26 genom DNA samples of second generation
(T1) plants analyzed with PCR. PCR analyzation showed that transposon Ac/Ds is
occur in all samples. Southern hybridization showed that 14 of 26 T0 plants
contain single copy of T-DNA. Fourteen T1 generation plants contain stable Ds
transposon based on the results of PCR analysis. This research proved that Ds
transposon is stable because it was inherited on the next generation.
Keywords: IR64, Ac/Ds transposon, stability analysis
DETEKSI GEN hpt DAN bar UNTUK UJI KESTABILAN
GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA
PADI MUTAN IR64
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji Kestabilan Transposon
Ac/Ds pada Padi Mutan IR64
Nama
: Clara Shinta Ayu Ftiriyanti
NIM
: G84090064
Disetujui oleh
Popi Asri Kurniatin, S.Si. Apt. M.Si.
Pembimbing I
Dr. Ir. Budi Santosa, MP
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MApp, Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian ini, serta shalawat dan salam semoga tercurahkan
pada Rasulullah SAW. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Popi Asri
Kurniatin, S.Si Apt. M.Si. dan Dr. Ir. Budi Santosa, MP selaku ketua dan anggota
pembimbing skripsi yang dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler, Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Cimanggu-Bogor. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada
orang tua, adik, dan keluarga atas segala doa, kasih sayang, dan motivasinya.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Tri Joko Santoso SP. MSi,
Mba Dewi, Ka Falin, Mba Mira, Vita, Tuhfah, Kiki, Siska, Sisca, Hilda, Sari serta
rekan-rekan Biokimia 46 yang lain atas bimbingan, doa dan dukungannya sehingga
penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan ini. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna
dalam penulisan ini. Penulis juga berharap karya tulis ilmiah ini dapat bermanfaat
bagi semua pihak
Bogor, Februari 2014
Clara Shinta Ayu Fitriyanti
DAFTAR ISI
ABSTRAK
ii
DAFTAR GAMBAR
iii
DAFTAR LAMPIRAN
iii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
HASIL
7
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
7
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
7
Uji Ketahanan Terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
9
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
9
PEMBAHASAN
11
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
12
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
13
Uji Ketahanan terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
13
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
14
SIMPULAN
15
DAFTAR PUSTAKA
15
Lampiran
17
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer basta pada tanaman
generasi T0
8
2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman
generasi T0
8
3 Hasil hibridisasi Southern pada tanaman padi IR64 generasi T0
8
4 Hasil pengolesan basta pada tanaman
9
5 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer basta pada
Tanaman padi T1
10
6 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman
generasi T1
10
7 Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon Ac/Ds
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T0
17
2 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T1
18
3 Motif sekuen primer yang digunakan
19
PENDAHULUAN
Beras adalah sumber bahan pangan fungsional, yaitu bahan makanan alami
yang mengalami pengolahan dan mengandung satu atau lebih komponen
pembentuk dengan fungsi-fungsi fisiologis tertentu dan bermanfaat bagi kesehatan
(Sisharmini 2009). Beras mempunyai nilai ekonomi yang penting dan merupakan
makanan pokok bagi sebagian besar belahan dunia terutama Asia. Tanaman padi
(Oryza sativa L.) sebagai penghasil beras akan menjadi salah satu komoditas
pangan utama dan sumber utama gizi maupun energi bagi lebih dari 90%
penduduk Indonesia saat ini hingga beberapa tahun mendatang (BPS 2011).
Berdasarkan hal tersebut maka kualitas dan produksi tanaman padi perlu
ditingkatkan untuk memenuhi kebutuhan penduduk Indonesia.
Eksplorasi kekayaan genom padi, melalui pencarian gen-gen dalam genom
padi yang berperan dalam menentukan suatu fenotipe, diperlukan untuk
memperoleh informasi mengenai fungsi gen-gen padi sehingga kualitasnya dapat
ditingkatkan (Jeoung et al. 2002). Menurut Bouchez dan Hofte (1998) ada dua
pendekatan yang dilakukan untuk menganalisis fungsi gen, yaitu forward genetics
dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan dengan menganalisis
fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke sekuen gennya.
pendekatan reverse genetics dilakukan dengan berpedoman dari informasi sekuen
gen yang telah diketahui.
Sistem mutagenesis dengan transposon Ac/Ds telah banyak diterapkan
sebagai strategi reverse genetics analisis fungsi gen-gen suatu tanaman.
Transposon adalah segmen DNA spesifik yang dapat bertransposisi dari satu
lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel dengan cara memotong segmen suatu
DNA, kemudian meligasinya. Transposon Ac/Ds terdapat secara alami di dalam
tanaman jagung yang menyebabkan penampakan warna yang beraneka ragam
pada lapisan biji jagung. Transposon Ac/Ds pertama kali ditemukan oleh Barbara
McClintock tahun 1948 (Griffth et al. 1999).
Transposon Ac (activator) telah mengalami delesi pada bagian inverted
repeat sehingga bersifat tidak mampu pindah (immobile), namun mampu
menghasilkan enzim transposase (otonom) (Greco et al. 2003). Transposon Ds
(dissociation) mengalami delesi pada bagian gen transposase sehingga tidak
mampu menghasilkan enzim transposase (non-otonom) namun mampu pindah
(mobile) (Brooker 2005). Transposon Ds akan berpindah posisi dalam genom
pada tempat berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional. Sedangkan elemen Ac
menyandikan suatu enzim yang mengaktifkan elemen Ds untuk bertransposisi.
Transposon Ac yang bersifat immobile dan transposon Ds yang bersifat nonotonom telah berhasil dikembangkan dalam suatu T-DNA. Transposon Ds akan
stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al.
2004).
Penelitian ini menggunakan sampel tanaman padi kultivar IR64 yang telah
disisipi T-DNA transposon Ac/Ds. Selama proses transformasi telah disisipkan
gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik dan herbisida sebagai marka
penyeleksi. Marka penyeleksi (selectable marker) atau gen penyeleksi merupakan
gen yang berguna untuk menyeleksi atau membedakan sel, jaringan, organ atau
tanaman yang tertransformasi dari yang tidak tertransformasi. Marka penyeleksi
2
yang digunakan pada penelitian ini yaitu gen hpt dan gen bar. Gen hpt merupakan
marka penyeleksi yang mengidentifikasikan keberadaan transposon Ac sedangkan
gen bar mengidentifikasikan keberadaan transposon Ds.
Gen hpt diisolasi dari Escherichia coli. Gen hpt penyandi higromisin
fosfotransferase merupakan gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik.
Enzim higromisin fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt, dapat
mendetoksifikasi aminosiklitol antibiotik higromisin B (Rodriguez & Nottenburg
2002). Gen bar (basta resistant) merupakan gen yang membawa ketahanan
terhadap fosfinotrisin (PPT), bahan aktif herbisida bialaphos dan basta. Gen ini
dapat diisolasi dari bakteri Streptomyces dan Alcaligenes. Gen bar memberi
ketahanan terhadap senyawa antibiotik bialaphos yang terdapat pada herbisida
nonselektif basta. Nama lain senyawa bialaphos ialah glufosinat atau
fosfinothrisin (Webb dan Moris 1990).
Sistem transposon Ac/Ds (activator/disociation) telah menunjukkan
aktivitasnya dan potensial digunakan sebagai mutagen penyisipan yang efektif.
Sistem ini juga merupakan metode alternatif yang lebih efisien untuk memperoleh
tanaman padi mutan. Posisi mutasi yang berbeda-beda pada sejumlah besar
tanaman padi dapat diperoleh melalui perpindahan (aktivitas) transposon Ds
(Greco et al. 2001). Dengan demikian, identifikasi mutasi gen untuk mengetahui
fungsi gen-gen padi kultivar IR64 yang belum diketahui dapat dilakukan tanpa
melakukan transformasi secara berulang-ulang. Namun untuk memperoleh
tanaman mutan yang diinginkan, diperlukan transposon yang stabil sehingga tidak
terjadi perpindahan ke kromosom lain. Transposon Ds akan stabil dalam suatu
genom jika tidak disertai dengan transposon Ac. Berdasarkan hal tersebut maka
digunakan gen bar dan hpt sebagai marka penyeleksi untuk mengidentifikasi
transposon Ac/Ds sehingga dapat dianalisis kestabilannya.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman padi IR64 mutan
generasi T0 yang mengandung transposon Ac/Ds dengan satu salinan (single
copy) T-DNA melalui analisis hibridisasi southern dan mengetahui kestabilan
transposon Ds pada tanaman padi T1 melalui PCR dengan menggunakan primer
bar dan hpt. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan gen-gen padi mutan
IR64 hasil transformasi transposon Ac/Ds yang stabil dan membantu dalam
menghasilkan perpustakaan mutan padi kultivar IR64 pembawa transposon Ac/Ds
yang dapat digunakan sebagai sumber plasma nutfah dan dapat dilepas sebagai
varietas unggul baru.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA adalah 26 sampel daun
padi mutan varietas IR64 generasi T0 dan 26 sampel padi generasi T1, nitrogen
cair, bufer ekstraksi, isopropanol, bufer TE (Tris-EDTA), Na-asetat 3 M pH 5.2,
etanol 70%, HCl 1N, HCl 0.1N, bufer CTAB (Cetyl Trimethylammonium
Bromide), chisam. Bufer ekstraksi, Tris-HCl 1 M pH 8.0, Ethyline Diamine
Tetraacetic Acid (EDTA) 0.5 M pH 8.0, NaCl 5 M. Elektroforesis memerlukan
bahan-bahan seperti bufer TE, loading buffer, agarosa, Ethidium bromide (EtBr)
3
1% (w/v), bufer TAE (Tris Acetat Acid-EDTA) 0.5X, marker 1 kb plus DNA
ladder, 10x bufer, dNTPs, Taq DNA Polimerase, primer bar dan primer hpt.
Bahan yang digunakan pada hibridisasi southern adalah DIG- 11-dUTP
(Digoxigenin-11-dUTP), anti-Digoxigenin, enzim restriksi DraI, kertas blotting,
kertas Whatmann 3MM, membran nilon Hybond N+, Amersham Hyperfilm (GE
Healthcare), substrat CDP-Star, larutan developer dan larutan fixer, Tween 20,
plasmid (100 pg/ L), LiCl, heksanukleotida, klenow enzyme, reagen blocking,
larutan depurinasi, larutan denaturasi, larutan netralisasi, larutan 20x SSC (SalineSodium Citrate), larutan washing 1, larutan washing 2, larutan bufer 1, larutan
washing buffer, larutan bufer 2, larutan antibody, larutan bufer 3, larutan stripping
buffer, dan larutan herbisida basta yang digunakan dalam uji basta.
Peralatan yang digunakan dalam proses isolasi DNA pada penelitian ini
adalah mortar, tabung sentrifuse, sentrifus Beckman Coulter AllegraTM 64R
Centrifuge, penangas air, pipet mikro, pipet Mohr, bulp, sudip, tabung mikro.
Analisis konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop. PCR
Biometra T-personal digunakan untuk amplifikasi DNA. Elektroforesis
menggunakan peralatan parafilm, cetakan gel, sisir, power supply, dan alat untuk
dokumentasi hasil pengamatan elektroforesis UV (UV Transilluminator 2201
Sigma). Peralatan gelas lain yang digunakan adalah gelas piala, labu erlenmeyer,
cawan petri dan gelas ukur.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Padi (Dellaporta et al. 1983)
Sebanyak 2 gram daun tanaman padi IR64 transgenik generasi T0
dimasukkan ke dalam mortar dan disiram dengan nitrogen cair, kemudian digerus
hingga menjadi serbuk. Serbuk tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung
berukuran 50 mL dan diberi label nama sampel. Selanjutnya ditambahkan 15 mL
larutan 1 (100 mL bufer ekstraksi + 0.38 gram natrium bisulfit) dan 1 mL SDS
20%, dikocok hingga homogen, dan diinkubasi pada suhu 65 0C selama 15 menit
(setiap 5 menit dikocok). Setelah itu, ditambahkan 5 mL kalium asetat 5 M, lalu
tabung dibolak-balik hingga homogen dan diinkubasi di dalam bak es selama 20
menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit.
Kemudian supernatan (cairan) disaring menggunakan kertas saring dan
dipindahkan ke dalam tabung 50 mL yang baru.
Isopropanol dingin ditambahkan 10 mL ke dalam cairan dan diinkubasi di
dalam freezer dengan suhu (-20 0C) selama 30 menit. Kemudian sampel
disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 20 menit lalu cairan di buang.
Sampel disentrifugasi lagi pada kecepatan 4000 rpm selama 2 menit dan sisa dari
cairan dibuang menggunakan pipet mikro sehingga cairan tidak ada sama sekali di
dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi pelet di keringkan di dalam oven
dengan suhu 65 0C selama 10 menit.
