106 Lampiran 2 Prosedur analisis
1. Aktivitas Enzim β-glukosidase Luijendijk et al. 1998
Sebanyak 25 l ekstrak enzim ditambah bufer fosfat 0,1 M pH 6,3 sebanyak 450 l dan substrat pnp-g 40 mM sebanyak 25 l. Selanjutnya dilakukan
inkubasi pada suhu 30
o
C hingga terbentuk warna kuning. Reaksi dihentikan dengan penambahan 800 l Na
2
CO
3
1M. Setelah disentrifuse 3500 rpm, 4
o
C, 15 menit absorbansi diukur pada panjang gelombang 400 nm. Aktivitas dihitung
menggunakan E = 18.500 M
-1
cm
-1
, dan dinyatakan dalam satuan IUg protein IU = molmenit.
2. Analisis Protein Terlarut Bradford Macro Assay
Dye reagen konsentrat dibuat dengan cara melarutkan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95, kemudian ditambahkan 100 ml
asam fosforid 85 dan diencerkan sampai 200 ml dengan air. Penyimpanan dilakukan pada suhu 4
o
C. Jika akan digunakan encerkan dye reagen dalam air 5 kali dan dapat disimpan selama dua minggu. Pada standar digunakan larutan
Bovine Serum Albumin BSA 0,2-1,4 mgml. Pada analisis 20 l laruran standar atau sampel dimasukkan ke dalam tabung ependorf kemudian ditambahkan 1.0 ml
reagen Bradford dan dikocok sampai merata. Absorbansi diukur pada 595 nm setelah 10 menit.
3. Kadar Vanillin SNI 01-0010-2002 Persiapan Contoh
a. Timbang dengan teliti 5,0 gram contoh, rendam dengan 35 ml etanol 60 dalam erelenmeyer asah 100 ml yang ditutup selama 4 jam perendaman
pertama. b. Setelah perendaman pertama, saring larutan etanol tersebut ke dalam labu
takar 100 ml. Bilas kertas saring dengan 5 ml etanol 60, simpan kertas saring ini untuk digunakan kembali pada penyaringan yang kedua.
c. Tumbuk contoh hasil penyaringan pertama sampai halus dengan mortal dan pestle, pindahkan contoh ke dalam Erlenmeyer bekas perendaman pertama,
107 rendam kembali dengan 35 ml etanol 60 selama 24 jam perendaman
kedua. d. Setelah perendaman kedua, saring larutan etanol dengan menggunakan kertas
saring yang sama dari perendaman pertama dan satukan saringan ke dalam labu takar yang berisi saringan hasil perendaman pertama.
e. Bilas sisa contoh dalam Erlenmeyer dan kertas saring dalam etanol 60. Satukan ke dalam labu takar yang berisi saringan perendaman vanili dan
tepatkan dengan etanol 60 sampai tanda garis. f. Kocok labu di atas 12 kali sampai merata larutan contoh 1.
Pembuatan Standar Vanillin
a. Timbang dengan teliti 0,10 g vanillin standar pada botol timbang. Tambahkan 5 ml etanol 95 dan digoyang-goyang sampai vanillin larut sempurna.
Pindahkan larutan ini ke dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan air suling sampai tanda garis larutan a.
b. Pipet 5 ml, 10 ml, dan 15 ml larutan a, masukkan masing-masing ke dalam labu takar250 ml, encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Kocok 12
kali sampai merata, maka akan didapat 3 larutan standar larutan b. c. Pipet 10 ml dari larutan b masing-masing ke dalam labu takar 100 ml,
tambahkan 80 ml air suling dan 2 ml 0,1 N NaOH, goyangkan sampai merata, encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Kocoklah 12 kali sampai
merata dan diperoleh 3 larutan blanko masing-masing 2, 4, dan 6 ppm. d. Ukur absorben dari larutan standar pada panjang gelombang 348 nm dengan
menggunakan larutan blanko yang disesuaikan untuk masing-masing standar. e. Buat kurva standar dengan memplotkan konsentrasi larutan standar ppm
terhadap absorben.
Penentuan absorben larutan contoh
a. Pipet 10 ml larutan contoh 1 ke dalam labu takar 100 ml, encerkan dengan air suling hingga tanda garis diperoleh larutan 2.
b. Pipet 10 ml larutan 2, masing-masing ke dalam dua labu takar 100 ml.
108 c. Pada labu takar pertama, tambahkan air suling sampai tanda garis, kocok 12
kali sampai merata, larutan ini disebut larutan blanko larutan c. d. Pada labu takar kedua, tambahkan 80 ml air dan 2 ml 0,1 N NaOH,
campurkan dengan baik, encerkan dengan air suling sampai tanda garis. Kocok 12 kali sampai merata, larutan ini disebut larutan d, yaitu larutan
contoh yang akan ditentukan kadar vanillinnya. Pengujian dilakukan menggunakan spektrofotometer. Pada alat ini, sinar
dari sumber cahaya dibagi menjadi dua berkas; berkas pertama melalui kuvet berisi blanko dan berkas kedua melalui kuvet berisi standar atau contoh. Kadar
vanillin dihitung menggunakan persamaan berikut : Kadar vanillin gg berat kering = C x fp x V x 100
M 100 – H Kadar vanillin berat kering = Kadar vanillin gg x 100
10
6
gg Keterangan :
C = konsentrasi larutan contoh larutan d gg atau ppm yang diperoleh dari kurva standar
V = volume ekstrak ml M = bobot contoh gram
H = kadar air contoh
4. Kadar Gula Pereduksi Metode DNS Reagen DNS dibuat dengan cara melarutkan 10 g dinitrosalicylic acid, 16
g NaOH dan 30 g Rochelle salt ke dalam 500 ml air. Setelah semuanya larut,
volume ditepatkan hingga 1 l dan ditempatkan pada botol gelap. .
Ekstrak vanili sebanyak 1 ml ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut kemudian dipanaskan dalam waterbath yang berisi air mendidih selama
15 menit. Setelah didinginkan, absorbansi larutan contoh dibaca pada panajng gelombang 515 nm.
109 Kadar gula pereduksi basis kering = Y x fp x 100 x V x 100
M x 100 – KA 1000 Y = konversi nilai absorbansi gula pereduksi ke dalam kurva standar mgml
fp = faktor pengenceran V = volume ekstrak vanilla ml
M = massa vanilla g KA = kadar air
5. Kadar Air AOAC 1984