Pelet dilarutkan ke dalam 700 akuades dan 5 RNAse lalu diinkubasi pada
suhu 65 0C selama 30 menit dengan di kocok setiap 10 menit. Suspensi tersebut
dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000
rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL
yang baru. Sebanyak 75 µL natrium asetat 3 M dan 500 µL isopropanol dingin
4
ditambahkan dalam tabung tersebut dan dicampur serta diinkubasi pada suhu
ruang selama 5 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama
5 menit dan supernatan dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL etanol 70%. Campuran
disentrifugasi kembali selama 2 menit pada kecepatan 10000 rpm dan cairan
dibuang. Kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 10000 selama 30 detik
dan cairan dibuang dengan pipet. Pelet dikeringkan dalam oven selama 10 menit.
Pelet yang telah kering dilarutkan dengan 50 µL larutan TE 0.1x.
Analisis Kuantitatif DNA Genom dengan Nanodrop (Thermo Fisher
Scientific 2009)
Sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu,
tutup nanodrop dan tekan tombol read blank pada komputer. Sisa buffer TE
dibersihkan dengan kertas tissue. Sampel DNA dimasukkan sebanyak 2 µL ke
dalam lubang ukur, kemudian pilih menu read sample. Hasil pengukuran berupa
nilai kemurnian sampel akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/ µL. Kemudian
DNA dapat dilihat berdasarkan nilai Å260/Å280.
Amplifikasi DNA dengan PCR (Trijatmiko et al. 2011)
Amplifikasi dengan teknik PCR dilakukan dengan menggunakan dua
pasang primer untuk gen ketahanan basta (bar) dan gen ketahanan higromisin
(hpt). Sekuen primer yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3. Total volume
reaksi PCR adalah 20 µL yang terdiri 2 µL 10x bufer PCR, 1.2 µL MgCl2 25 mM,
0.4 µL dNTP mix 10 mM, 1 µL primer forward 10 µM, 1 µL primer reverse 10
µM, 0.16 µL Taq DNA polimerase 5 U/µL, 5 µL DNA 10 ng/ µL, dan 9.24 µL
ddH2O. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Profil PCR yang
digunakan adalah pre-denaturasi 940C selama 5 menit, denaturasi 940C selama 30
detik, penempelan primer 650C selama 30 detik, dan pemanjangan primer 720C
selama 30 detik. Proses tersebut diulang sebanyak 30 siklus.
Analisis Kualitas DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook &
Russell 2001)
Disiapkan terlebih dahulu 1% gel agarosa dengan pada cetakan. Sebanyak
1.2 gram agarosa dicampur dengan 120 mL 1x bufer TAE. Larutan tersebut
dimasukkan ke dalam microwave selama 2 menit. Larutan yang sudah tercampur
dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur. Setelah gel
agarosa padat, gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x bufer
TAE. Sebanyak 10 µL produk PCR dicampur dengan 2 µL loading dye, kemudian
dimasukkan ke dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder sebagai marker untuk
melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase
80 volt selama 35 menit. Gel agarosa direndam dalam larutan etidium bromida (20
mg/L) selama 10 menit, kemudian dengan air selama 10 menit. Gel Pita-pita DNA
selanjutnya ditampilkan dengan chemidoc gel system.
Hibridisasi Southern (Trijatmiko et al. 2011)
DNA sampel padi transgenik generasi T0 dipotong menggunakan enzim
restriksi DraI. Pemotongan dilakukan dengan total volume 150 pada masingmasing DNA. Sebanyak 33 µL akuades dan 15 µL larutan buffer 10x dimasukkan
ke dalam tabung steril 1.5 mL, lalu ditambahkan enzim restriksi DraI (10 U/ µL)
5
2 µL. Selanjutnya 100 µL DNA hasil isolasi dimasukkan dalam tabung 1.5 mL
dan diinkubasi pada suhu 370C selama 16 jam. Ditambahkan sebanyak 0.1 x
volume natrium asetat (3M) dan 2.5 x volume etanol 96%. Kemudian tabung
diinkubasi pada suhu -200C selama 2 jam. Tabung disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C. Cairan dibuang kemudian
ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µL, lalu disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Cairan kembali dibuang menggunakan
pipet 20 µL dan dikeringkan selama 2 menit. Tahap selanjutnya, sebanyak 15 µL
0.1x TE dan 3 µL loading dye ditambahkan ke masing- masing tabung tersebut,
kemudian tabung diinkubasi pada suhu 650C selama 15 menit.
Pelabelan marker 1 Kb dilakukan dengan menyiapkan 10x dNTP mix di
dalam tabung 0.5 mL (1 mM dATP 2 µL, 1 mM dCTP 2 µL, 1 mM dGTP 2 µL,
0.65 mM dTTP 1.3 µL, dan 0.35 mM DIG-11-dUTP 7 µL). Tahap selanjutnya,
sebanyak 3 µL 1 Kb, 2 µL 10x heksanukleotida, 2 µL 10x dNTP mix, 1 µL klenow
enzyme, dan 12 µL nucleid acid free water (NF) dimasukkan ke dalam tabung 1.5
mL. Setelah itu, tabung yang berisi campuran larutan tersebut dipanaskan pada
suhu 1000C selama 10 menit lalu dimasukkan ke dalam es selama 2 menit,
kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 3 jam. Ditambahkan 2 µL EDTA
0.2 mol/µL dan 2.5 µL LiCl 4 N serta 75 µL etanol absolut. Tahap berikutnya,
tabung disimpan pada frezzer selama 1 jam dan disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 5 menit. Cairan dibuang lalu pelet dicuci dengan etanol 70%.
Tahap terakhir, etanol 70% dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan oven
dengan suhu 500C atau dikering anginkan kemudian pelet dilarutkan pada bufer
TE 1x sebanyak 50 µL.
Proses transfer DNA tanaman padi transgenik yang dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi DraI ke membran Hybond -N+ diawali dengan
dibuat gel agarosa dengan konsentrasi 0.7% dalam 1x buffer TAE (Tris Acetat
acid-EDTA) dan didiamkan hingga padat. DNA yang telah di potong kemudian
dimasukkan sebanyak 18 µL dan dimasukkan sebanyak 5 µL marker hpt yang
telah dilabel oleh DIG ke dalam masing- masing sumur selama 16 jam (semalam)
pada tegangan 20 volt. Di hari berikutnya, tegangan diubah menjadi 15 volts dan
ditunggu hingga 5 jam. Gel kemudian direndam dalam larutan depurinasi selama
10 menit, kemudian dibilas dengan menggunakan akuades, diikuti dengan
perendaman dalam larutan denturasi selama 2 x 15 menit, dan terakhir direndam
dalam larutan netralisasi selama 2 x 15 menit. Kemudian gel direndam dengan
larutan 20x SSC selama 10 menit. Semua proses tersebut dilakukan pada suhu
ruang. Transfer DNA ke membran Hybond –N+ dilakukan dengan proses kapiler
menggunakan 20x bufer SSC selama 20 jam. Setelah DNA berpindah ke
membran, DNA pada membran difiksasi menggunakan UV selama 5 menit pada
302 nm.
Pelabelan pelacak gen dilakukan menggunakan teknik amplifikasi PCR.
Reaksi PCR dengan total volume 50 µL menggunakan primer hpt forward dan
reverse masing-masing 1 µL (5 mM), 5 µL 10x buffer PCR, 3 µL MgCl2 (25
mM), 0.5 µL dATP (10 mM), 0.5 µL dGTP (10 mM), 0.5 µL dCTP (10 mM), 0.44
µL dTTP (10 mM), 0.4 µL enzim Taq DNA polimerase (5 U/ µL), dan 5 µL
pelacak Hpt (100 pg/ µL). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi 950C
selama 2 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi pada suhu 950C selama
30 detik, penempelan primer pada suhu 600C selama 30 detik, dan pemanjangan
6
pada suhu 720C selama 40 detik. Tahapan akhir PCR dilakukan pemanjangan
akhir pada suhu 720C selama 7 menit. Untuk mengetahui keberhasilan pelabelan
pelacak, sebanyak 5 µL produk PCR labeling dengan Dig-11-dUTP berdampingan
dengan produk PCR tanpa DIG-11-dUTP dengan teknik elektroforesis pada gel
agarosa 1% (w/v) dan hasilnya dianalisis dengan menggunakan program
dokumentasi CEMIDOC.
Membran yang mengandung DNA kemudian dihibridisasi dengan pelacak
yang sudah terlabel. Proses ini dimulai dengan memanaskan larutan DIG Easy
Hyb pada suhu 420C. Membran direndam dengan larutan DIG Easy Hyb sebanyak
50 µL yang diletakkan dalam kotak plastik dan digoyang pada suhu 420C selama 3
jam. Setelah itu larutan DIG Easy Hyb dimasukkan ke dalam tabung 50 mL dan
ditambahkan dengan larutan pelacak yang telah dilabel, kemudian dimasukkan
kembali ke dalam kotak plastik dan digoyang kembali selama 16 jam pada suhu
42 0C.
Membran kemudian dicuci dengan larutan Wash 1 pada suhu kamar
selama 2 x 5 menit, diikuti dengan pencucian dengan larutan Wash 2 pada suhu
680C selama 2 x 15 menit. Membran diseimbangkan dengan larutan washing
buffer selama 2 menit, diikuti dengan inkubasi membran dalam larutan bufer 2
selama 2 jam. Membran diinkubasi selama 30 menit dalam 40 mL larutan AntiDigoxigenin-Alkalin Fosfatase atau Antibody conjugate (Anti-DIG) (Roche).
Membran dipindahkan ke dalam kotak plastik baru untuk menghilangkan
kelebihan antibody conjugate, membran diinkubasi selama 2 x 15 menit dalam
washing buffer. Membran direndam dengan larutan bufer 3 selama 3 menit. Untuk
pendeteksian sinyal dilakukan penambahan substrat CDP-Star ke membran.
Kemudian membran ditutup dengan plastik wrap dan diletakkan ke dalam kaset.
Film X- Ray diletakkan di atas membran dan didiamkan hingga 6 jam. Proses
selanjutnya film X-Ray direndam dengan larutan developer selama 45 detik, air
30 detik, dan larutan fixer selama 30 detik maka jejak dari cahaya yang dihasilkan
bisa dilihat sebagai pita-pita pada film X-Ray.
Aklimatisasi
Aklimatisasi dilakukan secara bertahap, biji padi T1 dikecambahkan dalam
cawan petri yang berisi air secukupnya selama kurang lebih satu minggu.
Terdapat 3 tanaman padi T0 yang diteruskan menjadi generasi T1 dan biji padi
yang digunakan berjumlah 50 biji untuk setiap tanaman. Biji padi yang telah
tumbuh menjadi kecambah dipindahkan ke dalam bak plastik ukuran 44 cm x 34
cm x 15 cm yang berisi tanah sawah selama dua minggu. Biji padi yang bertahan
hidup selama periode aklimatisasi selanjutnya dipindahkan ke dalam pot plastik
dengan volume 10 l yang berisi tanah sawah.
Pengujian Ketahanan Tanaman Padi Generasi T1 terhadap Basta
Pengujian ketahanan tanaman terhadap basta dilakukan dengan cara
mengolesi ujung daun tanaman padi dengan larutan herbisida basta dengan
konsentrasi 200 mg/l. Setelah 3 hari setelah perlakuan kemudian dilakukan
pengamatan terhadap daun padi. Tanaman dikatakan tahan jika daun tidak
terbakar (warna daun tetap hijau) dan tidak tahan jika daun menjadi terbakar
(warna daun coklat) pada area daun yang diolesi larutan basta.
7
Isolasi DNA Tanaman Padi Generasi T1 (Doyle & Doyle 1987)
Daun padi yang telah dipotong-potong dimasukkan ke dalam tabung mikro
berukuran 2 mL, ditempatkan pada wadah berisi liquid nitrogen (LN) kemudian
digerus menggunakan sumpit, dan ditambahkan 800 µL bufer CTAB. Hasil
gerusan diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 65°C selama 15 menit, kocok
(bolak-balik tabung) setiap 5 menit sekali.
Pemurnian DNA dilakukan melalui penambahan natrium asetat 3M
sebanyak 1/10 volume atau sekitar 100 µL dan 1000 µL kloroform isoamilalkohol
ke dalam tabung, kemudian kocok hingga merata. Suspensi selanjutnya disentrifus
dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tube
baru.
Pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan 70 µL Na-asetat (1/10
volume) dan 600 µL isopropanol (2/3 volume) ke dalam supernatan dan dicampur
perlahan. Sampel disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Pelet
dicuci dengan 200 µL etanol 70 %. Campuran disentrifus selama 5 menit dengan
kecepatan 12000 rpm. Pelet selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit.
Pelet yang telah kering dilarutkan dalam 50 µL bufer TE yang mengandung
ribonuklease dan diinkubasi pada 37°C selama 30 menit.
HASIL
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
Sampel tanaman padi yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 27.
Sampel diisolasi menggunakan metode isolasi DNA skala besar yang mengacu
pada Dellaporta et al. (1983). Masing-masing sampel DNA hasil isolasi
diteteskan ke dalam mesin nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan
kemurnian DNA hasil isolasi. Kemurnian DNA padi yang diperoleh dari hasil
isolasi menggunakan metode skala besar berkisar antara 1.22–2.02 yang
mengindikasikan masih terkandungnya protein dan RNA.
Setelah isolasi DNA dilakukan amplifikasi dengan mesin PCR. Primer
bar dan hpt digunakan untuk mengetahui keberadaan transposon Ac dan
transposon Ds. Berdasarkan analisis elekroforegram dari hasil amplifikasi
dengan primer bar (Gambar 1), diketahui bahwa seluruh sampel menghasilkan
pita DNA yang mengindikasikan keberadaan gen bar. Hasil elektroforesis dari
hasil amplifikasi hpt (Gambar 2) menunjukkan bahwa semua sampel
menghasilkan pita DNA, hal ini yang menunjukkan bahwa seluruh sampel
mengandung gen hpt.
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
T-DNA sampel yang diharapkan untuk dilanjutkan pada tanaman
generasi kedua (T1) adalah T-DNA yang stabil. T-DNA suatu tanaman yang
stabil akan menghasilkan satu pita pada hasil hibridisasi Southern. Berdasarkan
Gambar 3 diketahui bahwa sampel yang menghasilkan satu pita DNA adalah
sampel 1.1, 1.2, 5.1, 5.2, 5.3, 4.5, 4.10, 4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16 dan
4.18. Sampel yang lain tidak menghasilkan pita DNA sama sekali. Tiga dari
sampel positif kemudian ditanam kembali untuk diuji lebih lanjut. Tiga sampel
tersebut adalah 5.3, 4.5 dan 4.12.
8
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer bar pada tanaman generasi T0.
A: air, K: kontrol (IR64), P: plasmid B2, 1.1 – 4.19: sampel (elektroforegram kedua
merupakan lanjutan dari elektroforegram pertama).
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T0.
A: air, K: kontrol (IR64), P: plasmid, 1.1- 4.19: sampel.
Gambar 3 Hasil hibridisasi Southern pada tanaman padi IR64 generasi T0. K: kontrol (IR64), P:
plasmid, 1.1– 4.19: sampel (5.3, 4.5, 4.12 : 3 sampel yang dilanjutkan ke T1).
9
Uji Ketahanan Terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
Tiga dari sampel padi generasi T0 yang memiliki satu salinan T-DNA
stabil dipilih untuk ditanam menjadi tanaman padi generasi kedua (T1). Tiga
genotipe tersebut adalah 5.3, 4.5 dan 4.12. Ketiga genotipe tersebut dipilih sebab
menghasilkan biji padi yang cukup banyak. Berdasarkan hukum segregasi
Mendel, generasi kedua akan memenuhi perbandingan 3:1 antara pembawa sifat
dan yang bukan pembawa sifat (Brooker 2005). Hal tersebut memungkinkan
muncul kembali individu-individu yang memiliki genotipe tipe liar (wild type)
karena masih mengalami segregasi dan belum homogen. Oleh karena itu
digunakan biji padi yang cukup banyak pada tahap aklimatisasi dengan harapan
untuk memperbesar kemungkinan memperoleh individu pembawa transposon
Ac/Ds. Tanaman padi yang tidak mengandung gen bar akan mengalami nekrosis
(Gambar 4) setelah perlakuan basta. Sebaiknya tanaman yang mengandung gen
bar akan menunjukkan ketahanan terhadap herbisida basta. Hasil pengamatan
menunjukkan sebanyak 8 tanaman padi dari sampel 5.3 menunjukkan ketahanan
terhadap basta, 5 tanaman pada sampel 4.5 dan 7 tanaman pada sampel 4.12.
A
B
Gambar 4 Hasil pengolesan basta pada tanaman. A: negatif dan B: positif.
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
Sampel yang menunjukkan hasil positif, disertai dengan beberapa sampel
hasil negatif yang akan digunakan sebagai perbandingan, kemudian diisolasi
dengan metode isolasi DNA yang mengacu pada Doyle et al. (1987).
Kemurnian DNA padi yang diperoleh dari hasil isolasi menggunakan metode
skala besar berkisar antara 1.78–1.97 yang menunjukkan DNA hasil isolasi
mempunyai kemurnian yang baik.
Analisis kestabilan transposon Ds dilakukan dengan amplifikasi tanaman
padi generasi T1 dengan primer bar dan hpt. Berdasarkan Gambar 5 diketahui
bahwa sebagian besar sampel menunjukkan hasil positif terhadap primer bar
kecuali sampel 4.12 (-1), dan 4.12 (-2). Sampel yang menunjukkan hasil positif
dari amplifikasi PCR dengan primer hpt (Gambar 6) berjumlah 11 sampel.
10
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 5 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer bar pada tanaman padi T1. K1
dan K2: kontrol (IR64), 5.3 (1-8): sampel positif, 5.3 (-1, -2): sampel negatif, 4.5 (15): sampel positif, 4.5 (-1, -2): sampel negatif, 4.12 (1-7): sampel positif, 4.12 (-1, 2): sampel negatif.
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 6 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T1.
K1 dan K2: kontrol (IR64), 5.3 (1-8): sampel positif, 5.3 (-1, -2): sampel negatif, 4.5
(1-5): sampel positif, 4.5 (-1, -2): sampel negatif, 4.12 (1-7): sampel positif, 4.12 (-1,
-2): sampel negatif (elektroforegram kedua merupakan lanjutan dari elektroforegram
pertama).
Tanaman padi yang mengandung transposon Ds stabil adalah tanaman yang
menunjukkan hasil positif terhadap primer bar dan menunjukkan hasil negatif
terhadap primer hpt. Analisis dari hasil amplifikasi dengan primer bar dan hpt
seperti yang tertera pada Tabel 1 bahwa sampel yang memiliki transposon Ds
stabil berjumlah 14 sampel. Hal ini mengidentifikasikan bahwa transposon Ds
11
telah terpisah dari transposon Ac pada proses segregasi tanaman padi T1. Hasil
yang demikian sesuai dengan harapan sebab transposon Ds akan stabil dalam
suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004).
Tabel 1 Hasil analisis kestabilan transposon Ds
Sampel
IR 64 (1)
IR 64 (2)
64.B2.5.3 (1)
64.B2.5.3 (2)
64.B2.5.3 (3)
64.B2.5.3 (4)
64.B2.5.3 (5)
64.B2.5.3 (6)
64.B2.5.3 (7)
64.B2.5.3 (8)
64.B2.5.3 (n.1)
64.B2.5.3 (n.2)
64.B2.4.5 (1)
64.B2.4.5 (2)
64.B2.4.5 (3)
64.B2.4.5 (4)
64.B2.4.5 (5)
64.B2.4.5 (n.1)
64.B2.4.5 (n.2)
64.B2.4.12 (1)
64.B2.4.12 (2)
64.B2.4.12 (3)
64.B2.4.12 (4)
64.B2.4.12 (5)
64.B2.4.12 (6)
64.B2.4.12 (7)
64.B2.4.12 (n.1)
64.B2.4.12 (n.2)
Hasil bar
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Hasil hpt
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
keterangan
kontrol
kontrol
tidak stabil
stabil
tidak stabil
tidak stabil
tidak stabil
tidak stabil
tidak stabil
stabil
stabil
stabil
stabil
stabil
tidak stabil
stabil
stabil
stabil
tidak stabil
stabil
stabil
stabil
stabil
tidak stabil
tidak stabil
stabil
tidak stabil
Gen tidak diturunkan
PEMBAHASAN
Transposon Ac/Ds diintroduksi ke dalam genom tanaman padi dengan
memanfaatkan T-DNA. Transposon Ds yang telah masuk ke dalam genom akan
berpindah posisi jika diinduksi oleh enzim transposase pada generasi berikutnya,
sehingga dapat dimanfaatkan untuk mutasi. Jika diperoleh tanaman T0 yang
cukup, diharapkan dari setiap tanaman tersebut diperoleh generasi tanaman T1
dengan insersi transposon yang berbeda. Insersi transposon diharapkan terjadi
pada gen penting dan menghasilkan fenotipe tanaman tertentu sehingga fungsi gen
yang dirusaknya (knock out) dapat diamati pada penelitian lebih lanjut.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 27 tanaman transgenik
hasil transformasi yang telah disisipkan transposon Ac/Ds sebelumnya.
Berdasarkan peta T-DNA yang digunakan pada transformasi sebelumnya
12
(Gambar 7) menunjukkan bahwa transposon Ac telah disisipkan gen hpt dan pada
transposon Ds telah disisipkan gen bar. Gen hpt dan gen bar berfungsi sebagai
marka untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac dan transposon Ds.
Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds serta kestabilannya perlu dilakukan
untuk mengetahui keberhasilan transfomasi pada sampel tanaman padi generasi
T0.
Konfirmasi keberadaan dan integrasi transposon dapat dilakukan dengan
polymerase chain reaction (PCR) dan Southern-blot. PCR merupakan cara yang
popular digunakan karena dapat menganalisis secara cepat sampel yang banyak
jumlahnya. Meskipun demikian, PCR mempunyai beberapa kelemahan. Hasil
PCR tidak dapat menunjukkan apakah sekuen DNA sudah terintegrasi ke dalam
genom tanaman atau belum (Padmadi 2009). Berdasarkan hal tersebut maka untuk
mengetahui apakah seluruh basa yang ada dalam transgen terintegrasi dalam
genom tanaman perlu dilakukan Southern-blot.
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
Metode isolasi DNA ditentukan sesuai dengan metode analisis molekuler
yang akan dilakukan dan kuantitas DNA yang dibutuhkan. Analisis molekuler
yang dilakukan pada tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 adalah
amplifikasi PCR dan hibridisasi Southern. Analisis gen menggunakan hibridisasi
Southern membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan murni (Padmadi 2009).
Berdasarkan hal tersebut maka dipilih metode isolasi skala besar (Dellaporta et
al. 1983). Hasil penelitian Kartini (2012) juga menunjukkan bahwa metode isolasi
skala besar merupakan metode isolasi yang paling tepat untuk analisis molekuler
dengan Southern blot.
Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds pada penelitian ini dilakukan
dengan polymerase chain reaction (PCR). Menurut Abdullah dan Retnoningrum
(2003), teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana
terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara
eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Secara umum proses ini dapat
dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat,
annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan
extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA
antara 106-109 kali.
Gambar 7 Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon Ac/Ds (Trijatmiko et
al. 2005)
13
Primer yang digunakan untuk konfirmasi transposon Ac/Ds pada penelitian
ini ada dua, yaitu primer bar dan hpt. Primer bar berfungsi untuk mengidentifikasi
keberadaan transposon Ds dan primer hpt untuk mengidentifikasi keberadaan
transposon Ac. Berdasarkan hasil analisis PCR (Gambar 2) diketahui bahwa
seluruh sampel mengandung transposon Ac dan Ds. Hasil demikian menunjukkan
transposon Ac/Ds berhasil disisipkan ke dalam gen padi.
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
Sampel yang positif pada hasil PCR hanya menunjukkan adanya sekuen
yang homolog dengan primer dan berada pada jarak yang memungkinkan
dihasilkannya produk PCR. Berdasarkan hal tersebut maka untuk mendapatkan
data yang lebih spesifik perlu dilakukan teknik hibridisasi Southern. Hibridisasi
merupakan proses identifikasi gen-gen hasil analisis DNA dengan menggunakan
enzim restriksi yang sesuai dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang
spesifik yang telah diberi label dengan radioisotope seperti 32p fosfat radioaktif
atau dengan substansi nonradioisotop (Berg et al. 2007). Hibridisasi Southern
dapat menunjukkan keberadaan transgen dan jumlah salinan dari gen hasil
transformasi pada tanaman transgenik. Jumlah salinan transgen (T-DNA)
ditunjukkan oleh jumlah pita yang dihasilkan. Apabila jumlah salinan gen
transforman terlalu banyak pada genom maka kemungkinan akan terjadi proses
pembungkaman (silencing) pada gen tertentu, namun apabila gen terkopi antara 110X kemungkinan tidak akan menimbulkan gene silencing pada gen gen lain
(Christou et al. 1991).
Berdasarkan Gambar 3 diketahui bahwa terdapat 14 sampel yang
menunjukkan T-DNA yang menghasilkan satu salinan (single copy). Jumlah
salinan demikian adalah hasil yang diharapkan. Apabila terjadi perubahan tingkat
ekspresi pada tanaman generasi selanjutnya dapat diduga karena pengaruh
integrasi gen yang ditransformasikan dan bukan karena proses pembungkaman
gen. Berdasarkan hasil diketahui bahwa selain sampel yang menghasilkan satu
pita, sampel yang lain tidak menghasilkan pita sama sekali. Hal ini diduga karena
transgen (T-DNA) masuk ke dalam sel sehingga positif ketika dideteksi dengan
PCR tetapi tidak terintegrasi ke dalam genom tanaman dan tidak menghasilkan
pita saat dideteksi dengan hibridisasi Southern. Marsch-Martinez et al (2002)
menyatakan bahwa kegagalan saat transformasi dapat mengakibatkan T-DNA
tidak terinsersi pada genom DNA.
Uji Ketahanan terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
Salah satu metode konfirmasi sederhana dan cepat untuk mengetahui
integrasi T-DNA ke dalam genom padi adalah dengan pengecatan/pengolesan
daun padi transgenik dengan herbisida basta pada konsentrasi 200 mg/l (Wang
dan Waterhouse 1997). Apabila gen bar telah terintegrasi ke dalam genom
tanaman padi, maka ketika daun padi transgenik yang mengandung gen tersebut
diolesi dengan basta akan memberikan respon ketahanan. Respon ketahanan
tersebut diketahui apabila daun yang diolesi akan tetap berwarna hijau (tahan
basta) sedangkan yang tidak membawa gen tersebut akan berwarna coklat atau
mengalami nekrosis (Gambar 4) (sisharmini et al 2009).
Hasil penelitian remelia 2009 menghasilkan 48% padi nipponbare mutan
tahan basta dari seluruh sampel padi yang diuji dengan herbisida basta. Penelitian
14
ini menghasilkan 13% padi tahan basta dari 150 padi IR64 mutan generasi F1
yang diuji. Perbedaan hasil tersebut diduga akibat perbedaan kultivar padi yang
digunakan. Tanaman yang menunjukkan hasil positif (tahan terhadap basta)
mengindikasikan bahwa gen bar yang terdapat pada elemen Ds telah terintroduksi
dan terekspresi pada tanaman transgenik generasi T1 yang diuji. Gen bar
memproduksi enzim fosfinotrisin asetiltransferase. Enzim yang dihasilkan
tersebut memberi gugus asil kepada senyawa fosfinotrisin yang dipaparkan oleh
herbisida basta sehingga berubah menjadi senyawa yang tidak berbahaya bagi
tanaman sehingga tanaman tidak mengalami nekrosis. Hal ini menyebabkan daun
padi yang mengandung gen bar tidak berubah warna ketika dipaparkan herbisida
basta. Herbisida basta mengandung senyawa fosfinotrisin yang dapat menghambat
kerja enzim dalam jalur sintesis glutamin sehingga menghasilkan senyawa toksik
yaitu amoniak. Senyawa toksik tersebut yang mengakibatkan sel-sel tanaman
menjadi mati sehingga mengalami gejala nekrosis (daun seperti terbakar)
(Kolesnik et al. 2004).
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
Tanaman padi yang tahan terhadap basta diisolasi dengan metode isolasi
DNA yang mengacu pada Doyle et al. (1987). Metode isolasi ini dipilih karena
hanya memerlukan bahan yang sedikit dan tidak membutuhkan waktu yang lama.
Keberadaan transposon Ac dan Ds dapat diketahui dengan PCR menggunakan
primer yang dapat mendeteksi keberadaan gen bar dan gen hpt. Gen bar terdapat
di dalam transposon Ds, sedangkan gen hpt terdapat dalam transposon Ac pada
konstruksi T-DNA.
Transposon Ds akan stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan
transposon Ac (Kolesnik et al. 2004). Berdasarkan hasil pengamatan transposon
Ds stabil berhasil terdeteksi dalam 53% sampel padi IR64 mutan yang diamati.
Kolesnik et al. (2004) berhasil mendeteksi lebih dari 80% transposon Ds stabil
pada pengamatan populasi padi mutan nipponbare dalam skala besar. Penelitian
yang dilakukan Mulyaningsih et al. (2010) berhasil mendeteksi sekitar 76%
transposon Ds dari seluruh sampel padi batutegi yang diamati. Perbedaan jumlah
transposon Ds stabil yang didapat pada masing-masing penelitian diduga karena
perbedaan dari kultivar padi dan konstruk gen yang digunakan. Padi mutan
dengan hasil positif dari analisis kestabilan ini dapat diturunkan ke generasi
selanjutnya untuk mengetahui kestabilan transposon Ds lebih lanjut. Uji stabilitas
gen pada tanaman transgenik perlu dilakukan untuk mengetahui kestabilan insersi
transgen pada turunannya. Tanaman padi mutan yang telah stabil dapat digunakan
dalam berbagai penelitian khususnya yang berkaitan dengan analisis fungsi gengen padi (Remelia 2008).
Sampel 5.3(-1), 5.3(-2) dan 4.5(-1) tidak menunjukkan ketahanan terhadap
uji herbisida basta namun menunjukkan hasil positif pada amplifikasi PCR dengan
primer bar. Hal ini mungkin disebabkan karena gen bar pada genom tanaman
bersifat resesif sehingga tidak tahan terhadap perlakuan herbisida basta namun
tetap ada dalam genom tanaman. Mangoendidjojo (2003) mengatakan bahwa gen
resesif tidak dapat menunjukkan ekspresinya jika berpasangan dengan gen
dominan (heterozigot). Sampel 4.12(-2) tidak menunjukkan ketahanan pada uji
herbisida basta serta menunjukkan hasil negatif pada PCR bar dan hpt. Hal
tersebut menunjukkan bahwa sampel tidak mengandung transposon Ac/Ds atau
15
merupakan tipe liar yang tidak mengandung transgen. Peristiwa ini dapat terjadi
karena transgen masih mengalami segregasi dan belum homogen. Berdasarkan
hukum Mendel individu-individu yang memiliki genotipe tipe liar (wild type)
dapat muncul kembali pada generasi kedua (T1) maupun generasi kedua (T1)
karena masih mengalami segregasi dan belum homogen (Brooker 2005). Tanaman
kontrol IR64 seperti yang diharapkan menunjukkan hasil negatif pada analisis
PCR. Hal ini menunjukkan gen penanda bar dan hpt mampu mendeteksi dengan
baik.
SIMPULAN
Tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 yang mengandung satu salinan
(single copy) T-DNA pembawa transposon Ac/Ds telah berhasil dikonfirmasi.
Sebanyak 14 sampel menghasilkan satu salinan pada analisis hibridisasi Southern.
Uji kestabilan transposon Ds pada tanaman padi IR64 transgenik generasi T1
berhasil dilakukan dan menghasilkan 12 sampel tanaman yang mengandung
transposon Ds stabil.
DAFTAR PUSTAKA
Berg MJ, JL Tymoczko, L Stryer. 2007. Biochemistry. Sixth Ed. San Fransisco
(US): WH Freeman.
Bouchez D, H Hofte. 1998. Functional genomic in plants. Plant Physiol.
118:725-732.
Brooker R J. 2005. Analysis and Principle. 2nd ed. New York (US): McGraw-Hill
companies, Inc.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS
Christou P, Ford TL, Kofron M. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa
L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties
via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into
immature zygotic embryos. Biotechnology. 9:957-966.
Dellaporta Sl, Jonathan W, James BH. 1983. A plant DNA minipreapration:
version II. Plant molecular Biology Reporter 1: 19- 21.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation from small amount of fresh
leaf tissue. J Phytochem Bull 19: 11-15.
Griffith AJF. 1999. An Introduction to Genetic Analysis. Ed ke-7. New York
(US): W.H. Freeman.
Greco R, PBF Ouwerkerk, AJC Taal, C Favalli, T Begiristain, P Puigmonech,
L Colombo, JHC Hoge, A Pereira. 2001. Early and multiple Ac
transpositions in rice suitable for efficient insertional mutagenesis.
PlantMolecular Biology 46: 215-227.
Greco R, PBF Ouwerkerk, RJ De Kam, C Sallaud, C Favalli, L Colombo, E
Guiderdoni,
AH
Meijer,
JHC
Hoge,
A
Pereira.
2003.
Transpositional behavior of an Ac/Ds system for reverse genetics in
16
rice. Theory Applied Genetics 108: 10-24.
Jeoung DH, S An, HG Kang, S Moon, J Han, S Park, HS Lee, K An, & G An.
2002. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice.
Plant physiology 130: 1636-1644.
Kartini RA. 2012. Karakerisasi Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa
Metode Isolasi DNA [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Kolesnik T, I Szeverenyi, D Bachman, CS Kumar, S Jiang, R Ramamoorthy,
M Cal, ZG Ma, V Sundaresan, S Ramachandran. 2004. Establishing
an efficient Ac/Ds tagging system in rice. The Plant Journal 37: 301314.
Mangoendidjojo W. 2003. Dasar-dasar Pemuliaan Tanaman. Yogyakarta (ID):
Kanisius.
Padmadi B. 2009. Identifikasi sifat aroma tanaman padi menggunakan marka
berbasis gen aromatik [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Remelia M. 2008. Analisis T-DNA pembawa transposon Ac/Ds pada T0 dan
aktivitas Ds pada T1 tanaman padi (Oryza sativa L.) kultivar
nipponbare
[skripsi]. Jakarta (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
Rodriguez RC,Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in
genetic transformation especially in plants. CAMBIA. [internet]. [diunduh
pada
2013
feb
22].
Tersedia
pada
http:www.cambiaip.org/whitepapers/TransgenidAb.
Rubin E, A.A. Levy. 1997. Abortive gap repair: Underlying mechanism for Ds
element formation. Molecular and Cellular Biology 17(11): 6294-6302.
Sambrook J, DW Russel. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New
York (US): Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific.
Trijatmiko KR, GV Arkel, A Karaba, EV Enckevort, A Pereira. 2005. Activation
tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. Dalam
Comparative Analysis of Drought Resistance Genes in Arabidopsis and
Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland
with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p. 111-128.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analysis
of Transgenic Plants. NewYork (US): Springer.
Wang MB, PM Waterhouse. 1997. A rapid and simple method of assaying
plants transformed with hygromycin or PPT resistance genes. Plant Mol.
Biol. Rep. 15:209-215.
Weaver NA, PW Hendrick. 1997. Genetics. 3rd ed. Dubuque (US): Wm. C.
Brown Publisher.
Webb KJ, Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation, In:
Gatehouse AMR, Hilder VA, Boulter D, editor. Plant Genetic
Manipulation for Crop Protection. United Kingdom (GB): CAB
International
Lampiran
Lampiran 1 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T0
No.
Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
IR64 WT
64.B2.1.1
64.B2.1.2
64.B2.5.1
64.B2.5.2
64.B2.5.3
64.B2.5.4
64.B2.5.5
64.B2.4.1
64.B2.4.2
64.B2.4.3
64.B2.4.4
64.B2.4.5
64.B2.4.6
64.B2.4.7
64.B2.4.8
64.B2.4.9
64.B2.4.10
64.B2.4.11
64.B2.4.12
64.B2.4.13
64.B2.4.14
64.B2.4.15
64.B2.4.16
64.B2.4.17
64.B2.4.18
64.B2.4.19
konsentrasi
DNA
(ng/µl)
1463
3383.3
1270.4
1724.6
1517
2364.3
1513.1
1356.1
1095.3
388.8
313.9
335.3
87.4
433
352
269.7
327.9
600.5
859.5
1267.4
522.7
368.5
1266.8
988.1
905.5
1624.2
1613.3
A260
A280
260/280
29.259
67.665
25.408
34.492
30.341
47.286
30.261
27.123
21.907
7.776
6.278
6.706
1.748
8.66
7.04
5.393
6.558
12.009
17.19
25.348
10.453
7.37
25.336
19.762
18.111
32.485
32.267
15.392
33.482
13.414
18.409
16.305
24.415
16.212
14.593
11.737
4.149
3.332
3.529
1.429
4.63
3.779
2.869
3.493
6.513
9.258
13.62
5.713
3.898
13.647
10.731
9.797
17.386
17.335
1.9
2.02
1.89
1.87
1.86
1.94
1.87
1.86
1.87
1.87
1.88
1.9
1.22
1.87
1.86
1.88
1.88
1.84
1.86
1.86
1.83
1.89
1.86
1.84
1.85
1.87
1.86
18
Lampiran 2 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T1
No. Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA
PADI MUTAN IR64
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Deteksi Gen hpt dan
bar untuk Uji Kestabilan Gen Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai
oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, S.P, M.Si. Sumber informasi
yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan
dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Clara Shinta Ayu Fitriyanti
NIM G84090064
ABSTRAK
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI. Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji
Kestabilan Gen Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64. Dibimbing oleh POPI
ASRI KURNIATIN dan BUDI SANTOSA.
Sistem transposon Ac/Ds dapat digunakan untuk memperoleh genotipe
mutan yang bervariasi pada genom padi dan untuk mengetahui fungsi gen-gen
tersebut khususnya pada padi kultivar IR64. Namun untuk memperoleh tanaman
mutan yang diinginkan, diperlukan transposon yang stabil sehingga tidak terjadi
perpindahan ke kromosom lain. Penelitian ini bertujuan mendapatkan tanaman
padi IR64 transgenik generasi T1 yang mengandung transposon Ds stabil.
Penelitian ini telah menganalisis 26 sampel DNA genom generasi pertama (T0)
dengan polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer bar dan hpt serta
analisis hibridisasi Southern. Sebanyak 26 sampel DNA genom generasi kedua
(T1) dianalisis dengan PCR. Hasil analisis PCR menunjukkan keberadaan
transposon Ac/Ds pada seluruh sampel generasi pertama. Hasil analisis hibridisasi
Southern menunjukkan 14 dari 26 sampel DNA tanaman T0 mengandung satu
salinan T-DNA transposon. Sebanyak 14 tanaman generasi T1 mengandung
transposon Ds yang stabil berdasarkan hasil analisis PCR. Penelitian ini berhasil
membuktikan gen transposon Ds bersifat stabil karena dapat diwariskan pada
generasi berikutnya.
Kata kunci: IR64, Transposon Ac/Ds, analisis kestabilan
ABSTRACT
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI. hpt dan bar Gene Detection for Stability
Test of Transposon Ac/Ds Gen in IR64 Mutant Rice. Supervised by POPI ASRI
KURNIATIN and BUDI SANTOSA.
Ac/Ds transposon system can be used to gain variety of mutant rice
genotype and for identifying the function of mutant gen especially IR64 rice.
However to obtain mutant plant that we want, stable transposon is required in
order to avoid transposon movement to other chromosoms. This research has
analyzed 26 samples of genom DNA of first generation (T0) plants with
polymerase chain reaction (PCR) using bar and hpt primer also Southern
hybridization analyzing. There is 26 genom DNA samples of second generation
(T1) plants analyzed with PCR. PCR analyzation showed that transposon Ac/Ds is
occur in all samples. Southern hybridization showed that 14 of 26 T0 plants
contain single copy of T-DNA. Fourteen T1 generation plants contain stable Ds
transposon based on the results of PCR analysis. This research proved that Ds
transposon is stable because it was inherited on the next generation.
Keywords: IR64, Ac/Ds transposon, stability analysis
DETEKSI GEN hpt DAN bar UNTUK UJI KESTABILAN
GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA
PADI MUTAN IR64
CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji Kestabilan Transposon
Ac/Ds pada Padi Mutan IR64
Nama
: Clara Shinta Ayu Ftiriyanti
NIM
: G84090064
Disetujui oleh
Popi Asri Kurniatin, S.Si. Apt. M.Si.
Pembimbing I
Dr. Ir. Budi Santosa, MP
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MApp, Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian ini, serta shalawat dan salam semoga tercurahkan
pada Rasulullah SAW. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Popi Asri
Kurniatin, S.Si Apt. M.Si. dan Dr. Ir. Budi Santosa, MP selaku ketua dan anggota
pembimbing skripsi yang dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler, Balai
Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian, Cimanggu-Bogor. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada
orang tua, adik, dan keluarga atas segala doa, kasih sayang, dan motivasinya.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Tri Joko Santoso SP. MSi,
Mba Dewi, Ka Falin, Mba Mira, Vita, Tuhfah, Kiki, Siska, Sisca, Hilda, Sari serta
rekan-rekan Biokimia 46 yang lain atas bimbingan, doa dan dukungannya sehingga
penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan ini. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna
dalam penulisan ini. Penulis juga berharap karya tulis ilmiah ini dapat bermanfaat
bagi semua pihak
Bogor, Februari 2014
Clara Shinta Ayu Fitriyanti
DAFTAR ISI
ABSTRAK
ii
DAFTAR GAMBAR
iii
DAFTAR LAMPIRAN
iii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
HASIL
7
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
7
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
7
Uji Ketahanan Terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
9
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
9
PEMBAHASAN
11
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
12
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
13
Uji Ketahanan terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
13
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
14
SIMPULAN
15
DAFTAR PUSTAKA
15
Lampiran
17
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer basta pada tanaman
generasi T0
8
2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman
generasi T0
8
3 Hasil hibridisasi Southern pada tanaman padi IR64 generasi T0
8
4 Hasil pengolesan basta pada tanaman
9
5 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer basta pada
Tanaman padi T1
10
6 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman
generasi T1
10
7 Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon Ac/Ds
12
DAFTAR LAMPIRAN
1 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T0
17
2 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T1
18
3 Motif sekuen primer yang digunakan
19
PENDAHULUAN
Beras adalah sumber bahan pangan fungsional, yaitu bahan makanan alami
yang mengalami pengolahan dan mengandung satu atau lebih komponen
pembentuk dengan fungsi-fungsi fisiologis tertentu dan bermanfaat bagi kesehatan
(Sisharmini 2009). Beras mempunyai nilai ekonomi yang penting dan merupakan
makanan pokok bagi sebagian besar belahan dunia terutama Asia. Tanaman padi
(Oryza sativa L.) sebagai penghasil beras akan menjadi salah satu komoditas
pangan utama dan sumber utama gizi maupun energi bagi lebih dari 90%
penduduk Indonesia saat ini hingga beberapa tahun mendatang (BPS 2011).
Berdasarkan hal tersebut maka kualitas dan produksi tanaman padi perlu
ditingkatkan untuk memenuhi kebutuhan penduduk Indonesia.
Eksplorasi kekayaan genom padi, melalui pencarian gen-gen dalam genom
padi yang berperan dalam menentukan suatu fenotipe, diperlukan untuk
memperoleh informasi mengenai fungsi gen-gen padi sehingga kualitasnya dapat
ditingkatkan (Jeoung et al. 2002). Menurut Bouchez dan Hofte (1998) ada dua
pendekatan yang dilakukan untuk menganalisis fungsi gen, yaitu forward genetics
dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan dengan menganalisis
fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke sekuen gennya.
pendekatan reverse genetics dilakukan dengan berpedoman dari informasi sekuen
gen yang telah diketahui.
Sistem mutagenesis dengan transposon Ac/Ds telah banyak diterapkan
sebagai strategi reverse genetics analisis fungsi gen-gen suatu tanaman.
Transposon adalah segmen DNA spesifik yang dapat bertransposisi dari satu
lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel dengan cara memotong segmen suatu
DNA, kemudian meligasinya. Transposon Ac/Ds terdapat secara alami di dalam
tanaman jagung yang menyebabkan penampakan warna yang beraneka ragam
pada lapisan biji jagung. Transposon Ac/Ds pertama kali ditemukan oleh Barbara
McClintock tahun 1948 (Griffth et al. 1999).
Transposon Ac (activator) telah mengalami delesi pada bagian inverted
repeat sehingga bersifat tidak mampu pindah (immobile), namun mampu
menghasilkan enzim transposase (otonom) (Greco et al. 2003). Transposon Ds
(dissociation) mengalami delesi pada bagian gen transposase sehingga tidak
mampu menghasilkan enzim transposase (non-otonom) namun mampu pindah
(mobile) (Brooker 2005). Transposon Ds akan berpindah posisi dalam genom
pada tempat berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional. Sedangkan elemen Ac
menyandikan suatu enzim yang mengaktifkan elemen Ds untuk bertransposisi.
Transposon Ac yang bersifat immobile dan transposon Ds yang bersifat nonotonom telah berhasil dikembangkan dalam suatu T-DNA. Transposon Ds akan
stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al.
2004).
Penelitian ini menggunakan sampel tanaman padi kultivar IR64 yang telah
disisipi T-DNA transposon Ac/Ds. Selama proses transformasi telah disisipkan
gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik dan herbisida sebagai marka
penyeleksi. Marka penyeleksi (selectable marker) atau gen penyeleksi merupakan
gen yang berguna untuk menyeleksi atau membedakan sel, jaringan, organ atau
tanaman yang tertransformasi dari yang tidak tertransformasi. Marka penyeleksi
2
yang digunakan pada penelitian ini yaitu gen hpt dan gen bar. Gen hpt merupakan
marka penyeleksi yang mengidentifikasikan keberadaan transposon Ac sedangkan
gen bar mengidentifikasikan keberadaan transposon Ds.
Gen hpt diisolasi dari Escherichia coli. Gen hpt penyandi higromisin
fosfotransferase merupakan gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik.
Enzim higromisin fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt, dapat
mendetoksifikasi aminosiklitol antibiotik higromisin B (Rodriguez & Nottenburg
2002). Gen bar (basta resistant) merupakan gen yang membawa ketahanan
terhadap fosfinotrisin (PPT), bahan aktif herbisida bialaphos dan basta. Gen ini
dapat diisolasi dari bakteri Streptomyces dan Alcaligenes. Gen bar memberi
ketahanan terhadap senyawa antibiotik bialaphos yang terdapat pada herbisida
nonselektif basta. Nama lain senyawa bialaphos ialah glufosinat atau
fosfinothrisin (Webb dan Moris 1990).
Sistem transposon Ac/Ds (activator/disociation) telah menunjukkan
aktivitasnya dan potensial digunakan sebagai mutagen penyisipan yang efektif.
Sistem ini juga merupakan metode alternatif yang lebih efisien untuk memperoleh
tanaman padi mutan. Posisi mutasi yang berbeda-beda pada sejumlah besar
tanaman padi dapat diperoleh melalui perpindahan (aktivitas) transposon Ds
(Greco et al. 2001). Dengan demikian, identifikasi mutasi gen untuk mengetahui
fungsi gen-gen padi kultivar IR64 yang belum diketahui dapat dilakukan tanpa
melakukan transformasi secara berulang-ulang. Namun untuk memperoleh
tanaman mutan yang diinginkan, diperlukan transposon yang stabil sehingga tidak
terjadi perpindahan ke kromosom lain. Transposon Ds akan stabil dalam suatu
genom jika tidak disertai dengan transposon Ac. Berdasarkan hal tersebut maka
digunakan gen bar dan hpt sebagai marka penyeleksi untuk mengidentifikasi
transposon Ac/Ds sehingga dapat dianalisis kestabilannya.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman padi IR64 mutan
generasi T0 yang mengandung transposon Ac/Ds dengan satu salinan (single
copy) T-DNA melalui analisis hibridisasi southern dan mengetahui kestabilan
transposon Ds pada tanaman padi T1 melalui PCR dengan menggunakan primer
bar dan hpt. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan gen-gen padi mutan
IR64 hasil transformasi transposon Ac/Ds yang stabil dan membantu dalam
menghasilkan perpustakaan mutan padi kultivar IR64 pembawa transposon Ac/Ds
yang dapat digunakan sebagai sumber plasma nutfah dan dapat dilepas sebagai
varietas unggul baru.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA adalah 26 sampel daun
padi mutan varietas IR64 generasi T0 dan 26 sampel padi generasi T1, nitrogen
cair, bufer ekstraksi, isopropanol, bufer TE (Tris-EDTA), Na-asetat 3 M pH 5.2,
etanol 70%, HCl 1N, HCl 0.1N, bufer CTAB (Cetyl Trimethylammonium
Bromide), chisam. Bufer ekstraksi, Tris-HCl 1 M pH 8.0, Ethyline Diamine
Tetraacetic Acid (EDTA) 0.5 M pH 8.0, NaCl 5 M. Elektroforesis memerlukan
bahan-bahan seperti bufer TE, loading buffer, agarosa, Ethidium bromide (EtBr)
3
1% (w/v), bufer TAE (Tris Acetat Acid-EDTA) 0.5X, marker 1 kb plus DNA
ladder, 10x bufer, dNTPs, Taq DNA Polimerase, primer bar dan primer hpt.
Bahan yang digunakan pada hibridisasi southern adalah DIG- 11-dUTP
(Digoxigenin-11-dUTP), anti-Digoxigenin, enzim restriksi DraI, kertas blotting,
kertas Whatmann 3MM, membran nilon Hybond N+, Amersham Hyperfilm (GE
Healthcare), substrat CDP-Star, larutan developer dan larutan fixer, Tween 20,
plasmid (100 pg/ L), LiCl, heksanukleotida, klenow enzyme, reagen blocking,
larutan depurinasi, larutan denaturasi, larutan netralisasi, larutan 20x SSC (SalineSodium Citrate), larutan washing 1, larutan washing 2, larutan bufer 1, larutan
washing buffer, larutan bufer 2, larutan antibody, larutan bufer 3, larutan stripping
buffer, dan larutan herbisida basta yang digunakan dalam uji basta.
Peralatan yang digunakan dalam proses isolasi DNA pada penelitian ini
adalah mortar, tabung sentrifuse, sentrifus Beckman Coulter AllegraTM 64R
Centrifuge, penangas air, pipet mikro, pipet Mohr, bulp, sudip, tabung mikro.
Analisis konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop. PCR
Biometra T-personal digunakan untuk amplifikasi DNA. Elektroforesis
menggunakan peralatan parafilm, cetakan gel, sisir, power supply, dan alat untuk
dokumentasi hasil pengamatan elektroforesis UV (UV Transilluminator 2201
Sigma). Peralatan gelas lain yang digunakan adalah gelas piala, labu erlenmeyer,
cawan petri dan gelas ukur.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Padi (Dellaporta et al. 1983)
Sebanyak 2 gram daun tanaman padi IR64 transgenik generasi T0
dimasukkan ke dalam mortar dan disiram dengan nitrogen cair, kemudian digerus
hingga menjadi serbuk. Serbuk tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung
berukuran 50 mL dan diberi label nama sampel. Selanjutnya ditambahkan 15 mL
larutan 1 (100 mL bufer ekstraksi + 0.38 gram natrium bisulfit) dan 1 mL SDS
20%, dikocok hingga homogen, dan diinkubasi pada suhu 65 0C selama 15 menit
(setiap 5 menit dikocok). Setelah itu, ditambahkan 5 mL kalium asetat 5 M, lalu
tabung dibolak-balik hingga homogen dan diinkubasi di dalam bak es selama 20
menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit.
Kemudian supernatan (cairan) disaring menggunakan kertas saring dan
dipindahkan ke dalam tabung 50 mL yang baru.
Isopropanol dingin ditambahkan 10 mL ke dalam cairan dan diinkubasi di
dalam freezer dengan suhu (-20 0C) selama 30 menit. Kemudian sampel
disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 20 menit lalu cairan di buang.
Sampel disentrifugasi lagi pada kecepatan 4000 rpm selama 2 menit dan sisa dari
cairan dibuang menggunakan pipet mikro sehingga cairan tidak ada sama sekali di
dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi pelet di keringkan di dalam oven
dengan suhu 65 0C selama 10 menit.
Pelet dilarutkan ke dalam 700 akuades dan 5 RNAse lalu diinkubasi pada
suhu 65 0C selama 30 menit dengan di kocok setiap 10 menit. Suspensi tersebut
dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000
rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL
yang baru. Sebanyak 75 µL natrium asetat 3 M dan 500 µL isopropanol dingin
4
ditambahkan dalam tabung tersebut dan dicampur serta diinkubasi pada suhu
ruang selama 5 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama
5 menit dan supernatan dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µL etanol 70%. Campuran
disentrifugasi kembali selama 2 menit pada kecepatan 10000 rpm dan cairan
dibuang. Kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 10000 selama 30 detik
dan cairan dibuang dengan pipet. Pelet dikeringkan dalam oven selama 10 menit.
Pelet yang telah kering dilarutkan dengan 50 µL larutan TE 0.1x.
Analisis Kuantitatif DNA Genom dengan Nanodrop (Thermo Fisher
Scientific 2009)
Sebanyak 2 µL larutan TE dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu,
tutup nanodrop dan tekan tombol read blank pada komputer. Sisa buffer TE
dibersihkan dengan kertas tissue. Sampel DNA dimasukkan sebanyak 2 µL ke
dalam lubang ukur, kemudian pilih menu read sample. Hasil pengukuran berupa
nilai kemurnian sampel akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/ µL. Kemudian
DNA dapat dilihat berdasarkan nilai Å260/Å280.
Amplifikasi DNA dengan PCR (Trijatmiko et al. 2011)
Amplifikasi dengan teknik PCR dilakukan dengan menggunakan dua
pasang primer untuk gen ketahanan basta (bar) dan gen ketahanan higromisin
(hpt). Sekuen primer yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3. Total volume
reaksi PCR adalah 20 µL yang terdiri 2 µL 10x bufer PCR, 1.2 µL MgCl2 25 mM,
0.4 µL dNTP mix 10 mM, 1 µL primer forward 10 µM, 1 µL primer reverse 10
µM, 0.16 µL Taq DNA polimerase 5 U/µL, 5 µL DNA 10 ng/ µL, dan 9.24 µL
ddH2O. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Profil PCR yang
digunakan adalah pre-denaturasi 940C selama 5 menit, denaturasi 940C selama 30
detik, penempelan primer 650C selama 30 detik, dan pemanjangan primer 720C
selama 30 detik. Proses tersebut diulang sebanyak 30 siklus.
Analisis Kualitas DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook &
Russell 2001)
Disiapkan terlebih dahulu 1% gel agarosa dengan pada cetakan. Sebanyak
1.2 gram agarosa dicampur dengan 120 mL 1x bufer TAE. Larutan tersebut
dimasukkan ke dalam microwave selama 2 menit. Larutan yang sudah tercampur
dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur. Setelah gel
agarosa padat, gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x bufer
TAE. Sebanyak 10 µL produk PCR dicampur dengan 2 µL loading dye, kemudian
dimasukkan ke dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder sebagai marker untuk
melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase
80 volt selama 35 menit. Gel agarosa direndam dalam larutan etidium bromida (20
mg/L) selama 10 menit, kemudian dengan air selama 10 menit. Gel Pita-pita DNA
selanjutnya ditampilkan dengan chemidoc gel system.
Hibridisasi Southern (Trijatmiko et al. 2011)
DNA sampel padi transgenik generasi T0 dipotong menggunakan enzim
restriksi DraI. Pemotongan dilakukan dengan total volume 150 pada masingmasing DNA. Sebanyak 33 µL akuades dan 15 µL larutan buffer 10x dimasukkan
ke dalam tabung steril 1.5 mL, lalu ditambahkan enzim restriksi DraI (10 U/ µL)
5
2 µL. Selanjutnya 100 µL DNA hasil isolasi dimasukkan dalam tabung 1.5 mL
dan diinkubasi pada suhu 370C selama 16 jam. Ditambahkan sebanyak 0.1 x
volume natrium asetat (3M) dan 2.5 x volume etanol 96%. Kemudian tabung
diinkubasi pada suhu -200C selama 2 jam. Tabung disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C. Cairan dibuang kemudian
ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µL, lalu disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Cairan kembali dibuang menggunakan
pipet 20 µL dan dikeringkan selama 2 menit. Tahap selanjutnya, sebanyak 15 µL
0.1x TE dan 3 µL loading dye ditambahkan ke masing- masing tabung tersebut,
kemudian tabung diinkubasi pada suhu 650C selama 15 menit.
Pelabelan marker 1 Kb dilakukan dengan menyiapkan 10x dNTP mix di
dalam tabung 0.5 mL (1 mM dATP 2 µL, 1 mM dCTP 2 µL, 1 mM dGTP 2 µL,
0.65 mM dTTP 1.3 µL, dan 0.35 mM DIG-11-dUTP 7 µL). Tahap selanjutnya,
sebanyak 3 µL 1 Kb, 2 µL 10x heksanukleotida, 2 µL 10x dNTP mix, 1 µL klenow
enzyme, dan 12 µL nucleid acid free water (NF) dimasukkan ke dalam tabung 1.5
mL. Setelah itu, tabung yang berisi campuran larutan tersebut dipanaskan pada
suhu 1000C selama 10 menit lalu dimasukkan ke dalam es selama 2 menit,
kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 3 jam. Ditambahkan 2 µL EDTA
0.2 mol/µL dan 2.5 µL LiCl 4 N serta 75 µL etanol absolut. Tahap berikutnya,
tabung disimpan pada frezzer selama 1 jam dan disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 5 menit. Cairan dibuang lalu pelet dicuci dengan etanol 70%.
Tahap terakhir, etanol 70% dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan oven
dengan suhu 500C atau dikering anginkan kemudian pelet dilarutkan pada bufer
TE 1x sebanyak 50 µL.
Proses transfer DNA tanaman padi transgenik yang dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi DraI ke membran Hybond -N+ diawali dengan
dibuat gel agarosa dengan konsentrasi 0.7% dalam 1x buffer TAE (Tris Acetat
acid-EDTA) dan didiamkan hingga padat. DNA yang telah di potong kemudian
dimasukkan sebanyak 18 µL dan dimasukkan sebanyak 5 µL marker hpt yang
telah dilabel oleh DIG ke dalam masing- masing sumur selama 16 jam (semalam)
pada tegangan 20 volt. Di hari berikutnya, tegangan diubah menjadi 15 volts dan
ditunggu hingga 5 jam. Gel kemudian direndam dalam larutan depurinasi selama
10 menit, kemudian dibilas dengan menggunakan akuades, diikuti dengan
perendaman dalam larutan denturasi selama 2 x 15 menit, dan terakhir direndam
dalam larutan netralisasi selama 2 x 15 menit. Kemudian gel direndam dengan
larutan 20x SSC selama 10 menit. Semua proses tersebut dilakukan pada suhu
ruang. Transfer DNA ke membran Hybond –N+ dilakukan dengan proses kapiler
menggunakan 20x bufer SSC selama 20 jam. Setelah DNA berpindah ke
membran, DNA pada membran difiksasi menggunakan UV selama 5 menit pada
302 nm.
Pelabelan pelacak gen dilakukan menggunakan teknik amplifikasi PCR.
Reaksi PCR dengan total volume 50 µL menggunakan primer hpt forward dan
reverse masing-masing 1 µL (5 mM), 5 µL 10x buffer PCR, 3 µL MgCl2 (25
mM), 0.5 µL dATP (10 mM), 0.5 µL dGTP (10 mM), 0.5 µL dCTP (10 mM), 0.44
µL dTTP (10 mM), 0.4 µL enzim Taq DNA polimerase (5 U/ µL), dan 5 µL
pelacak Hpt (100 pg/ µL). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi 950C
selama 2 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi pada suhu 950C selama
30 detik, penempelan primer pada suhu 600C selama 30 detik, dan pemanjangan
6
pada suhu 720C selama 40 detik. Tahapan akhir PCR dilakukan pemanjangan
akhir pada suhu 720C selama 7 menit. Untuk mengetahui keberhasilan pelabelan
pelacak, sebanyak 5 µL produk PCR labeling dengan Dig-11-dUTP berdampingan
dengan produk PCR tanpa DIG-11-dUTP dengan teknik elektroforesis pada gel
agarosa 1% (w/v) dan hasilnya dianalisis dengan menggunakan program
dokumentasi CEMIDOC.
Membran yang mengandung DNA kemudian dihibridisasi dengan pelacak
yang sudah terlabel. Proses ini dimulai dengan memanaskan larutan DIG Easy
Hyb pada suhu 420C. Membran direndam dengan larutan DIG Easy Hyb sebanyak
50 µL yang diletakkan dalam kotak plastik dan digoyang pada suhu 420C selama 3
jam. Setelah itu larutan DIG Easy Hyb dimasukkan ke dalam tabung 50 mL dan
ditambahkan dengan larutan pelacak yang telah dilabel, kemudian dimasukkan
kembali ke dalam kotak plastik dan digoyang kembali selama 16 jam pada suhu
42 0C.
Membran kemudian dicuci dengan larutan Wash 1 pada suhu kamar
selama 2 x 5 menit, diikuti dengan pencucian dengan larutan Wash 2 pada suhu
680C selama 2 x 15 menit. Membran diseimbangkan dengan larutan washing
buffer selama 2 menit, diikuti dengan inkubasi membran dalam larutan bufer 2
selama 2 jam. Membran diinkubasi selama 30 menit dalam 40 mL larutan AntiDigoxigenin-Alkalin Fosfatase atau Antibody conjugate (Anti-DIG) (Roche).
Membran dipindahkan ke dalam kotak plastik baru untuk menghilangkan
kelebihan antibody conjugate, membran diinkubasi selama 2 x 15 menit dalam
washing buffer. Membran direndam dengan larutan bufer 3 selama 3 menit. Untuk
pendeteksian sinyal dilakukan penambahan substrat CDP-Star ke membran.
Kemudian membran ditutup dengan plastik wrap dan diletakkan ke dalam kaset.
Film X- Ray diletakkan di atas membran dan didiamkan hingga 6 jam. Proses
selanjutnya film X-Ray direndam dengan larutan developer selama 45 detik, air
30 detik, dan larutan fixer selama 30 detik maka jejak dari cahaya yang dihasilkan
bisa dilihat sebagai pita-pita pada film X-Ray.
Aklimatisasi
Aklimatisasi dilakukan secara bertahap, biji padi T1 dikecambahkan dalam
cawan petri yang berisi air secukupnya selama kurang lebih satu minggu.
Terdapat 3 tanaman padi T0 yang diteruskan menjadi generasi T1 dan biji padi
yang digunakan berjumlah 50 biji untuk setiap tanaman. Biji padi yang telah
tumbuh menjadi kecambah dipindahkan ke dalam bak plastik ukuran 44 cm x 34
cm x 15 cm yang berisi tanah sawah selama dua minggu. Biji padi yang bertahan
hidup selama periode aklimatisasi selanjutnya dipindahkan ke dalam pot plastik
dengan volume 10 l yang berisi tanah sawah.
Pengujian Ketahanan Tanaman Padi Generasi T1 terhadap Basta
Pengujian ketahanan tanaman terhadap basta dilakukan dengan cara
mengolesi ujung daun tanaman padi dengan larutan herbisida basta dengan
konsentrasi 200 mg/l. Setelah 3 hari setelah perlakuan kemudian dilakukan
pengamatan terhadap daun padi. Tanaman dikatakan tahan jika daun tidak
terbakar (warna daun tetap hijau) dan tidak tahan jika daun menjadi terbakar
(warna daun coklat) pada area daun yang diolesi larutan basta.
7
Isolasi DNA Tanaman Padi Generasi T1 (Doyle & Doyle 1987)
Daun padi yang telah dipotong-potong dimasukkan ke dalam tabung mikro
berukuran 2 mL, ditempatkan pada wadah berisi liquid nitrogen (LN) kemudian
digerus menggunakan sumpit, dan ditambahkan 800 µL bufer CTAB. Hasil
gerusan diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 65°C selama 15 menit, kocok
(bolak-balik tabung) setiap 5 menit sekali.
Pemurnian DNA dilakukan melalui penambahan natrium asetat 3M
sebanyak 1/10 volume atau sekitar 100 µL dan 1000 µL kloroform isoamilalkohol
ke dalam tabung, kemudian kocok hingga merata. Suspensi selanjutnya disentrifus
dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tube
baru.
Pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan 70 µL Na-asetat (1/10
volume) dan 600 µL isopropanol (2/3 volume) ke dalam supernatan dan dicampur
perlahan. Sampel disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Pelet
dicuci dengan 200 µL etanol 70 %. Campuran disentrifus selama 5 menit dengan
kecepatan 12000 rpm. Pelet selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit.
Pelet yang telah kering dilarutkan dalam 50 µL bufer TE yang mengandung
ribonuklease dan diinkubasi pada 37°C selama 30 menit.
HASIL
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
Sampel tanaman padi yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 27.
Sampel diisolasi menggunakan metode isolasi DNA skala besar yang mengacu
pada Dellaporta et al. (1983). Masing-masing sampel DNA hasil isolasi
diteteskan ke dalam mesin nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan
kemurnian DNA hasil isolasi. Kemurnian DNA padi yang diperoleh dari hasil
isolasi menggunakan metode skala besar berkisar antara 1.22–2.02 yang
mengindikasikan masih terkandungnya protein dan RNA.
Setelah isolasi DNA dilakukan amplifikasi dengan mesin PCR. Primer
bar dan hpt digunakan untuk mengetahui keberadaan transposon Ac dan
transposon Ds. Berdasarkan analisis elekroforegram dari hasil amplifikasi
dengan primer bar (Gambar 1), diketahui bahwa seluruh sampel menghasilkan
pita DNA yang mengindikasikan keberadaan gen bar. Hasil elektroforesis dari
hasil amplifikasi hpt (Gambar 2) menunjukkan bahwa semua sampel
menghasilkan pita DNA, hal ini yang menunjukkan bahwa seluruh sampel
mengandung gen hpt.
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
T-DNA sampel yang diharapkan untuk dilanjutkan pada tanaman
generasi kedua (T1) adalah T-DNA yang stabil. T-DNA suatu tanaman yang
stabil akan menghasilkan satu pita pada hasil hibridisasi Southern. Berdasarkan
Gambar 3 diketahui bahwa sampel yang menghasilkan satu pita DNA adalah
sampel 1.1, 1.2, 5.1, 5.2, 5.3, 4.5, 4.10, 4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16 dan
4.18. Sampel yang lain tidak menghasilkan pita DNA sama sekali. Tiga dari
sampel positif kemudian ditanam kembali untuk diuji lebih lanjut. Tiga sampel
tersebut adalah 5.3, 4.5 dan 4.12.
8
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer bar pada tanaman generasi T0.
A: air, K: kontrol (IR64), P: plasmid B2, 1.1 – 4.19: sampel (elektroforegram kedua
merupakan lanjutan dari elektroforegram pertama).
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T0.
A: air, K: kontrol (IR64), P: plasmid, 1.1- 4.19: sampel.
Gambar 3 Hasil hibridisasi Southern pada tanaman padi IR64 generasi T0. K: kontrol (IR64), P:
plasmid, 1.1– 4.19: sampel (5.3, 4.5, 4.12 : 3 sampel yang dilanjutkan ke T1).
9
Uji Ketahanan Terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
Tiga dari sampel padi generasi T0 yang memiliki satu salinan T-DNA
stabil dipilih untuk ditanam menjadi tanaman padi generasi kedua (T1). Tiga
genotipe tersebut adalah 5.3, 4.5 dan 4.12. Ketiga genotipe tersebut dipilih sebab
menghasilkan biji padi yang cukup banyak. Berdasarkan hukum segregasi
Mendel, generasi kedua akan memenuhi perbandingan 3:1 antara pembawa sifat
dan yang bukan pembawa sifat (Brooker 2005). Hal tersebut memungkinkan
muncul kembali individu-individu yang memiliki genotipe tipe liar (wild type)
karena masih mengalami segregasi dan belum homogen. Oleh karena itu
digunakan biji padi yang cukup banyak pada tahap aklimatisasi dengan harapan
untuk memperbesar kemungkinan memperoleh individu pembawa transposon
Ac/Ds. Tanaman padi yang tidak mengandung gen bar akan mengalami nekrosis
(Gambar 4) setelah perlakuan basta. Sebaiknya tanaman yang mengandung gen
bar akan menunjukkan ketahanan terhadap herbisida basta. Hasil pengamatan
menunjukkan sebanyak 8 tanaman padi dari sampel 5.3 menunjukkan ketahanan
terhadap basta, 5 tanaman pada sampel 4.5 dan 7 tanaman pada sampel 4.12.
A
B
Gambar 4 Hasil pengolesan basta pada tanaman. A: negatif dan B: positif.
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
Sampel yang menunjukkan hasil positif, disertai dengan beberapa sampel
hasil negatif yang akan digunakan sebagai perbandingan, kemudian diisolasi
dengan metode isolasi DNA yang mengacu pada Doyle et al. (1987).
Kemurnian DNA padi yang diperoleh dari hasil isolasi menggunakan metode
skala besar berkisar antara 1.78–1.97 yang menunjukkan DNA hasil isolasi
mempunyai kemurnian yang baik.
Analisis kestabilan transposon Ds dilakukan dengan amplifikasi tanaman
padi generasi T1 dengan primer bar dan hpt. Berdasarkan Gambar 5 diketahui
bahwa sebagian besar sampel menunjukkan hasil positif terhadap primer bar
kecuali sampel 4.12 (-1), dan 4.12 (-2). Sampel yang menunjukkan hasil positif
dari amplifikasi PCR dengan primer hpt (Gambar 6) berjumlah 11 sampel.
10
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 5 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer bar pada tanaman padi T1. K1
dan K2: kontrol (IR64), 5.3 (1-8): sampel positif, 5.3 (-1, -2): sampel negatif, 4.5 (15): sampel positif, 4.5 (-1, -2): sampel negatif, 4.12 (1-7): sampel positif, 4.12 (-1, 2): sampel negatif.
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
12.000 bp
1.000 bp
500 bp
Gambar 6 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T1.
K1 dan K2: kontrol (IR64), 5.3 (1-8): sampel positif, 5.3 (-1, -2): sampel negatif, 4.5
(1-5): sampel positif, 4.5 (-1, -2): sampel negatif, 4.12 (1-7): sampel positif, 4.12 (-1,
-2): sampel negatif (elektroforegram kedua merupakan lanjutan dari elektroforegram
pertama).
Tanaman padi yang mengandung transposon Ds stabil adalah tanaman yang
menunjukkan hasil positif terhadap primer bar dan menunjukkan hasil negatif
terhadap primer hpt. Analisis dari hasil amplifikasi dengan primer bar dan hpt
seperti yang tertera pada Tabel 1 bahwa sampel yang memiliki transposon Ds
stabil berjumlah 14 sampel. Hal ini mengidentifikasikan bahwa transposon Ds
11
telah terpisah dari transposon Ac pada proses segregasi tanaman padi T1. Hasil
yang demikian sesuai dengan harapan sebab transposon Ds akan stabil dalam
suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004).
Tabel 1 Hasil analisis kestabilan transposon Ds
Sampel
IR 64 (1)
IR 64 (2)
64.B2.5.3 (1)
64.B2.5.3 (2)
64.B2.5.3 (3)
64.B2.5.3 (4)
64.B2.5.3 (5)
64.B2.5.3 (6)
64.B2.5.3 (7)
64.B2.5.3 (8)
64.B2.5.3 (n.1)
64.B2.5.3 (n.2)
64.B2.4.5 (1)
64.B2.4.5 (2)
64.B2.4.5 (3)
64.B2.4.5 (4)
64.B2.4.5 (5)
64.B2.4.5 (n.1)
64.B2.4.5 (n.2)
64.B2.4.12 (1)
64.B2.4.12 (2)
64.B2.4.12 (3)
64.B2.4.12 (4)
64.B2.4.12 (5)
64.B2.4.12 (6)
64.B2.4.12 (7)
64.B2.4.12 (n.1)
64.B2.4.12 (n.2)
Hasil bar
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Hasil hpt
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
keterangan
kontrol
kontrol
tidak stabil
stabil
tidak stabil
tidak stabil
tidak stabil
tidak stabil
tidak stabil
stabil
stabil
stabil
stabil
stabil
tidak stabil
stabil
stabil
stabil
tidak stabil
stabil
stabil
stabil
stabil
tidak stabil
tidak stabil
stabil
tidak stabil
Gen tidak diturunkan
PEMBAHASAN
Transposon Ac/Ds diintroduksi ke dalam genom tanaman padi dengan
memanfaatkan T-DNA. Transposon Ds yang telah masuk ke dalam genom akan
berpindah posisi jika diinduksi oleh enzim transposase pada generasi berikutnya,
sehingga dapat dimanfaatkan untuk mutasi. Jika diperoleh tanaman T0 yang
cukup, diharapkan dari setiap tanaman tersebut diperoleh generasi tanaman T1
dengan insersi transposon yang berbeda. Insersi transposon diharapkan terjadi
pada gen penting dan menghasilkan fenotipe tanaman tertentu sehingga fungsi gen
yang dirusaknya (knock out) dapat diamati pada penelitian lebih lanjut.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 27 tanaman transgenik
hasil transformasi yang telah disisipkan transposon Ac/Ds sebelumnya.
Berdasarkan peta T-DNA yang digunakan pada transformasi sebelumnya
12
(Gambar 7) menunjukkan bahwa transposon Ac telah disisipkan gen hpt dan pada
transposon Ds telah disisipkan gen bar. Gen hpt dan gen bar berfungsi sebagai
marka untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac dan transposon Ds.
Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds serta kestabilannya perlu dilakukan
untuk mengetahui keberhasilan transfomasi pada sampel tanaman padi generasi
T0.
Konfirmasi keberadaan dan integrasi transposon dapat dilakukan dengan
polymerase chain reaction (PCR) dan Southern-blot. PCR merupakan cara yang
popular digunakan karena dapat menganalisis secara cepat sampel yang banyak
jumlahnya. Meskipun demikian, PCR mempunyai beberapa kelemahan. Hasil
PCR tidak dapat menunjukkan apakah sekuen DNA sudah terintegrasi ke dalam
genom tanaman atau belum (Padmadi 2009). Berdasarkan hal tersebut maka untuk
mengetahui apakah seluruh basa yang ada dalam transgen terintegrasi dalam
genom tanaman perlu dilakukan Southern-blot.
Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0
Metode isolasi DNA ditentukan sesuai dengan metode analisis molekuler
yang akan dilakukan dan kuantitas DNA yang dibutuhkan. Analisis molekuler
yang dilakukan pada tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 adalah
amplifikasi PCR dan hibridisasi Southern. Analisis gen menggunakan hibridisasi
Southern membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan murni (Padmadi 2009).
Berdasarkan hal tersebut maka dipilih metode isolasi skala besar (Dellaporta et
al. 1983). Hasil penelitian Kartini (2012) juga menunjukkan bahwa metode isolasi
skala besar merupakan metode isolasi yang paling tepat untuk analisis molekuler
dengan Southern blot.
Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds pada penelitian ini dilakukan
dengan polymerase chain reaction (PCR). Menurut Abdullah dan Retnoningrum
(2003), teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana
terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara
eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Secara umum proses ini dapat
dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat,
annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan
extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA
antara 106-109 kali.
Gambar 7 Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon Ac/Ds (Trijatmiko et
al. 2005)
13
Primer yang digunakan untuk konfirmasi transposon Ac/Ds pada penelitian
ini ada dua, yaitu primer bar dan hpt. Primer bar berfungsi untuk mengidentifikasi
keberadaan transposon Ds dan primer hpt untuk mengidentifikasi keberadaan
transposon Ac. Berdasarkan hasil analisis PCR (Gambar 2) diketahui bahwa
seluruh sampel mengandung transposon Ac dan Ds. Hasil demikian menunjukkan
transposon Ac/Ds berhasil disisipkan ke dalam gen padi.
Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern
Sampel yang positif pada hasil PCR hanya menunjukkan adanya sekuen
yang homolog dengan primer dan berada pada jarak yang memungkinkan
dihasilkannya produk PCR. Berdasarkan hal tersebut maka untuk mendapatkan
data yang lebih spesifik perlu dilakukan teknik hibridisasi Southern. Hibridisasi
merupakan proses identifikasi gen-gen hasil analisis DNA dengan menggunakan
enzim restriksi yang sesuai dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang
spesifik yang telah diberi label dengan radioisotope seperti 32p fosfat radioaktif
atau dengan substansi nonradioisotop (Berg et al. 2007). Hibridisasi Southern
dapat menunjukkan keberadaan transgen dan jumlah salinan dari gen hasil
transformasi pada tanaman transgenik. Jumlah salinan transgen (T-DNA)
ditunjukkan oleh jumlah pita yang dihasilkan. Apabila jumlah salinan gen
transforman terlalu banyak pada genom maka kemungkinan akan terjadi proses
pembungkaman (silencing) pada gen tertentu, namun apabila gen terkopi antara 110X kemungkinan tidak akan menimbulkan gene silencing pada gen gen lain
(Christou et al. 1991).
Berdasarkan Gambar 3 diketahui bahwa terdapat 14 sampel yang
menunjukkan T-DNA yang menghasilkan satu salinan (single copy). Jumlah
salinan demikian adalah hasil yang diharapkan. Apabila terjadi perubahan tingkat
ekspresi pada tanaman generasi selanjutnya dapat diduga karena pengaruh
integrasi gen yang ditransformasikan dan bukan karena proses pembungkaman
gen. Berdasarkan hasil diketahui bahwa selain sampel yang menghasilkan satu
pita, sampel yang lain tidak menghasilkan pita sama sekali. Hal ini diduga karena
transgen (T-DNA) masuk ke dalam sel sehingga positif ketika dideteksi dengan
PCR tetapi tidak terintegrasi ke dalam genom tanaman dan tidak menghasilkan
pita saat dideteksi dengan hibridisasi Southern. Marsch-Martinez et al (2002)
menyatakan bahwa kegagalan saat transformasi dapat mengakibatkan T-DNA
tidak terinsersi pada genom DNA.
Uji Ketahanan terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1
Salah satu metode konfirmasi sederhana dan cepat untuk mengetahui
integrasi T-DNA ke dalam genom padi adalah dengan pengecatan/pengolesan
daun padi transgenik dengan herbisida basta pada konsentrasi 200 mg/l (Wang
dan Waterhouse 1997). Apabila gen bar telah terintegrasi ke dalam genom
tanaman padi, maka ketika daun padi transgenik yang mengandung gen tersebut
diolesi dengan basta akan memberikan respon ketahanan. Respon ketahanan
tersebut diketahui apabila daun yang diolesi akan tetap berwarna hijau (tahan
basta) sedangkan yang tidak membawa gen tersebut akan berwarna coklat atau
mengalami nekrosis (Gambar 4) (sisharmini et al 2009).
Hasil penelitian remelia 2009 menghasilkan 48% padi nipponbare mutan
tahan basta dari seluruh sampel padi yang diuji dengan herbisida basta. Penelitian
14
ini menghasilkan 13% padi tahan basta dari 150 padi IR64 mutan generasi F1
yang diuji. Perbedaan hasil tersebut diduga akibat perbedaan kultivar padi yang
digunakan. Tanaman yang menunjukkan hasil positif (tahan terhadap basta)
mengindikasikan bahwa gen bar yang terdapat pada elemen Ds telah terintroduksi
dan terekspresi pada tanaman transgenik generasi T1 yang diuji. Gen bar
memproduksi enzim fosfinotrisin asetiltransferase. Enzim yang dihasilkan
tersebut memberi gugus asil kepada senyawa fosfinotrisin yang dipaparkan oleh
herbisida basta sehingga berubah menjadi senyawa yang tidak berbahaya bagi
tanaman sehingga tanaman tidak mengalami nekrosis. Hal ini menyebabkan daun
padi yang mengandung gen bar tidak berubah warna ketika dipaparkan herbisida
basta. Herbisida basta mengandung senyawa fosfinotrisin yang dapat menghambat
kerja enzim dalam jalur sintesis glutamin sehingga menghasilkan senyawa toksik
yaitu amoniak. Senyawa toksik tersebut yang mengakibatkan sel-sel tanaman
menjadi mati sehingga mengalami gejala nekrosis (daun seperti terbakar)
(Kolesnik et al. 2004).
Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1
Tanaman padi yang tahan terhadap basta diisolasi dengan metode isolasi
DNA yang mengacu pada Doyle et al. (1987). Metode isolasi ini dipilih karena
hanya memerlukan bahan yang sedikit dan tidak membutuhkan waktu yang lama.
Keberadaan transposon Ac dan Ds dapat diketahui dengan PCR menggunakan
primer yang dapat mendeteksi keberadaan gen bar dan gen hpt. Gen bar terdapat
di dalam transposon Ds, sedangkan gen hpt terdapat dalam transposon Ac pada
konstruksi T-DNA.
Transposon Ds akan stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan
transposon Ac (Kolesnik et al. 2004). Berdasarkan hasil pengamatan transposon
Ds stabil berhasil terdeteksi dalam 53% sampel padi IR64 mutan yang diamati.
Kolesnik et al. (2004) berhasil mendeteksi lebih dari 80% transposon Ds stabil
pada pengamatan populasi padi mutan nipponbare dalam skala besar. Penelitian
yang dilakukan Mulyaningsih et al. (2010) berhasil mendeteksi sekitar 76%
transposon Ds dari seluruh sampel padi batutegi yang diamati. Perbedaan jumlah
transposon Ds stabil yang didapat pada masing-masing penelitian diduga karena
perbedaan dari kultivar padi dan konstruk gen yang digunakan. Padi mutan
dengan hasil positif dari analisis kestabilan ini dapat diturunkan ke generasi
selanjutnya untuk mengetahui kestabilan transposon Ds lebih lanjut. Uji stabilitas
gen pada tanaman transgenik perlu dilakukan untuk mengetahui kestabilan insersi
transgen pada turunannya. Tanaman padi mutan yang telah stabil dapat digunakan
dalam berbagai penelitian khususnya yang berkaitan dengan analisis fungsi gengen padi (Remelia 2008).
Sampel 5.3(-1), 5.3(-2) dan 4.5(-1) tidak menunjukkan ketahanan terhadap
uji herbisida basta namun menunjukkan hasil positif pada amplifikasi PCR dengan
primer bar. Hal ini mungkin disebabkan karena gen bar pada genom tanaman
bersifat resesif sehingga tidak tahan terhadap perlakuan herbisida basta namun
tetap ada dalam genom tanaman. Mangoendidjojo (2003) mengatakan bahwa gen
resesif tidak dapat menunjukkan ekspresinya jika berpasangan dengan gen
dominan (heterozigot). Sampel 4.12(-2) tidak menunjukkan ketahanan pada uji
herbisida basta serta menunjukkan hasil negatif pada PCR bar dan hpt. Hal
tersebut menunjukkan bahwa sampel tidak mengandung transposon Ac/Ds atau
15
merupakan tipe liar yang tidak mengandung transgen. Peristiwa ini dapat terjadi
karena transgen masih mengalami segregasi dan belum homogen. Berdasarkan
hukum Mendel individu-individu yang memiliki genotipe tipe liar (wild type)
dapat muncul kembali pada generasi kedua (T1) maupun generasi kedua (T1)
karena masih mengalami segregasi dan belum homogen (Brooker 2005). Tanaman
kontrol IR64 seperti yang diharapkan menunjukkan hasil negatif pada analisis
PCR. Hal ini menunjukkan gen penanda bar dan hpt mampu mendeteksi dengan
baik.
SIMPULAN
Tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 yang mengandung satu salinan
(single copy) T-DNA pembawa transposon Ac/Ds telah berhasil dikonfirmasi.
Sebanyak 14 sampel menghasilkan satu salinan pada analisis hibridisasi Southern.
Uji kestabilan transposon Ds pada tanaman padi IR64 transgenik generasi T1
berhasil dilakukan dan menghasilkan 12 sampel tanaman yang mengandung
transposon Ds stabil.
DAFTAR PUSTAKA
Berg MJ, JL Tymoczko, L Stryer. 2007. Biochemistry. Sixth Ed. San Fransisco
(US): WH Freeman.
Bouchez D, H Hofte. 1998. Functional genomic in plants. Plant Physiol.
118:725-732.
Brooker R J. 2005. Analysis and Principle. 2nd ed. New York (US): McGraw-Hill
companies, Inc.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS
Christou P, Ford TL, Kofron M. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa
L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties
via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into
immature zygotic embryos. Biotechnology. 9:957-966.
Dellaporta Sl, Jonathan W, James BH. 1983. A plant DNA minipreapration:
version II. Plant molecular Biology Reporter 1: 19- 21.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation from small amount of fresh
leaf tissue. J Phytochem Bull 19: 11-15.
Griffith AJF. 1999. An Introduction to Genetic Analysis. Ed ke-7. New York
(US): W.H. Freeman.
Greco R, PBF Ouwerkerk, AJC Taal, C Favalli, T Begiristain, P Puigmonech,
L Colombo, JHC Hoge, A Pereira. 2001. Early and multiple Ac
transpositions in rice suitable for efficient insertional mutagenesis.
PlantMolecular Biology 46: 215-227.
Greco R, PBF Ouwerkerk, RJ De Kam, C Sallaud, C Favalli, L Colombo, E
Guiderdoni,
AH
Meijer,
JHC
Hoge,
A
Pereira.
2003.
Transpositional behavior of an Ac/Ds system for reverse genetics in
16
rice. Theory Applied Genetics 108: 10-24.
Jeoung DH, S An, HG Kang, S Moon, J Han, S Park, HS Lee, K An, & G An.
2002. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice.
Plant physiology 130: 1636-1644.
Kartini RA. 2012. Karakerisasi Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa
Metode Isolasi DNA [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Kolesnik T, I Szeverenyi, D Bachman, CS Kumar, S Jiang, R Ramamoorthy,
M Cal, ZG Ma, V Sundaresan, S Ramachandran. 2004. Establishing
an efficient Ac/Ds tagging system in rice. The Plant Journal 37: 301314.
Mangoendidjojo W. 2003. Dasar-dasar Pemuliaan Tanaman. Yogyakarta (ID):
Kanisius.
Padmadi B. 2009. Identifikasi sifat aroma tanaman padi menggunakan marka
berbasis gen aromatik [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Remelia M. 2008. Analisis T-DNA pembawa transposon Ac/Ds pada T0 dan
aktivitas Ds pada T1 tanaman padi (Oryza sativa L.) kultivar
nipponbare
[skripsi]. Jakarta (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
Rodriguez RC,Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in
genetic transformation especially in plants. CAMBIA. [internet]. [diunduh
pada
2013
feb
22].
Tersedia
pada
http:www.cambiaip.org/whitepapers/TransgenidAb.
Rubin E, A.A. Levy. 1997. Abortive gap repair: Underlying mechanism for Ds
element formation. Molecular and Cellular Biology 17(11): 6294-6302.
Sambrook J, DW Russel. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New
York (US): Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific.
Trijatmiko KR, GV Arkel, A Karaba, EV Enckevort, A Pereira. 2005. Activation
tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. Dalam
Comparative Analysis of Drought Resistance Genes in Arabidopsis and
Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland
with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p. 111-128.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analysis
of Transgenic Plants. NewYork (US): Springer.
Wang MB, PM Waterhouse. 1997. A rapid and simple method of assaying
plants transformed with hygromycin or PPT resistance genes. Plant Mol.
Biol. Rep. 15:209-215.
Weaver NA, PW Hendrick. 1997. Genetics. 3rd ed. Dubuque (US): Wm. C.
Brown Publisher.
Webb KJ, Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation, In:
Gatehouse AMR, Hilder VA, Boulter D, editor. Plant Genetic
Manipulation for Crop Protection. United Kingdom (GB): CAB
International
Lampiran
Lampiran 1 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T0
No.
Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
IR64 WT
64.B2.1.1
64.B2.1.2
64.B2.5.1
64.B2.5.2
64.B2.5.3
64.B2.5.4
64.B2.5.5
64.B2.4.1
64.B2.4.2
64.B2.4.3
64.B2.4.4
64.B2.4.5
64.B2.4.6
64.B2.4.7
64.B2.4.8
64.B2.4.9
64.B2.4.10
64.B2.4.11
64.B2.4.12
64.B2.4.13
64.B2.4.14
64.B2.4.15
64.B2.4.16
64.B2.4.17
64.B2.4.18
64.B2.4.19
konsentrasi
DNA
(ng/µl)
1463
3383.3
1270.4
1724.6
1517
2364.3
1513.1
1356.1
1095.3
388.8
313.9
335.3
87.4
433
352
269.7
327.9
600.5
859.5
1267.4
522.7
368.5
1266.8
988.1
905.5
1624.2
1613.3
A260
A280
260/280
29.259
67.665
25.408
34.492
30.341
47.286
30.261
27.123
21.907
7.776
6.278
6.706
1.748
8.66
7.04
5.393
6.558
12.009
17.19
25.348
10.453
7.37
25.336
19.762
18.111
32.485
32.267
15.392
33.482
13.414
18.409
16.305
24.415
16.212
14.593
11.737
4.149
3.332
3.529
1.429
4.63
3.779
2.869
3.493
6.513
9.258
13.62
5.713
3.898
13.647
10.731
9.797
17.386
17.335
1.9
2.02
1.89
1.87
1.86
1.94
1.87
1.86
1.87
1.87
1.88
1.9
1.22
1.87
1.86
1.88
1.88
1.84
1.86
1.86
1.83
1.89
1.86
1.84
1.85
1.87
1.86
18
Lampiran 2 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T1
No. Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28